Inhibitoren des Natrium/Wasserstoff-Austauschers (NHE) sind in den letzten Jahren in zahlreichen präklinischen Studien als Substanzen charakterisiert worden, die bei Minderdurchblutung des Herzens in überlegener Weise geeignet sind, das durch das akut einsetzende lschämie-Ereignis gefährdete Herzgewebe vor dem Untergang zu schützen. Der Schutz des Herzgewebes durch NHE Inhibitoren umfasst alle Ausprägungen der durch die Mangeldurchblutung hervorgerufenen Schädigungen, angefangen bei Herzrhythmusstörungen über Hyperkontraktur des Herzmuskels und vorübergehenden Funktionsverlust bis hin zum Absterben des Herzgewebes und damit verbundenen dauerhaften Schäden.

Der im akuten Ischämiegeschehen wichtige Wirkmechanismus der NHE-Inhibitoren besteht darin, dass sie den verstärkten Natrium-loneneinstrom, der in akut mangeldurchblutetem Gewebe durch eine Aktivierung des NHE, infolge intrazellulärer Ansäuerung entsteht, vermindern. Dadurch wird die Situation einer Natriumüberladung des Gewebes. hinausgezögert. Da im Herzgewebe Natrium-und Calcium- lonentransport miteinander gekoppelt sind, wird damit die Leben bedrohende Calciumüberladung der Herzzellen verhindert.

Ferner ist bekannt, dass die Inhibitoren des NHE eine Protektion des Zentralnervensystems (ZNS) bewirken, wobei derartige Wirkstoffe das ZNS, ähnlich wie das Herz, gegen akute ischämische Zustände schützten. Diese Zustände werden verursacht durch eine akute Mangeldurchblutung und somit durch eine

Mangelversorgung mit Nährstoffen, Sauerstoff oder Mineralien. Besonders ausgeprägt sind derartige ischämische Schädigungen des ZNS bei zentralen Infarkten, wie dem Gehirnschlag (Stroke). Bei normaler gesunder Durchblutung konnten deshalb erwartetermaßen auch keine protektiven Effekte von NHE-Inhibitoren. gegen diese akuten Ereignisse beobachtet werden, da keine akut einsetzenden ischämischen Gewebsschädigungen des Herzens oder des ZNS auftraten.

Im Stand der Technik werden zahlreiche Substanzklassen beschrieben, die in das Zusammenspiel der Gerinnungsfaktoren eingreifen und damit den Ablauf der Gerinnungskaskade zum Stillstand bringen. Ebenfalls wurden zahlreiche Wirkprinzipien entwickelt, die nicht die Thrombenbildung unterdrücken, sondern die Auflösung (Lyse) bereits gebildeter Thromben verursachen. Einige dieser Wirkpinzipien, die an unterschiedlichsten Schaltstellen der genannten Kaskade eingreifen, wurden in die Therapie zur Verhinderung der Thrombogenese eingeführt, wie Derivate der Vitamin K-Gruppe (Phyllochinone), Faktor VIII und Faktor-IX Präparate, Thrombozytenaggregationshemmer wie Acetylsalizylsäure, Dipyridamol und Ticlopidin, Antikoagulantien wie Heparine oder Heparinoide.

Die Blutgerinnungskaskade kann mechanistisch in zwei Pfade eingeteilt werden, wie in nachfolgendem Schema dargestellt wird, nämlich in einen intrinsichen und einen extrinsischen Verlauf, die beide schließlich in die Aktivierung de Faktor X und die resultierende Erzeugung von Thrombin und nachfolgend von Fibrin münden : Intrinsic Extrinsic Xll > Xlla Vll + TF 4 Xla xi > axa s t X Xa Platelet Aggregation 19 1 Prothrombin- Thrombin Fibrinogen---- Fibrin

Schema 1 : Blutgerinnungs-Kaskade Bei der therapeutischen Anwendung derartiger Blutgerinnungsinhibitoren ist es wichtig, dass keine zu starke oder vollständige Gerinnungshemmung erzielt wird, die die lebensnotwendige Bildung von Mikrothromben und Mikrokoagulationen inhibieren würden, welche an den sich kontinuierlich ereignenden Mikroverletzungen stattfinden müssen. Der Grad der Gerinnungshemmung lässt sich infolge unterschiedlicher Ansprechbarkeit des jeweiligen Individuums zum jeweiligen Zeitpunkt nur ungenau einstellen und muss, soweit dies möglich ist, genau überwacht werden. Im Falle einer Inhibierung dieser vielen kleinen, permanent stattfindenden Gerinnungsvorgänge besteht das hohe Risiko von massiven Blutungen (Hämophilie).

Nachteil der bekannten am Markt befindlichen Therapeutika, die als Inhibitoren in das Gerinnungsgeschehen eingreifen, ist daher das hohe Risiko von Blutungs- komplikationen. Insbesondere während einer hochdosierten Thrombolysetherapie, z.

B. im Rahmen der Therapie des akuten Myokardinfarktes oder Lungenembolie, besteht die Gefahr der lebensbedrohlichen Blutung. Deshalb besteht ein dringender

Bedarf an therapeutischen Wirkstoffen, die trotz Überdosierung keine Gefahr einer erhöhten Blutungsneigung in sich tragen.

Viele der bekannten gerinnungshemmenden Stoffe wirken dadurch, dass sie an den Blutplättchen, den Thrombozyten, angreifen und deren Funktion hemmen oder deren Aktivierung inhibieren. Auch das Endothel spielt offensichtlich eine zentrale Rolle im Gerinnungsgeschehen. So wird beispielsweise der für die Gerinnung notwendige von- Willebrand-Faktor (vWF) zum größten Teil in den Endotheizellen gebildet und von dort permanent (konstitutiv) in das zirkulierende Blut sezerniert, um die notwendigen Gerinnungsprozesse im Blut zu gewährleisten. Ein beachtlicher Teil, des gebildeten vWF wird in zytoplasmatischen Granula, den sogenannten Weibel-Palade-Körperchen, gespeichert und bei Bedarf durch Stimulation der Endothelzellen freigesetzt. Sind Endothelzellen nicht in der Lage, den vWF zu bilden und an das Blut abzugeben, so kommt es zur bekannten erblichen vWF-abhängigen von Willebrand-Jürgens-Syndrom Erkrankung, die sich durch ihre kaum-stillbaren Blutungen auszeichnet.

Erst seit wenigen Jahren sind Erkrankungen bekannt, die durch erhöhte Konzentrationen an vWF im Blut verursacht werden, und dadurch beispielsweise eine verstärkte Blutgerinnungsneigung und Entzündungsvorgänge ausgelöst werden. So weisen Kamphuisen et al. in ihrer Publikation"Elevated factor VIII levels and the risk of thrombosis" [Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21 (5) : 731-738 (2001)] anhand zahlreicher Studien nach, dass ein signifikanter Zusammenhang zwischen erhöhten Blutspiegeln an vWF und einer erhöhten Thromboseerkrankungsrate besteht. Dabei bildet der Faktor VIII mit vWF einen Komplex als notwendige Voraussetzung der Blutgerinnung. Es konnte herausgearbeitet werden, dass hohe Blutspiegel an von Willebrand-Faktor (vWF) und an durch vWF-gebundenen Faktor Vlil einen klaren Risikofaktor für eine Thrombose darstellen. Allerdings können antithrombotische Wirkstoffe, die die stabilisierende Bindung des vWF an Faktor-VIII antagonisieren, auch nachteilig sein, weil im Falle einer Überdosierung mit einer weitgehenden Inhibition der Blutgerinnung und mit gefährlichen Blutungsneigungen gerechnet werden muss.

In dem Bestreben, wirksame Verbindungen zur Behandlung von akuten oder chronischen Krankheiten, die durch erhöhte Blutspiegel des von Willebrand-Faktors verursacht werden, zu finden, wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen die Freisetzung des von Willebrand-Faktors aus den Endothelzellen inhibieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen die massive pH-abhängige Freisetzung des in der Ischämie akkumulierten vWF.

Während die Sezernierung bei dem normalen Blut-pH bekanntermaßen um 7,4 regulär, konstitutiv erfolgt und ein Teil. des vWF in Weibel-Palade-Körperchen gespeichert wird, konnte nun gefunden werden, dass die Freisetzung des vWF mit sinkendem pH verzögert und vermindert erfolgt. Die Exocytose der Weibel-Palade- Körperchen, in denen der vWF verpackt ist, wird bei absinkendem pH zunehmend gehemmt. So kommt es unter acidotischen Bedingungen zur signifikanten Zunahme der Weibel-Palade-Körperchen und damit zur massiven Akkumulation des VWF in der Endothelzelle und zu einer verminderten konstitutiven und stimulierten vWF-Sekretion.

Diese kann durch Anfärbungsmaßnahmen sichtbar gemacht und durch quantitative vWF-Messungen im Überstand bewiesen werden. Derartige acidotische Zustände mit signifikanten pH-Absenkungen unter 7 treten beispielsweise in Fällen von Gewebsischämien auf. Im Moment der Realkalinisierung und Endothelzellstimulation, die dem Zustand der Reperfusion entspricht, kommt es innerhalb von Sekunden zur Exocytose und damit zur Entleerung der Weibel-Palade-Körperchen (WPK) und führt so zu einer massiven Freisetzung des prothrombotischen Risikofaktors.

Neben dem vWF wird in den Weibel-Palade-Körperchen auch das transmembranäre Protein P-Selektin gespeichert (Wagrier, D. D. 1993, Thromb. Haemost., 70 : 105-110) Das P-Selektin sitzt in der Vesikelmembran und wird nach der Vesikelfusion (Exozytose) in die Plasmamembran der Endothelzelle eingebaut. Damit führt jede Weibel-Palade-Körperchen Exozytose nicht nur zu einer vermehrten vWF-Freisetzung, sondern auch zu einer gesteigerten P-Selektin Expression in der Endothelzellmembran. In den Beispielen wird die vWF-Sekretion (quantitative Messung mittels ELISA) unter Azidose, wie auch während einer anschließenden Reperfusion gezeigt. Parallel werden diese quantitativen Messungen mit

Immunfluoreszenzdaten der Weibel-Palade-Körperchen belegt. Damit ist der gemessene vWF nicht nur ein Marker für gesteigerte (Zunahme der vWF Sekretion) oder verringerte (Abnahme der vWF-Sekretion) Thromboseneigung (über die Aggregationszunahme der Thrombozyten), sondern auch ein direkter Marker für eine gesteigerte oder verringerte P-Selektin Expression in der Endotheizellmembran. P- Selektin dient als Anker für Leukozyten und damit der initialen Entzündungsreaktion (Vestweber, D., Blanks, J. E. 1999, Physio. Rev., 79 : 181-213 ; Issekutz, A. C., Issekutz, T. B. 2002, J. Immunol., 168 : 1934-1939). Die pathophysiologische Bedeutung ist vielfältig und belegt für Ischämie/Reperfusionserkrankungen, Thrombosen und Arteriosklerose (Massberg, S., et al., 1998, Blood, 92 : 507-515 ; Kita, T., et al., 2001, Ann. N. Y. Acad. Sci., 947 : 199-205). Neben der Bedeutung des P-Selektins als Entzündungsmarker und Initiator einer Entzündung, spielt es eine wesentliche Rolle im Prozeß der Krebsverbreitung (Varki, A., Varki, N. M. 2001, Braz.

J. Med. Biol. Res. 34 : 711-717), als auch während unterschiedlicher Gelenksentzündungen (Arthritis) (Veihelmann, A. et al, 1999, Microcirculation, 6 : 281- 290 ; Mclnnes, lob., et al., 2001, J. Immunol., 167 : 4075-4082). Damit kann die hier dargestellte Wirkungsweise der Substanzen, auch Einsatz als Therapeutikum für alle oben erwähnten P-Selektin assoziierten Erkrankungen finden.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von Inhibitoren des Natrium- Wasserstoffaustauschers zur Herstellung von Arzneimitteln zur Prophylaxe und Therapie von akuten oder chronischen Krankheiten, die durch erhöhte Blutspiegel des von Willebrand-Faktors verursacht werden.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von mindestens einer der folgenden Verbindungen

und/oder alle stereoisomeren Formen der obengenannten Verbindungen und/oder Gemische diese Formen in jedem Verhältnis, und/oder der physiologisch verträglichen Salze der obengenannten Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und Therapie von akuten oder chronischen Krankheiten, die durch erhöhte Blutspiegel des von Willebrand-Faktors und/oder erhöhte Expression des P-Selektins verursacht werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Cariporide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und Therapie von akuten oder chronischen Krankheiten, die durch erhöhte Blutspiegel des von Willebrand-Faktors und/oder erhöhte Expression des P-Selektins verursacht werden.

Die obengenannten Verbindungen sind bekannt und lassen sich beispielsweise wie in EP 0 416 499, EP 0 556 673, EP 0 589 336, EP 0 622 356, EP 0 699 666, EP 0 708 088, EP 0 719 766, EP 0 726 254, EP 0 787 728, EP 0 972 767, DE 19529612, DE 19601303, WO 99 00379 ; oder T. Kawamoto, et al., Potent and selective Inhibition of the human Na+/H+ exchanger isoformNHE1 by a novel aminoguanidine derivative T-162559, Eur. J. Pharmacol. 420 (2001), 1-8, beschrieben herstellen.

Sofern die obengenannten Verbindungen diastereoisomere oder enantiomere Formen zulassen und bei der gewählten Synthese als deren Gemische anfallen, gelingt die Trennung in die reinen Stereoisomeren entweder durch Chromatographie an einem gegebenenfalls chiralen Trägermaterial, oder, sofern die racemischen obengenannten Verbindungen zur Salzbildung befähigt sind, durch fraktionierte Kristallisation der mit einer optisch aktiven Base oder Säure als Hilfsstoff gebildeten diastereomeren Salze.

Als chirale Stationärphasen für die dünnschicht-oder säulenchromatographische Trennung von Enantiomeren eignen sich zum Beispiel modifizierte Kieselgelträger (sogenannte Pirkle-Phasen) sowie hochmolekulare Kohlenhydrate wie Triacetylcellulose. Für analytische Zwecke sind nach entsprechender, dem Fachmann bekannter Derivatisierung, auch gaschromatographische Methoden an chiralen Stationärphasen anwendbar. Zur Enantiomerentrennung der racemischen Carbonsäuren werden mit einer optisch aktiven, in der Regel kommerziell erhältlichen Base wie (-) -Nicotin, (+)-und (-)-Phenylethylamin, Chininbasen, L-Lysin oder L-und D- Arginin die unterschiedlich löslichen diastereomeren Salze gebildet, die schwerer lösliche Komponente als Feststoff isoliert, das leichter lösliche Diastereomer aus der Mutterlauge abgeschieden, und aus den so gewonnenen diastereomeren Salzen die reinen Enantiomeren gewonnen. Auf prinzipiell gleiche Weise kann man die racemischen Verbindungen der Formel I, die eine basische Gruppe wie eine Aminogruppe enthalten, mit optisch aktiven Säuren., wie (+)-Campher-10-sulfonsäure, D-und L-Weinsäure, D-und L-Milchsäure sowie (+) und (-)-Mandelsäure in die reinen Enantiomeren überführen. Auch kann man chirale Verbindungen, die Alkohol-oder Aminfunktionen enthalten, mit entsprechend aktivierten oder gegebenenfalls N- geschützten enantiomerenreinen Aminosäuren in die entsprechenden Ester oder Amide, oder umgekehrt chirale Carbonsäuren mit carboxygeschützten enantiomerenreinen Aminosäuren in die Amide oder mit enantiomerenreinen Hydroxycarbonsäuren wie Milchsäure, in die entsprechenden chiralen Ester überführen. Sodann kann die Chiralität des in enantiomerenreiner Form eingebrachten Aminosäure-öder Alkoholrestes zur Trennung der Isomeren genutzt werden, indem man eine Trennung der nunmehr vorliegenden Diastereomeren durch Kristallisation oder Chromatographie an geeigneten Stationärphasen vornimmt und danach den mitgeführten chiralen Molekülteil mittels geeigneter Methoden wieder abspaltet.

Saure oder basische Produkte der obengenannten Verbindungen können in Form ihrer Salze oder in freier Form vorliegen. Bevorzugt sind pharmakologisch verträgliche Salze, z. B. Alkali-oder Erdalkalimetallsalze bzw. Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Hemisulfate, alle möglichen Phosphate sowie Salze der Aminosäuren, natürlicher Basen oder Carbonsäuren.

Die Herstellung physiologisch verträglicher Salze aus den zur Salzbildung befähigten obengenannten Verbindungen, einschließlich deren stereoisomeren Formen, erfolgt in an sich bekannter Weise. Die Carbonsäuren und Hydroxamsäuren bilden mit basischen Reagenzien wie Hydroxiden, Carbonaten, Hydrogencarbonaten, Alkoholaten sowie Ammoniak oder organischen Basen, beispielsweise Trimethyl-oder Triethylamin, Ethanolamin oder Triethanolamin oder auch basischen Aminosäuren, etwa Lysin, Ornithin oder Arginin, stabile Alkali-, Erdalkali oder gegebenenfalls substituierte Ammoniumsalze. Sofern die obengenannten Verbindungen basische Gruppen aufweisen, lassen sich mit starken Säuren auch stabile Säureadditionssalze herstellen. Hierfür kommen sowohl anorganische als auch organische Säuren, wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, p-Toluolsulfon-, 4-Brombenzol-sulfon-, Cyclohexylamidosulfon-, Trifluormethylsulfon-, Essig-, Oxal-, Wein-, Bernstein-oder Trifluoressigsäure in Frage.

Insbesondere bevorzugt sind Methansulfonsäuresalze der obengenannten Verbindungen.

Aufgrund der pharmakologischen Eigenschaften eignen sich die obengenannten Verbindungen zur Prophylaxe und Therapie von akuten oder chronischen Krankheiten, die durch erhöhte Blutspiegel des von Willebrand-Faktors und/oder erhöhte Expression des P-Selektins verursacht werden.

Dazu gehören thrombotische Erkrankungen, die durch ischämische Zustände mit nachfolgender Reperfusion provoziert werden ; wie Thrombosen im akuten Myokard-, Mesenterial-oder auch Hirninfarkt ; thrombotische Erkrankungen, die während oder nach chirurgischen Eingriffen auftreten ; pulmonare Embolien ; tiefe venöse Thrombosen, wie sie nach längerer Einschränkung des Blutkreislaufs insbesondere der unteren Extremitäten beispielweise nach längerem Liegen oder Sitzen vermehrt auftreten, sowie entzündliche Erkrankungen, wie sie während der Ischämie und anschliessenden Reperfusion, während einer Vaskulitis (z. B. im Rahmen einer Autoimmunerkrankung oder Kollagenose), auftreten.

Ferner gehören dazu Erkrankungen, die durch eine erhöhte Expression des P- Selektins verursacht werden wie beginnende Entzündungsreaktionen ; aber auch

Prophylaxe und Behandlung von Arteriosklerose ; sowie Prophylaxe und Behandlung von Krebs ; als auch Gelenksentzündungen und arthritische Erkrankungen wie rheumatoide Arthritis.

Die Applikation der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann durch orale, inhalative, rektale oder transdermale Applikation oder durch subkutane, intraartikuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Bevorzugt ist die orale Applikation.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine der obengenannten Verbindungen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz-oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.

Die obengenannten Verbindungen werden mit den dafür geeigneten Zusatzstoffen wie Trägerstoffen, Stabilisatoren oder inerten Verdünnungsmitteln vermischt und durch die üblichen Methoden in geeignete Darreichungsformen gebracht, wie Tabletten, Dragees, Steckkapseln, wässrige, alkoholische oder ölige Suspensionen oder wässrige oder ölige Lösungen. Als inerte Trägerstoffe können z. B. Gummi arabicum, Magnesia, Magnesiumcarbonat, Kaliumphosphat, Milchzucker, Glukose oder Stärke, insbesondere Maisstärke, verwendet werden. Dabei kann die Zubereitung sowohl als Trocken-als auch als Feuchtgranulat erfolgen. Als ölige Trägerstoffe oder Lösemittel kommen beispielsweise pflanzliche oder tierische Öle in Betracht, wie Sonnenblumenöl oder Lebertran.

Zur subkutanen, intraperitonealen oder intravenösen Applikation werden die aktiven Verbindungen gewünschtenfalls mit den dafür geeigneten Substanzen wie Lösungsvermittler, Emulgatoren oder weiteren Hilfsstoffen in Lösung, Suspension oder Emulsion gebracht. Als Lösungsmittel kommen z. B. in Frage physiologische Kochsalzlösung oder Alkohole, z. B. Ethanol, Propanol, Glycerin, daneben auch Zuckerlösungen wie Glukose-oder Mannitlösungen, oder auch eine Mischung aus den verschiedenen genannten Lösungsmitteln.

Ferner finden übliche Hilfsmittel, wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit-oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung. Als häufig verwendete Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss-oder Sesamöl, Polyethylenglykol und Lösungsmittel wie etwa steriles Wasser und ein-oder mehrwertige Alkohole wie Glycerin, genannt.

Die obengenannten Verbindungen werden bevorzugt als pharmazeutische Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis der Verbindung der Formel I enthält. Sie können zu diesem Zweck oral in Dosen von 0,01 mg/kg/Tag bis 25,0 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,01 mg/kg/Tag bis 5,0 mg/kg/Tag oder parenteral in Dosen von 0,001 mg/kg/Tag bis 5 mg/kg/Tag, vorzugsweise 0,001 mg/kg/Tag bis 2,5 mg/kg/Tag, appliziert werden. Die Dosierung kann in schweren Fällen auch erhöht werden. In vielen Fällen genügen jedoch auch geringere Dosen. Diese Angaben beziehen sich auf einen Erwachsenen von etwa 75 kg Gewicht.

Die obengenannten Verbindungen können allein oder in Kombination mit blutgerinnungshemmenden, plättchenaggregationshemmenden oder fibrinolytischen Wirkstoffen eingesetzt werden. Die Koapplikation kann beispielsweise mit Faktor Xa- Inhibitoren, Standardheparin, niedermolekularen Heparinen wie Enoxaparin, Dalteparin, Certroparin, Parnaparin oder Tinzaparin, direkten Thrombin Inhibitoren wie Hirudin, Aspirin, Fibrinogen Rezeptor Antagonisten, Streptokinase, Urokinase und/oder Tissue Plasminogen Aktivator (tPA) erfolgen.

Es ist bekannt, dass die Inhibitoren des Natrium-Wasserstoff-Austauschers auf die Aggregation der Thrombocyten wirken und eine adhäsionshemmende Wirkung aufweisen (siehe Rosskopf, Dieter, J. Thromb. Thrombolysis (1999), 8 (1), 15-23. ; oder Nieuwland, Rienk ; Akkerman, Jan-Willem Nicolaas. Adv. Mol. Cell Biol. (1997), 18 (Platelet), 353-366).

Im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Wirkungen auf die Blutplättchen- aggregation zeigen die obengenannten Verbindungen auch eine Inhibition der überschießenden Freisetzung des von-Willebrand-Faktors. Dieses neuartige antithrombotische Wirkprinzip unterscheidet sich von den bislang bekannten antithrombotischen Wirkprinzipien in entscheidender und vorteilhafter Weise dadurch, dass a) es nur im ischämischen Gewebe in der nachfolgenden Reperfusionsphase wirkt, während andere nicht von der Ischämie betroffene (prä-ischämische) Zellen völlig unbeeinflusst bleiben, und b) keine der gefährlichen Blutungskomplikationen während der Lyse-Therapie befürchtet werden müssen.

Nachfolgend ist die Erfindung an Hand von Beispielen näher erläutert.

In den nachfolgenden Beispielen wurden die Auswirkungen einer extrazellulären Azidose (pHex = 6,4), sowie die Wirkungen der obengenannten erfindungsgemäßen Verbindungen auf den intrazellulären pH (pH,) und die Freisetzung des von- Willebrand-Faktors (vWF) dargestellt. Sämtliche Beispiele wurden mit humanen umbilikalvenösen Endotheizellen (HUVEC) durchgeführt. Hierbei handelte es sich um primäre Zellkulturen, die aus der Vene der Nabelschnur isoliert wurden.

Für die folgenden Beispiele wurden die Zellen entweder auf gelatinierte Glasplättchen (Messung der intrazellulären Protonenkonzentration) oder auf Zelikulturplatten (12-well culture plates, Falcon, New Jersey, USA ; Messung der vWF-Freisetzung) nach. der ersten Passage kultiviert.

Beispiel 1 : Messung des intrazellulären pH-Wertes Zur Messung der intrazellulåren Protonenkonzentration. (pHj) wurden HUVECs mit dem pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff BCECF-AM (2', 7'-bis (carboxyethyl)- 5 (6)-carboxyfluoreszein) beladen. Zur anschließenden Messung der Fluoreszenz wurde ein Deltascan Spectrofluorometer (PTI, Hamburg) eingesetzt. Im wesentlichen besteht dieses Meßsystem aus einer UV-Lichtquelle, einem Monochromator, einem Photonendetektor sowie den Softwarepaketen Felix und Oscar (PTI, Hamburg) für die Steuerung des Systems über einen Computer. Nach alternierender Anregung mit den Wellenlängen 439, 5 nm (pH-unabhängig) und 490 nm (pH-sensitiv) wurde das Verhältnis der gemessenen Emissionen des BCECF (Ratio) aufgezeichnet und der pH-Wert nach einer Kalibrierung ermittelt. Die Messkammer ist derart aufgebaut, dass die Parameter Temperatur sowie Kohlenstoffdioxidpartialdruck des Systems bei kontinuierlicher Perfusion kontrolliert werden. Für die Reperfusionssimulation wurden die Versuchsbedingungen auf 37 °C und einen Kohlenstoffdioxidpartialdruck von 5% oder 10% durch System-und Perfusatbegasung eingestellt.

Im Versuch wurde zunächst 60 Minuten mit Natrium-Bicarbonat-Puffer pHex 6,4 vorinkubiert, um eine respiratorisch-metabolische Azidose zu simulieren. Dann erfolgte ein Wechsel der eingeleiteten Perfusion auf Natrium-Bicarbonat-Puffer pH 7,4 mit 10 uM Histamin als Reperfusionssimulation.

Im Vergleich zu diesen Kontrollexperimenten wurde im Versuch dem Reperfusionspuffer der NHE-Inhibitor Cariporide in einer Konzentration von 10 uM zugesetzt.

Die Ergebnisse mehrerer Versuche wurden in Tabellen 1 und 2 zusammengefasst. Tabelle 1 : Intrazellulärer pH Wert während einer extrazellulären Azidose (pHi (Azidose)) von mindestens 15 Minuten bzw. unter Kontrollbedingungen (Co).

Tabelle 1 :

pH, (Azidose) 6,53 0,02 (Mittelwert SEM) PHI (Co) 7,23 0,02 (Mittelwert SEM) SEM ist die Standardabweichung vom Mittelwert Eine extrazelluläre Azidose führte zu einer intrazelluläreri Azidifizierung, die während der Dauer der Azidose bestehen blieb. Der intrazelluläre, azidotische pH-Wert ist dem extrazellulären pH nahezu identisch (angelegte extrazelluläre Azidose pHeX = 6,4).

Tabelle 2 : Reperfusion mit Versuchspuffer, enthaltend Cariporide (HOE) und Kontrollpuffer (Co). Die initiale Anstiegsgeschwindigkeiten der pHI-Werte wurde nach 60 Minuten Azidose aus den Messwerten innerhalb der ersten 30 Sekunden nach Reperfusion ermittelt.

Tabelle 2 : pH-Anstiegsgeschwindigkeit [A pH/min] Einzelexperimente Mittelwert SEM 0, 97 1, 04 Co 0, 89 0, 97 0, 04 0, 88 1 1, 07 0, 30 0, 24 HOE 0, 23 0, 27 0,02 0, 34 0, 24

Bei einer Änderung des extrazellulären pH-Wertes von 6,4 auf 7,4 war die Anstiegsgeschwindigkeit des intrazellulären pH-Wertes im Vergleich zur Kontrolle um den Faktor 3,6 vermindert. Somit ließ sich durch den Einsatz von Cariporide während der Reperfusion die Realkalinisierungsgeschwindigkeit signifikant vermindern.

Beispiel 2 Messung der vWF-Freisetzung nach Reperfusion Die Messungen wurden durchgeführt in einem Inkubator Heraeus Heracell. Dadurch war es möglich die umbilikalvenösen Endotheizellen, unter kontrollierten physiologischen Bedingungen (Temperatur 37 °C, relative Luftfeuchtigkeit 100%, pC02 konstant 5%) zu kultivieren, und einen raschen Wechsel verschiedener Zellkulturmedien zu gewährleisten.

Die genannten Zellen wurden zunächst mit azidotischem Medium (pH 6,4 aus den Bestandteilen : Medium M199 w/Earle's & Amino Acids, w/L-Glutamin, w/o NaHCO3, w/o Hepes + 0,084g NaHCOs/1) oder pH-Standardmedium (pH 7,4 aus den Bestandteilen : Medium M199 w/Earle's & Amino Acids, w/L-Glutamin, w/o NaHCO3, w/o Hepes + 2,200g NaHCOs/1) für eine, drei oder 48 Stunden inkubiert. Vor Beginn der Reperfusion wurden Überstandsproben zur Bestimmung der vWF Konzentration unter azidotischen Bedingungen (vWFazidose) und Kontrollbedingungen (vWFco) entnommen. Zur Simulation der Reperfusion wurde auf ein Medium mit einem pH-Wert von 7,4 gewechselt (Bestandteile : Medium M199 w/Earle's & Amino Acids, w/L- Glutamin, w/o NaHCO3, w/o Hepes + 2,200 g NaHCOs/1 + 10uM Histamin), welchem der NHE-Inhibitor Cariporide in einer Konzentration von 10uM zugesetzt wurde. Als Kontrolle diente der Wechsel auf das gleiche Medium ohne entsprechenden Inhibitorzusatz.

Die dem Überstand entnommenen Proben wurden zur Bestimmung der vWF- Konzentration verwendet. Hierzu diente ein ELISA-Verfaren (enzyme-linked immuno sorbent assay) unter Verwendung spezifischer Antikörper. Der vWF-Gehalt von Standard Human Plasma (Behring,. Marburg) wird anhand eines internationalen

Standards (2nd International Standard 87/718 ; National Institute for Biological Standards and Control, London) umgerechnet.

Tabelle 3 : vWF-Konzentration im Zellüberstand unter azidotischen (vWFazidose) und unter Kontrollbedingungen (vWFco) gemessen nach einer 15 minütigen Inkubationsdauer. Die vWF-Konzentration unter Kontrollbedingungen wird auf 100% gesetzt.

Tabelle 3 : vWFco 100 % vWFazidose (konstitutiv) 46 ~ 1,1 % vWFazidose (stimuliert, Histamin 50 µM) 52 ~ 2,5 % Die Azidose führte zu einer deutlichen Abnahme der vWF-Sekretion, sowohl der konstitutiven Sekretion als auch der stimulierten Weibel-Palade Körperchen Sekretion.

Die vWF Sekretion war während einer Azidose (pHex = 6,4) um einen Faktor 2 im Vergleich zu Kontrollzellen reduziert.

Tabelle 4 : vWF-Sekretion wurde während einer 10 minütigen Reperfusionsdauer unter Stimulation gemessen. Die vWF-Sekretion der Kontrollzellen (vWFco) wurde auf 100 % gesetzt. Die vWF-Konzentration während der Reperfusion preazidotischer Zellen (vWFazidose) und die vWF-Konzentration während der Reperfusion preazidotischer Zellen in Anwesenheit von 10 uM Cariporide (vWFHoE) wurden als relative Werte zu den Kontrollwerten angegeben. Kontrollzellen wurden mit Cariporide inkubiert (vWFco+HOE) Tabelle 4 : vWFco 100 % vWFco+HOE 106 ~ 3,0% vWFazidose 193 8, 0 % WVFHOE13916%

Während der Reperfusion kam es zu einer massiven Steigerung der vWF Sekretion um den Faktor 2. Eine Blockade des NHE mit Cariporide vermindert die vWF- Mehrsekretion um nahezu 60% und nähert sich somit den Kontrollwerten.

Kontrollzellen inkubiert mit Cariporide (10 uM) zeigten keinen Mehr-oder Mindersekretion des vWF.

In den Beispielen wurde gezeigt, dass eine extrazelluläre Azidose, wie sie beispielsweise während einer Ischämie vorlag, zu einer intrazellulären Azidose führte mit der Folge einer verminderten (konstitutiven und stimulierten) vWF-Sekretion und einer verminderten P-Selektinexpression. Die anschließende Reperfusion und Stimulation der Endotheizellen bewirkte eine schnelle intrazelluläre Realkalinisierung.

Simultan kam es zu einer massiv gesteigerten vWF-Mehrsekretion und vermehrten P- Selektinexpression. Eine Verzögerung der Realkalinisierung mit Cariporide verringerte die vWF-Mehrsekretion und P-Selektinexposition und damit die mögliche Thrombosierung und Entzündungsreaktionen. Die Beispiele zeigten, dass der intrazelluläre pH-Wert vom extrazellulären pH-Wert determiniert wird. Die Sekretionsleistung der Endothelzellen wiederum wird vom intrazellulären pH-Wert bestimmt. Damit lässt sich die in der Reperfusionsphase bekannte Endothelzellaktivierung und die damit verbundene gefürchtete Rethrombosierung (vWF-Sekretion) und Entzündung durch Hemmung der Realkalinisierung stark reduzieren. Die Inkubation gesunder, nicht azidotischer Kontrollzellen mit Cariporide zeigte keine Wirkung. Dies indiziert ein geringes Nebenwirkungspotential und verhindert eine überschießende Blutungsneigung. Der Wirkstoff wirkt nur dort, wo eine Ischämie vorliegt.