Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand, das heißt die Verwendung von radioaktiven Metallocen-Carbonsäuren und deren Derivaten und Verfahren zur radioaktiven Markierung von Proteinen und anderen NH-aktiven Verbindungen. Die Erfindung betrifft weiterhin neue Metallocen-Carbonsäuren und Carbonsäurederivate des Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 oder Ir-191.

Radioaktive markierte Verbindungen finden eine breite Anwendung in vielen Bereichen der Technik. Im Bereich der Medizin werden radioaktiv markierte Substanzen - wie z.B. markierte Proteine - sowohl zu diagnostischen- als auch zu therapeutischen Zwecken eingesetzt. Ein bekanntes Markierungs-Verfahren von Proteinen besteht darin, daß Chelatbildner derart an Proteine oder Oligopeptide gebunden werden, daß sie ihre chelatbildende Eigenschaft möglichst nicht verlieren. Entsprechende Chelatbildner können zum Beispiel Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) sein. Durch Umsetzung mit radioaktiven Ionen wie zum Beispiel radioaktiven Indium- oder Technetiumisotopen erfolgt dann die eigentliche Markierung.

Ein Nachteil bei der Verwendung von Chelatbilnern zur Bindung der radioaktiven Isotope ist, daß die biologische Funktion des Proteins durch den Chelatbildner verändert werden kann. Zusätzlich kann durch "Umchelatisierung" durch körpereigene Komplexbildner ein Teil des primär an das Protein gebundenen Radioisotops wieder verlorengehen. Die dauerhafte Bindung von Radioisotopen ist jedoch die entscheidende Vorraussetzung für Radio-Immunoassays - hier die Bindung an Proteine wie zum Beispiel Immunglobuline - oder eine nukleamedizinische Anwendung.

Auch mit Hilfe Iod-markierter Ester von N-Hydroxysuccinimid sind Proteinmarkierungen durchgeführt worden (A.E.Bolton, W.M. Hunter, Biochem. J., 133. 529, 1973). Radioaktive Iodisotope sind aus verschiedenen Gründen für die nuklearmedizinische Anwendung jedoch schlecht geeignet. Iod-125 hat eine zu geringe Energie und zu lange Halbwertszeit, Iod-131 führt durch seine Partikelstrahlung zu einer hohen Strahlenbelastung und das Iod-123 ist zu teuer, da dessen relativ kurze Halbwertszeit eine umfangreiche Logistik erfordert. Des weiteren kann auch bei der Iodierung die Struktur des Proteins teilweise derart verändert werden, daß die biologischen Funktionen des Proteins nur noch zum Teil erhalten sind.

Aus WO 91/18908 sind ⁹⁹ Tc-Cyclopentydienyl-Carbonyl-Komplexe mit verschiedenen Seitenketten bekannt. Die dort beschriebenen Komplexe zeichnen sich durch eine hohe in vivo Stabilität aus, so daß ein "umchelatisieren" durch körpereigene Komplexbildner nicht beobachtet wird. Auch wird das durch die Seitenkette bestimmte Anreicherungsverhalten durch den Komplexbildner (Cyclopentadienylring) nur unwesentlich beeinflußt. Allerdings geht aus dem in der WO 91/18908 offenbarten Herstellungsverfahren hervor, daß für jeden Tc-Komplex (mit spezifischer - der jeweiligen diagnostischen Fragestellung angepaßten - Seitenkette) zunächst der entsprechende Cyclopentadienyl-Eisen-, -Chrom- oder - Cobalt-Komplex synthetisiert bzw. bereitgestellt werden muß, der dann durch Metallaustauschreaktion in den entsprechenden Tc-Komplex überführt wird. Das heißt, jede individuelle 99mχ _c _verbmdung benötigt eine eigene Vorstufe. Ein weiterer Nachteil des in der WO 91/18908 offenbarten Verfahrens ist es, daß es nicht zur Herstellung von markierten, thermisch instabilen Verbindung geeignet ist.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher ein eine Substanzklasse, die eine radioaktive Markierung beliebiger Aminogruppen-haltiger Moleküle, die ein spezifisches in-vivo Anreicherungsverhalten zeigen, erlaubt, sowie ein Verfahren zur Markierung dieser Moleküle bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Metallocen- Carbonsäuren und deren Derivaten von radioaktiven Metallisotopen der allgemeinen Formel I

R

^{M *}

R 2

⁽ D

worin

R ¹ , R ² , R ³ jeweils für eine CO-Gruppe stehen oder gemeinsam ein Cyclopentadienyl- rest bedeuten, der gegebenenfalls durch R ⁵ ' substituiert ist, R ⁴ für ein Wasserstoffatom, einen C _r C ₁₀ -Alkylrest oder eine Gruppe

-CO-CH ₃ steht, R ⁵ , R ⁵ ' unabhängig voneinander für -CO-(CH ₂ ) _m -COR ⁶ , -(CH ₂ ) _n -COR ⁶ , -CH=CH-(CH ₂ ) _n -COR ⁶ oder -C≡C-(CH ₂ ) _n -COR6 steht, wobei m für die Ziffern 1 bis 6, n für die Ziffern 0 bis 6, R ⁶ für Chlor, eine Gruppe -NH-NH2, einen Rest -R ⁸ , -OR ⁷ oder

-SR ⁷ steht, mit R ⁷ in der Bedeutung von Wasserstoff, einem C ₁ -C ₁₀ -Alkyl-,

R ⁸ in der für R ⁷ angegebenen Bedeutung mit der Außnahme von Wasserstoff und einem Cj-Ci _Q -Alkylrest und M ein radioaktives Metallisotop eines Elements der Ordnungszahlen 21-29,

31, 42-44, 49 oder 57-83 bedeutet, gelöst.

Unter Verwendung der Verbindungen der Formel I (nachfolgend auch als "Marker- Moleküle" bezeichnet) gelingt es, beliebige basische Gruppen tragende Moleküle, insbesondere Biomoleküle - wie Proteine, Proteohormone oder Polypeptide - in stabile, radioaktiv markierten Substanzen zu überführen, die sowohl in der Radioimmun-Diagnostik als auch in der Nuklearmedizin - zum Beispiel zur in vivo Darstellung von Rezeptoren oder Antikörper-bindenden Strukturen, besonders zur Lokalisation von Tumoren - eingesetzt werden können.

Darüberhinaus sind die Metallocen-Carbonsäuren der Formel I auch geeignet, Positronenstrahler in Proteine einzuführen.

Als Reste R ¹ , R ² , R ³ kommen infrage jeweils eine Carbonylgruppe oder ein pentahapto-gebundener - gewünschtenfalls R ^5' substituierter - zweiter Cyclopentadienylring, wobei die Carbonylgruppen bevorzugt sind.

Als Rest R ⁴ kommen infrage eine -CO-CH ₃ - Gruppe, ein gerad- oder verzweigtkettiger Cj-CjQ-Alkylrest wie z.B. ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Buty-1-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Isopentyl-, Neopenty-1-, Hexylrest oder insbesondere ein Wasserstoffatom.

Erfindungsgemäß bevorzugte Reste R ⁵ sind, eine -COOH -, eine -CO-(CH2)2-COOH - Gruppe, insbesondere aber aktivierte Säuregruppen wie z.B. eine -COC1 -, eine -CO-(CH ₂ ) ₂ -CO-R ⁸ -, eine -CO-(CH ₂ ) ₂ -COOR ⁸ -, eine -CO-OR ⁸ - oder eine -CO-R ⁸ -Gruppe mit R ⁸ in der Bedeutung eines Succinimid- oder Phtalimid- Restes.

Die Aktivierung der freien Carbonsäuregruppen kann aber auch nach anderen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, so z.B. durch Säureanhydrid-Bildung, die unter Wasserabspaltung durch Dimerisierung zweier - aus unterschiedlichen Molekülen stammenden (intermolekular) - Carbonsäuregruppen, erfolgt. Für den Fall, daß R ¹ , R ² , R ³ für einen pentahapto-gebundenen zweiten Cyclopentadienylring stehen, der im Substituenten R ^5' ebenfalls eine Carbonsäuregruppe enthält, kann die Anhydrid-Bildung auch intramolekular erfolgen.

Als radioaktive Metallionen M kommen bevorzugt zum Einsatz Mn-52, Tc-99m, Re-186, Re-188, Fe-52, Ru-95, Ru-97, Ru-103, Ir-191, darunter insbesondere Tc-99m, Ru-97 und Re-168.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur radioaktiven Markierung von basische Gruppen enthaltenden Molekülen unter Verwendung von Komplexen der Formel I. Die Markierung erfolgt in der Regel in zwei Stufen. Im ersten Schritt werden zunächst - in Analogie zu dem Fachmann bekannten Methoden (siehe z.B. WO 91/18908, sowie Beispiele 1-4) - in einer Metallaustauschreaktion die entsprechenden Cyclopentadienlkomplexe der Formel II

worin R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ und R ⁵ die angegebenen Bedeutungen haben, M ¹ jedoch für ein nicht-radioaktives Isotop der Elemente Eisen, Cobalt oder Chrom steht, mit Metalloxiden bzw. Metallsalzen der gewünschten Metallionen der Elemente der Ordnungszahlen 21-29, 31, 42-44, 49 oder 57-83 umgesetzt.

Die Reinigung der radioaktiven Verbindung der Formel I erfolgt in der Regel mittels Dünnschichtchromatographie oder HPLC. Die Lokalisation der Verbindungen auf den Platten sowie die Ausbeutebestimmungen erfolgen über Radioaktivitätsmessungen.

In Fällen von längerlebigen Isotopen, wie z.B. Ru-97, kann diese Umsetzung bereits außerhalb der Klinik bei einem entsprechenden Radiopharmaka-Hersteller erfolgen. Im Falle von kurzlebigen Isotopen, wie z.B. Tc-99m, wäre diese Umsetzung unmittelbar vor der Applikation durch den behandelnden Arzt durchzuführen, wobei entsprechende Kits (analog zu den in der WO 91/18908 offenbarten) bereitzuhalten wären.

Die entsprechenden Ausgangsverbindungen der Formel II mit M ¹ in der Bedeutung von Eisen, Cobalt oder Chrom sind zum Teil kommerziell erhältlich oder können wie in M. Tanaka, J. Chromatogr. 292 (1984) 410 oder Gmelin's Handbuch der

Anorganischen Chemie [(Springer Verlag; Achte Auflage) Bände Ferrocen 2-4, 7, und 8 (Teil A)] beschrieben (oder analog zu den dort beschriebenen Verbindungen) leicht hergestellt werden.

Im zweiten Reaktionsschritt schließt sich die eigentliche Markierung des gewünschten Moleküls an. Dabei wird eine beliebig wählbare NH-Gruppen tragendende Substanz wie z.B. ein Protein, ein Proteohormon oder ein Polypeptid mit der (dem) radioaktiven Metallocen Carbonsäure (Derivat) der Formel I, gegebenenfalls unter Zugabe eines Aktivators, umgesetzt. Die Umsetzung erfolgt analog zu den in der Analytica Chimica Acta, 1992, 2 , 145-159 beschrieben Methoden.

Als Aktivatoren zur in situ Aktivierung der Carbonsäuregruppen seien beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DDC), Alkoxyacethylen, Iso-butylchlorcarbonat, Benzotriazol-1-yl-tetramethyl-uronium-tetrafluorat (TBTU) genannt. Weitere Aktivatoren werden von Bodanszky et. al., Principles of peptid synthesis, 1984 beschrieben.

Bei Metallocenen bei denen die Carbonsäuregruppen bereits in aktivierter Form z.B. Succinimidester, Ester, Thioester, Amid oder als Anhydrid vorliegen, kann auf eine die Zugabe eines Aktivators verzichtet werden.

Der zweite Reaktionsschritt erfolgt schnell und in guten radiochemischen Ausbeuten, bereits bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 40 °C und wird in der Regel in wäßrigen Pufferlösungen durchgeführt, so daß die Voraussetzungen für eine routinemäßige Anwendung in der Klinik geschaffen sind.

Die beschriebenen "Marker-Moleküle" der Formel I sowie das zuvor beschriebene Verfahren eignen sich zur radioaktiven Markierung beliebiger NH-aktiver Verbindungen, wie zum Beispiel Proteinen, Immunglobulinen, Antikörpern, insbesondere Antikörpern gegen Tumorgewebe, Fab-Fragmenten,

Proteinbruchstücken, Oligopeptiden wie zum Beispiel Endothelin oder Endothelinteilsequenzen, Aminosäuren, Neurotransmittern, Proteohormonen, biogenen Aminen wie zum Beispiel Serotonin, Histamin, γ-Aminobuttersäure sowie Aminogruppen-haltigen Derivaten von Steroiden und östrogenen Steroiden, Aminozuckern, Ergolin und andere dopaminergen Verbindungen.

Die unter Verwendung der Metallocen-Carbonsäuren und Carbonsäurederivaten der Formel I nach dem genannten Verfahren markierten Verbindungen können direkt in der in vivo Diagnostik und Therapie zur Anwendung kommen, wobei die markierten Verbindungen nach den in der Galenik üblichen Methoden in physiologisch verträglicher Weise formuliert werden. Dies kann z.B. durch Suspendieren oder Lösen der jeweiligen Verbindung in einem physiologisch verträglichen Suspensionsmedium wie Wasser, Elektrolytlösungen u.s.w. erfolgen.

Bei der nuklearmedizinischen in vivo Anwendung werden die markierten

Verbindungen in der Regel in Mengen kleiner als 10 ^**10 mol/kg Körpergewicht dosiert, wobei die genaue Dosis in Abhängigkeit der untersuchten Körperregion aber insbesondere auch der jeweils gewählten Untersuchungsmethode stark variieren kann.

Ausgehend von einem mittleren Körpergewicht von 70 kg beträgt die Radioaktivitätsmenge für diagnostische Anwendungen zwischen 180 und 1100 MBq, vorzugsweise 500 - 800 MBq pro Applikation. Die Applikation erfolgt normalerweise intravenös, intraarteriell, peritoneal oder intratumoral, wobei die intravenöse Applikation bevorzugt ist. Pro Untersuchung werden im allgemeinen 0,1 bis 2 ml des betreffenden Mittels verabreicht.

Die Wahl des jeweiligen Radioisotops richtet sich nach der gewünschten diagnostischen Methode, in der die radioaktiv markierte NH-aktive Verbindungen eingesetzt werden soll.

Für das SPECT- Verfahren finden insbesondere die Radioisotope Tc-99m und Ru-97 Verwendung. Ru-97 hat gegenüber dem kurzlebigen Tc-99m den Vorteil, daß es (aufgrund seiner längeren Halbwertszeit von 2,88 Tagen) bereits als fertiges "Marker- Molekül " - zum Beispiel in Form des Metallocen-Säurechlorids oder bevorzugt als N-Succinimidester - in die Kliniken geliefert werden kann.

Die Isotopen Re-186 oder Re-188 finden insbesondere bei der Markierung von Proteinen für die Strahlentherapie Anwendung.

Mit Fe-52, Mn-52 oder Ru-95 markierte Metallocencarbonsäuren sind zur Einführung von Positronenstrahlern in Proteine geeignet.

Einige der erfmdungsgemäß verwendeten Metallocencarbonsäuren und Carbonsäure- Derivate wurden bislang nicht beschrieben. Die Erfindung betrifft daher auch neue Metallocen-Carbonsäuren und Derivate der allgemeinen Formel I

worin

R ¹ , R ² , R ³ jeweils für eine CO-Gruppe stehen oder gemeinsam ein Cyclopentadienyl- rest bedeuten, der gegebenenfalls durch R ^5' substituiert ist, R ⁴ für ein Wasserstoffatom, einen Cj- C ₁₀ -Alkylrest oder eine Gruppe

-CO-CH3 steht, R ⁵ , R ⁵ ' unabhängig voneinander für -CO-(CH ₂ ) _m -COR ⁶ , -(CH ₂ ) _n -COR ⁶ , -CH = CH-(CH ₂ ) _n -COR ⁶ oder -C≡C-(CH ₂ ) _n -COR ⁶ steht, wobei m für die Ziffern 1 bis 6, n für die Ziffern 0 bis 6, R ⁶ für Chlor, eine Gruppe -NH-NH2, einen Rest -R ⁸ , -OR ⁷ oder

-SR ⁷ steht, mit -R ⁷ und -R ⁸ in der Bedeutung eines Succinimid- oder Phtalimidrestes und M für ein Cr-51, Mn-52, Ru-97, Ru-103, Re-186, Re-188 oder ein Ir-191 steht.

Die Marker-Moleküle der Formel I zeichnen sich insbesondere dadurch aus, daß sie

die biologische Aktivität des markierten Moleküls nicht bzw. nur unwesentlich beeinflussen, eine hohe Stabilität in vivo zeigen und eine "Umchelatisierung" nicht eintritt, universell zur Markierung beliebiger NH-Gruppen enthaltender Verbindungen genutzt werden können und daß sie unter milden Reaktionsbedingungen mit NH-Gruppen enthaltenden Verbindungen reagieren.

Das erfmdungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß der Markierungsschritt unter milden Bedingungen schnell und nahezu quantitativ abläuft. Das Verfahren ist daher zum einen leicht in der Klinik durchführbar, ermöglicht aber zum anderen auch die Markierung von - insbesondere thermisch - wenig belastbaren Molekülen wie z.B. Proteinen. Derartige Moleküle wären nach anderen bekannten Verfahren (siehe z.B. WO 91/18908) nicht radioaktiv markierbar.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung des Erfindungsgegenstandes, ohne ihn auf diese beschränken zu wollen.

"Cyclopentadienylcarbonyl-Technetium- Verbindungen" werden im folgenden als "Cytectrene" bezeichnet. "Cyclopentadienylcarbonyl-Re- Verbindungen" werden als "Cyrhetrene" und "Rutheniumdicyclopentadienyl- Verbindungen" als "Ruthenocene"

bezeichnet. Beispiele 1- 4 beschreiben die Synthese verschiedener erfindungsgemäß verwendeter "Marker-Moleküle", Beispiele 5 - 7 beschreiben die Derivatisierung (Aktivierung) einiger Carbonsäuregruppen enthaltenden "Marker-Moleküle", Beispiele 8 -13 beschreiben die radioaktive Markierung verschiedener NH-aktiver Verbindungen.

Metallaustauschreaktion

Beispiel 1 Tc-99m Cytectrencarbonsäurechlorid

In eine kleine Glasampulle gibt man 3 mg Ferrocen-carbonsäurechlorid 0,5 mg Mn(CO) ₅ Br sowie 20 μCi radioaktives Tc-99m-Pertechnetat, gelöst in 0,5 ml getrocknetem Methylethylketon. Man schmilzt die Ampulle ab und erhitzt 1 h auf

150°C. Danach trennt man das radioaktive Säurechlorid durch

Dünnschichtchromatographie ab. Elutionsmittel ist Methylenchlorid.

Rp ('Cytectrencarbonsäurechlorid') : 0,72 Rp (Ferrocencarbonsäure : 0,64

Radiochemische Ausbeute: 50%

Beispiel 2 Tc-99m-Cytectrencarbonsäure 1 mg Ferrocencarbonsäure und 0,8 mg Mn(CO) ₅ Br werden mit 10-20 MBq Tc-99m- Pertechnetat in 50μl Tetrahydrofuran gemischt, in einer Glasampulle unter vermindertem Druck eingeschmolzen und 1 h auf 170°C erhitzt. Zur Trennung der Cytectrencarbonsäure von der Resten unumgesetzter Ferrocencarbonsäure wird der Ampulleninhalt strichförmig auf eine ICW-Silicon-Rapid-Platte F 254 aufgetragen und in Methylenchlorid/Methanol (90:10) chromatographiert. Die Cytectrencarbonsäure wird mit 2-3 ml Chloroform/Methanol (1:1) eluiert und das Eluat unter Stickstoffatmosphäre zur Trockene eingeengt. Rp (Cytectrencarbonsäure'): 0,30 Rp (Ferrocencarbonsäure'): 0,64 Radiochemische Ausbeute: 91 %

Beispiel 3 Tc-99m-Cytectren-CO-(CH _l ) _τ COOΗ.

2 mg Ferrocenoylpropionsäure und 0,5 mg Mn(CO) ₅ Br werden in eine kleine Ampulle eingewogen. Dazu gibt man 10 μl Pertechnetatlösung (physiologische NaCl-Lösung) mit 50MBq Tc-99m und spült mit 50 μl Tetrahydrofuran nach. Nach Abschmelzen der Ampulle wird 40 min auf 150°C erhitzt. Die Reinigung erfolgt durch Chromatographie in Cyclohexan/Ether/Eisessig (65:35:5). Die Tc-99m- Cytectrenoylpropionsäure wird mit 1 ml Tetrahydrofuran eluiert. RF (Ferrocenoylpropionsäure . 0,23

RF (Tc-99m-Cytectrenoylpropionsäure') : 0,17 Radiochemische Ausbeute: 79%

Beispiel 4 Ru-103-Ruthenocencarbonsäure

In eine Glasampulle werden 2 mg Ferrocencarbonsäure und eine Lösung von 2 MBq

Ru-103-Cl3 in 50 μl Dioxan mit 3% HC1 eingeschmolzen. Der Ampulleninhalt wird 1 h auf 130°C erhitzt und danach auf Kieselgeldünnschichtplatten aufgetragen.

Chromatographie in Methylenchlorid/Methanol (88: 12). Nach der Chromatographie erhält man eine gelbe Bande bei einem Rp = 0,64 und eine nicht gefärbte, UV-aktive Bande bei Rp = 0,56, der die radioaktive Ruthenocencarbonsäure enthält. Dieser radioaktive Peak wird abgeschabt und mit Chloroform/Methanol (1:1) eluiert. Rp (Ferrocencarbonsäure : 0,64 Rp (Ruthenocencarbonsäure'): 0,56 Radiochemische Ausbeute: 65%

Derivatisierung (Aktivierung)

Beispiel 5 Tc-99m-Cytectrencarbonsäure-N-s ccinimidester

Die aus Beispiel 2 erhaltene Cytectrencarbonsäure wird in 200 μl Tetrahydrofuran aufgenommen und bei Raumtemperatur mit 0,25 mg N-Hydroxysuccinimid sowie 0,5 mg Dicyclohexylcarbonsäurediimid 30 min unter Rühren umgesetzt. Die

Reinigung erfolgt durch Dünnschichtchromatographie in Methylenchlorid/Methanol

(98:2).

Rp (N-Succinimidester): 0,57

Radiochemische Ausbeute: 92%

Beispiel 6 Tc-99m-Cytectrenoylpropionsä re-N-succinimidester 200μl Eluat der Tc-99m-Cytectrenoylpropionsäure aus Beispiel 3, 4 mg N-Hydroxysuccinimid und 8 mg Dicyclohexylcarbonsäurediimid werden unter mehrmaligem Schütteln bei Raumtemperatur Stehen gelassen. Nach 2 h wird der N-Succinimidester durch Chromatographie in 79 %iger Ausbeute erhalten. Die Reinigung erfolgt dünnschichtchromatographisch in Methylenchlorid/Methanol (95:5). R-p (N-Succinimidester'): 0,65 Radiochemische Ausbeute: 79%

Beispiel 7 Ru-103-Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester Das in Beispiel 4 erhaltene Eluat der radioaktiven Ruthenocencarbonsäure wird zur Trockene eingeengt, mit 5 mg N-Hydroxysuccinimid und 10 mg N,N-Dicyclohexylcarbodiimid in 300 μl Tetrahydrofuran versetzt. Anschließend wird 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Der Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester wird nach Dünnschichtchromatographie in Methylenchlorid/Methanol (88:12) 95 %iger Ausbeute erhalten. Rp (Ruthenocencarbonsäure ^' ): 0,49 Rp (Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester) : 0,82 Radiochemische Ausbeute: 95%

Markierung

Beispiel 8 Tc-99m-Cytectrenoyl-glycin

Die aus Beispiel 5 erhaltene Lösung des Cytectrencarbonsäure-N-succiriimidesters wird unter Stickstoffatmosphäre auf 10 μl eingeengt und mit 3 μmol Glycin - gelöst in 100 μl Boratpuffer [0,1 molar, pH 8,5] -versetzt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wird das Produkt durch Chromatographie in Ethanol isoliert und anschließend dünnschichtchromatographisch in Chloroform Aceton/ Ameisensäure (75:20:5) gereinigt.

Rp (Tc-99m-Cytectrenoyl-glvcin : 0,30 Radiochemische Ausbeute: 82%

Beispiel 9 Tc-99m-Cytectrenoyl-glycin-ethylester

10,93 MBq Tc-99m-Cytectrencarbonsäure hergestellt nach Beispiel 2 werden in 2 ml

Tetrahydrofuran gelöst. Von dieser Lösung werden 0,2 ml entnommen und mit 2 mg

Benzotriazol-l-yl-tetramethyl-uronium-tetrafluorat und 1 ml Diisopropylethylamin versetzt. Nach 5 min Schütteln bei Raumtemperatur wird diese Lösung zugegeben zu 1 mg Glycin-ethylester x HC1 in 0,1 ml Tetrahydrofuran und 2 μl Diisopropylamin. Das

Reaktionsgemisch wird 30 Minuten gerührt. Die Dünnschichtchromatographie erfolgt in Chloroform / Aceton / Ameisensäure (80:2,5:2,5).

R-p(Ferrocencarbonsäure') : 0,39 R-p(Ferrocenovl-Glvcinethvlester'): 0,58

Rp(Tc-99m-Cytectrenoyl-Glvcinethv1ester'): 0,62

Radiochemische Ausbeute an Tc-99m-Cvtectrenoyl-G1vcinethy1estp.r- 98%

Beispiel 10 Tc-99m-Cytectrenoyl-N-glucosamin

Zu 9 MBq Tc-99m markierter Cytectrencarbonsäure hergestellt nach Beispiel 2 gibt man 0,76 mg (2 μmol) HBTU, 1 μl Diisopropylamin und 100 μl Methylpyrrolidon. Das Reaktionsgemisch wird 30 min. bei Raumtemperatur gerührt und danach auf 20 cm breite DC-Platten aufgetragen. Im Laufmittel Chloroform/Ethanaol (70:30) erhält man bei einem Rp-Wert 0,40 ein Radioaktivitätsmaximum des gewünschten Glucosaminderivates. Nach Abschaben dieses Rp-Bereiches wird die radioaktive Substanz mit Methanol eluiert. Ein re-chromatographieren in Aceton / Ethanol / Ammoniak (75:20:5) zeigt die radiochemische Reinheit dieser Verbindung. Rp(Cytectrenoyl-N-glucosamiri) : 0,40 Radiochemische Ausbeute: 80%

Beispiel .11 Ru-103-Ruthenocenoyl-gfycin-ethylester

Zu 1 MBq des Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidesters aus Beispiel 7 werden nach Abziehen des Lösungsmittels 1 mg Glycinεthylester und 100 μl Boratpuffer (pH 9) gegeben. Nach 1 h erhält man 69% und nach 2 h 91 % des gewünschten Ruthenocenoyl-glycin-ethylesters. Die Aufreinigung erfolgt durch Dünnschichtchromatographie in Chloroform/Aceton/Ameisensäure (80:2,5:2,5). Rp (Ruthenocenoyl-glycin-ethylester) : 0,43 Rp (Ruthenocencarbonsäure-N-hvdoxysuccinimidester') : 0,56 Radiochemische Ausbeute: 91 %

Beispiel 12 Ru-103-Ruthenocenσyl-heptapeptid

In einem kleinen Glas werden 1 mg Endothelinderivat [Heptapeptid; Gly-His-Leu-Asp- Ue-Ile-Trp-COOH] mit 4,8 KBq Ru-103-Ruthenocencarbonsäure-N-succinimidester (hergestellt nach Beispiel 7) in 100 μl Boratpuffer (pH 9) bei Raumtemperatur gerührt. Nach 90 min wird der Ansatz im Laufmittel Chloroform Methanol/ Ammoniak (50:45:10) Chromatographien:. Radiochemische Ausbeute: 62%

Beispiel 13 Tc-99m-Cytectrenoyl-heptapeptid

19 MBq Cytectrencarborisäure-N-succinimidester (hergesellt nach Beispiel 5) in 0,1 ml THF werden mit 1 mg Endothelinderivat [Heptapeptid; Gly-His-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp- COOH] gelöst in 0,2 ml Borat-Puffer (pH 9) versetzt. Nach 180 min Rühren wird der Ansatz im Laufmittel Essigester/MeOH/NH3 (50:40:10) chromatographiert. Rp Cytectrencarbonsäuresuccinimidester: 0,69 Rg (Cytectrenoyl-Heptapeptidl: 0,33 Radiochemische Ausbeute: 53,6%