UTILISATION DE GAZ COMPRIME POUR LE DEPLACEMENT D'ELUANT APPLIQUE A LA CHROMATOGRAPHIE

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé de séparation chromatographique incluant une étape de déplacement d'un éluant par un gaz comprimé tel que du CO2. L'invention concerne également une installation adaptée à la mise en œuvre de ce procédé.

ARRIERE-PLAN TECHNIQUE

De nombreux documents de l'état de la technique décrivent des procédés de séparation chromatographique, notamment de produits hydrophobes, soit en chromatographie liquide, soit en chromatographie supercritique.

En chromatographie liquide, les produits tels que squalènes, caroténoïdes et vitamine E, et de nombreux autres produits sont séparés par une succession d'étapes d'élution. L'exigence de haut rendement et de haute pureté conduit à utiliser plusieurs éluants. De ce fait, des solutions en sortie de chromatographie comprennent des mélanges d'éluants qu'il est nécessaire de récupérer et dissocier par distillation.

Ainsi, le document CN 103288571 décrit la séparation de squalène par chromatographie haute performance en phase liquide (HPLC) sur un gel de silice au moyen d'une première élution avec un éluant tel que le n- hexane, suivie d'une seconde élution avec un éluant comprenant un mélange tel que n-hexane et cyclohexane dans des ratios volumiques tels que 5-20:1 .

Le document US 6,072,092 décrit la séparation de tocophérols et tocotriénols en HPLC sur un gel de silice au moyen d'une première élution avec une solution apolaire suivie d'une seconde élution par une solution polaire ou un mélange de solutions polaires et apolaires.

Le document WO 2014/100327 décrit la séparation d'isomères de tocotriénol en HPLC sur un gel de silice ; il est procédé à deux élutions par un mélange de solutions apolaires avec une faible teneur en solution polaire. Le document CN 101323607 décrit la séparation de tocophérols par HPLC en trois élutions successives.

Une méthode d'élution comprenant des mélanges de solutions est aussi décrite dans le document EP 242148 présentant l'extraction de carotènes avec une solution d'élution comprenant une majorité de solution polaire et une minorité de solution apolaire.

Le document CN 1013197 décrit la séparation de tocophérols avec une élution simple avec un mélange de solution apolaire et un faible ratio de solution polaire. Il en est de même pour les documents WO 94/08987 et EP 1424013 décrivant la séparation de carotènes, et le document WO 2003/37884 sur l'extraction de tocophérols.

Une élution simple du produit au moyen d'une solution unique apolaire est décrite dans les documents JP 2547595 et US 4,122,094 pour la séparation de carotènes et tocophérols.

L'art antérieur décrit ci-dessus concerne la voie HPLC en phase normale. Les documents GB 8729232 et EP 1083174 décrivent des modes de séparation en phase inverse, où l'adsorption du produit ou des impuretés sur le support chromatographique se fait par l'intermédiaire de liaisons de type hydrophobes.

Pour la séparation en chromatographie supercritique, l'élution du produit se fait au moyen d'une solution de CO2 et/ou solution apolaire. Les documents EP 1 122250, EP 1097985 et IN 2005DE00333 proposent l'application de cette méthode pour la séparation de carotènes et/ou de dérivés de vitamine E, issus d'huile de palme ou de dérivés d'huile de palme. Le support est de type silice non greffée ou de type C18, et la séparation du produit d'intérêt et des impuretés se fait à l'aide d'un gradient de température et/ou de pression lors de l'étape d'élution. Le document WO 2007/90545 propose l'utilisation de gaz à l'état supercritique pour un procédé en deux étapes, où un dérivé d'huile de palme préalablement concentré en produit d'intérêt (vitamines E ou carotènes) est extrait par un fluide supercritique en mode continu (étape 1 ) puis purifié par méthode chromatographique avec désorption contrôlée par du CO2 supercritique dans le cas des dérivés vitamines E, et par du propane supercritique dans le cas des carotènes.

De manière générale, une séparation sur une colonne de chromatographie, notamment pour l'obtention des composés apolaires ci- dessus, repose sur une suite d'étapes dont une séquence typique est détaillée ci-après : - Etape 1 : équilibrage. La matrice de séparation, appelée aussi phase stationnaire, est équilibrée par un éluant ayant une faible affinité avec la matrice. La nature de l'éluant peut être identique à celle de l'éluant utilisé pendant l'étape d'élution. Cette étape rend les sites d'adsorption de la phase disponibles.

- Etape 2 : injection du produit. Le produit à séparer est injecté dans le milieu. Au cours de l'injection, en fonction du solvant utilisé dans la solution d'injection, le produit peut rester adsorbé sur le support ou bien être entraîné le long de la colonne. De même les impuretés peuvent être entraînées ou non en fonction de leur affinité avec la phase stationnaire.

- Etape 3 (optionnelle) : élution des impuretés à faible affinité avec la phase stationnaire. Dans cette étape, appelée aussi rinçage, certaines impuretés à faible affinité avec la phase stationnaire sont éluées avec un éluant ayant lui aussi une faible affinité avec la phase stationnaire. Cet éluant de rinçage peut être identique à celui utilisé dans l'étape d'équilibrage ou l'étape d'élution du produit.

- Etape 4 : élution du produit. Le produit à séparer est désorbé par un éluant qui peut être identique à celui utilisé en phase d'injection ou en phase d'équilibrage ou bien avoir une plus forte affinité avec la phase stationnaire.

- Etape 5 (optionnelle) : nettoyage ou régénération. Un autre éluant à plus forte affinité avec la phase stationnaire est alors introduit dans la colonne afin d'éliminer les impuretés non éluées par un des solvants des étapes 2, 3 ou 4 car fortement liées à la phase stationnaire.

Une des limites de cette méthode de séparation séquentielle, utilisée à des fins analytiques ou préparatives, apparaît lorsqu'on applique au moins deux cycles de façon consécutive, et que l'on passe de l'étape 4 ou optionnellement 5 à l'étape 1 . En effet lors de cette transition, on utilise un éluant dont l'affinité pour la phase stationnaire est faible, pour déplacer un éluant dont l'affinité avec la phase stationnaire est forte. Des volumes importants d'éluant d'équilibrage sont nécessaires pour déplacer totalement l'éluant de lavage, les temps d'équilibrage de la colonne sont donc longs, et la consommation en solvant est significative.

Un autre inconvénient de cette méthode, lorsqu'elle est appliquée à l'échelle de production, est lié à la difficulté de recycler les solvants utilisés dans la phase mobile. En effet lorsqu'un solvant dans une colonne de chromatographie est déplacé par un autre, c'est un mélange de ces deux solvants qui est en premier lieu retrouvé en sortie de colonne, jusqu'à ce que la totalité des molécules de solvant à remplacer soit totalement désorbée, comme illustré sur la figure 1.

La durée de cette phase de rééquilibrage impacte négativement la productivité, et le volume de cette interface entre solvant de régénération et d'équilibrage impacte le coût de la séparation : soit cette interface est éliminée, soit les solvants de ce mélange de solvants doivent être purifiés par distillation avant d'être utilisés à nouveau car les teneurs résiduelles en solvant de régénération dans le solvant d'élution doivent être très faibles pour ne pas faire évoluer l'élution des différents produits dans les cycles successifs. Ces difficultés de recyclage de solvant sont d'autant plus significatives que l'affinité du produit à séparer pour la phase stationnaire est faible (étape d'élution) et l'affinité des impuretés très adsorbées est forte (étape de régénération). En effet dans ce cas, les différences de force d'élution entre les solvants sont plus significatives, et les teneurs résiduelles en solvant de lavage que l'on peut accepter dans le solvant recyclé pour l'équilibrage, l'injection ou l'élution doivent être d'autant plus faibles afin d'éviter une élution trop rapide du produit peu retenu et aussi afin d'éviter sa co-élution avec des impuretés censées être plus retenues.

En conclusion, cette méthode requiert des volumes importants d'éluant avec une très haute pureté, et une étape de distillation est nécessaire pour séparer les différents éluants avant leur recyclage et ainsi éviter une consommation très importante de solvants.

Il y a donc véritablement un besoin de développer une méthode de séparation chromatographique dans laquelle le déplacement d'un solvant par un autre dans une colonne de chromatographie est facilité, notamment lorsque le solvant à déplacer est de plus grande affinité pour le support que le solvant utilisé pour son déplacement.

Il y a aussi intérêt à développer une méthode permettant d'éviter aux solvants utilisés de se mélanger dans la colonne, afin de faciliter leur recyclage. RESUME DE L'INVENTION

L'invention concerne en premier lieu un procédé de séparation chromatographique, comprenant au moins une étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant, suivie d'une étape de déplacement de l'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé.

Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est à l'état liquide.

Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est à l'état supercritique.

Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est du CO2.

Selon un mode de réalisation, la pression absolue du gaz comprimé utilisé pour l'étape de déplacement est inférieure ou égale à 300 bar, de préférence à 200 bar, de préférence à 150 bar, de préférence à 100 bar, de préférence à 75 bar, de préférence encore à 50 bar.

Selon un mode de réalisation, l'éluant est un composé unique.

Selon un mode de réalisation, l'éluant est un mélange d'au moins deux composés.

Selon un mode de réalisation, l'éluant est un solvant aqueux et/ou organique ou un mélange de solvants aqueux et/ou organiques.

Selon un mode de réalisation, l'éluant est un mélange de solvant(s) aqueux et/ou organique(s) et de gaz comprimé, préférentiellement du CO2 à l'état liquide ou supercritique.

Selon un mode de réalisation, le procédé comprend, après l'étape de déplacement de l'éluant, la collecte d'un mélange de gaz comprimé et de solvant(s) aqueux et/ou organiques en sortie de la phase stationnaire, et la séparation du gaz comprimé et du ou des solvants aqueux et/ou organiques.

Selon un mode de réalisation, le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés de manière discontinue.

Selon un mode de réalisation, le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés de manière continue.

Selon un mode de réalisation, le(s) solvant(s) aqueux et/ou organiques sont recyclés à plus de 50 %, de préférence 60 %, de préférence 70 %, de préférence 80 %, de préférence 90 %, de préférence 95 %, de préférence 99 %, en poids.

Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est recyclé de manière discontinue.

Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est recyclé de manière continue.

Selon un mode de réalisation, le gaz comprimé est recyclé à plus de

50 %, de préférence 60 %, de préférence 70 %, de préférence 80 %, de préférence 90 %, de préférence 95 %, de préférence 99 %, en poids. Selon un mode de réalisation, ladite étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est une étape d'élution de produit(s) d'intérêt.

Selon un mode de réalisation, ladite étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est une étape de régénération de la phase stationnaire.

Selon un mode de réalisation, ledit éluant est un premier éluant, le procédé comprenant, après l'étape de déplacement de l'éluant au moyen d'un gaz comprimé, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire, qui est de préférence différent du premier éluant.

Selon un mode de réalisation, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire est une étape de régénération de la phase stationnaire.

Selon un mode de réalisation, la mise en contact d'un deuxième éluant avec la phase stationnaire est une étape d'équilibrage.

Selon un mode de réalisation, le procédé comprend de manière cyclique :

- une étape d'équilibrage, comprenant la mise en contact d'un éluant d'équilibrage avec la phase stationnaire ;

- une étape d'injection, comprenant la mise en contact d'une composition comprenant un produit à séparer avec la phase stationnaire ;

- une étape optionnelle de rinçage, comprenant la mise en contact d'un éluant de rinçage avec la phase stationnaire ;

- une étape d'élution du produit, comprenant la mise en contact d'un éluant d'élution avec la phase stationnaire et la collecte du produit à séparer ;

- à nouveau l'étape d'équilibrage ;

l'étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé étant effectuée entre l'étape d'élution du produit et l'étape d'équilibrage.

Selon un mode de réalisation, le procédé comprend de manière successive ou cyclique :

- une étape d'équilibrage, comprenant la mise en contact d'un éluant d'équilibrage avec la phase stationnaire ;

- une étape d'injection, comprenant la mise en contact d'une composition comprenant un produit à séparer avec la phase stationnaire ; - une étape optionnelle de rinçage, comprenant la mise en contact d'un éluant de rinçage avec la phase stationnaire ;

- une étape d'élution du produit, comprenant la mise en contact d'un éluant d'élution avec la phase stationnaire et la collecte du produit à séparer ;

- une étape de régénération, comprenant la mise en contact d'un éluant de régénération avec la phase stationnaire ;

- le cas échéant, l'étape d'équilibrage à nouveau ;

le procédé comprenant au moins une étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape d'élution du produit et l'étape de régénération ; et/ou entre l'étape de régénération et l'étape d'équilibrage.

Selon un mode de réalisation, le procédé comprend à la fois une étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape d'élution du produit et l'étape de régénération, et une autre étape de déplacement d'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé entre l'étape de régénération et l'étape d'équilibrage.

Selon un mode de réalisation, les étapes d'équilibrage, d'injection, le cas échéant de rinçage, d'élution, et le cas échéant de régénération, sont mises en œuvre avec des éluants comprenant un gaz comprimé.

Selon un mode de réalisation, les étapes d'équilibrage, d'injection, le cas échéant de rinçage, d'élution, et le cas échéant de régénération, sont mises en œuvre avec des éluants ne comprenant pas de gaz comprimé.

Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase normale.

Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase inverse.

Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase de polarité intermédiaire.

Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire est une phase chirale.

Selon un mode de réalisation, la phase stationnaire comprend au moins un matériau choisi parmi l'alumine activée, le gel de silice, le charbon actif, l'acide silicique, l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, la cellulose, l'amylose, un adsorbant polymérisé, un de leurs dérivés, et/ou les combinaisons de ceux-ci. Selon un mode de réalisation, le procédé est un procédé de séparation chromatographique préparative.

Selon un mode de réalisation, le procédé est un procédé de séparation chromatographique analytique.

Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification d'extraits naturels.

Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de carotènes.

Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de squalènes.

Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de vitamines.

Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification de peptides.

Selon un mode de réalisation, le procédé est pour la purification d'insuline, de préférence d'insuline recombinante ou de dérivé d'insuline.

L'invention a également pour objet une installation pour la mise en œuvre du procédé ci-dessus, comprenant :

- au moins une enceinte contenant une phase stationnaire ;

- une alimentation de l'enceinte en au moins un éluant ; et

- une alimentation de l'enceinte en gaz comprimé.

Selon un mode de réalisation, l'enceinte est une colonne chromatographique.

Selon un mode de réalisation, l'installation comprend en outre une alimentation de l'enceinte en au moins un autre éluant.

Selon un mode de réalisation, l'installation comprend un dispositif de séparation de gaz comprimé et de solvant(s) en sortie de l'enceinte.

La présente invention permet de surmonter les inconvénients de l'état de la technique. Elle fournit plus particulièrement un procédé de séparation chromatographique dans lequel des injections d'éluants successifs sur une même phase stationnaire sont facilitées et/ou accélérées, la consommation d'éluants est minimisée et le recyclage des éluants est facilité.

Cela est accompli grâce à l'utilisation d'un gaz comprimé, tel que du CO2 comprimé, pour déplacer un éluant en contact avec la phase stationnaire, avant l'injection de l'éluant successif.

Ainsi, l'invention évite de collecter en sortie de phase stationnaire des mélange d'éluants de nature différente : on récupère en sortie un mélange de gaz comprimé et d'éluant d'une seule étape. Le recyclage des éluants est alors possible sans distillation intermédiaire, en utilisant par exemple simplement une filtration ou une évaporation flash à pression réduite, par exemple dans des séparateurs cycloniques.

La forte diffusivité du gaz comprimé (tel que le CO2 comprimé) peut améliorer très sensiblement l'étape de régénération de la phase stationnaire, et plus précisément la désorption des impuretés. Cette même propriété de diffusivité est susceptible d'améliorer sensiblement l'étape d'équilibrage de la phase stationnaire, puisque le solvant de régénération à forte affinité pour la phase stationnaire aura déjà été désorbé par le gaz comprimé. Les volumes d'éluants nécessaires à l'équilibrage sont ainsi plus faibles, réduisant ainsi le temps entre deux injections successives (ou temps de cycle), et augmentant ainsi la productivité.

L'invention permet une excellente stabilité des conditions opératoires et ainsi une meilleure reproductibilité des essais.

Ces avantages en termes de réduction de temps opératoires et de baisse de la consommation d'éluants ont une portée très intéressante pour la chromatographie préparative tout comme pour la chromatographie analytique. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

La figure 1 illustre les inconvénients de l'état de la technique, en montrant l'évolution de la concentration en différents solvants en sortie d'une colonne de chromatographie de 50 mm de diamètre interne, remplie d'une phase stationnaire de silice non greffée. Le temps d'élution en minutes figure en abscisse, et la teneur de solvants en % figure en ordonnée. Initialement, la colonne remplie d'hexane (solvant 1 ). A t=10 minutes, on commence l'injection d'acétone à 100 % en poids (solvant 2). A t=15 minutes, on commence l'injection de dichlorométhane à 100 % en poids (solvant 3). A t=25 minutes, on commence l'injection d'hexane à 100 % en poids à nouveau (solvant 1 ).

La figure 2 illustre de manière très schématique une succession d'étapes dans un procédé selon l'invention.

La figure 3 illustre de manière très schématique une succession d'étapes dans un mode de réalisation préféré de l'invention (avec un taux de gaz comprimé dans le flux de sortie de la colonne chromatographique en ordonnée, et une durée en abscisse). DESCRIPTION DE MODES DE REALISATION DE L'INVENTION

L'invention est maintenant décrite plus en détail et de façon non limitative dans la description qui suit.

Dans sa forme la plus générale, l'invention concerne un procédé de séparation chromatographique, dans lequel une étape d'élution d'espèces retenues sur une phase stationnaire au moyen d'un éluant est suivie d'une étape de déplacement de l'éluant en contact avec la phase stationnaire au moyen d'un gaz comprimé.

Par « éluant » on entend un fluide susceptible de désorber des espèces retenues sur une phase stationnaire, qu'il s'agisse d'espèces d'intérêt ou d'impuretés.

Un éluant peut être un solvant pur ou un mélange de solvants. Chaque solvant peut-être notamment aqueux ou organique, ou encore un gaz à l'état liquide ou supercritique ou proche de l'état supercritique.

Des composés organiques utilisables en tant que solvants sont en particulier les alcanes, les alcools, les éthers, les esters, les cétones et les nitriles.

Les alcanes sont de préférence en C1 -C10, de préférence encore en C6-C8. Ils peuvent être linéaires ou ramifiés, et de préférence sont linéaires. L'hexane et l'heptane sont des exemples préférés.

Les alcools sont de préférence de formule R-OH avec R un groupe alkyle en C1 -C6. Ils incluent le méthanol, l'éthanol, le n-propanol, l'i-propanol, le n-butanol, l'i-butanol, le s-butanol et le t-butanol.

Les éthers sont de préférence de formule R-O-R', avec R et R' des groupements alkyles en C1 -C6. Ils incluent le diéthyléther, le diisopropyléther, et le méthyl t-butyléther (MTBE).

Les éthers sont de préférence de formule R-(C=O)O-R', avec R et R' des groupements alkyles en C1 -C6. Ils incluent l'acétate de méthyle et l'acétate d'éthyle.

Les cétones sont de préférence de formule R-(C=O)-R', avec R et R' des groupements alkyles en C1 -C6. Elles incluent l'acétone, la méthyléthylcétone et la méthylisobutylcétone (MIBK).

Les nitriles sont de préférence de formule R-CN, avec R un groupement alkyle en C1 -C6. Ils incluent l'acétonitrile.

Par « gaz comprimé » on entend un fluide qui est à l'état gazeux dans des conditions normales de température et de pression (à savoir 0°C et 1 bar absolu), mais qui est utilisé dans le procédé de l'invention à une pression supérieure à la pression de 1 bar absolu. Selon des modes de réalisation particuliers, le gaz comprimé est utilisé à une pression supérieure ou égale à 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 bar absolu.

Afin de simplifier la mise en œuvre du procédé, il peut être avantageux que la pression du gaz comprimé utilisé pour l'étape de déplacement soit toutefois inférieure ou égale à 300 bar absolu, de préférence 200 bar absolu, de préférence 150 bar absolu, de préférence 100 bar absolu, de préférence 75 bar absolu, et de préférence encore 50 bar absolu.

Le gaz comprimé peut être à l'état gazeux lorsqu'il est utilisé dans le procédé de l'invention pour la mise en œuvre de l'étape de déplacement d'éluant. Toutefois, de préférence, il est à l'état liquide ou supercritique.

A titre d'exemples de gaz comprimés, on peut citer le dioxyde de carbone (CO2), le propane et le protoxyde d'azote. Le CO2 est préféré. Il a notamment l'avantage de présenter un point critique à température quasi- ambiante (31 °C) et à pression modérée (73 bar). Il est par ailleurs d'ores et déjà largement utilisé en tant qu'éluant en chromatographie en phase liquide ou supercritique, pur ou en mélange avec d'autres solvants.

La séparation chromatographique selon l'invention peut être une séparation de chromatographie liquide, auquel cas les éluants utilisés sont des solvants liquides tels que décrits ci-dessus, de préférence aqueux et/ou organiques.

Alternativement, il peut s'agir d'une chromatographie avec liquide expansé par un gaz, auquel cas les éluants utilisés sont des mélanges de solvant ou solvants liquides (de préférence organiques) tels que décrits ci- dessus, et de gaz comprimé, le ou les solvants liquides étant majoritaires en poids.

Alternativement, il peut s'agir d'une chromatographie supercritique, auquel cas les éluants utilisés sont soit un ou des gaz comprimés seuls, soit un ou des mélanges de gaz comprimé et d'un ou plusieurs solvants liquides (de préférence organiques), le gaz comprimé étant majoritaire en poids.

Il est toutefois entendu que le gaz comprimé utilisé lors de l'étape de déplacement de l'éluant est différent de l'éluant lui-même, même lorsque cet éluant est également un gaz comprimé.

Le procédé de l'invention peut notamment comprendre, de manière successive ou de manière cyclique :

- une étape d'équilibrage ;

- une étape d'injection d'une composition contenant au moins un produit devant être séparé (ou purifié) ; - une étape optionnelle de rinçage ;

- une étape d'élution du produit ;

- une étape optionnelle de régénération ;

- à nouveau l'étape d'équilibrage si le procédé est mis en œuvre de manière cyclique.

Un ou plusieurs éluants, tels que définis ci-dessus, sont utilisés à chacune de ces étapes et mis en contact avec la phase stationnaire.

Selon un mode de réalisation, l'éluant d'équilibrage et l'éluant d'élution sont identiques.

Selon un mode de réalisation, l'éluant de rinçage et l'éluant d'élution sont identiques.

Selon un mode de réalisation, l'éluant d'équilibrage et l'éluant de rinçage sont identiques.

L'étape optionnelle de rinçage vise à désorber de la phase stationnaire des espèces ayant une affinité avec la phase stationnaire plus faible que celle du produit à séparer.

L'étape optionnelle de régénération vise à désorber de la phase stationnaire des espèces ayant une affinité avec la phase stationnaire plus forte que celle du produit à séparer.

De préférence, l'éluant de régénération est différent de l'éluant d'élution. Il comporte avantageusement une plus forte affinité avec la phase stationnaire que l'éluant d'élution.

A chaque étape où un éluant est utilisé, on peut utiliser un éluant de composition constante (élution en mode isocratique, la force éluante restant constante au cours du temps).

Alternativement, on peut utiliser un éluant de composition variant au cours du temps, par exemple deux ou trois éluants différents successifs, ou bien un éluant ayant une composition variant continûment (élution en mode gradient, la force éluante augmentant alors généralement au cours du temps). Pour ce faire, il est par exemple possible d'augmenter progressivement la proportion du solvant le plus éluant dans un mélange contenant au moins deux solvants.

Dans le contexte de la succession d'étapes décrite ci-dessus, le procédé de l'invention comporte au moins une étape de déplacement d'éluant par un gaz comprimé.

Cette étape de déplacement peut notamment être effectuée après l'étape d'élution et avant l'étape de régénération (déplacement de l'éluant d'élution). Elle peut également être effectuée après l'étape de régénération et avant l'étape d'équilibrage (déplacement de l'éluant de régénération).

Lorsque le procédé ne comporte pas d'étape de régénération, l'étape de déplacement peut être effectuée après l'étape d'élution et avant l'étape d'équilibrage (déplacement de l'éluant d'élution).

Dans un mode de réalisation préféré, une étape de régénération est présente, et deux étapes de déplacement sont prévues : l'une après l'élution et avant la régénération (déplacement de l'éluant d'élution) ; et l'autre après la régénération et avant l'équilibrage (déplacement de l'éluant de régénération).

Ce mode de réalisation est illustré à la figure 2, qui montre de manière schématique le déplacement d'éluants dans le cas où le gaz comprimé est du CO2 : deux cycles (1 et 2) sont représentés. Chaque cycle comprend successivement : une étape d'équilibrage (Eq.), une étape d'injection de produit (I), une étape d'élution des impuretés peu retenues et du produit (El.), une étape de déplacement d'éluant par le CO2, une étape de régénération, à savoir désorption des impuretés très retenues (R), et enfin une autre étape de déplacement des solvants par le CO2.

Selon un mode de réalisation, l'ensemble des étapes du procédé sont effectuées sensiblement à une même pression. Selon un mode de réalisation alternatif, la pression diffère d'une étape à l'autre. Elle peut notamment être plus élevée dans les étapes de déplacement d'éluant au moyen du gaz comprimé.

A l'issue de chaque étape de déplacement d'éluant, de préférence, au moins 95 % en poids, de préférence encore au moins 99 % en poids, ou au moins 99,5 % en poids, ou au moins 99,9 % en poids, ou au moins 99,95 % en poids, ou au moins 99,99 % en poids de l'éluant initialement en contact avec la phase stationnaire est éliminé.

Au cours de l'étape de déplacement d'éluant, on collecte en sortie de la phase stationnaire un flux de sortie. De préférence, à l'issue de l'étape de déplacement, la teneur d'éluant dans le flux de sortie est inférieure ou égale à 5 % en poids, de préférence encore inférieure ou égale à 1 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,5 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,1 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,05 % en poids, ou inférieure ou égale à 0,01 % en poids.

La phase stationnaire est généralement présente sous forme de lit dans une enceinte, qui en général est sous forme de colonne. La séparation chromatographique selon l'invention peut ainsi être mise en œuvre soit dans un système chromatographique à colonne unique, soit dans un système chromatographique à plusieurs colonnes.

Il peut s'agir d'un système chromatographique à lit statique ou non. Dans un système chromatographique à lit statique, le mélange de composés à séparer percole dans une enceinte ou colonne, généralement cylindrique. La colonne contient un lit de matériau poreux (la phase stationnaire) perméable aux fluides. La vitesse de percolation de chaque composé dans le mélange dépend des propriétés physiques du composé. Les composés les plus retenus sur la phase stationnaire percolent plus lentement que les composés les moins retenus sur la phase stationnaire. Ce principe permet d'effectuer la séparation souhaitée.

Il est possible d'effectuer un tel traitement dans plusieurs colonnes en série ou en parallèle, mais généralement une séparation chromatographique dans un système à lit statique est mise en œuvre avec une colonne unique.

Des exemples de tels systèmes chromatographiques à lit statique sont les systèmes HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) ou CYCLOJET™ (c'est-à-dire système avec recyclage à l'état stationnaire).

Le système CYCLOJET™ est tel que décrit dans le document US 6,063,284, auquel il est fait expressément référence. Il s'agit d'un système de séparation chromatographique discontinue à colonne unique, dans lequel les espèces (i) les plus retenues puis (ii) les moins retenues sont collectées séparément à la sortie de la colonne, une portion non-séparée du chromatogramme étant recyclée par une pompe principale. Le mélange à séparer est périodiquement injecté au moyen d'une boucle d'injection dans la portion recyclée du chromatogramme. La boucle d'injection est de préférence connectée entre la pompe principale et la colonne. Après plusieurs cycles chromatographiques, le procédé atteint un état stationnaire périodique dans lequel la quantité de produits injectés est égale à la quantité de produits collectés séparément à la sortie de la colonne.

Selon un mode de réalisation, la séparation chromatographique dans un système à lit statique mono-colonne avec recyclage à l'état stationnaire est cyclique et comprend les étapes suivantes :

- établissement et maintien d'un profil chromatographique circulant dans la colonne au moyen d'une pompe à éluant ;

- injection dans ledit profil chromatographique circulant d'un échantillon comprenant les au moins deux composés à séparer, de manière discontinue et à chaque cycle, l'injection étant effectuée au moyen d'une boucle d'injection contrôlée dans une position d'injection par une vanne d'injection, afin d'injecter l'échantillon présent dans la boucle dans le profil chromatographique circulant, la vanne d'injection restant en position d'injection du début de l'injection jusqu'au moment où la totalité du profil est élué de la colonne, puis basculement de la vanne d'injection dans une position de charge, pour charger la boucle d'injection lorsque tout le profil est dans la colonne, et

- collecte d'au moins deux fractions enrichies à partir du profil circulant, de manière discontinue et périodique.

Cette séparation peut également comprendre l'étape suivante :

- passage d'éluant dans la colonne en tant que phase mobile, de manière essentiellement continue au cours du cycle, au moyen de la pompe à éluant.

Cette séparation peut également comprendre les étapes suivantes :

- enregistrement des événements se produisant à partir du début de la collecte d'une première fraction jusqu'au début suivant de collecte de première fraction ;

- interruption de la pompe à éluant lors de la collecte d'une troisième fraction, cette interruption se poursuivant jusqu'à la fin du cycle, de sorte que les cycles soient reproductibles temporellement. Selon un mode de réalisation, il n'y a aucune perte de profil circulant lors de l'injection dans le profil circulant maintenu.

Un mode de réalisation détaillé de ce système figure en col.5 1.36- col.10 1.41 du document US 6,063,284 précité.

L'unité de séparation chromatographique peut également être un système chromatographique à lit non-statique. Un système à lit non-statique est un système multi-colonnes, dans lequel les positions relatives du lit de phase stationnaire et des points d'injection et/ou de collecte des flux se déplacent au cours du temps.

Des exemples de tels systèmes chromatographiques à lit non-statique sont les systèmes SMB, iSMB, SSMB, AMB, VARICOL™, MODICON™, POWERFEED™, DCC ou MCSGP.

Un système SMB comprend une pluralité de colonnes individuelles contenant un adsorbant, qui sont connectées en série. Un flux d'éluant traverse les colonnes selon une première direction. Les points d'injection du flux d'alimentation et de l'éluant, ainsi que les points de collecte des composés séparés, sont décalés périodiquement et simultanément au moyen d'un ensemble de vannes. L'effet global est de simuler le fonctionnement d'une colonne unique contenant un lit mobile d'adsorbant solide, l'adsorbant solide se déplaçant dans une direction à contre-courant du flux d'éluant. Ainsi, un système SMB est composé de colonnes qui contiennent des lits stationnaires d'adsorbant solide à travers lesquels passe l'éluant, mais le fonctionnement est tel qu'un lit mobile continu à contre- courant est simulé.

La forme la plus conventionnelle d'un système SMB est le système SMB à quatre zones. D'autres formes possibles sont les systèmes SMB à trois zones et les systèmes SMB à deux zones (tels que décrits dans l'article « Two Section Simulated Moving Bed Process » de Kwangnam Lee, dans Séparation Science and Technology 35(4):519-534, 2000, auquel il est fait expressément référence).

Un système iSMB est tel que décrit dans les documents EP 0342629 et US 5,064,539, auxquels il est fait expressément référence. Un système SSMB découpe les introductions et collectes des flux en sous séquences appliquées de façons périodiques. Dans les systèmes iSMB et SSMB, il y a au moins une étape dans laquelle le système fonctionne en boucle fermée, sans entrée ou sortie de produit.

D'autres variantes des systèmes SMB sont : le système SMB variant dans le temps et le système POWERFEED™, tels que décrits dans le document US 5,102,553 et dans l'article « PowerFeed opération of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval », de Zhang et al. dans Journal of Chromatography A, 1006:87-99, 2003, auxquels il est fait expressément référence; le système MODICON™, tel que décrit dans le document US 7,479,228, auquel il est fait expressément référence ; et le système SMB avec recirculation interne, tel que décrit dans le document US 8,282,831 , auquel il est fait expressément référence.

Un système de chromatographie DCC est tel que décrit dans le document FR 2889077, auquel il est fait expressément référence. Un système DCC est un procédé séquentiel à déplacement périodique des points d'injection de phase mobile et de mélange à séparer, ayant la caractéristique d'être constamment en boucle ouverte. Il utilise deux colonnes ou plus.

Un système AMB présente un fonctionnement similaire à un système

SMB. Toutefois, au lieu de déplacer les points d'injection du flux d'alimentation et de l'éluant, ainsi que des points de collecte, au moyen d'un système de vannes, un ensemble d'unités d'adsorption (colonnes) sont déplacées physiquement par rapport aux points d'alimentation et de collecte. A nouveau, le fonctionnement permet de simuler un lit mobile continu à contre-courant.

Un système de chromatographie VARICOL™ est tel que décrit dans les documents US 6,136,198, US 6,375,839 US 6,413,419 et US 6,712,973, auxquels il est fait expressément référence. Un système VARICOL™ comprend une pluralité de colonnes individuelles contenant un adsorbant qui sont reliées en série. On fait passer un éluant dans les colonnes selon une première direction. Contrairement au système SMB, les points d'injection pour le mélange à séparer et pour l'éluant et les points de collecte des composés séparés dans le système sont déplacés périodiquement mais de manière asynchrone, au moyen d'un ensemble de vannes. L'effet global est de créer des zones de séparation de longueur variable dans le temps, allouant ainsi la phase stationnaire de manière dynamique dans les zones où elle est la plus utile, et permettant une puissance de séparation similaire avec moins d'unités de séparation chromatographique et une productivité accrue. Contrairement à un système SMB, un système VARICOL™ ne simule pas le fonctionnement d'une colonne unique contenant un lit mobile d'adsorbant solide, l'adsorbant solide se déplaçant dans une direction à contre-courant du flux d'éluant, et ainsi le principe de fonctionnement du VARICOL™ ne peut pas être mis en œuvre dans un système AMB équivalent.

L'ensemble des installations connues ci-dessus peuvent être adaptées pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention, en prévoyant des alimentations adéquates pour l'enceinte ou les enceinte(s) contenant le lit de phase stationnaire, à savoir :

- au moins une alimentation en éluant tel que décrit ci-dessus, de préférence plusieurs alimentations en éluants (notamment une alimentation en éluant d'élution et une alimentation en éluant de régénération) ; et

- au moins une alimentation en gaz comprimé, pour la ou les étapes de déplacement d'éluant par le gaz comprimé.

L'installation de l'invention comprend également avantageusement un dispositif de séparation de gaz comprimé et de solvant, en sortie de la ou des enceintes ou colonnes.

Ce dispositif de séparation peut notamment comporter un séparateur cyclonique, un filtre et/ou un évaporateur. Ainsi, le procédé de l'invention comprend avantageusement une collecte d'un mélange de gaz comprimé et d'un ou plusieurs solvants lors de l'étape de déplacement de l'éluant par le gaz comprimé, et la séparation du gaz comprimé d'une part et du ou des solvants d'autre part. Ainsi, le gaz comprimé peut être recyclé (notamment pour la mise en œuvre de la ou les étapes de déplacement). De même le ou les solvants peuvent être recyclés (notamment pour reconstituer un éluant).

La phase stationnaire de l'invention comprend au moins un matériau choisi parmi l'alumine activée, le gel de silice, le charbon actif, l'acide silicique, l'oxyde de magnésium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, la cellulose, l'amylose, un adsorbant polymérisé, un de leurs dérivés, et/ou les combinaisons de ceux-ci.

La séparation chromatographique de l'invention peut être en phase normale, c'est-à-dire reposer sur des interactions polaires entre les espèces à séparer et la phase stationnaire. La phase stationnaire est alors de nature polaire, par exemple une phase de silice, fonctionnalisée ou non.

Alternativement, la séparation chromatographique de l'invention peut être en phase inverse, c'est-à-dire reposer sur des interactions hydrophobes entre les espèces à séparer et la phase stationnaire. La phase stationnaire est alors de nature apolaire, par exemple une phase de silice sur laquelle sont greffées des chaînes hydrocarbonées.

Alternativement, la séparation chromatographique de l'invention peut employer une phase stationnaire de polarité intermédiaire.

Alternativement, la séparation chromatographique de l'invention peut être une séparation chirale. Dans cas, la phase stationnaire comporte des molécules chirales greffées sur un support (par exemple de la silice).

L'invention peut en particulier être mise en œuvre pour la séparation de produits apolaires, de préférence sur une phase stationnaire normale. Dans ce cas, le produit d'intérêt et les impuretés engagent avec la phase stationnaire des interactions non covalentes hydrophiles, notamment des liaisons de type hydrogène.

Le pouvoir éluant de chaque éluant est donc d'autant plus fort que le ou les solvants qui le constituent est ou sont polaires. Le produit d'intérêt, hydrophobe, est faiblement retenu sur la phase stationnaire.

Ainsi, on peut utiliser un alcane, ou mélange d'alcanes, ou un mélange d'alcane(s) et de gaz comprimé, pour l'étape d'élution (et pour l'équilibrage). Pour la régénération, on utilise de préférence un solvant polaire tel que l'acétate d'éthyle, afin de désorber les impuretés fortement liées à la phase stationnaire.

La figure 3 illustre de manière schématique un tel procédé, le graphe représentant l'évolution du taux de gaz comprimé dans le flux de sortie d'une colonne chromatographique (en ordonnée) en fonction du temps.

La phase 1 correspond à l'étape d'élution. Le flux de sortie de la colonne est l'éluant d'élution, par exemple un alcane. Les phases 2 et 3 correspondent au déplacement de l'éluant d'élution par le gaz comprimé. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie augmente en phase 2 jusqu'à atteindre un maximum, puis reste en plateau en phase 3. Les phases 4 et 5 correspondent à l'étape de régénération, dans laquelle un éluant de régénération, par exemple de l'acétate d'éthyle, est injecté. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie diminue en phase 4 jusqu'à zéro, puis il reste à zéro en phase 5. Les phases 6 et 7 correspondent au déplacement de l'éluant de régénération par le gaz comprimé. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie augmente en phase 6 jusqu'à atteindre un maximum, puis reste en plateau en phase 7. Les phases 8 et 9 correspondent à l'étape d'équilibrage, dans laquelle un éluant d'équilibrage, par exemple à nouveau un alcane, est injecté. Le taux de gaz comprimé dans le flux de sortie diminue en phase 8 jusqu'à zéro, puis il reste à zéro en phase 9.

Les produits d'intérêt à séparer ou purifier peuvent être en particulier des extraits naturels, des carotènes, des squalènes, des vitamines, des peptides, de l'insuline (de préférence de l'insuline recombinante) ou un dérivé d'insuline.