La alta especificidad y gran actividad de la Garvicina A hace que esta bacteriocina tenga una utilización potencial, tanto en acuicultura como en la industria alimentaria, inhibiendo el crecimiento de cepas de Lactococcus garvieae (L. garvieae) patógenas para el hombre y/o los animales susceptibles.

En el caso de la acuicultura, la especificidad de la Garvicina A asegura que su utilización no afectaría a la microbiota intestinal de los peces, y que no interferiría con la actividad de las especies bacterianas utilizadas como probióticos como Lactobacillus spp., que se podrían aplicar de forma simultánea.

En el caso de los alimentos, la utilización de esta bacteriocina podría evitar la contaminación de los mismos con cepas patógenas de L. garvieae, que podrían estar implicadas en el desarrollo de casos clínicos en humanos, sin por ello inhibir el desarrollo de otras bacterias lácticas implicadas en las características organolépticas y en la elaboración de productos alimentarios. ESTADO DE LA TÉCNICA:

La lactococosis de la trucha, cuyo agente etiológico es L. garvieae, es una enfermedad de gran importancia económica y sanitaria en la acuicultura de los países mediterráneos. España es uno de los principales países productores de trucha en la Unión Europea, ocupando el primer puesto en cuanto al nivel de producción y el quinto respecto a su valor (Informe APROMAR, 2008). La lactococosis afecta de forma significativa a esta producción, debido a la mortalidad inducida en la trucha (superior al 50%), la disminución de la tasa de crecimiento de los animales y la imposibilidad de comercializar los peces afectados (Vendrell et ai., 2006). Otras especies de peces afectadas por L. garvieae son la anguila, el serióla y el pez gato. Además, L. garvieae es capaz de infectar a otras especies animales y a humanos, y por ello es considerado un agente con potencial zoonósico. L. garvieae es responsable de mastitis en ganado vacuno y búfalos (Teixeira et al., 1996), y de procesos neumónicos en ganado porcino (Tejedor et al., 2011). También se aisla frecuentemente de productos lácteos (quesos de fabricación artesanal), carne de cerdo y de pollo, y de verduras (Santos et al, 2005; Kawanishi et al., 2007, Foschino et al., 2008). En el hombre, L garvieae da lugar de forma esporádica a distintos procesos clínicos (Fefer et al., 1998, Wang er a/., 2007).

En la trucha, la lactococosis es una enfermedad septicémica generalizada que muestra una acusada estacionalidad. Está asociada a un aumento en la temperatura del agua, favorecida por deficiencias en la calidad del agua (Ghittino y Múzquiz, 1998, Vendrell et al., 2006) y cursa con un alto porcentaje de mortalidad (50-80% de la producción). También es de señalar que L. garvieae puede permanecer durante largo tiempo en el agua sin perder viabilidad, contribuyendo de este modo al mantenimiento de la infección en las instalaciones y a su diseminación (Vendrell et al., 2006). El tratamiento de esta enfermedad requiere la administración de antibióticos que resultan caros, difíciles de aplicar y en muchos casos son ineficaces debido a la aparición cada vez más frecuente de cepas de L. garvieae multirresistentes. En la actualidad, las medidas preventivas dirigidas contra la lactococosis en peces consisten en la utilización de vacunas y probióticos (Vendrell et al., 2007 y 2008). Sin embargo, aunque la vacuna comercial resulta efectiva, es costosa económicamente y requiere medidas de manejo estresantes para los peces y complicadas en su aplicación. Por otra parte, aunque los probióticos estimulan la respuesta inmune de los peces, no se ha demostrado que sean totalmente efectivos frente a la infección por L. garvieae.

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos sintetizados por diversas bacterias, y que presentan la capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias similares o de cepas de la misma especie de la bacteria productora. En la actualidad, la nisina, una bacteriocina producida por Lactococcus lactis, es empleada como conservante en la industria alimentaria (Delves-Broughton, 1990), en especial en la prevención de las posibles alteraciones del queso y de diversas carnes (tanto crudas como pre-cocinadas), mostrando efectividad frente a varias bacterias Gram positivas, como Clostridium spp., Listeria monocytogenes y diversas bacterias lácticas.

Hasta el momento sólo se han descrito tres bacteriocinas producidas por L. garvieae: Garviecin L1-5 (Villani et al., 2001 ), Garvicin ML (Borrero et al, 201 1) y Garvieacin Q (Tosukhowong et al., 2012). Todas estas bacteriocinas inhiben, en mayor o menor medida, el crecimiento tanto de L. garvieae como de otras bacterias Gram positivas, como Enterococcus faecium, Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Pediococcus spp, Lactobacillus casei, Lactobacillus sakei, Propionibacterium spp., Clostridium spp., Streptococcus pneumoniae y Lactococcus lactis.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN:

Usode la Garvicina A como producto antimicrobiano. Un aspecto de la presente invención se refiere a un producto que contiene al menos, un péptido llamado Garvicina A, que tiene actividad antimicrobiana y que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:1 , teniendo en cuenta que los aminoácidos que componen el péptido se seleccionan independientemente de los isómeros D o L. Así mismo, la invención incluye formulaciones que incluyen fragmentos de dicho péptido de, al menos, 22 aminoácidos y sus derivados que presentan al menos un 55% de identidad con los aminoácidos de la secuencia descrita en SEQ ID NO:1 , comprenden al menos una glicosilación, una amidación, una acilación, una acetilación, una metilación, o llevan un grupo protector, presentando dichos fragmentos y derivados una actividad antimicrobiana

Otro aspecto de la invención se refiere a un producto que contiene un polipéptido que comprende un péptido definido en los dos párrafos anteriores.

Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o un polipéptido según se han descrito en los párrafos anteriores. También se refiere a una construcción de ácido nucleico que codifica un péptido o polipéptido de los descritos aquí, en la que el ácido nucleico está enlazado a una o más secuencias control que dirigen la producción de dichos péptidos en una hospedador adecuado, e incluye, así mismo, vectores de expresión recombinante, células u organismos hospedadores que comprenden dicha construcción de ácidos nucleicos. La invención también se refiere a un método para producir uno de los péptidos o polipéptidos de la invención, que comprende: cultivar células u organismos hospedadores recombinantes o células de cualquiera de las cepas descritas en la invención bajo condiciones adecuadas para la producción del péptido o polipéptido; recolectar dichas células u organismos o tomar una muestra del medio de cultivo de las células o del cuerpo del organismo y, si procede; preparar un extracto crudo o extracto clarificado homogeneizado; y, si procede, enriquecer el nivel de pureza del péptido o polipéptido en el extracto homogeneizado o extracto crudo; y, si procede, añadir una o varias sustancias que modifiquen las propiedades fisicoquímicas de la formulación final. Entre las células y organismos hospedadores que se pueden utilizar en dicho método, se encuentran las células de insectos, larvas de insectos o insectos en estado pupa.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de dicha composición como bactericida o bacteriostático para aplicaciones en la industria alimentaria, especialmente en alimentación animal, y/o como agente profiláctico y/o terapéutico en acuicultura o en otra producción ganadera, frente a enfermedades infecciosas producidas por Lactococcus garvieae, otras lactococcosis u otras enfermedades.

Como consecuencia de la secuenciación de una cepa de L. garvieae en nuestro laboratorio (Aguado-Urda et al., 2011), se han caracterizado a nivel molecular las secuencias de ADN de los cinco plásmidos que forman el genoma completo de la cepa 21881 de L garvieae (Aguado-Urda et al., 2012). La cepa 21881 de L. garvieae ha sido depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Edificio de Investigación, 46100 Burjassot (Valencia) donde le ha sido asignado el número de depósito CECT8279. El análisis de los posibles ORFs correspondientes a los plásmidos pGL1 (4.536 bp), pGL2 (4.572 bp) y pGL5 (68.798 bp), muestra la existencia de genes que podrían codificar tres posibles bacteriocinas (Figura 1). En el plásmido pGL1 , el gen orf3 codificaría potencialmente una proteína de 72 aminoácidos (aa) que es idéntica en un 57% a una posible bacteriocina de Streptococcus pyogenes y en un 46% a una posible bacteriocina de Enterococcus faecalis. En el plásmido pGL2, el gen orfl podría codificar una bacteriocina de 71 aa, idéntica en un 57% a una posible bacteriocina de Streptococcus mitis y cuya secuencia líder es 70% idéntica a la de la Garvieacina Q (Tosukhowong et al., 2012). Separados por 2 nucleótidos, anexo al gen or†1 de pGL2 se localiza el gen entl que parece codificar una proteína de 97 aa involucrada, aparentemente, en la inmunidad frente a la acción bactericida que podría tener orfl. De hecho, entl presenta el dominio estructural correspondiente al de la familia "Enterocin A Immunity" (pfam 08951 ). Por último, en el plásmido pGL5, el gen or†37 parece codificar una proteína de 63 aa que, aunque no presenta ninguna homología significativa con ninguna bacteriocina descrita, podría tener actividad antimicrobiana al estar formando parte de un operón junto a otros tres genes presentes en pGL5 (denominados IgnCDÍ), que presentan una gran identidad (57-74%) con las proteínas implicadas en la inmunidad (Ignl) y en el procesamiento y secreción (IgnD, IgnC), de la lactococina A (Stoddard et al., 1992).

Con el fin de esclarecer qué bacteriocinas produce esta cepa de L. garvieae, se ha llevado a cabo la purificación de la/s proteína/s con actividad bacteriocina. A partir de cultivos de 5 litros de L garvieae 21881 crecido en medio MRS (D0 ₆ oonm =3.0) a 30°C, se procedió a la eliminación de las células bacterianas por centrifugación (10.000 rpm, 10 min) y a la filtración del sobrenadante por membranas de 0,2 mieras. La mitad del sobrenadante se ajustó con NaOH hasta pH 6,15 y la otra mitad se dejó al pH del cultivo (pH 4,87). Los sobrenadantes se mantuvieron congelados a -20°C, hasta su posterior utilización en ensayos de actividad microbicida en placa, por la técnica de difusión en agar, frente a diferentes especies de bacterias. De este modo, se estableció que los sobrenadantes de L garvieae 21881 presentaban actividad microbicida frente a L. garvieae exclusivamente (Tabla 1 y Figura 2a y 2b). Así mismo, a partir de los sobrenadantes de la cepa 21881 de L. garvieae crecida en medio MRS, se ha procedido a la purificación de la/s proteína/s con actividad bacteriocina mediante FPLC. El sobrenadante se mezcló con Amberlite XAD-16 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), a razón de 20 g por litro durante dos horas. Seguidamente, la matriz se lavó con 250 mi de agua destilada y 187,5 mi de etanol al 40% (v/v) en agua, y la fracción con actividad bacteriocina se eluyó con 500 mi de 2-propanol al 70% (v/v) en agua destilada (pH 2,0). El eluido fue posteriormente pasado por una columna de intercambio catiónico (SP-SepharoseFastFIow) e interacción hidrofóbica (Octyl-Sepharose CL-4B), siguiendo el protocolo de Maldonado et al. (2003). El eluido con actividad bacteriocina se aplicó a una columna Resource RPC 3-ml de cromatografía en fase reversa acoplada a un sistema de cromatografía líquida Fast-system, eluyendo la bacteriocina con un gradiente lineal de 2-propanol en 0,1 % de ácido trifluoroacético en agua (v/v).

Las fracciones eluidas en las diferentes etapas de purificación se analizaron en geles PAGE y en ensayos biológicos de actividad microbícida (Figura 2a), utilizando cepas como indicadoras:

^* L. garvieae 8831 : aislada en nuestro laboratorio a partir de un brote agudo de lactococosis en trucha arcoíris en España en 2004. * L. garvieae 4976: aislada en nuestro laboratorio a partir de un brote de alta mortalidad en anguila europea en 2006.

^* L. garvieae 3AA7: aislada de queso Cabrales.

^* L. garvieae Lg80: aislada de morcilla de Burgos en España (Santos et al., 2005). Además, las fracciones que contenían la bacteriocina purificada (Figura 5) se analizaron por MALDI-TOF-TOF (tiempo-de-vuelo-desorción/ionización láser asistida-por-una-matriz) (Figura 4) y de este modo, se ha podido establecer que la única bacteriocina secretada al medio de cultivo por la cepa L. garvieae 21881 es la codificada por el gen or†37 del plásmido pGL5. Además, la eliminación del plásmido pGL5 de la cepa L. garvieae 21881 , mediante dosis altas de novobiocina (0,125-8 Mg/ml) en el medio de cultivo, según el protocolo de Ruiz-Barba y colaboradores (1991 ), condujo a la pérdida de la producción de la bacteriocina, confirmando la localización del gen responsable de su síntesis en dicho plásmido. Esta nueva bacteriocina se ha denominado "Garvicina A".

Tal y como se muestra en la Tabla 1 , los estudios de la actividad antimicrobiana de la Garvicina A mediante ensayos de actividad microbicida en placa multipocillo, junto con la técnica de difusión en agar, demuestran que esta bacteriocina tiene un espectro de inhibición muy específico, siendo activa exclusivamente frente a otras cepas de L garvieae. Además, los ensayos de dilución de la actividad microbicida sobre la cepa indicadora L. garvieae 8831 , muestran que la Garvicina A es más activa que otras bacteriocinas estudiadas, siendo activa a diluciones 1/512 y reteniendo el 42% de su actividad a pH 6,15 tras un tratamiento de 5 minutos a 121°C. La actividad permanece durante períodos prolongados a temperatura ambiente, refrigeración o congelación a -20°C.

Por otro lado, los genes del operon IgnAICD se han clonado detrás del promotor constitutivo P59 de Lactococcus lactis, carente de su promotor original pero incluyendo el RBS (Figura 3). La fusión P59.lgnAICD se introdujo en el vector plL252 de bajo número de copias (6-9 copias), y el plásmido recombinante se introdujo por electroporación en la cepa Lactococcus lactis MG1363. La utilización del plásmido plL252 que es un plásmido natural de bajo número de copias, estable y no "autotransmisible", así como la utilización de la cepa L. lactis MG1363, que está considerada como una cepa "segura" (GRAS), permite la purificación de la bacteriocina en fermentadores a partir de medios de cultivo asequibles.

En la actualidad, las medidas preventivas dirigidas contra la lactococosis en peces consisten en la utilización de vacunas y probióticos. Sin embargo, aunque la vacuna comercial resulta efectiva, es costosa económicamente, requiere medidas de manejo estresantes para los peces y su aplicación es complicada, ya que debe realizarse por inyección intraperitoneal. Por otra parte, los probióticos, aunque estimulan la respuesta inmune de los peces, no se han demostrado totalmente efectivos frente a la infección por L garvieae. En el caso de la acuicultura, la especificidad de la Garvicina A permitiría eliminar la infección por las cepas de L. garvieae responsables de lactococosis. Además, la especificidad de la Garvicina A asegura que su utilización no afectaría a la microbiota intestinal de los peces, y que no interferiría con la actividad de los probióticos que se podrían aplicar de forma simultánea.

Por otra parte, L. garvieae es una bacteria que se aisla en diferentes especies animales y también en humanos, siendo la posible fuente de infección en estos casos, la ingestión de alimentos en los que se ha detectado esta bacteria: pescado, productos lácteos (quesos de fabricación artesanal), carne de cerdo y de pollo y verduras. En el caso de los alimentos, la utilización de esta bacteriocina podría evitar la contaminación de los mismos con cepas patógenas de L. garvieae, que podrían estar implicadas en el desarrollo de casos clínicos en humanos, sin por ello inhibir el desarrollo de otras bacterias lácticas implicadas en las características organolépticas y en la elaboración de los alimentos.

Por último, se ha estudiado el efecto a nivel fisiológico de Garvicina A sobre las cepas indicadoras mediante microscopía electrónica de transmisión (TAM). La Figura 5 muestra que esta bacteriocina parece afectar a la formación del septo durante la división celular, obteniéndose células anormalmente alargadas y no viables (Figura 5B). Este efecto es similar al de la bacteriocina Lcn972 de L. lactis IPLA972 (Martínez et al., 1999 y 2000). Las secuencias de los genes que forman el operón IgnAICD están depositadas en la base de datos del EMBL, donde se describe únicamente la caracterización molecular de los plásmidos, incluido pGL5 con el acceso numérico HE651326. La secuencia aminoacídica de la Garvicina A purificada en la actualidad es la siguiente:

MENNNYTVLSDEELQKIDGGIGGALGNALNGLGTWANMMNGGGFVNQWQ VYANKGKINQYRPY, siendo el pre-péptido la secuencia subrayada. La Garvicina A no se produce en cultivos de L. garvieae 21881 crecidos en el medio de Luria Bertani (LB). Se desconoce en la actualidad qué cambios post-traduccionales sufre la proteína activa en el medio de cultivo. El peso molecular (P.M.) de la Garvicina A se ha determinado experimentalmente por MALDI-TOF MS (espectometría en masa tiempo-de-vuelo- desorción/ionización láser asistida-por-una-matriz) en 4.678,59 Da y difiere en 33 Da del P.M. teórico de la secuencia de la proteína, lo que podría deberse a una oxidación post-traduccional de la Garvicina A en dos residuos de Metionina.

Tal y como se observa en la Figura 2b, la Garvicina A es eficaz tras cinco minutos de aplicación en cultivos bacterianos, y su eficacia es mayor en cultivos en mitad de fase logarítmica que en fase estacionaria. Estos resultados, junto con los obtenidos del estudio de microscopía electrónica, indican que la bacterocina afecta a la división celular de la bacteria (Figura 5). Por tanto, podría evitar la multiplicación de la bacteria tanto en los alimentos como en los tejidos del animal.

En definitiva, la presente invención propone la utilización de la nueva bacteriocina descrita, Garvicina A, en acuicultura o en la producción de alimentos en los que se requiera la inhibición específica de cepas patógenas de L garvieae. La Garvicina A presenta una gran actividad bactericida que se mantiene durante varios meses tanto en refrigeración como en congelación, y se mantiene estable tras un tratamiento de 50°C durante 10 min. A diferencia del resto de las bacteriocinas descritas hasta el momento producidas por L. garvieae, y a diferencia de los antibióticos permitidos en acuicultura, la actividad bactericida de la Garvicina A afecta únicamente a otras cepas de L garvieae. Las características de actividad y especificidad de la nueva bacteriocina (Garvicina A) suponen una ventaja considerable para su utilización en sistemas biológicos en los que se requiera específicamente la inhibición de crecimiento de L. garvieae, ya que no inhibe ni las cepas bacterianas utilizadas como probióticos en acuicultura, ni otras bacterias lácticas utilizadas en fermentaciones industriales para la obtención de alimentos. Tabla 1 : Actividad inhibitoria del sobrenadante de un cultivo de L garvieae 21881 , a 30°C evaluada mediante la técnica de difusión en agar.

Diámetro del halo de inhibición (cm)

Indicadores pH 4,85 pH 6

Enteroccus faecalis TAB 28

Enteroccus faecium P21

Listeria monocytogenes Scott A

Listeria monocytogenes CECT934

Listeria monocytogenes CECT 935

Staphylococcus epidermidis CECT231

Lactococcus lactis lactis MG16 14

Staphylococcus aureus CECT 86

Staphylococcus epidermidis CECT231

Lactobacillus delbruecki /CECT282

Lactococcu slactis lactis /L1403

Lactococcus lactis cremoris CECT697 — —

Lactococcus garvieae 8831 2,1 2,2

Lactococcus garvieae DK-25 1 ,3 1 ,5

Lactococcus garvieae 306/79 1,4 1 ,3

Lactococcus garvieae 1205 1 ,6 1 ,6

Lactococcus garvieae Lg80 1 ,5 1 ,4

Lactococcus garvieae 4AB5 1 ,6 1 ,5

Lactococcus garvieae BM06/00349 1,5 1 ,4

Lactococcus garvieae 148/03 1 ,5 1 ,5

Lactococcus garvieae CP-1 2 1,8

Lactococcus garvieae 3AA7 1 ,9 1 ,8

Lactococcus garvieae T1-1 1 ,6 1 ,6

Lactococcus garvieae 201 1 ,6 1 ,6

Lactococcus garvieae 1204 1 ,8 1 ,8 Lactococcus garvieae T2-17 1.6 1 ,6 Lactococcus garvieae CAS-2 1 ,5 1 ,6

Lactococcus garvieae 4977 2 2

Streptococcus bovis DSM 12643

Streptococcus uberis DSM20569

Streptococcus dysgalactiae DSM20662

Streptococcus oralis CECT 907

Streptococcus pyogenes CECT191

Streptococcus lactaris DSM23027

Streptococcus salivarius CECT 803

Pediococcus acidilactici CECT98

Escherichia coli 057: H7

Bordetella pertusis NCTC8616

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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figural : Esquema de los plásmidos con genes potencialmente implicados en la producción de bacteriocinas.

Figura 2: Efecto del sobrenadante del cultivo de L. garvieae 21881 sobre la cepa indicadora L. garvieae 8831 en a) ensayos de actividad microbicida en placa por la técnica de difusión en agar y b) en distintos estadios de la curva de crecimiento.

Figura 3: Clonación del operón IgnAICD detrás del promotor fuerte constitutivo P59 de L. lactis en plL252. RBS: sitio de unión del ribosoma; T: terminador de transcripción. Figura 4: Resultados del análisis por MALDI_TOF_TOF de las fracciones que contenían la bacteriocina purificada. En todas las muestras, después de la digestión con tripsina se obtenían péptidos correspondientes a la proteína Orf37 de pGL5. Figura 5: Gel SDS-PAGE de la Garvicina A purificada y de su actividad biológica.

Figura 6: A la izquierda se muestra un cultivo de L. garvieae 8831 antes del tratamiento con Garvicina A (A) y a la derecha el mismo tras la acción de la bacteriocina durante una hora (B).

Figura 7: Peces correspondientes a las infecciones experimentales con L garvieae 8831 (A) y L. garvieae 22 (B) Figura 8: Gráfica que muestra la inhibición del crecimiento producida por la Garvicina A sobre una cepa indicadora (L. garvieae Pw 1537) adicionada a leche estéril comercial. MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN:

La purificación de la bacteriocina, denominada Garvicina A, se puede realizar mediante las siguientes metodologías:

1) A partir de la cepa productora, L. garvieae 21881, portadora del plásmido pGL5 que contiene el operón IgnAICD, crecida a una rango de temperaturas entre 18°C y 37°C (los genes del operón se sobreexpresan a 37°C), en medio MRS durante 12 horas con o sin agitación. Tras el crecimiento bacteriano, se procederá a la eliminación de las células por centrifugación (10.000 rpm, 10min) y a la filtración del sobrenadante por membranas de 0,2 mieras. A partir de estos sobrenadantes la Garvicina A se purificará mediante FPLC, de la siguiente manera:

a) Columna de Amberlita XAD-16 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y elución con 70% (vol/vol) 2-propanol en agua destilada (pH 2,0).

b) Columnas de Intercambio catiónico (SP-SepharoseFastFIow) e interacción hidrofóbica (Octyl-Sepharose CL-4B) (Maldonado et al., 2003). c) Columna de cromatografía de fase reversa (GE Healthcare) acoplada a un sistema FPLC, con gradiente de elución lineal con una solución acuosa de 2-propanol (Merck) y 0.1% (vol/vol) de ácido trifluoroacético.

2) A partir de cepas recombinantes, transformadas con un plásmido en el que se introduzcan los genes del operón IgnAICD bajo la expresión de un promotor de expresión. En ese caso, el medio de cultivo empleado podrá ser un medio de cultivo económico con glucosa, sacarosa y fuente de nitrógeno apropiada. El proceso de purificación por FPLC será semejante al descrito anteriormente.

Adicionalmente, se contempla la utilización de las cepas recombinantes de L lactis adicionadas al suero de leche o al pienso de los animales, durante los procesos de fabricación de los mismos (procesos p re-fermentativos y procesos térmicos). 3) A partir de la clonación y expresión en cualquier otro sistema biológico que pueda añadirse de forma inocua a piensos de peces, agua o alimentos en proceso de fabricación. APLICACIÓN INDUSTRIAL:

La aplicación industrial de la Garvicina A como antimicrobiano deriva de sus características (ver apartado de la explicación de la invención) y la posible utilización tanto de Garvicina A purificada como del operón IgnAICD en otros sistemas biológicos, en cualquiera de sus posibles aplicaciones, tanto en la producción animal como en la industria alimentaria.

A) APLICACIÓN EN ACUICULTURA:

Para valorar la aplicación industrial de la Garvicina A en acuicultura, se estudió la producción de la misma en cultivos bacterianos incubados a 18°C, y en diferentes estadios de crecimiento, obteniéndose los siguientes resultados:

Tabla 2: Sobrenadante de L. garvieae 21881 crecido a 18°C (DO 0,3). Las placas de medio MRS con el indicador se incuban a 32 °C durante 24 horas.

Tabla 3: Sobrenadante de L. garvieae 21881 crecido a 18°C (DO 1 ,7). Las placas de medio MRS con el indicador se incuban a 32°C en las mismas condiciones.

Actividad inhibitoria (mm) indicadores pH 4,85 pH 6,13

L. garvieae Pw 1537 20 21

L. garvieae 8831 18 19

L garvieae! 182-81 21 21

Estos resultados muestran que la Garvicina A se sintetiza también a 18°C, desde el comienzo de la fase logarítmica hasta la fase estacionaria de crecimiento bacteriano.

Así mismo, y con el fin de valorar su utilización en ensayos experimentales de infección en peces, se estudió la actividad de la Garvicina A obtenida de cultivos bacterianos a 30°C y a 18°C, temperatura normalmente asociada con los brotes de lactococosis en truchas. Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 4: Sobrenadante de L. garvieae 21881 crecido a 30 °C. Las placas de MRS con el indicador se incuban a 18°C

Si comparamos estos datos con los mostrados en las Tablas 2 y 3, y con los de la Tabla 1 para las mismas cepas, observamos que la Garvicina A presenta una mayor actividad inhibitoria sobre otras cepas de L. garvieae, a 18°C. Este hecho propicia su posible utilidad como método preventivo de lactococosis en peces.

Con el fin de valorar la utilización del pez cebra (Daño rerío) como modelo de infección de L. garvieae en peces, se eligieron cuatro cepas bacterianas de diferente origen clínico, en los ensayos de "desafío":

• L. garvieae CP1 : aislada de un brote de lactococosis en trucha en 1991 • L. garvieae 8831 : aislada deun brote de lactococosis en trucha en 2004

• L. garvieae Lg22: aislada de un brote de lactococosis en serióla.

• L. garvieae 4976: aislada de un brote de lactococosis en anguila europea.

Se utilizaron diez acuarios de 1 ,5 litros de agua en los que se repartieron 5 peces por acuario, de aproximadamente 2-4 cm de longitud. Por cada grupo de infección y grupo control se utilizaron dos acuarios, realizando de este modo el ensayo por duplicado. Las cepas de L. garvieae patógenas se incubaron en medio MRS hasta una concentración de 10 ⁹ UFC/ml. De cada cultivo se realizaron diluciones 1/4 y de éstas, se tomaron 20 microlitros para inyectar a cada pez. Para las inyecciones intraperitoneales se emplearon jeringas estériles UI-1 mi (G29X1/2") con aguja incorporada.

Para la infección y el sacrificio, los animales fueron previamente anestesiados con Metansulfonato de tricaína o MS-222 en baño, a una dosis de 50 mg /L. En el acuario utilizado como control, los animales fueron inoculados con 20 microlitros de medio MRS estéril. Tras la inoculación, se hizo el seguimiento de los animales, y se registraron las mortalidades. A de los animales muertos se realizaron necropsias para análisis microbiológico e histológico. Para el análisis histológico los animales fueron introducidos en una solución de formaldehido al 10% en tampón fosfato sódico 80 mM, pH 6,7. A la finalización del experimento, los animales de acuario control fueron sacrificados y procesados para análisis microbiológico e histológico.

A las 48 horas post-infección, las mortalidades registradas fueron las siguientes:

· Infección con L. garvieae CP1 : 40% de animales muertos. El análisis microbiológico de los peces muestra el aislamiento de una bacteria de perfil bioquímico (API Rapid ID32 Strep): 30223111130, correspondiente a la misma cepa de L. garvieae (99,8% identificación de especie).

· Infección con L garvieae 8831 : 66% de animales muertos. El análisis microbiológico de los peces muestra el aislamiento de una bacteria de perfil bioquímico (API Rapid ID32 Strep): 30223101131 , correspondiente a la misma cepa de L. garvieae (99,9% identificación de especie).

• Infección con L. garvieae Lg22: 75% de animales muertos. El análisis microbiológico de los peces muestra el aislamiento de una bacteria de perfil bioquímico (API Rapid ID32 Strep): 30223001010, correspondiente a la misma cepa de L. garvieae (99,6% identificación de especie).

• Infección con L. garvieae 4976: 73% de animales muertos. El análisis microbiológico de los peces muestra el aislamiento de una bacteria de perfil bioquímico (API Rapid ID32 Strep): 30223001010, correspondiente a la misma cepa de L. garvieae (99,6% identificación de especie)

En la mayoría de los animales muertos se observaron hemorragias externas, ascitis, exoftalmos y, en ocasiones, hemorragias oculares (Figuras 7A y B). Las lesiones histológicas detectadas en los animales infectados fueron significativas.

En ninguno de los animales del acuario control se aisló L garvieae, siendo las bacterias aisladas identificadas como enterobacterias, Aeromonas spp. y Enterococcus faecalis.

La aplicación de la Garvicina A en acuicultura deriva de los experimentos de actividad biológica realizados in vitro y de los resultados de protección obtenidos en los experimentos de infección in vivo en pez cebra, realizados por inyección intraperitoneal con la cepa L. garvieae 8831 y la bacteriocina purificada. En los ensayos en los que se ensayó la protección proporcionada por la bacteriocina purificada en peces cebra se procedió de la siguiente manera:

1.- Se utilizaron 10 acuarios de 1 ,5 litros de agua en los que se repartieron 6-8 peces por acuario, de 2-4 cm de longitud. Los peces se mantuvieron a temperatura ambiente durante todo el ensayo

2.-.Los peces de los acuarios 1 , 2 y 3 se inocularon intraperitonealmente, con 10 ⁸ UFC/pez de la cepade L. garvieae elegida (cepa 8831) a la que se añadió una dilución 1/10 de Garvicina A purificada (equivalente a 200UA/ml). En los acuarios 4 y 5, los animales se inyectaron con MRS estéril y Garvicina A, como control.

3. Los peces de los acuarios 6 y 7 sirvieron como control de infección. Se realizó la inoculación con la cepa L.garvieae 883 a una concentración 10 ⁸ UFC/pez por inyección intraperitoneal.

4. Los animales se mantuvieron en condiciones óptimas de alimentación y ambiente, y se observaron diariamente durante 4 días.

A las 96 horas post-infección las mortalidades registradas fueron las siguientes:

• Infección con L srarw ^' eae8831 : 53% de mortalidad. El análisis microbiológico de los peces muestra el aislamiento de una bacteria de perfil bioquímico (API Rapid ID32 Strep): 30323101131 , correspondiente a la misma cepa L. garvieae 8831 (99, 9% identificación de especie).

• Infección con L. garvieae 8831 y Garvicina A: 0% de mortalidad. En el análisis microbiológico más del 70% de los animales fueron negativos para el aislamiento de L garvieae. En los animales restantes (29%), se aisló L. garvieae en cantidad inferior a la de la dosis infectiva.

Conclusión: La mortalidad en el control de infección fue mayor del 50%. El porcentaje relativo de supervivencia en los peces inoculados con L. garvieae junto con Garvicina A fue del 100%, con una reducción del patógeno superior al 70%.

B) APLICACIÓN EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA:

Para valorar la aplicación industrial de la Garvicina A en la industria alimentaria, se estudió la inhibición del crecimiento de una cepa indicadora (L garvieae Pw 1537) adicionada a una concentración de 10 ⁸ UFC/ml de leche estéril comercial. A la muestra de leche una vez inoculada, se le adicionó 200 UA/ml de Garvicina A y se incubó a 30° C durante 6 horas. A diferentes tiempos (15 min, 30 min, 1 hora, 2 horas y 4 horas) se recogieron muestras de 1 mi de leche para realizar recuentos de L. garvieae en placas de medio selectivo Columbia sangre/ nalidíxico/colistina (BioMérieux). Los resultados se muestran en la figura 8.

Tal y como se observa, a los cinco minutos y durante dos horas de incubación, la Garvicina A, a las concentraciones ensayadas, fue capaz de eliminar casi por completo la presencia de L. garvieae y de inhibir el crecimiento de este microorganismo en leche.