DE POLYGLUTAMINE

La présente invention concerne le domaine des médicaments destinés au traitement des maladies neurodégénératives par expansion de polyglutamine, plus particulièrement des ataxies spinocérébelleuses dominantes.

Les maladies neurodégénératives humaines représentent un problème majeur de santé publique compte tenu du vieillissement de la population. En effet, un grand nombre de ces maladies voit leur incidence augmenter fortement avec l'âge. Ceci pourrait être lié à la défaillance, avec l'âge, de mécanismes adaptatifs capables de contenir les dysfonctionnements cellulaires à l'origine de ces pathologies.

Parmi les maladies neurodégénératives, les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes (ADCA, dénommées aussi ataxies spinocérébelleuses dominantes) représentent un groupe de plus d'une vingtaine de maladies rares (1 personne sur 10 000 est affectée), caractérisées par des troubles moteurs liés à une dégénérescence du cervelet. Les ataxies spinocérébelleuses dominantes les plus répandues (SCA1 , 2, 3, 6, 7, 17) appartiennent à la classe des maladies par expansion de polyglutamine dont font aussi partie la maladie de Huntington, l'atrophie dentato-rubro-pallido-luysienne (DRPLA) et la maladie de Kennedy (ou amyotrophie spino-bulbaire ; SBMA) (Soong and Paulson, 2007 ; Gatchel and Zoghbi 2005). Ces maladies sont dues à une mutation par expansion du codon CAG (codant pour la glutamine) dans la séquence du gène codant pour la protéine responsable de la maladie (e.g., Huntingtine, Atrophine-1 , Ataxine-1 , 2, 3 ou 7). Au delà d'un certain nombre de répétitions de la glutamine, la protéine devient toxique pour la cellule et l'organisme, selon des mécanismes encore mal compris.

De nombreux modèles animaux ont été développés pour étudier ces pathologies humaines. Parmi ceux-ci, les modèles invertébrés (drosophile et nématode) ont été utilisés pour étudier les maladies par expansion de polyglutamine et les maladies de Parkinson et d'Alzheimer. En effet, ces modèles reproduisent les principales caractéristiques des pathologies humaines et permettent de réaliser des cribles génétiques rapides (Bilen and Bonini, 2005 ; Zoghbi and Botas, 2002 ; Bonini and Fortini, 2003). La conservation fonctionnelle des différentes voies de régulation entre invertébrés et vertébrés, permet d'utiliser les résultats obtenus pour développer des traitements des pathologies humaines. Ainsi, plusieurs composés ayant montré leur efficacité chez la Drosophile sont en cours d'essais cliniques chez l'homme (Shulman et al, 2003).

La plupart des neurones ne se divisant pas dans le cerveau adulte, les marqueurs de cycle cellulaire caractéristiques de la phase de réplication de l'ADN ne sont normalement pas activés. Or, il a été montré dans des modèles de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson, la sclérose amyotrophique latérale, les tauopathies et la maladie d'Alzheimer, qui ne sont pas des maladies par expansion de polyglutamine, que les neurones post-mitotiques ré-expriment de façon anormale de nombreux marqueurs du cycle cellulaire, tels que les ADN polymérases α, δ, β et la primase, et répliquent leur ADN (Herrup et al. , 2004 ; Lee et al. , 2003 ; Ranganathan and Bowser, 2003 ; Ueberham and Arendt, 2005 ; Andorfer et al. , 2005 ; Copani et al, 2002).

Par exemple, Khurana et ses collaborateurs ont montré, dans un modèle Drosophile de tauopathie, que le cycle cellulaire est réactivé dans les neurones post-mitotiques des mouches adultes, et que l'inhibition de certaines protéines du cycle cellulaire est capable de supprimer le phénomène de neurodégénerescence de l'œil observé dans cette pathologie (Khurana et al, 2006 et 2007). En ce qui concerne la maladie d'Alzheimer, Copani et ses collaborateurs ont montré, in vitro, à l'aide d'un modèle de cellules exprimant le peptide amyloide Αβ42, que la toxicité de ce peptide est réduite dans des cellules où l'ADN polymérase bêta est inactivée (Copani et al, 2002, 2006, 2007 et 2008).

En revanche, en ce qui concerne les maladies neurodégénératives par expansion de polyglutamine, notamment des ataxies spinocérébelleuses dominantes, Khurana et al (2006) ont montré à l'aide d'un modèle Drosophile de tauopathie, que l'expression de la protéine MJD-78Q (protéine MJD, appelée aussi ATXN3, possédant une expansion de 78 glutamines) induisait une neurodégénérescence apoptotique, sans que les auteurs aient pu observer la présence de certains marqueurs de réplication et de mitose (PCNA, PH3) ou aient réussi à moduler la pathologie par l'inhibition des protéines impliquées dans le cycle cellulaire dans ce modèle.

Il n'existe actuellement aucun traitement guérissant les maladies par expansion de polyglutamine. Des essais cliniques sont cependant en cours avec, dans certains cas, des molécules ayant montré leur efficacité sur les modèles Drosophile. On peut citer par exemple les inhibiteurs de l'histone désacétylase 8 (HDAC8, qui joue un rôle dans la régulation de l'expression des gènes et la réparation de l'ADN ; Demande Internationale WO 2007/130419) et les inhibiteurs de la protéine Hsp90 (protéine « chaperon » jouant notamment un rôle dans la protection du repliement tridimensionnelle des protéines) comme les dérivés de la geldanamycine. A la connaissance des Inventeurs, aucune donnée concernant une possible influence des désacétylases sur la transcription des gènes liés à la réplication de l'ADN n'a été documentée dans des cellules post-mitotiques telles que les neurones.

Il existe donc un besoin de disposer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de nouvelles compositions pharmaceutiques utilisables pour le traitement des maladies par expansion de polyglutamine.

Les Inventeurs ont établi trois modèles Drosophile d'ataxies spinocérébelleuses dominantes (SCA1, SCA3 et SCA7). Le principe de ces modèles est représenté à la Figure 1 : les formes pathologiques polyglutaminées des protéines ATXN1, ATXN3 et ATXN7T impliquées dans les ADCA humaines sont induites chez la Drosophile adulte (dans l'œil, les neurones ou les cellules gliales) en utilisant le système à deux composants GAL4-UAS (Brand and Perrimon, 1993 ; Latouche et al, 2007). Dans le modèle SCA1, la protéine Ataxine 1 (ATXN1) comprenant une expansion de 82 glutamines (ATXN1-82Q) a été exprimée. Dans le modèle SCA3, la protéine Ataxine 3 (ATXN3) comprenant une expansion de 70 glutamines (ATXN3- 70Q) a été exprimée. Dans le modèle SCA7, la protéine Ataxine 7 tronquée (ATXN7T) comprenant une expansion de 102 glutamines (ATXN7T-102Q ; Latouche et al., 2007) a été exprimée. Pour l'expression neuronale des protéines pathologiques, les Inventeurs ont utilisé une lignée elav-GAL4GS pour laquelle l'activité transcriptionnelle de GAL4 est sous contrôle d'un inducteur, le RU486 (mifépristone), que l'on peut faire ingérer aux mouches adultes (Latouche et al, 2007) ; ceci permet de s'affranchir des effets sur le développement des Drosophiles que pourraient avoir ces protéines ou les différents produits testés lors des cribles, et de suivre précisément chez la mouche adulte le développement de la pathologie. Ces modèles Drosophile ont ensuite été utilisés pour identifier (cribler), par inactivation par ARN interfèrent, des gènes capables de moduler ces pathologies.

Au cours de ces cribles, les Inventeurs ont identifié de manière surprenante le gène DNA-pol-alpha50, orthologue du gène humain priml (codant pour la primase, protéine qui joue un rôle majeur dans la réplication de l'ADN) comme un modulateur majeur de ces 3 ataxies. En effet, les Inventeurs ont montré que la réduction du niveau de la protéine DNApol-alpha50 par ARN interférence permet de supprimer en grande partie les effets toxiques des protéines pathologiques dans les 3 modèles drosophile SCA1, SCA3 et SCA7 étudiés. La protection observée des cellules concerne à la fois les neurones et les cellules gliales. Un sauvetage de la neurodégénération dans l'œil a aussi été observé par les Inventeurs sur un modèle drosophile de maladie de Huntington dans lequel le niveau de la protéine DNApol- alpha50 est réduit par ARN interférence.

D'autres cribles génétiques sur le modèle Drosophile SCA3 ont permis aux Inventeurs d'identifier plusieurs autres acteurs de la réplication de l'ADN susceptibles de moduler la pathologie SCA3 : il s'agit des gènes mcm2, dup/Cdtl, DNApol-alpha73IPOLA2 et timeoutlTimeless nécessaires à la réplication de l'ADN et dont l'inactivation sauve le phénotype pathologique, du gène Huwel, un inhibiteur de réplication de l'ADN, dont le gain de fonction a un effet protecteur dans la pathologie SCA3, ainsi que du gène grp/Chkl, codant pour une kinase majeure de la voie ATR (« Ataxia Telangiectasia and RadS-related ») impliquée dans le contrôle de la réplication de l'ADN, dont le gain de fonction sauve aussi le phénotype pathologique.

Il ressort de ces résultats que plusieurs acteurs (gènes, protéines) jouant un rôle dans la réplication de l'ADN et son contrôle apparaissent comme des cibles thérapeutiques potentielles dans les maladies neurodégénératives par expansion de polyglutamine :

- la primase (DNApolalpha50/PRIMl) (Arezi and Kuchta, 2000 ; Lao-Sirieix et al., 2005 et Muzi-Falconi et al., 2003), qui intervient lors de la phase S du cycle cellulaire qui précède les phases ultérieures du cycle (G2, M, Gl) (Sclafani and Holzen, 2007) ;

- les complexes de réplication de l'ADN comprenant les protéines ORC et MCM, qui se mettent en place au cours de la phase de pré-réplication précédant la réplication de l'ADN proprement dite. L'activation de ces complexes induit la réplication, lors de laquelle la primase synthétise les amorces ARN nécessaires aux ADN polymérases (polalpha et epsilon) pour effectuer la synthèse d'un brin d'ADN complémentaire ;

- les protéines intervenant dans les mécanismes de réparation de l'ADN lorsque la réplication de l'ADN se bloque, telles que les kinases ATM (« ataxia telangiectasia mutated ») et ATR (« ATM and Rad3-related ») (Cimprich and Cortez, 2008), et la protéine TIM (« Timeless ») (Benna et al, 2010) ;

- les protéines contrôlant le déroulement du cycle cellulaire, telles que les kinases cdk et les cyclines (Sclafani and Holzen, 2007) ;

- les ADN polymérases telles que la sous-unité B de l'ADN polymérase alpha (POLA2) (Takahashi et al, 1996).

La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation d'un inhibiteur de la réplication de l'ADN, lequel inhibiteur de la réplication de l'ADN est un inhibiteur d'une protéine choisie parmi les primases, les facteurs d'initiation de la réplication, les hélicases, les ADN polymérases, les ADN ligases, les topoisomérases, les kinases, les antigènes nucléaires de la prolifération nucléaire (PCNA), les facteurs de réplication A et C, de préférence une primase, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine.

On entend par inhibiteur de la réplication de l'ADN, un composé, qui, lorsqu'il est administré à un sujet, inhibe totalement ou d'au moins 20%, et par ordre de préférence croissant d'au moins 50%, 75% et 95%, la réplication de l'ADN dans les tissus, de préférence les cellules neuronales et/ou gliales, dudit sujet comparé à un niveau de réplication de l'ADN mesuré en l'absence de l'administration {le., sans traitement) dudit agent inhibiteur. L'inhibition de la réplication de l'ADN peut être déterminée par des techniques connues de l'Homme du métier, telles que par exemple, in vitro, par l'incorporation de thymidine marquée au ³ H ou de bromodésoxyuridine (BrdU ; un analogue de la thymidine) ou, l'analyse par cytométrie de flux ou, in vivo, par l'analyse de la taille finale d'organes en croissance rapide (Shibutani et al., 2008).

L'inhibiteur de la réplication de l'ADN peut agir en empêchant la fixation d'un ligand (e.g., substrat) sur le site actif de la protéine, ou provoquer une déformation conformationnelle de la protéine qui rend celle-ci inactive.

L'inhibiteur de la réplication de l'ADN peut être un composé chimique ou biologique, d'origine naturelle ou synthétique. Il peut être choisi parmi un anticorps, un acide nucléique (tel qu'un ARN interfèrent, un ARN antisens ou un ribozyme), un peptide, une protéine, de préférence un ARN interfèrent.

L'inhibition de la réplication de l'ADN est bien entendu fonction des doses auxquelles ledit inhibiteur est utilisé. L'inhibiteur de la réplication de l'ADN peut aussi avoir une ou plusieurs autres actions qui ne sont pas l'inhibition de la réplication de l'ADN. Toutefois, l'action inhibitrice de la réplication de l'ADN dudit composé doit être prépondérante à la dose (ou concentration) utilisée par rapport à ses autres actions.

Selon un mode de mise en œuvre préféré de l'invention, ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est un inhibiteur de la réplication de l'ADN des cellules post-mitotiques, telles que les neurones.

Selon un autre mode de mise en œuvre préféré de l'invention, ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN inhibe l'expression d'un gène choisi parmi les gènes priml (codant pour l'ADN primase), mcm2 (codant pour la protéine « minichromosome maintenance complex component 2 »), Cdtl (codant pour la protéine « chromatin licensing and DNA réplication factor 1 »), PLOA2 (codant pour la sous-unité B de l'ADN polymérase alpha), Timeless (codant pour la protéine TIM) et les gènes orthologues de ces gènes, de préférence le gène priml.

Selon un autre mode de mise en œuvre préféré de l'invention, ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN active ou augmente l'expression d'un gène inhibiteur de la réplication de l'ADN choisi parmi les gènes Huwel (codant pour la protéine « HECT, UBA and WWE domain containing 1 », Chkl (codant pour la kinase CHK1) et les gènes orthologues de ces gènes.

L'inhibition de la réplication de l'ADN peut aussi être obtenue avec un agent alkylant (e.g., cyclophosphamide, sels de platine), un agent intercalant (e.g. , anthracyclines) ou un analogue des bases nucléiques (e.g., 5-FU).

On entend par sujet, un mammifère, de préférence un humain.

Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, ladite maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine est choisie parmi la maladie de Huntington, les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes 1, 2, 3, 6, 7 et 17, l'atrophie dentato-rubro-pallido-luysienne et la maladie de Kennedy (ou amyotrophie spino-bulbaire), de préférence les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes et la maladie de Huntington, et de préférence encore les ataxies spinocérébelleuses autosomiques dominantes 1, 3 et 7.

Les modes et voies d'administration de la composition pharmaceutique peuvent être adaptés par l'Homme du métier en fonction du sujet, de la pathologie à traiter et l'inhibiteur de la réplication de l'ADN utilisé. A titre d'exemple, la composition pharmaceutique préparée selon l'invention peut être formulée pour une administration par voie orale ou nasale, ou par injection par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, nasale ou intracraniale.

La détermination de la dose à laquelle ledit inhibiteur de la réplication de l'ADN est utilisé peut s'effectuer par des techniques connues de l'Homme du métier, par exemple lors d'essais cliniques. Cette dose dépendra de divers facteurs comprenant notamment l'activité de l'inhibiteur de la réplication de l'ADN, du mode d'administration, de la durée de l'administration, du taux d'excrétion de l'inhibiteur de la réplication de l'ADN, de la durée du traitement, d'autres médicaments ou composés utilisés en combinaison avec l'inhibiteur de la réplication de l'ADN, de l'âge, du sexe, du poids, de l'état de santé générale et de l'histoire médicale antérieure du sujet qui est traité. A titre d'exemple, cette dose peut être comprise entre 5 mg/kg et 60 mg/kg, de préférence entre 10 mg/kg et 30 mg/kg.

La composition pharmaceutique peut comprendre au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable qui peut être tout excipient connu de l'Homme du métier. Les excipients pharmaceutiquement acceptables varient en fonction de l'inhibiteur de la réplication de l'ADN et du mode d'administration choisis.

On entend par traitement, le traitement curatif, symptomatique ou préventif. Les inhibiteurs de la réplication de l'ADN utilisés conformément à la présente invention peuvent être utilisés chez un sujet atteint d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine déclarée, comprenant les stades précoces et/ou tardifs de la maladie. Ces inhibiteurs de la réplication de l'ADN ne permettent pas nécessairement de guérir le sujet atteint de la maladie, mais peuvent retarder ou ralentir la progression ou prévenir une progression plus en avant de la maladie, améliorant ainsi la condition du sujet. Ces inhibiteurs de la réplication de l'ADN peuvent aussi être administrés à un sujet ne présentant pas de symptôme d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine, mais qui pourrait développer la maladie, ou qui a un risque important de développer la maladie.

La présente invention a également pour objet une méthode de traitement d'une maladie neurodégénérative par expansion de polyglutamine, comprenant l'administration d'une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de la réplication de l'ADN tel que défini ci-dessus, à un sujet ayant besoin de ce traitement. Bien entendu, les spécifications décrites plus haut s'appliquent également à cet aspect de l'invention.

On entend par une quantité efficace, une quantité d'inhibiteur de la réplication de l'ADN pour produire le résultat biologique désiré.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :

- la Figure 1 représente le principe de l'établissement d'un modèle Drosophile exprimant une protéine ATXN pathologique humaine sous le contrôle d'un promoteur inductible (elav). Des Drosophiles portant un transposon contenant la protéine ATXN humaine mutée sous la dépendance de séquences de régulation UAS sont croisées avec des individus portant un transposon contenant la protéine de régulation GAL4GS sous la dépendance d'un promoteur tissus spécifique inductible (ici le promoteur neuronal elav). Dans la descendance, la protéine GAL4GS est produite dans le tissu considéré. Elle ne devient active qu'en présence de RU486 qui est apporté dans la nourriture des animaux. Dans ce cas, GAL4GS se fixe sur les séquences UAS et active la transcription du gène adjacent et la production de la protéine humaine pathologique. Les phénotypes de ces individus peuvent alors être étudiés ;

- la Figure 2 représente le principe d'un crible génétique par inactivation par ARN interfèrent. Des drosophiles exprimant une protéine pathologique (e.g., l'Ataxine 3) dans un tissu spécifique (e.g., les neurones) sont croisées avec des individus portant une répétition en tandem inversée d'une portion de l'ADNc d'un gène modificateur d'intérêt (noté GM). Dans la descendance, en présence de RU486, les drosophiles expriment la protéine pathologique et un ARN double brin correspondant aux séquences de GM. Par phénomène d' ARN interférence, cet ARN double brin (ARNi) spécifique de GM, qui entraine la dégradation de Γ ARN endogène de GM et donc la diminution de la protéine correspondante codée par GM. On peut alors étudier dans ces individus si la diminution de l'expression de GM modifie le phénotype causé par l'expression de la protéine pathologique ;

- la Figure 3 représente la distribution des durées de vie moyennes observées dans le crible des lignées provenant du centre de stockage VDRC correspondant au Tableau II ci-après (barres pleines). La distribution normale correspondant à la même valeur moyenne et au même écart-type est représentée en barres vides. La position des individus de génotype elavGS>ATXN3-70Q/DNApol- alpha50{v43870} est indiquée par une flèche ;

- la Figure 4 : graphiques montrant la survie de Drosophiles exprimant dans les neurones les protéines pathologiques ATXN3-70Q (a), ATXN7T-

102Q (b) ou ATXN1 -82Q (c) est fortement réduite (cercles pleins) comparée à celle des individus contrôles possédant le même génotype mais n'exprimant pas la protéine pathologique (cercles ouverts) ou exprimant une protéine non-pathologique comme la EGFP ou la luciférase (carrés ouverts). La réduction simultanée du niveau de la primase (DNApolalpha50) (triangles pleins) améliore considérablement la survie dans ces trois modèles d'ataxie ; - la Figure 5 : photographies montrant, chez la Drosophile, la neurodégénérescence induite par l'expression dans l'œil de la protéine Atxn3 pathologique tronquée (photo du milieu) comparée au phénotype d'un œil normal (photo de gauche) et au phénotype restauré par la diminution de l'expression de la primase induite par ARN interférant (photo de droite) ;

- la Figure 6 représente une analyse par Western blot de Drosophiles mâles exprimant la protéine pathologique ATXN3-70Q dans les neurones. Cette analyse montre que l'expression de TATXN3-70Q n'est pas modifiée par la présence du transposon DNApol-a50-{v43870}. Génotypes: elav-GAL4GS, UAS-ATXN3- 70Q/UAS-EGFP (piste gauche) ; elav-GAL4GS, UAS-ATXN3-70Q/DNApol-alpha50 {v43870} (piste droite) ;

- la Figure 7 est un graphique montrant que la survie de Drosophiles exprimant dans un sous ensemble de cellules gliales la protéine pathologique ATXN7T-102Q est fortement réduite (cercles pleins) avec une durée de vie ne dépassant pas 16 jours. La réduction simultanée du niveau de la primase (DNApolalpha50) (triangles pleins) améliore la survie dans ce modèle glial d'ataxie ;

- la Figure 8 : photographies montrant, chez la Drosophile, la neurodégénérescence induite par l'expression dans l'œil de la protéine Huntingtine humaine pathologique tronquée (photo A) comparée au phénotype restauré par la diminution de l'expression de la primase induite par ARN interférant (photo B).

EXEMPLES 1 : IDENTIFICATION DES GENES IMPLIQUES DANS LA REPLICATION DE L'ADN SUSCEPTIBLES DE MODULER LES ATAXIES SPINOCEREBELLEUSES DOMINANTES SCA1, SCA3 ET SCA7

1) Matériels et Méthodes

Souches de Drosophile et culture

Trois modèles neuronaux d'ataxies spinocérébelleuses différents (SCA1, SCA3 et SCA7) ont été générés en combinant une lignée pilote (driver) exprimant la protéine GAL4 sous le contrôle du promoteur spécifique des neurones différentiés elavGS (Latouche et al, 2007) et des lignées contenant un transposon (pUAS ; Brand and Perrimon, 1993) comprenant une séquence codant pour une protéine ATXN pathologique (pUAST-ATXN). Les lignées ainsi générées sont notées elavGS>ATXN. Le principe de l'établissement d'un modèle Drosophile exprimant une protéine ATXN pathologique humaine sous le contrôle d'un promoteur inductible est représenté à la Figure 1.

La lignée pUAST-ATXNl-82Q (Fernando-Funez et al, 2000) exprime l'Ataxine 1 contenant 82 répétitions de glutamine.

La lignée pUAST-ATXN3-70Q a été réalisée par transgénèse après clonage dans un vecteur pUAST d'un cDNA codant pour l'Ataxine 3 et contenant 70 répétitions du triplet CAG (Mueller et al, 2009).

La lignée pUAST-ATXN7T-102Q est décrite dans Latouche et al, 2007.

La lignée pUAST-ATXN7T-102Q a été recombinée avec la lignée dEaatl-GAL4 (Rival et al, 2004), exprimant la protéine d'intérêt dans un sous- ensemble de cellules gliales, pour établir un modèle glial d'ataxie spinocérébelleuse. La lignée résultante est notée dEaatl>ATXN7T-102Q.

La lignée pUAST-ATXN3T-78Q (Warrick et al , 1998) a été croisée avec la lignée GMR-GAL4 (numéro d'accession FBrf0091569 dans la base de données FlyBase), exprimant la protéine d'intérêt dans les cellules de l'œil, pour établir un modèle d'œil d'ataxie spinocérébelleuse. La lignée résultante est notée GMR>ATXN3T-78Q.

Les lignées RNAi (exprimant un ARN interfèrent spécifique d'un gène modificateur d'intérêt) utilisées pour les cribles génétiques ont été obtenues auprès du Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC ; Vienne, Autriche). Les autres lignées mutantes utilisées pour les cribles génétiques ont été obtenues auprès du Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC ; Indiana University ; Bloomington, USA). La Figure 2 représente le principe d'un crible génétique par inactivation par ARN interfèrent.

La lignée UAS-GFP-IR a été décrite par Roignant et al, 2003.

Les drosophiles ont été élevées sur un milieu nutritif contenant 8,2% de levure, 3,4% de farine de maïs, 5% de saccharose, 1,1% d'agarose et 2,5% de méthyl benzoate (un antifongique). Afin de permettre l'expression des transgènes par les lignées inductibles elavGS>ATXN, l'inducteur, le RU486 (dilué dans l'éthanol 100%), a été ajouté à 200μg/mL de milieu (le milieu supplémenté en RU486 est dénommé RU200). Le milieu contrôle sans inducteur a été complémenté avec le même volume d'éthanol 100%.

Cribles de longévité

Des drosophiles femelles elavGS>ATXN ont été croisées avec des mâles de lignées portant les mutations ou les transposons à tester ainsi qu'éventuellement avec des lignées témoins (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR et UAS-Luci) dont l'expression ne modifie pas la longévité. Les individus résultants ont été séparés par groupes de 30 dans des tubes contenant un milieu nutritif inductible (RU200) ou contenant un milieu non inductible (RU0). Le crible a eu lieu à température constante (26°C). Sauf spécification contraire, les animaux analysés sont des mâles.

Les individus ont été transférés sur un milieu frais tous les 2 jours et les individus morts ont été comptés. Les courbes de longévité ont été comparées à une courbe témoin par une analyse de Log-Rank (Peto and Peto, 1972). La courbe témoin correspond à la moyenne des longévités des lignées après élimination des extrêmes de la distribution de durée de vie (déciles 3 à 8) lorsqu'un grand nombre de lignées de fond génétique identique sont analysées simultanément (comme pour les tests de lignées RNAi issues du VDRC). Alternativement, les courbes correspondant à la survie des lignées témoins (UAS-EGFP, UAS-GFP-IR et UAS-Luci) mesurées dans les mêmes conditions ont été utilisées.

Analyse du phénotype de l'œil

Des femelles de génotype GMR>ATXN3-78Q et des mâles de génotype DNApol-alpha50{v43870} et UAS-GFP-IR ont été élevés à une température de 23°C et croisées ensemble. L'examen optique de la structure de l'œil a été réalisé sur les mâles obtenus, âgés de 3 jours, avec un stéréomicroscope Leica M205FA.

Western Mot et immunodétection de l'Ataxine 3

L'expression de l'Ataxine 3 dans les drosophiles de génotype elavGS>ATXN3-70Q/UAS-EGFP et elavGS>ATXN3-70Q/DNApol- alpha50{v43870} élevées pendant 4 jours sur milieu inductible a été analysée par Western blot. 10 mouches de chaque condition (induction ou non de l'expression de la protéine pathologique) ont été broyées dans ΙΟΟμί de tampon urée supplémenté en antiprotéases. Après centrifugation pendant 10 mn à 12000 rpm à 4°C, les surnageants ont été dénaturés 5 minutes à 95 °C dans le tampon Laemmli avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide 12%, pour analyse par électrophorèse. Après transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose, celle-ci a été incubée pendant la nuit à 4°C dans du TBS-tween 0,1% et 5% de lait avec l'anticorps primaire (Chemicon- MAB5360) dirigé contre l'Ataxine 3, dilué à 1/2000. L'incubation avec l'anticorps secondaire anti-anticorps de souris couplé à la péroxydase (HRP) a été effectuée pendant lh à température ambiante. La révélation a été réalisée avec un substrat luminescent (Millipore). Le signal a été détecté et quantifié en utilisant une caméra LAS-400 (Fujifilm).

2) Résultats

2.1) Caractérisation des modèles Drosophile d'ataxie spinocérébelleuse de type SCA1, SCA3 et SCA 7.

Des modèles Drosophile d'ataxie spinocérébelleuse de type SCA1, SCA3 et SCA7 ont été générés et caractérisés par diverses études : analyse des phénotypes induits par différente lignées pilotes (« drivers ») GAL4, réduction de longévité provoquée par l'expression de la protéine pathologique dans le cerveau, marquage des cerveaux in toto ou de coupes de cerveaux congelés par cryostat à l'aide d'anticorps dirigés contres des protéines d'intérêt (ubiquitine, sous-unités du protéasome, facteurs de transcription) identifiés chez les mammifère dans les agrégats contenant les protéines pathologiques (Sang and Jackson, 2005), étude cinétique de la formation des agrégats (Latouche et al. 2007), quantification de l'activité locomotrice.

De façon significative, les modèles Drosophile reproduisent les caractéristiques des pathologies humaines, y compris une forte réduction de la durée de vie et un déficit moteur progressif.

L'effet sur la durée de vie des drosophiles obtenues après croisement avec différentes lignées témoins et exprimant l'Ataxine 3 pathologique est donné dans le Tableau I ci-dessous. Une diminution de l'ordre de 35% de la longévité des individus exprimant l'Ataxine 3 pathologique par rapport à des individus de même génotype non induits (avec le RU486), n'exprimant pas l'Ataxine 3 pathologique, a été observée.

Tableau I : Des drosophiles mâles de plusieurs lignées témoins (sauvage (w), UAS-EGFP, UAS-GFP-IR et UAS-Luci) ont été croisées avec des femelles de génotype elavGS>ATXN3-70Q ou elavGS (contrôles). Les descendants de ces croisements dont le génotype est indiqué en colonne 1, ont été placés en condition induite (les mouches sont placées sur milieu contenant 200 de RU486 ; milieu RU200) ou en condition non induite (colonne 2). Les durées de vie moyenne en jours (colonne 4) ont été comparées. On observe une diminution de la durée de vie de l'ordre de 35% lorsque l'Ataxine 3 pathologique est exprimée, avec des différences statistiques hautement significatives entre les courbes de longévité analysées par test du LogRank (colonne 6). Les drosophiles contrôles n'exprimant pas l'Ataxine 3 ne sont pas sensibles au traitement par le RU486. Les effectifs analysés (N) pour chaque condition (expression induite ou non induite) sont représentés à la colonne 3.

Tableau I : Effet sur la durée de vie des drosophiles obtenues après croisement avec différentes lignées témoins et exprimant l'Ataxine 3 pathologique

GFP IR / elavGS>ATXN3-70Q Non Induit 27 44,1

0,62 -3/7E-17

GFP IR / elavGS>ATXN3-70Q Induit 119 27,3

UAS-luci / elavGS>ATXN3-70Q Non Induit 24 48,8

0,46 -2,6E-15

UAS-luci / elavGS>ATXN3-70Q Induit 52 22,4

2.2) Suppression de la toxicité dans des modèles Drosophiles d'ataxies spinocérébelleuses (SCA1, SCA3 etSCA 7) par inactivation de la primase

98 lignées exprimant un ARN interfèrent, provenant du centre de stockage du VDRC, ont été analysées pour leur capacité à modifier la durée de vie de Drosophiles co-exprimant l'Ataxine 1, 3 ou 7 pathologique respectivement et l'ARM. Pour cela des femelles de génotype elavGS UAS-ATXN1-82Q, elavGS UAS- ATXN3-70Q et elavGS UAS- ATXN7T- 102 Q ont respectivement été croisées avec des mâles de différents génotypes et la descendance a été analysée (selon le principe de crible génétique représenté à la Figure 2).

Les résultats concernant le modèle Drosophile SCA3 sont représentés au Tableau II ci-dessous et à la Figure 3 : il a été observé une durée de vie réduite de la plupart des individus exprimant l'Ataxine 3 pathologique (Tableau II), avec une distribution de cette durée de vie proche d'une distribution normale (Figure 3).

Tableau II : Résultats du crible de gènes modificateurs de la toxicité de l'Ataxine 3 sur le modèle Drosophile SCA3 après induction (sur milieu RU200). Les génotypes sont portés en colonne 2, les effectifs (N) en colonne 3 et la durée de vie en colonne 4. La courbe témoin correspond à la moyenne des lignées après élimination des extrêmes de la distribution de durée de vie (déciles 3 à 8). Pour chaque génotype le rapport de la durée de vie moyenne par rapport à celle de la courbe témoin est portée en colonne 5 et la probabilité d'un écart significatif des 2 courbes de survie par une analyse par le test du LogRank est indiquée en colonne 6. Une augmentation de la durée de vie de 44% est observée lorsque la DNApol-alpha50 est inactivée (avant dernière ligne du tableau). Tableau II

Gène Génotype N durée de Ratio Test du vie durée de LogRank moyenne vie après moyenne élimination

/ courbe des déciles témoin 3 à 8

T-cpl T-cpl {v34070}/elavGS>ATXN3-70Q 93 13,5 0,54 -6,4E-73

1(2)05070 1(2)05070 {v35923 }/elavGS>ATXN3-70Q 91 20,0 0,80 -1,4E-21

CG14542 CG14542{v24869}/elavGS>ATXN3-70Q 92 20,8 0,83 -1/7E-13 eIF5 eIF5 {v29070}/elavGS>ATXN3-70Q 104 21,0 0,84 -2.7E-12 ashl ashl {v28982}/elavGS>ATXN3-70Q 99 21,5 0,86 -3.7E-11

Rpn6 pn6 {vl 8022}/elavGS>ATXN3-70Q 96 21,5 0,86 -2,9E-22

CGI 4224 CG14224{v47447}/elavGS>ATXN3-70Q 92 21,7 0,86 -2,5E-09

CG2051 CG2051 {v33459}/elavGS>ATXN3-70Q 83 21,7 0,86 -3,6E-07

Prosbeta3 Prosbeta3 {v31608}/elavGS>ATXN3-70Q 90 21,7 0,87 -2.7E-10

G9a G9a { v25474 }/elavGS> ATXN3 -70Q 100 21 ,8 0,87 -2,2E-09 l(l)G0148 1( 1 )G0148 { v24184 }/elavGS> ATXN3-70Q 74 22,0 0,88 -2.4E-01 not not{v45776}/elavGS>ATXN3-70Q 80 22,0 0,88 -2,3E-06

Ada2b Ada2b {v24076}/elavGS>ATXN3-70Q 90 22,1 0,88 -1.7E-12 en cn{vl 1322}/elavGS>ATXN3-70Q 81 22,1 0,88 -3.2E-10

Hsp70Aa Hsp70Aa{v41748 }/elavGS> ATXN3-70Q 97 22,9 0,91 -5,6E-06

Rtfl Rtfl {v27341 }/elavGS>ATXN3-70Q 90 22,9 0,91 -l,6E-03 alphaTub84B alphaTub84B{v33427}/elavGS>ATXN3-70Q 99 23,0 0,92 -2,7E-03

CG4165 CG4165 {v41976}/elavGS>ATXN3-70Q 93 23,2 0,93 -2,7E-06

CG14712 CG 14712 { v 18347 }/elavGS> ATXN3-70Q 98 23,2 0,93 -3,2E-03

Cas Cas{vl2648}/elavGS>ATXN3-70Q 96 23,3 0,93 -l,9E-03

SmD3 SmD3 {v35934}/elavGS>ATXN3-70Q 85 23,5 0,94 -l,3E-03

CG6905 CG6905 {vl3492}/elavGS>ATXN3-70Q 92 23,5 0,94 -l ,0E-02

Usp36 Usp36{vl 1 152}/elavGS>ATXN3-70Q 91 23,6 0,94 -6,4E-04

Tafl Tafl {v41099}/elavGS>ATXN3-70Q 90 23,6 0,94 -Ι,ΟΕ-03

HDAC4 HDAC4{v20522}/elavGS>ATXN3-70Q 89 23,7 0,95 -2,6E-05 cdk7 cdk7{vl0442}/elavGS>ATXN3-70Q 88 23,8 0,95 -6,8E-01 sop sop {v20963 }/elavGS>ATXN3-70Q 87 23,8 0,95 -1,6E-01

Pplalpha-96A Pp 1 alpha-96 A { v27673 } /elavGS> ATXN3 -70Q 91 23,8 0,95 -1.6E-04

CG4049 CG4049 { v6981 }/elavGS> ATXN3-70Q 80 23,9 0,95 2,2E-02

CG33182 CG33182 {v46444}/elavGS>ATXN3-70Q 100 24,0 0,96 -2,2E-03

Epac Epac{v50373}/elavGS>ATXN3-70Q 81 24,0 0,96 -2.2E-01

PICKl PICKl {v22269}/elavGS>ATXN3-70Q 91 24,1 0,96 -2.5E-01 Mi-2 Mi-2 {vl0766}/elavGS>ATXN3-70Q 90 24,1 0,96 -5,5E-03

SirÛ Sirt2{v21999}/elavGS>ATXN3-70Q 86 24,1 0,96 -9,lE-03 enc enc{vl5291 }/elavGS>ATXN3-70Q 85 24,2 0,97 -6,0E-02

4406-1-1M} UAS-4406- 1 - 1 M}/elavGS>ATXN3-70Q 87 24,3 0,97 9,3E-01

Nurf-38 Nurf-38 {v3200}/elavGS>ATXN3-70Q 60 24,4 0,97 -9,8E-03

Hdac3 Hdac3 {v20814}/elavGS>ATXN3-70Q 90 24,4 0,97 -2,4E-02

4406-2} UAS-4406-2}/elavGS>ATXN3-70Q 86 24,6 0,98 -5,1E-01

CG4751 CG4751 {v45530}/elavGS>ATXN3-70Q 92 24,6 0,98 -2,2E-02

CG5567 CG5567 { v44319 }/elavGS> ATXN3 -70Q 72 24,6 0,98 -6,3E-03

CG15835 CG15835 {v32652}/elavGS>ATXN3-70Q 89 24,7 0,99 -7,7E-01 eRFl eRFl {v45027}/elavGS>ATXN3-70Q 99 24,7 0,99 -4,8E-01

ΒαρΠΟ Bap 170 {v34581 }/elavGS>ATXN3-70Q 88 24,8 0,99 -4,5E-01 gfll Sgfl 1 {vl7166}/elavGS>ATXN3-70Q 93 24,8 0,99 -l,8E-02 rpt4 rpt4 {v49574}/elavGS>ATXN3-70Q 89 24,8 0,99 -3,0E-01

Artl Artl {v40388}/elavGS>ATXN3-70Q 85 24,8 0,99 -6,9E-01

CG32016 CG32016 {v34755 }/elavGS>ATXN3-70Q 87 24,9 0,99 -5,5E-01 mbfl mbfl {vl2752}/elavGS>ATXN3-70Q 90 24,9 1,00 6,2E-01 ben ben {v9413 }/elavGS>ATXN3-70Q 92 25,0 1,00 4,9E-07

Su(z)12 Su(z) 12 {v42423 } /elavGS> ATXN3-70Q 86 25,1 1,00 -4,6E-01

Hsc70-4 Hsc70-4 {v26465 }/elavGS>ATXN3-70Q 89 25,1 1,00 -4.6E-01 pr-set7 pr-set7{v34589}/elavGS>ATXN3-70Q 96 25,2 1 ,00 -9,6E-02

CG8417 CG8417 {v49509}/elavGS>ATXN3-70Q 94 25,2 1,00 3,3E-01

Taf5 Taf5 {v45957}/elavGS>ATXN3-70Q 87 25,2 1,00 -2,1E-01

CG40351 CG40351 {v45267}/elavGS>ATXN3-70Q 86 25,2 1,01 -1,2E-01

YL-1 YL-1 {v21903}/elavGS>ATXN3-70Q 92 25,2 1,01 6,2E-01

Psc Psc{v30586}/elavGS>ATXN3-70Q 83 25,3 1,01 -1,5E-01

Snrl Snrl {vl2644}/elavGS>ATXN3-70Q 83 25,3 1,01 -4,8E-01

Set2 Set2 {v30707}/elavGS>ATXN3-70Q 90 25,4 1,01 -4,6E-01

Usp7 Usp7 {vl 8231 }/elavGS> ATXN3-70Q 95 25,4 1,01 5,0E-02 brm brm{v37721 }/elavGS>ATXN3-70Q 94 25,4 1,01 2,1E-01 osa osa{v7810}/elavGS>ATXN3-70Q 87 25,4 1,01 -4,7E-01

RpL7A RpL7 A { v43760 }/elavGS> ATXN3 -70Q 80 25,5 1,02 4,5E-01

Sn(var)3-9 Su(var)3-9{v39378}/elavGS>ATXN3-70Q 93 25,5 1 ,02 5,2E-01

Bap55 Bap55 {v24704}/elavGS>ATXN3-70Q 84 25,6 1 ,02 -4,0E-01

Atacl Atacl {v36092}/elavGS>ATXN3-70Q 25 25,6 1 ,02 1 ,5E-01 deltaCOP deltaCOP { v41549 }/elavGS> ATXN3 -70Q 83 25,6 1 ,02 l ,9E-02

Art4 Art4{vl 5645}/elavGS>ATXN3-70Q 85 25,6 1,02 -2,8E-01 esc esc{v5690}/elavGS>ATXN3-70Q 89 25,6 1,02 8,8E-01

Sce Sce{v27465}/elavGS>ATXN3-70Q 57 25,6 1 ,02 7,2E-01

Rpd3 Rpd3 {v30599}/elavGS>ATXN3-70Q 82 25,7 1 ,03 9,3E-01 Cafl Cafl {v26456}/elavGS>ATXN3-70Q 87 25,8 1,03 2,6E-02

Hcf Hcf{v46998}/elavGS>ATXN3-70Q 87 25,8 1,03 1 ,4E-01

RpS27A RpS27A{v34325}/elavGS>ATXN3-70Q 95 25,8 1,03 2,7E-02

Sirt4 Sirt4 {v40295 }/elavGS>ATXN3-70Q 88 25,9 1,03 5,6E-02

Tip60 Tip60 {v22233 }/elavGS>ATXN3-70Q 90 25,9 1,03 l ,0E-02

CG8184 CG8184 {v26935 }/elavGS>ATXN3-70Q 58 25,9 1,03 8,0E-01

Vha55 Vha55 {v46553}/elavGS>ATXN3-70Q 88 26,0 1,04 1,0E-01 b r bur{v24153 }/elavGS>ATXN3-70Q 86 26,1 1,04 2,lE-02 trx trx {v37715 }/elavGS>ATXN3-70Q 88 26,1 1,04 3,3E-01

CG1249 CG1249 {v31947}/elavGS>ATXN3-70Q 98 26,2 1,05 8,3E-02

Iswi Iswi {v6208 }/elavGS> ATXN3-70Q 90 26,3 1,05 6.0E-04

CG15817 CG15817 {v41605}/elavGS>ATXN3-70Q 88 26,5 1,06 5,9E-02 bail bail {v48980}/elavGS>ATXN3-70Q 43 26,6 1,06 3,8E-01

Rpb4 Rpb4{v23308}/elavGS>ATXN3-70Q 86 26,6 1,06 l,7E-03

E(z) E(z) {v27645 }/elavGS>ATXN3-70Q 85 26,6 1,06 6,3E-03 atms atms {v20876}/elavGS>ATXN3-70Q 91 26,8 1,07 7,9E-03

Parg Parg{v23962}/elavGS>ATXN3-70Q 89 26,8 1,07 7,0E-02

Pros45 Pros45 {v24937}/elavGS>ATXN3-70Q 83 26,8 1,07 1,1E-01

Sir2 Sir2 {v23201 }/elavGS>ATXN3-70Q 32 27,0 1,08 l,2E-02

TER94 TER94 {v24354}/elavGS>ATXN3-70Q 93 27,0 1,08 6,2E-02

CG4706 CG4706 {v34888}/elavGS>ATXN3-70Q 92 27,0 1,08 l,2E-02

Mes-4 Mes-4 {vl0836}/elavGS>ATXN3-70Q 87 27,0 1,08 2,7E-03

Brel Brel {vl5620}/elavGS>ATXN3-70Q 90 27,0 1,08 3,6E-03 wda wda { v34847 }/elavGS> ATXN3 -70Q 78 27,2 1,09 l,5E-02

CG14619 CG14619 {v37929}/elavGS>ATXN3-70Q 85 27,3 1,09 7,5E-03

Hsc70-5 Hsc70-5 {v47745 }/elavGS>ATXN3-70Q 103 27,5 1 ,10 8,2E-03 trr trr{vl 0749}/elavGS>ATXN3-70Q 84 27,7 1,11 Ι,ΙΕ-05

Luci UAS-Luci/elavGS>ATXN3-70Q 82 27,9 1,11 1.4E-03

GFP UAS-GFP/elavGS>ATXN3-70Q 143 28,0 1,12 3,5E-10

Pcaf Pcaf{v21787}/elavGS>ATXN3-70Q 89 28,1 1,12 5,lE-06

UbcD6 UbcD6{v23229}/elavGS>ATXN3-70Q 81 28,6 1,14 2,4E-06

Cdk9 Cdk9{v30449}/elavGS>ATXN3-70Q 62 29,3 1,17 3,1E-12

Acfl Acfl {v33447}/elavGS>ATXN3-70Q 13 29,5 1,18 3,3E-02

CG17293 CG17293 {v25248}/elavGS>ATXN3-70Q 86 29,8 1,19 7.3E-13

CG7597 CG7597{v25508}/elavGS>ATXN3-70Q 86 30,3 1 ,21 5,5E-15

DNApol- DN Apol-alpha50 { v43870 } /elavGS> ATXN3 -70Q 82 36,0 1 ,44 l,2E-30 alpha50

tous les mâles mâles/elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 300 25,1 1 ,00 l ,0E+00 La durée de vie des individus elavGS>ATXN3-70Q/DNApol- alpha50{v43870}, dans lesquels le niveau d'expression du gène DNApol-alpha50 est réduit in vivo par ARN interférence (ARNi), s'écarte significativement de la distribution normale des durées de vie (Figure 3).

Ainsi, l'inactivation de ce gène (DNApol-alpha50) chez des mouches exprimant dans les neurones l'Ataxine 3 pathologique est capable de restaurer une durée de vie similaire à celle de Drosophiles sauvages avec 44% d'augmentation de la durée de vie moyenne (Figure 4a).

De même, un phénomène semblable de restauration de la durée de vie a pu être observé pour l'ataxie SCA7, avec 28% d'augmentation de la durée de vie moyenne (Figure 4b) et pour l'ataxie SCA1, avec 60% d'augmentation de la durée de vie moyenne (Figure 4c).

Le Tableau III ci-dessous présente les résultats obtenus dans les différentes expériences menées sur les 3 modèles Drosophile d'ataxies (SCA1, SCA3 et SCA7) exprimant un ARNi spécifique du gène DNApol-alpha50. En ce qui concerne le modèle Drosophile SCA3, la protéine ATXN3-70Q a été exprimée soit dans les cellules neuronales soit dans les cellules gliales. Les notations sont les mêmes que celles du Tableau II. Les génotypes utilisés pour les différentes expériences pour les calculs des rapports de durée de vie moyenne et l'analyse des courbes de survie sont indiqués en caractères gras.

Tableau III : Résultats du crible de gènes modificateurs de la toxicité des Ataxines 1, 3 et7 sur les modèles Drosophile SCA1, SCA3 et SCA7 respectivement

Génotype Condition N Durée de Ratio durée Test du vie de vie LogRank moyenne moyenne

DNApol- alpha50

induit /

contrôle

Modèle neuronal SCA3

DNApol-alpha50 {v43870}/ elavGS>ATXN3-70Q Induit 82 36,0 1,44 l ,2E-30 ail maies/ elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 Induit 300 25,1 1,00 l,0E+00

DNApol-alpha50{v43870} / elavGS>ATXN3-70Q Induit 1 19 46,7 1,38 7,l E-44

UAS-EGFP{AH2} /elavGS>ATXN3-70Q Induit 182 33,8 1,00 l,0E+00

DNApol-alpha50{v43870}/ elavGS>ATXN3-70Q Induit 92 31,7 1,33 8.7E-17

UAS-GFP-IR maie/ elavGS>ATXN3-70Q Induit 90 23,8 1,00 l,0E+00

DNApol-alpha50 {v43870}/ elavGS Induit 1 18 38,6 1 ,02 -5.9E-01

DNApol-aIpha50{v43870}/ elavGS Non 30 37,9 1,00 l,0E+00 Induit

Modèle neuronal SCA7

DN Apol-alpha50 { v43870 } /elavGS>SC A7- 102Q Induit 195 32,7 1,28 9,7E-32

UAS-Luci /elavGS>SCA7-102Q Induit 184 25,5 1,00 l,0E+00

Modèle neuronal SCAl

DNApol-alpha50{v43870}/ elavGS>UAS-SCAl-82Q Induit 277 44,9 1,60 3,4E-72

UAS-Luci elavGS>UAS-SCAl-82Q Induit 267 28,0 1,00 l,0E+O0

Modèle glial SCA7

DNApol-alpha50 {v43870} /dEaatl >SCA7- 102Q Non Induit 171 20,0 1,25 5,5E-44

Non

UAS-Luci /dEaatl>SCA7-102Q 103 16,0 1,00 l,0E+00

Induit

DNApol-alpha50 { v43870 } /dEaat 1 >SC A7- 102Q Non Induit 125 12,5 1,22 l,3E-37 dup{V23131 } /dEaatl>SCA7-102Q Non Induit 152 12,0 1 ,17 4,0E-26

GFP-IR /dEaatl>SCA7-102Q Non Induit 235 9,2 0,89 -3,1E-21

Non

UAS-Luci /dEaatl>SCA7-102Q 216 10,3 1,00 l,0E+00

Induit

L'amélioration de la survie s'accompagne aussi d'une augmentation des performances locomotrices des mouches SCA3 qui sont similaires à la lignée sauvage (non quantifié).

La souche GMR-GAL4 a été utilisée pour exprimer une protéine pathologique tronquée ATXN3T-78Q dans l'œil. Dans ces conditions il a été observé une forte dégénérescence de l'œil (Figure 5). Ce phénotype est supprimé dans les mouches GMR-GAL4, UAS-ATXN3T-78Q/UAS-DNApol-alpha50{v43870} où la DNApol-alpha50 est inactivée par ARN interférence (Figure 5).

Enfin, les résultats montrent que la protection apportée par l'inhibition de la primase (DNApol-alpha50) s'applique aussi lorsque la protéine pathologique ATXN7T-102Q est exprimée dans une sous population de cellules gliales (celles dans lesquelles le transporteur du glutamate dEaatl est exprimé). On observe dans ces conditions une augmentation de la durée de vie d'environ 25% (Tableau III et Figure 7). Ces résultats démontrent donc une protection des cellules gliales par inhibition de la réplication de Γ ADN.

2.3) Crible génétique de nouveaux gènes modificateurs liés à la réplication dans le modèle Drosophile d'ataxie spinocérébelleuse SCA3

Les résultats précédents montrent que la réduction du niveau de la DNApol-alpha50 par ARN interfèrent spécifique de DNApol-alpha50 permet de supprimer tous les effets toxiques de 3 ataxies spinocérébelleuses par expansion de polyglutamine, SCAl, SCA3 et SCA7 dans un modèle Drosophile. La protection observée concerne à la fois les neurones et les cellules gliales qui sont tous deux des acteurs critiques des processus dégénératifs.

La DNApol-alpha50 est très fortement conservée chez l'homme (orthologue de PRIM1) et joue un rôle majeur dans la réplication de l'ADN.

Les données obtenues ci-dessus suggèrent que, dans les pathologies neurodégénératives à amplification de polyglutamine, une réactivation de la réplication dans les neurones post-mitotiques est un facteur majeur de toxicité conduisant aux phénotypes délétères associés.

Il a donc été cherché si d'autres modifications génétiques affectant des gènes liées à la réplication de l'ADN ou à des voies de contrôle de la réplication de l'ADN peuvent supprimer la toxicité de la protéine ATXN3 pathologique. Pour cela des femelles de génotype elavGS>ATXN3-70Q ont été croisées avec des mâles de différents génotypes et la durée de vie moyenne de la descendance analysée. Les gènes étudiés sont indiqués dans le Tableau IV ci-dessous et les résultats sont représentés dans le Tableau V ci-dessous.

Tableau IV : Gènes analysés

Gène Gène orthologue Rôle

(humain ou levure)

cdc6 Cdc6 Origine de pré-réplication (pre-RC)

DDB1 ddbl Origine de pré-réplication (pre-RC) dup Cdtl Origine de pré-réplication (pre-RC)

Huwel Huwel Origine de pré-réplication (pre-RC) mcm2 MCM2 Origine de pré-réplication (pre-RC) orcl Orcl Origine de pré-réplication (pre-RC) orc2 Orc2 Origine de pré-réplication (pre-RC) cdc45L Cdc45 Formation de la fourche de réplication l(l)G0148 Cdc7 Formation de la fourche de réplication

DNApol-alpha50 priml Etape de Réplication 1

DNApol-delta POLD1 Etape de Réplication 2

DNApol-epsilon POLE Etape de Réplication 2

cdk4 cdk4 Cycle cellulaire

cycA cycA Cycle cellulaire

cycB cycB Cycle cellulaire

cycE cycE Cycle cellulaire

E2f E2fl Cycle cellulaire

E2f2 E2J2 Cycle cellulaire

polo PLK1 Cycle cellulaire

string cdc25 Cycle cellulaire tefu ATM Voie de signalisation ATM lok CHK2 Voie de signalisation ATM nbs NBS1 Voie de signalisation-recrutement ATM rad50 RAD50 Voie de signalisation-recrutement ATM cdc2c cdk2 Voie de signalisation ATR

CG32251 claspin Voie de signalisation ATR

grp CHK1 Voie de signalisation ATR p53 p53 Voie de signalisation ATR p53 p53 Voie de signalisation ATR p53 p53 Voie de signalisation ATR stg CDC25 Voie de signalisation ATR muslOl TOPBP1 Voie de signalisation-activation ATR mei-41 ATR Voie de signalisation-activation ATR mus 304 ATRIP Voie de signalisation-activation ATR

DNApol-alpha 73 POLA2 Etape de Réplication 1

timeout Timeless (TIM) Cycle cellulaire

Tableau V : Résultats du crible de gènes modificateurs à l'aide du modèle Drosophile SCA3 (après induction de l'expression de la protéine ATXN3-70Q en milieu RU200). Les notations sont les mêmes que pour le Tableau II ci-dessus. Les génotypes de références utilisés pour les différentes expériences pour les calculs des rapports de durée de vie moyenne et l'analyse des courbes de survie sont indiqués par un astérisque. Certaines expériences (représentées en caractères gras) ont été réalisées sur des mouches femelles pour des raisons de localisation chromosomique des insertions.

Tableau V

Génotype N Durée de Ratio durée Test du vie de vie LogRank moyenne moyenne /

courbe

témoin

*GFP IR femelles/elavGS>ATXN3-70Q 118 29,3 1,00 l,0E+00 muslOl [Dl]/elavGS>ATXN3-70Q 117 26,5 0,90 -2,8E-08 mei-41 [e02381]/elavGS>ATXN3-70Q 122 28,0 0,95 -l,5E-08

*GFP IR mâles/elavGS>ATXN3-70Q 119 27,3 1,00 Ι,ΟΕ+00

1( 1 )G0148 [EY07177]/elavGS>ATXN3-70Q 117 24,2 0,89 -2.5E-16 rad50[EPl]/elavGS>ATXN3-70Q 120 24,4 0,89 -3,8E-04

E2f2[KG07098]/elavGS>ATXN3-70Q 116 24,4 0,89 -l,6E-09

E2f[EY14408]/elavGS>ATXN3-70Q 115 24,5 0,90 -3,lE-04 Rpd3[04556] ry[506]/elavGS>ATXN3-70Q 120 24,5 0,90 -l,5E-03 polo[DG 12705]/elavGS>ATXN3-70Q 116 24,6 0,90 -l,9E-06

CG32251 [EY11302]/elavGS>ATXN3-70Q 119 24,7 0,91 -5,4E-09 nbs[EY 15506]/elavGS>ATXN3-70Q 114 25,1 0,92 -l,8E-08

E2f2[EY02995]/elavGS>ATXN3-70Q 120 26,1 0,95 -2,3E-05 p53 [5 A- 1 -4]/elavGS>ATXN3-70Q 118 26,3 0,96 -l,3E-04 stg[EY12388]/elavGS>ATXN3-70Q 119 26,6 0,98 -l,6E-02 cdc2c[2]/elavGS>ATXN3-70Q 116 29,8 1,09 2,6E-06 grp[EY09600]/elavGS>ATXN3-70Q 121 30,0 1,10 l,3E-05 mus304[D 1 ]/elavGS>ATXN3-70Q 120 32,4 1,18 6,2E-14 grp[EY00450]/elavGS>ATXN3-70Q 121 32,9 1,20 1,4E-16 mâles/elavGS>ATXN3-70Q 300 26,8 0,98 -6,2E-01

*GFP IR femelles/elavGS>ATXN3-70Q 93 26,4 1,00 l,0E+00

DNApol-delta{V41028} femelles/eIavGS>ATXN3-70Q 15 21,2 0,80 -7,0E-09 mus304{V46012} femeUes/elavGS>ATXN3-70Q 132 15,7 0,59 -l,9E-27

*GFP IR mâles/elavGS>ATXN3-70Q 119 24,7 1,00 l,0E+00 cdk4 {V40576}/elavGS>ATXN3-70Q 120 19,5 0,79 -2,9E-20 mei 41 {VI 1251 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 20,6 0,83 -4,8E-12 muslOl {V31431 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 21,6 0,88 -9,4E-07 cycA{V32421 }/elavGS>ATXN3-70Q 122 22,0 0,89 -2,6E-12

1( 1 )GO 148 { V40715 } /elavGS>ATXN3-70Q 118 22,0 0,89 -8,lE-07 grp{V12680}/elavGS>ATXN3-70Q 123 22,3 0,91 -8,0E-05 tefii{V22502}/elavGS>ATXN3-70Q 90 22,6 0,92 -l,0E-04 cdc6{V46927}/elavGS>ATXN3-70Q 31 23,4 0,95 -2,1E-01 orcl {V46522}/elavGS>ATXN3-70Q 118 24,4 0,99 3,9E-02 p53 {V45138}/elavGS>ATXN3-70Q 115 24,4 0,99 3,0E-01 cdc45L {V41084}/elavGS>ATXN3-70Q 117 24,8 1,00 4JE-04 lok{V44980}/elavGS>ATXN3-70Q 122 24,8 1,01 6,9E-01 orc2 { V47603 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 25,5 1,04 4,lE-03 p53 {V10692}/elavGS>ATXN3-70Q 117 25,6 1,04 6,3E-06 cycB {V43772}/elavGS>ATXN3-70Q 122 25,7 1,04 4,lE-03 cycE{V52662}/elavGS>ATXN3-70Q 123 25,8 1,05 7,6E-05

DNA pol epsilon{V13647}/elavGS>ATXN3-70Q 116 25,8 1,05 l,8E-04 l(l)G0148 {V24186}/elavGS>ATXN3-70Q 118 27,1 1,10 1,8E-12 mcm2{V10967}/elavGS>ATXN3-70Q 30 27,3 1,11 7,5E-07 dup { V23131 } /elavGS>ATXN3-70Q 117 27,7 1,12 2,3E-19 * mâles/elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 300 24,4 0,99 2,3E-01

*UAS-GFP-IR femelIe/elavGS>ATXN3-70Q 110 22,8 1,00 l,0E+00

1(1)G0148[EY07177] femelles NV/elavGS>ATXN3-70Q 25 22,1 0,97 -l,7E-04 mei-41 [e02381] femelles/elavGS>ATXN3-70Q 13 22,4 0,98 -1,6E-01

UAS-luci femelle/elavGS>ATXN3-70Q 20 23,3 1,02 -6,5E-02

1(1)G0148[EY07177] femelles/elavGS>ATXN3-70Q 98 24,4 1,07 -5,8E-02

Huwel {EY01689} femelles/elavGS>ATXN3-70Q 31 36,3 1,59 2,6E-20

*UAS-GFP-IR mâle/elavGS>ATXN3-70Q 90 23,8 1,00 l,0E+00 cdc6 {v46927}/elavGS>ATXN3-70Q 29 15,7 0,66 -8,6E-13

UAS-S6K/elavGS>ATXN3-70Q 31 16,1 0,68 -1JE-13 cdk4 {v40576}/elavGS>ATXN3-70Q 80 17,6 0,74 -2,0E-08 cdc2c[2]/elavGS>ATXN3-70Q 58 21,1 0,89 2,1E-01 mei-41 {vl 1251 }/elavGS>ATXN3-70Q 119 21,9 0,92 -4,3E-02

E2F2 {KG07098}/elavGS>ATXN3-70Q 60 22,1 0,93 -5,6E-01

CG32251 [EY11302]/elavGS>ATXN3-70Q 111 22,3 0,94 -5,6E-02

UAS-luci mâle/elavGS>ATXN3-70Q 52 22,4 0,94 8,9E-02 muslOl {v31431 }/elavGS>ATXN3-70Q 120 22,4 0,94 -2,4E-02 cycA{v32421 }/elavGS>ATXN3-70Q 57 22,8 0,96 -7,2E-01 mei-41 [e02381] mâles (témoins)/elavGS>ATXN3-70Q 37 22,9 0,96 -l,7E-02 l(l)G0148 {v40715}/elavGS>ATXN3-70Q 120 23,0 0,97 -7,1E-01

UAS-cycE/elavGS>ATXN3-70Q 81 23,1 0,97 3,6E-02

UAS-E2F nul pl717/elavGS>ATXN3-70Q 90 23,2 0,98 8,1E-01

UAS-cycE _P 1396/elavGS>ATXN3-70Q 65 23,3 0,98 -l,2E-02 dup {v23131 } /elavGS>ATXN3-70Q 88 24,0 1,01 7,7E-01 grp[DG25208]/elavGS>ATXN3-70Q 51 24,2 1,02 -6,3E-02

UAS-cycA/elavGS>ATXN3-70Q 48 24,8 1,04 5,9E-01 muslOl [Dl]/elavGS>ATXN3-70Q 123 24,8 1,04 5,5E-02 grp{vl2680}/elavGS>ATXN3-70Q 47 25,4 1,07 2,9E-02 nbs[EY15506]/elavGS>ATXN3-70Q 116 25,4 1,07 8,2E-02 w/elavGS>ATXN3-70Q 116 25,8 1,09 l,4E-03

DDBl[EY01408]/elavGS>ATXN3-70Q 55 25,9 1,09 9,4E-03 grp[06034]/elavGS>ATXN3-70Q 80 26,3 1,11 3,0E-02

UAS-string/elavGS>ATXN3-70Q 79 26,8 1,13 l,4E-06 timeout { v22592 }/elavGS>ATXN3-70Q 113 30,4 1,12 1,1Ε-02

DNApol-alpha73 {vl08579}/elavGS>ATXN3-70Q 125 30,6 1,13 2,2E-02

DNApol-alpha73 {vl08579}/elavGS>ATXN3-70Q 121 31,6 1 ,22 l,8E-08 DNApol-alpha50{v43870}/elavGS>ATXN3-70Q 92 31,7 1,33 8/7E-17 timeout[c06976]/elavGS>ATXN3-70Q 114 31,8 1,12 1,2Ε-06 timeout {v22592 }/elavGS>ATXN3-70Q 149 32,6 1,25 5,7E-20 grp[EY00450]/elavGS>ATXN3-70Q 116 32,8 1,38 l,3E-27

*mâles/elavGS>ATXN3-70Q déciles 3-8 300 23,6

Ces cribles génétiques ont permis d'identifier plusieurs autres gènes impliqués dans la réplication de l'ADN susceptibles de moduler la pathologie SCA3. Il s'agit des gènes mcm2 et dup/Cdtl, nécessaires à la réplication et dont l'inactivation sauve le phénotype pathologique, ainsi que du gène Huwel, un inhibiteur de la réplication dont le gain de fonction a un effet protecteur dans la pathologie SCA3. D'autre part, le gain de fonction de la kinase grp/Chkl, un effecteur majeur de la voie ATR impliquée dans le contrôle de la réplication de l'ADN, sauve aussi le phénotype pathologique. Ces cribles ont aussi permis d'identifier les gènes dPOLA2 et dTimeless nécessaires à la réplication et dont l'inactivation restaure partiellement le phénotype sauvage. Ainsi plusieurs gènes jouant un rôle dans le processus de la réplication de l'ADN et son contrôle apparaissent comme des cibles thérapeutiques potentielles.

EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE CHEZ LA DROSOPHILE DE L'EFFET DE LA DIMINUTION DE L'EXPRESSION DE LA PRIMASE SUR LA MALADIE DE HUNTINGTON

1) Matériels et Méthodes

Souches de Drosophile et culture

Pour l'étude sur un modèle de la maladie de Huntington, la lignée GMR-UAS-Htt-93Q a été créée à partir d'une lignée pUAS-Htt 93Q (Steffan et al, 2001).

Les conditions de cultures sont identiques à celles décrites dans l'Exemple 1.

Analyse du phénotype de l'œil

Des femelles de génotype GMR>Htt-93Q et des mâles de génotype DNApol-alpha50{v43870} et UAS-GFP-IR ont été élevés à une température de 23°C et croisées ensemble. L'examen optique de la structure de l'œil a été réalisé sur les mâles obtenus, âgés de 3 jours, avec un stéréomicroscope Leica M205FA. 2) Résultats

La souche GMR-GAL4 a été utilisée pour exprimer la protéine Huntingtine humaine pathologique tronquée Htt-93Q (intron 1) dans l'œil. Dans ces conditions il a été observé une forte dégénérescence de l'œil (Figure 8A). Ce phénotype est supprimé dans les mouches UAS-Htt-93Q/UAS-DNApol- alpha50{v43870} où la DNApol-alpha50 est inactivée par ARN interférence (Figure 8B).

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