ALCAINO GORMAN JENNIFER (CL)
ALCAINO GORMAN JENNIFER (CL)
REIVINDICACIONES
1.- Una secuencia de ADN CARACTERIZADA porque codifica para una enzima que tiene una actividad citocromo P450 reductasa que actúa como donador de electrones para la reacción de catalizada por la enzima astaxantina sintasa y que transforma el beta-caroteno en astaxantina, preferiblemente en X. dendrorhous.
2.- El ADN aislado de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque: a) la secuencia de nucleótidos codifica para dicha enzima y tiene una secuencia mostrada en SEQl, o b) Una secuencia de nucleótidos que, debido a que el código genético es degenerado, codifica para citocromo P450 reductasa teniendo igual secuencia de aminoácidos que la codificada por la secuencia nucleotidica a) ;
c) Una secuencia de nucleótidos que híbrida el complemento de la secuencia nucleotidica de a) y b) bajo condiciones de estrictez estándar.
3.- El ADN aislado de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque: a) Una secuencia de nucleótidos representada por la SEQ2; b) Una secuencia de nucleótidos que, debido a que el código genético es degenerado, codifica para citocromo P450 reductasa teniendo igual secuencia de aminoácidos que la codificada por la secuencia nucleotidica a) ; c) Una secuencia de nucleótidos que hibrida el complemento de la secuencia nucleotidica de a) y b) bajo condiciones de estrictez estándar.
4.- Una secuencia de aminoácidos que tiene actividad citocromo P450 reductasa, codificada por las secuencias nucleotidicas de las reivindicaciones 2 y 3, CARACTERIZADA porque tiene la secuencia SEQ3, preferiblemente de X. dendrorhous.
5.- El polipéptido aislado de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque: a) Una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ3; o b) Un polipéptido similar a la SEQ3 que posea cambios en uno o más aminoácidos y que mantenga la actividad citocromo P450 reductasa descrita. c) Un polipéptido descrito en a) y b) sintetizado mediante síntesis química o biosintesis.
6.- Un oligonucleótido CARACTERIZADO por hibridar con las secuencias correspondientes a las reivindicaciones 1 a 3.
7. - Un oligonucleótido aislado de acuerdo a la reivindicación 6 CARACTERIZADO porque es útil para amplificar secuencias de ADN mediante técnica de PCR u otra utilización para técnicas de biología molecular descritas en el estado del arte.
8.- Un vector o plasmidio CARACTERIZADO porque comprende el segmento de ADN reivindicado en las reivindicaciones 1 a 3.
9.- Un organismo huésped CARACTERIZADO porque es transformado o transfectado por el ADN aislado descrito en las reivindicaciones 1 a 3 o un vector o plasmidio descrito en la reivindicación 7.
10.- Un proceso de producción de un polipéptido que tenga una actividad citocromo P450 reductasa CARACTERIZADO porque comprende el cultivo de un organismo huésped transformado como se describe en la reivindicación 8, cultivado bajo condiciones conducentes a la producción de dicha enzima.
11.- Un proceso para la producción biológica de astaxantina CARACTERIZADO porque comprende la introducción de uno o más aislados de ADN como los detallados en las reivindicaciones de 1 a 4 en un organismo huésped apropiado, cultivado bajo condiciones que conduzcan a la producción de astaxantina y la recuperación de astaxantina a partir del cultivo.
12.- Un proceso de producción de astaxantina a partir de Beta-caroteno CARACTERIZADO porque contempla la donación de electrones por parte del polipéptido detallado en las reivindicaciones 4 y 5 para la reacción catalizada por astaxantina sintasa, en una mezcla de reacción apropiada que contenga una membrana reconstituida apropiada.
13.- El proceso de producción de astaxantina a partir de beta-caroteno CARACTERIZADO porque el polipéptido de las reivindicaciones 4 y 5 está presente en forma de una membrana reconstituida la cual es preparada a partir de una membrana biológica como un microsoma o una membrana mitocondrial .
14,- El proceso de producción de astaxantina a partir de betacaroteno CARACTERIZADO porque el polipéptido de las reivindicaciones 4 y 5 es presentado en la forma de una membrana reconstituida artificial, como un liposoma.
15.- Las composiciones, productos y/o formulaciones CARACTERIZADAS porque comprenden los vectores o plasmidios, ADN genómico, ADN complementario y fragmentos del gen crtR contemplados en las reivindicaciones 1, 2, 3, 6, 7, 8, útiles para transformación de organismos huéspedes y producción de astaxantina contempladas en las reivindicaciones 9, 10 y 11. |
USO DE GEN EN LA SíNTESIS DE ASTAXANTINA
CAMPO DE LA INVENCIóN
La levadura basidiomicete Xanthophyllomyces dendrorhous sintetiza carotenoides, principalmente la xantofila astaxantina, de gran interés comercial debido a su uso como suplemento alimenticio en la industria acuicola.
En la presente invención se describe el material genético y el polipéptido que codifica, el cual posee actividad citocromo P450 reductasa y participa en la síntesis de astaxantina a partir de beta-caroteno, actuando como donador de electrones en la reacción catalizada por la enzima astaxantina sintasa.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN
Los carotenos son un grupo de pigmentos naturales producidos principalmente por plantas, levaduras y microalgas. Particularmente la xantofila astaxantina es un compuesto ampliamente encontrado en la naturaleza, este posee
una gran importancia comercial ya que es utilizada como aditivo alimenticio para pigmentar la carne de truchas y salmones en la acuicultura (Johnson y cois. 1977) . Por otro lado • y debido a su actividad altamente antioxidante, se han observado sus beneficios para la salud humana como, por ejemplo, en la prevención de enfermedades cardiovasculares, favorece al sistema inmune, bioactividad contra Helicobacter pylori y prevención de cataratas (Higuera-Ciapara y cois. 2006) .
Originalmente, la obtención de este compuesto se realizaba directamente a partir de crustáceos (organismos ricos en este pigmento) , en la actualidad la producción se realiza mayoritariamente mediante síntesis química, algunos ejemplos son los descritos en las patentes US4.245.109, US5.210.314, US5.625.099 y US5.654.488.
Otra manera de obtención de astaxantina es la biosintesis y extracción a partir de microorganismos, en este sentido tienen mayor importancia el uso de microalga (Haematococcus pluviales) y levadura {Xanthophyllomyces dendrorhous) . El crecimiento, producción y extracción de
astaxantina en microalgas ha sido descrita en varias patentes, entre ellas CNl.966.660, JP2007/222168, KR2005/0005341, MX/PA05/007801, sin embargo, si se compara la astaxantina producida por Haematococcus pluvialís con la obtenida de Xanthophyllomyces dendrorhous, existen diferencias importantes. En agua dulce, la microalga verde unicelular H. pluvialis ha sido reconocida durante muchos años como un acumulador del carotenoide astaxantina, bajo ciertas condiciones de stress, tales como alta intensidad de luz y/o limitación de nitrógeno, las células de esta alga forman quistes y acumulan altas cantidades de astaxantina (>1% de peso seco) (Margalith, 1999) , cambiando su coloración de verde a rojo. Esta microalga ha recibido recientemente mucha atención debido a su capacidad de sintetizar y acumular grandes cantidades de astaxantina durante y al finalizar su fase de crecimiento (Margalith, 1999) . Sin embargo, la utilización H. pluvialis como fuente de astaxantina resultó deficiente debido a la obtención de pigmentos de calidad inferior a la requerida comercialmente, dado el elevado porcentaje de esterificación de la astaxantina obtenida
(Sominer et al 1991) . En este sentido, la astaxantina producida por la levadura Xanthophyllomyces dendrorhous, es 100% libre (no esterificada) y está compuesta por el isómero óptico 3R, 3R' y el isómero geométrico "trans", lo que le otorga una gran ventaja comparativa sobre la producida por la microalga (Andrewes y Starr, 1976) . A pesar de que las microalgas son la fuente natural con el más alto contenido de astaxantina conocido, el interés para la explotación comercial de estos organismos no ha sido suficiente debido a los altos índices de contaminación con protozoos y a un menor desarrollo de las tecnologías de cultivo, en comparación con organismos heterotróficos como las levaduras.
La ruta biosintética de pigmentos carotenoides ha sido ampliamente estudiada en levaduras, en la Figura 1 se muestra la ruta identificada para X. dendrorhous y se detallan aquellos genes que han sido aislados, secuenciados, caracterizados y publicados (Kajiwara y cois., 1997, Niklitschek y cois., 2008, Verdoes y cois., 1999a; Alcaíno, 2002, Verdoes y cois., 1999b; León, 2000) . En la formación de astaxantina a partir de beta-caroteno se requiere de dos
actividades enzimáticas: cetolasa que incorpora un grupo ceto en las posiciones 4 y 4' de la molécula de beta-caroteno e hidroxilasa que introduce un grupo hidroxilo en las posiciones 3 y 3' del beta-caroteno (Cunningham y Gantt 1998; Linden 1999) . A diferencia de otros organismos donde participan dos genes independientes en este paso, en X. dendrorhous se ha aislado un gen crtS que codifica para una enzima astaxantina sintasa la que presenta ambas actividades (EP 1.035.206; 0j ima y cois., 2006; álvarez y cois., 2006) . A partir de la secuencia aminoacidica deducida del gen crtS y realizando análisis bioinformáticos, se determinó que la enzima astaxantina sintasa de X. dendrorhous pertenece a la familia de proteínas citocromo P450 monooxigenasas (Oj ima y cois. , 2006) .
Para la inserción del oxigeno al sustrato, las enzimas del tipo Citocromo P450 monooxigenasas requieren de un sistema donador de electrones que en eucariontes es una proteina citocromo P450 Reductasa (CPR) (van den Brink y cois., 1998) . Adicionalmente, Oj ima y cois (2006) describieron un trabajo en el cual se transformó Escherichia
coli con 3 plasmidios compatibles entre si, uno de los plasmidios contenia los genes necesarios para la síntesis de beta-caroteno, otro contenia el gen crtS de X. dendrorhous y el tercero contenia un gen de la Citocromo P450 reductasa de Saccharomyces cerevisiae, mediante este sistema sólo fue posible obtener derivados oxigenados de beta-caroteno, pero no astaxantina. A partir de estos resultados se puede inferir la necesidad de contar con la secuencia de Citocromo P450 reductasa adecuada para complementar la ruta biosintética en el sistema.
En este sentido, no se ha aislado ni secuenciado aun el gen que codifica para la enzima Citocromo P450 reductasa proveniente de X. dendrorhous, ni se ha demostrado su participación en la síntesis de astaxantina.
La presente invención describe la secuencia del gen crtR y el polipéptido que codifica, el cual posee actividad Citocromo P450 Reductasa de X. dendrorhous. Esta invención otorga herramientas técnicas que permiten transformar microorganismos ya sea potenciando su capacidad natural de producir astaxantina o creando nuevas rutas metabólicas en
otros organismos no carotenogénicos que permitan la producción de este pigmento de una manera comercialmente atractiva.
DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN
La presente invención se refiere al material genético que codifica para la enzima citocromo P450 reductasa (CPR) , entendiéndose material genético como la secuencia de ácidos nucleicos del tipo ADN genómico, ADN complementario, ARN mensajero y las respectivas variantes alélicas que codifiquen para un polipéptido con actividad de CPR, útil para la producción de astaxantina mediante la transformación de organismos huéspedes que pueden o no ser productores naturales de dicho carotenoide.
BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS
Figura 1, Principales pasos de la ruta de biosintesis de astaxantina en X. dendrorhous. Se señalan los genes estructurales de la via que han sido clonados y secuenciados . Se muestra el color de las colonias que
acumulan carotenoides intermedios en la ruta de biosíntesis. El color es un indicador del tipo de pigmento que se está obteniendo en las diferentes etapas de la síntesis.
Figura 2, Secuencia de ADN genómico (SEQl) del gen crtR de X. dendrorhous . Los fragmentos de la secuencia subrayados corresponden a los exones del gen. En negritas y subrayados se destacan aquellos ácidos nucleicos identificados como sitios dadores y receptores para procesos de empalme. Se indican los sitios de restricción para la enzima Bamñl .
Figura 3, Comparación de secuencias nucleotidicas de genes de NADPH-citocromo P450 reductasa de diferentes hongos. C_echinulata : Cunninghamella echinulata (Zygomycete) N°Acceso GenBank: AF195660. S_cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae (Ascomycete) N°Acceso GenBank: D13788. R_minuta: Rhodotorula minuta (Basidiomycete) N°Acceso GenBank: AB055119. En gris se muestra donde alinean algunos de los partidores descritos en la tabla 1.
Figura 4, Secuencia de ADN complementario (SEQ2) correspondiente a la región codificante del gen crtR y
traducción a secuencia aminoacidica (SEQ3) con código de una letra por cada aminoácido. En letras cursivas: Exon 1 gen crtR. En letras negras: Exon 2 gen crtR. Secuencia subrayada: Exon 3 gen crtR.
Figura 5, Secuencia de aminoácidos deducida a partir de la región codificante del gen crtR. En negro y subrayado se destacan los dominios conservados de la proteina, en orden se encuentran: Dominio de transmembrana, dominio de unión a FMN, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NAD(P)H, identificados mediante el programa BlastP.
Figura 6, Esquema del proceso de obtención de las construcciones diseñadas para obtener la deleción del gen crtR en cepas silvestres UCD67-385 y CBS6938 de X. dendrorhous .
Figura 7, Esquema de los eventos de mutación del gen crtR por recombinación homologa en las cepas silvestres UCD67-385 (385) y CBS6938 (CBS) de X. dendrorhous, donde A muestra la transformación de la cepa UCD67-385. y B muestra transformación de cepa CBS6938.
Figura 8, Cultivo de levaduras silvestres (UCD 67- 385 y CBS 6938) y transformantes (T13: derivada de UCD 67-385 y CBSTr: derivada de CBS 6938) en placa de petri con medio de cultivo YM-agar.
Figura 9, Análisis de los pigmentos presentes en las levaduras silvestres (UCD 67-385 y CBS 6938) y transformadas (T13 y CBSTr) .
(A) Cromatogramas por HPLC (465 nm) . En cada pico se indica al carotenoide que corresponde, NI: No Identificado.
(B) Gráfico que muestra una comparación de los pigmentos producidos por cepas silvestres y su respectivo mutante, expresado en ppm (partes por millón) de cada pigmento detectado.
Figura 10, GeI de reacción de PCR de cepas silvestres y transformantes, λ: Estándar de tamaño molecular ADN bacteriófago λ digerido con la enzima HindIII (Bandas de 23.1, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0 y 0.6 kb)
A: PCR de UCD67-385 y transformante T13. Carril: (1) : ADN 385 + gpd rev+SEQ50, (2) : ADN T13 + gpd rev+SEQ50,
(3) H 2 O + gpd rev+SEQ50, (4): ADN 385 + SEQ14+Pef fwd, (5): ADN T13 + SEQ14+Pef fwd, (β) : H 2 O + SEQ14+Pef fwd, (7) : ADN 385 + SEQ14+SEQ50, (8) : ADN T13 + SEQ14+SEQ50, (9) : H 2 O + SEQ14+SEQ50, (10) : ADN 385 + SEQ14+SEQ15, (11) : ADN T13+ SEQ14+SEQ15 y (12) : H 2 O+ SEQ14+SEQ15.
B: PCR de CBS6938 y transformante CBSTr. Carril: (1) : ADN CBS + Pef fwd+SEQ35, (2) : ADN CBSTr + Pef fwd+SEQ35, (3) : H 2 O + Pef fwd+SEQ35, (4) : ADN CBS 4- gpd rev+SEQ30, (5) : ADN CBSTr 4- gpd rev+SEQ30 y (6) : H 2 O 4- gpd rev+SEQ30.
C: PCR de transformante CBSTr. Carril: (1) : ADN CBSTr + SEQ754-hygSecR, (2) : ADN CBSTr + HF+SEQ35, (3) : ADN CBSTr + HygSecF+M13F, (4) : ADN CBSTr + M13R+SEQ15, (5) : ADN CBSTr + SEQ20+SEQ50 y (6) : ADN CBSTr 4- SEQ30+SEQ50.
DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN
La presente invención se relaciona con un gen y una enzima que está involucrada en la última etapa de la sintesis de astaxantina a partir de beta-caroteno.
La presente invención provee una secuencia de ADN genómico (gen crtR) y ADN complementario que codifica para
una enzima con actividad Citocromo P450 reductasa (CPR) responsable de entregar los electrones necesarios para la incorporación de los grupos ceto e hidroxilo a la molécula de beta-caroteno para obtener astaxantina, esta reacción es catalizada por la enzima astaxantina sintasa.
La presente invención se refiere a las secuencias de ADN del gen crtR de X. dendrorhous, en su modalidad preferida secuencias de ADN genómico y ADN complementario, asi como también fragmentos de dicho gen, siendo estos semi- degenerados o no.
La presente invención se refiere a una secuencia de ADN genómico del gen crtR, su hebra complementaria, sus variantes alélicas y secuencias representadas con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos que codifiquen para un polipéptido que tenga actividad enzimática CPR. Debido a que el código genético es degenerado, esta invención también contempla secuencias de ácidos nucleicos que hibriden con el gen crtR, bajo condiciones de estrictez estándar, como por ejemplo la descrita por Sambrook y cois 2001. En su modalidad preferida,
la secuencia de ADN corresponde a la SEQl y se caracteriza por provenir de X. dendrorhous y poseer 9.903 pares de bases, dentro de ella se identifican ácidos nucleicos descritos como sitios dadores y receptores para procesos de empalme {splicing) , dichos ácidos nucleicos están marcados en negro y subrayados en la SEQl (figura 2) . La secuencia de ADN genómico de dicho gen se caracteriza por poseer 3 segmentos de la secuencia que corresponden a los exones, subrayados en la SEQl.
Esta invención también considera una secuencia de ADN complementario, su hebra complementaria y la secuencia de ARN mensajero que la genera, sus variantes alélicas y secuencias representadas con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos que codifique para un polipéptido que tenga actividad enzimática CPR. Debido a que el código genético es degenerado, esta invención también contempla secuencias de ácidos nucleicos que hibriden con el complemento del gen crtR, bajo condiciones de estrictez estándar, como por ejemplo la descrita por Sambrook y cois. En su modalidad preferida dicho ADN complementario es
sintetizado a partir de los ARN mensajeros generados del gen crtR, y se refiere a la SEQ2 (figura 4), dicho ADN complementario representa el segmento codificante del gen crtR y posee un largo de 2.241 pares de bases.
La invención también se refiere a métodos de obtención de secuencias de ADN del gen crtR de X. dendrσrhous. En una primera modalidad o etapa dicho método corresponde a la identificación del ADN genómico del gen de interés, o parte de éste, empleando fragmentos semi- degenerados . Adicionalmente, en otra modalidad o etapa consecutiva, se identifica el gen de interés con fragmentos de la secuencia aislada de la etapa anterior. De preferencia en la primera etapa se emplean secuencias de consensos de segmentos conservados entre genes equivalentes al de interés provenientes de otras especies.
En una modalidad preferida, la invención comprende la comparación mediante técnicas de bioinformática de secuencias conocidas de genes de Citocromo P450 reductasa de otras levaduras, la identificación de segmentos conservados y el diseño, en base a ellos, de fragmentos cortos de ácidos
nucleicos (entre 15 y 30 pares de bases), útiles para la identificación y amplificación de secuencias de ADN. En su modalidad preferida, se diseñaron los fragmentos de ADN descritos en la tabla 1 (SEQ4 a SEQ9) . Dichos partidores son semi-degenerados y consideran los caracteres R, K, D, H, W, Y como representaciones de los siguientes grupos de ácidos nucleicos: R= G o A, K= G o T, D = G o A o T, H = A o T o C, W = A o T, Y = T o C, la ubicación de dichos partidores dentro de la secuencia genómica del gen crtR, de las especies consideradas para este diseño se describe en la figura 3. Dichos fragmentos fueron utilizados para amplificar parte del gen crtf? a partir de ADN genómico de X. dendrorhous mediante la técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction) . En la segunda etapa se diseñan los fragmentos no degenerados de ADN de la tabla 1 (SEQlO a SEQ106) . En particular los partidores desde SEQlO a SEQ13 fueron utilizados para identificar clones de genotecas de ADN genómico y ADN complementario de X. dendrorhous portadores de fragmentos del gen crtR, mediante la técnica de PCR. El resto de los partidores mencionados fueron usados para la secuenciación completa del gen crtR.
Tabla 1: Fragmentos de ADN útiles para la identificación y amplificación del gen crtR.
Por otro lado, esta invención se refiere a una secuencia de aminoácidos con actividad Citocromo P450 reductasa, correspondiente en su modalidad preferida a la descrita en la SEQ3 (Figura 5) , y codificada por el gen crtR, el ARN mensajero o el ADN complementario generado a partir de dicho gen, sus hebras complementarias, variantes alélicas y secuencias representadas por SEQl o SEQ2 con adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más nucleótidos, o secuencias de ácidos nucleicos que hibriden bajo condiciones de estrictez estándar con la secuencia genómica o ADN complementario (ej . Condiciones detalladas por Sambrook y cois. 2001) . En su modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos del polipéptido con actividad CPR posee 746
aminoácidos , SEQ3 (figura 5) , mediante comparaciones utilizando herramientas bioinformáticas, se identificaron ciertos dominios conservados marcados en la SEQ3, y que corresponden, en orden de aparición a: dominio transmembrana, dominio de unión a FMN, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NAD(P)H.
La presente invención está dirigida también a variantes del polipéptido SEQ3. Dichas variaciones se refieren a la adición, inserción, deleción y/o sustitución de uno o más aminoácidos en dichas secuencias, mientras estos derivados mantengan la actividad descrita. Dicha actividad puede ser medida por cualquier ensayo conocido en el estado del arte o descritos especificamente en este documento. Dichas variantes pueden ser sintetizadas mediante síntesis químico o mediante recombinación en base a las secuencias de ADN disponibles, utilizando métodos del estado del arte.
La presente invención se refiere al uso del polipéptido CPR, cuya modalidad preferida es la SEQ3, para la obtención de organismos modificados con fines de aumentar la producción de astaxantina o generar nuevas rutas metabólicas
conducentes a su bioproducción en organismos apropiados. En otra modalidad, se utiliza la secuencia de ADN codificante para la secuencia SEQ3 modificada para suprimir la función citocromo P450 reductasa en organismos productores de astaxantina en conjunto con astaxantina sintasa, este uso es sugerido con fines de investigación.
En su modalidad preferida, la invención comprende la supresión de la funcionalidad del gen crtR en la levadura X. dendrorhous y la evaluación de las cepas transformadas a nivel fenotipico y genotipico. La deleción del gen crtR- se realiza reemplazando el gen nativo en cepas silvestres de X. dendrorhous por un módulo que posee un fragmento de dicho gen interferido por un marcador de selección, de preferencia genes de resistencia a antibiótico. En su modalidad preferida dicho reemplazo del gen nativo se realizó por recombinación homologa utilizando un vector apropiado que contiene el módulo descrito anteriormente, particularmente, se diseñaron los vectores descritos en la figura 6 y se transformó con ellos dos cepas de X. dendrorhous nativas obteniéndose dos cepas transformadas (CBSTr y T13) que poseen una capacidad
reducida de producción de astaxantina respecto de las cepas nativas de las que provienen. La evaluación fenotipica de las cepas transformadas se realiza mediante la inspección visual del color de la levadura en cultivo y su comparación con la cepa nativa, en otra modalidad, mediante la identificación de los pigmentos que contiene, de preferencia utilizando la técnica HPLC (High Performance Liquid Chromatography) . En la evaluación a nivel genómiσo de la deleción del gen crtR en las cepas transformadas, esta invención contempla el análisis y comparación de la secuencia genómica correspondiente a este gen mediante técnicas de biología molecular presentes en el estado del arte, de preferencia a través de su amplificación mediante PCR utilizando los fragmentos descritos en la tabla 1, en especial los fragmentos SEQ14, SEQ15, SEQ20, SEQ30, SEQ35, SEQ50, SEQ76, y aquellos descritos en la tabla 3.
La presente invención está también dirigida un vector o plasmidio que comprenda las secuencias de ADN descritas anteriormente y una célula huésped transformada o transfectada con dicho ADN o un vector o plasmidio descrito anteriormente .
Asimismo, esta invención contempla composiciones, productos y/o formulaciones que comprenden dichos vectores o plasmidios, ADN genómico, ADN complementario y fragmentos del gen descritos previamente. Dichas composiciones, productos y/o formulaciones, asi como las secuencias descritas anteriormente, pueden ser empleadas con fines de investigación, producción, análisis o técnicas de biología molecular existentes en el estado del arte. De manera preferida en los procesos necesarios para la transformación de organismos con el fin de obtener una producción modificada de astaxantina y evaluación de dichas transformaciones.
La presente invención contempla la obtención de organismos recombinantes transformados a partir de los vectores o plasmidios y el ADN que contienen, y el cultivo de estos organismos transformados bajo condiciones que conduzcan a la producción de dicho polipéptido o a la producción de astaxantina.
El polipéptido contemplado en la presente invención y las secuencias que lo codifican son útiles para manipular genéticamente organismos naturalmente productores de
astaxantina con el fin de potenciar sus capacidades de biosintesis o de generar la ruta biosintética en otros organismos, que por sus cualidades de crecimiento, condiciones de cultivo, biodisponibilidad y otros pueden ser productivamente más atractivas para la obtención de dicho pigmento, tal como es el caso de Saccharomyces cerevisiae.
A continuación se describen algunos ejemplos de aplicación, los que no pretenden ser exclusivos ni limitantes a la invención.
EJEMPLOS DE APLICACIóN
Ejemplo 1: Obtención de la secuencia de ADN genómico del gen crtR a partir de X. dendrorhous .
Para aislar y caracterizar el gen crtR de X. dendrorhous se diseñaron oligonucleótidos que permitieran amplificar partes del gen crtR mediante la técnica de PCR (Reacción de la Polimerasa en Cadena) . Con este fin se compararon secuencias nucleotidicas de genes de enzimas CPRs de las levaduras Cunninghamella echinulata, Saccharomyces
cerevisiae y Rhodotorula minuta mediante el programa Clustal W, se identificaron zonas conservadas y en base a ellas se diseñaron los oligonucleótidos semi-degenerados descritos en la tabla 1 (SEQ4 a SEQ9) y cuya ubicación dentro de las secuencias comparadas se muestra en la figura 3. Utilizando la pareja de partidores SEQ4 y SEQ8, se amplificó el gen crtR a partir de ADN genómico de X. dendrorhous de la cepa silvestre UCD 67-385, utilizando un protocolo de PCR bajo las siguientes condiciones: denaturación inicial 95°C por 3 minutos, 35 ciclos: denaturación a 94 0 C por 30 segundos, alineamiento a 55° C por 30 segundos, extensión a 72 0 C por 3 minutos. Luego una extensión final a 72 0 C por 10 minutos. El amplificado obtenido fue corrido en un gel de agarosa al 0,8% y purificado a partir de él, posteriormente fue secuenciado. Mediante esta técnica fue posible obtener un amplificado de 1649 pares de bases. Al comparar la secuencia obtenida con las bases de datos internacionales, utilizando el programa BlastX (Búsqueda en base de datos de proteínas usando la secuencia de nucleótidos obtenida traducida a aminoácidos) se encontró que el amplificado obtenido poseía un elevado
porcentaje de similitud con CPRs de otras levaduras, encontrándose las mayores identidades con Trametes versicolor BAB83588.1 (identidad: 61% y valor de E: 3xlO ~142 ) y Phanerochaete chrysosporium AAG31351.1 (identidad: 59% y valor de E: IxICT 137 ) .
A partir de la secuencia obtenida, se analizaron aquellos segmentos codificantes conservados (mediante programa BlastP) y en base a ellos se diseñó nuevos partidores específicos para el gen crtR de X. dendrorhous (SEQlO a SEQ13, Tabla 1) . Estos partidores se utilizaron para buscar clones en una genoteca de X. dendrorhous construida en el sitio BamHI del plasmidio YIp5 que utiliza como huésped a la cepa DH5α de E. coli, que contenían segmentos de ADN genómico codificantes para el gen crtR. La búsqueda de estos clones se realizó mediante la amplificación, por PCR, de los insertos de los clones de la genoteca. El gen crtR contiene sitios BamHI en su secuencia, por lo tanto no se logró obtener un clon que contenia al gen crtR completo desde la genoteca utilizada. Sin embargo, se obtuvieron dos clones que contenían partes del gen. Uno de ellos con un inserto de
12820 pb que fue secuenciado completamente y contiene el gen crtR desde la base nucleotídica N° 82 del exón 1 hasta el final del gen, el otro clon contiene un inserto de aproximadamente 6500 pb que fue secuenciado completamente y la región promotora del gen crtR y 88 pb del exón 1. Mediante digestión con enzimas de restricción y ensayos de hibridación del ADN genómico y utilizando como sonda un fragmento amplificado con los partidores SEQ4 y SEQ8 se determinó que el gen crtR no contiene sitios Salí en su secuencia y que un fragmento de Salí de aproximadamente 4900 pb, contiene al gen en su totalidad. Básicamente, el protocolo utilizado para estos experimentos fue el siguiente: El ADN genómico de la cepa UCD67-385 de X. dendrorhous, fue digerido con distintas enzimas de restricción y se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Luego el ADN fue denaturado y transferido a una membrana de nylon y se realizó una hibridación utilizando un fragmento de DNA que corresponde a parte del gen crtR como sonda. La preparación de las membranas y la hibridación se realizó de a acuerdo a métodos estándares Sambroock y cois., 2001.
En base a estos antecedentes, se construyó una nueva genoteca parcial utilizando fragmentos Salí de ADN de X. dendrorhous seleccionados de tamaños entre 6400 y 4400 pb aproximadamente, como vector se utilizó pBluescript SK+ y la cepa DH5α de E. coli como huésped, la elaboración de esta nueva genoteca fue realizada según las instrucciones del fabricante. Utilizando esta nueva genoteca, se amplificaron insertos mediante PCR, utilizando los pares de partidores SEQlO y SEQ13. De esta manera se obtuvo un clon que contenia al gen crtR en su totalidad (SEQl) .
Ejemplo 2: Obtención de la secuencia de ADN complementario del gen crtR a partir de X. dendrorhous .
Con el fin de obtener la secuencia de ADN complementario del gen crtR, se utilizó una genoteca de ADN complementario de X. dendrorhous, a partir de la cual se amplificaron secuencias mediante la técnica de PCR utilizando los pares de partidores SEQlO y SEQ13 que hibridan con segmentos codificantes del gen, cuyo tamaño de amplificado
esperado a partir de ADN complementario del gen crtR es de 338_pb. La genoteca de cDNA se construyó utilizando el kit comercial "pBluescript II XR cDNA library construction kit" de Stratagene, utilizando como huésped a la cepa XLlO-GOLD de Escherichia coli, según las instrucciones dadas por el fabricante. Las condiciones utilizadas para las reacciones de PCR fueron de: denaturación inicial 95 0 C por 3 minutos, 35 ciclos: denaturación a 94 0 C por 30 segundos, alineamiento a 55°C por 30 segundos, extensión a 72 0 C por 3 minutos. Luego una extensión final a 72 0 C por 10 minutos. Los amplificados obtenidos se cargaron en un gel de agarosa al 0,8%, identificándose mezclas de clones positivas para la amplificación del ADN complementario del gen crtR.
Mediante esta técnica se identificó un clon con un inserto de ADN complementario del gen crtR. Dicho inserto fue secuenciado, obteniéndose una secuencia de 2.241 pares de bases (SEQ2) .
Comparando las secuencia obtenida del ADN complementario con la secuencia de ADN genómico del gen se determinó la organización de exones e intrones (figura 2) .
Posteriormente se realizó la traducción a aminoácidos de la secuencia obtenida (SEQ2) , mediante el paquete de software Vector NTI Suite 10 (Informax) , una vez determinado el marco de lectura correcto, se identificaron los dominios conservados de la proteina descritos en la figura 5, en orden de aparición son dominio transmembrana, dominio de unión a FMN, dominio de unión a FAD y dominio de unión a NAD(P)H. La identificación del dominio transmembrana fue realizado mediante el programa TMPred (www. ch. embnet . org/software/TMPRED forín, html) , obteniéndose un puntaje de 2.280, los dominios consecutivos fueron identificados mediante el programa InterProScan (http: //www. ebi.ac.uk/ínterProScan/) , con valores de E 2,5x10 " 41 , l,6xlθ ~67 y 7,8xlO ~23 respectivamente.
Ejemplo 3. Determinación de la importancia funcional del polipéptido CPR, codificado por el gen crtR, en la ruta carotenogénica de X. dendrorhous .
Para demostrar la importancia del gen crtR en la ruta biosintética de astaxantina en la levadura X.
dendrorhous, se construyeron mutantes por deleción del gen crtR en cepas de X. dendrorhous silvestres y se compararon los fenotipos y genotipos de las mutantes con la cepa original. Con este fin, se insertó en un vector de transformación, una construcción en la cual se reemplazó un fragmento de ADN que contenía al gen crtR por un módulo de resistencia al antibiótico higromicina B. Este módulo se compone del gen de resistencia al antibiótico higromicina B {hph) , bajo el control del promotor del gen TEF (que codifica al Factor de la elongación de la traducción, EF-IcO y la región terminadora del gen GPD de X. dendrorhous. En la figura 6 se muestra el detalle de los constructos realizados, básicamente, el vector CPRl .3 posee un fragmento de ADN de X. dendrorhous, segmento contenido entre los nucleótidos 4531 y 9902 de la SEQl, fue digerido con la endonucleasas de restricción BsiWI o Ndel para generar una deleción en el gen crtR. Los extremos del fragmento obtenido (que contiene la deleción crtR) , fueron rellenados con la polimerasa Klenow para posibilitar el ligado del módulo de resistencia a higromicina cuyos extremos son romos. De esta manera se
obtuvo dos clones: CPRl .3δBsiWI+hyg y CPRl .3δNdeI+hyg. La inserción de este constructo en el genoma de las cepas silvestres utilizadas se realizó mediante la técnica de recombinación homologa detallada más adelante. Utilizando estos vectores se transformaron cepas silvestres de X. dendrorhous: UCD 67-385 y CBS 6938.
La cepa UCD67-385 fue transformada con un fragmento de ADN lineal que contiene la deleción del gen crtR y el módulo de resistencia a higromicina. Este fragmento fue obtenido a partir de la digestión del clon CPRl .3δBsiWI+hyg con las endonucleasas Smal y Spel . Por un evento de doble recombinación homologa, un alelo del gen crtR de la cepa UCD67-385 fue reemplazado por la deleción, obteniéndose la cepa T13.
La cepa CBS6938 fue transformada con el clon CPRl .3δNdeI+hyg (ADN circular) que contiene la deleción del gen crtR y el módulo de resistencia a higromicina. Por un evento de recombinación homologa, se reemplazó el gen crtR silvestre con el gen mutado, obteniéndose la cepa CBSTr.
La transformación de ambas cepas silvestres se realizó por medio de electroporación, en base a los protocolos descritos por Adrio y cois. (1995) y Kim y cois. (1998) . Brevemente, se inocula 200 mi de medio YM comercial (glucosa 1%, extracto de levadura 0,3%, extracto de malta 0,3% y bacto-peptona 0,5%) con 1-2 mi de un cultivo de X. dendrorhous de 48 horas de crecimiento y se incuba con agitación constante a 22 0 C hasta alcanzar una DO 55O n 1n de 1,2. Las células se cosechan y se resuspenden en 25 mi de tampón BD (50 mM tampón fosfato de potasio, pH 7.0, 25 mM ditiotritol [DTT]) y se incuban a 22 0 C por 15 minutos. Las células se lavan dos veces con 25 mi de tampón STM (270 mM sacarosa, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ImM MgC12) frío y se resuspenden en 1 mi de tampón STM. Para transformar se mezcla 60 μl de células electrocompetentes con 10 a 20 μg de ADN transformante en un volumen de 5 μl . Las condiciones de electroporación son: 125 πiF, 600 ω, 0,45 kV y posteriormente las células se resuspenden en 1 mi de medio YM líquido y se incuban a 22 0 C por 5 horas. Finalmente, las células se siembran en placas con el medio YM y agar al 2% suplementado
con 10 ug/ml de higromicina B. Utilizando este medio de selección se identificaron clones que poseen el inserto con el gen de resistencia a higromicina.
De los clones obtenidos en la primera selección con antibióticos, se eligieron dos clones transformantes de cada una de las cepas silvestres. A partir de transformación de la cepa CBS 6938 se obtuvo una cepa color amarillo (CBSTr) , cuyo color indica que acumula beta-caroteno y es incapaz de sintetizar astaxantina. Al transformar la cepa UCD 67-385, se obtuvo un transformante pálido (T13), lo cual igualmente indica la via metabólica de síntesis de astaxantina esta afectada (evidencias fenotipicas se muestran en la figura 8) . Se extrajeron los pigmentos totales de las 2 cepas silvestres y de las 2 cepas transformantes y su composición fue analizada por HPLC (figura 9) , siguiendo el siguiente protocolo basado en el método de An y cois. (1989) : A un pellet de células provenientes de 5 a 20 mi de cultivo se le agregó entre 1 y 3 mi de acetona más un volumen de perlas de vidrio, que luego fue agitado a máxima velocidad en vórtex por 1 min. La fase orgánica se recuperó por centrifugación a
12.100 x g a 4°C. Los pigmentos totales se extrajeron con éter de petróleo, luego se secaron con nitrógeno gaseoso, se disolvieron en acetona y se separaron por HPLC con una columna de fase reversa
RP-18 Lichrocart 125-4 (Merck) , utilizando acetonitrilo:metanol : isopropanol (85:10:5 v/v) como fase móvil con un flujo de 1 ml/min a temperatura ambiente, en condiciones isocráticas. Los espectros de cada máximo de elusión fueron recuperados por un detector con arreglo de diodos. Los caretonoides fueron identificados de acuerdo a su espectro de absorción, tiempos de retención y comparación con estándares específicos. Se observó que la composición de carotenoides en las cepas transformantes es completamente distinto al de las cepas silvestres de las cuales provienen. El transformante CBSTr acumula beta-caroteno y es incapaz de sintetizar astaxantina, a diferencia de la cepa silvestre de la cual proviene (CBS 6938), que produce astaxantina y una cantidad mínima de Beta-caroteno. El transformante T13 redujo su producción de astaxantina en un 75% aproximadamente a costa de un aumento en la producción de beta-caroteno, a
diferencia de la cepa silvestre de la cual proviene (UCD67- 385) , que produce altas cantidades de astaxantina y cantidades mínimas de Beta-caroteno (Figura 9) .
Para confirmar la transformación a nivel genómico de las cepas mencionadas anteriormente, se analizó el locus afectado mediante amplificación de sus insertos por PCR, utilizando como molde ADN genómico de los transformantes y las cepas silvestres. Para el análisis de la cepa transformada T13, se realizaron reacciones de PCR con los siguientes pares de partidores: gdp rev + SEQ50, SEQ14 + Pef fwd, SEQ14 + SEQ50 y utilizando como templados la cepa silvestre UCD 67-385, la cepa transformada T13 y agua destilada como control negativo. Para el análisis de la cepa transformada CBSTr se realizaron reacciones de PCR con los siguientes pares de partidores: Pef fwd + SEQ35, gpd rev + SEQ30 y utilizando como templados la cepa silvestre CBS 6938, la cepa transformada CBSTr y agua destilada como control negativo, además se usaron los pares de partidores: SEQ75 + hygSecR, HF + SEQ35, HygSecF + M13F, M13R + SEQ15, SEQ20 + SEQ50 y SEQ30 + SEQ50, utilizando como templado la cepa
transformada CBSTr. Algunos de estos partidores no hibridan con la secuencia de crtR, su secuencia se detalla en la tabla 2 y su ubicación relativa se muestra en la figura 7. Las reacciones de PCR se realizaron según el siguiente protocolo: denaturación inicial 95 0 C por 3 minutos, 35 ciclos: denaturación a 94 0 C por 30 segundos, alineamiento a 55°C por 30 segundos, extensión a 72 0 C por 3 minutos. Luego una extensión final a 72 0 C por 10 minutos y fueron cargados en geles de agarosa al 0,8%. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 10 y la comparación entre los tamaños de los amplificados esperados y obtenidos se muestran en la Tabla 3.
Tabla 2 : Partidores no complementarios a la secuencias de crtR, utilizados en el análisis genómico de las cepas transformadas
Tabla 3 : Tamaño de amplificados esperados y obtenidos en el análisis de transformantes T13 y CBSTr
A. Resultados para el transformante T13
B. Resultados para el transformante CBSTr
Los tamaños de los amplificados obtenidos en las cepas transformadas coinciden los resultados esperados (tabla 3) . Este análisis fue confirmado mediante hibridación ADN- ADN. Los experimentos de hibridación se realizaron digiriendo el ADN genómico de las cepas silvestres (UCD67-385 y CBS6938) y de las cepas transformantes (T13 y CBSTr) con distintas
endonucleasas de restricción. Las digestiones fueron corridas en geles de agarosa al 0,8% y luego denaturadas y transferidas a membranas de nylon para la hibridación. Las membranas fueron hibridadas de manera independiente con dos sondas: 1) sonda amplificado gen gen crtR con partidores SEQ4 y SEQ8, 2) sonda gen higromicina. La preparación de las membranas y la hibridación se realizó de acuerdo a métodos estándares Sambroock y cois., 2001.
Los resultados obtenidos indican el transformante T13 es heterocigoto para el gen crtR, donde hay un alelo silvestre y otro mutante, por un efecto de dosis génica, este transformante produce menos astaxantina y acumula más beta- caroteno que su parental silvestre, con estos resultados se demuestra que la inserción de la deleción del gen crtR con la resistencia a higromicina B corresponde a la esquematizada en la figura 7. En el caso del transformante CBSTr, la copia del gen crtR fue mutada y por lo tanto no es capaz de producir astaxantina, acumulando beta-caroteno. Este resultado indica que la cepa CBS6938 es haploide, al menos para el gen crtR.
Todos los amplificados fueron secuenciados completamente y su análisis confirmó su origen
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