NUCLEOFÍLICOS EN EL C3 Y SUS VARIANTES DIMÉRICAS EN LA PREPARACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA ÚTIL PARA EL TRATAMIENTO DE NEOPLASIAS LINFOIDES B

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invención se sitúa en el sector de la industria farmacéutica, pues específicamente se refiere al uso de un compuesto indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 y sus variantes diméricas en la preparación de una composición farmacéutica que los comprende y que es útil para el tratamiento de neoplasias linfoides B.

ESTADO DE LA TECNICA

El uso de derivados indólicos con sustituyentes nucleofílicos en el C3 para su uso terapéutico se ha restringido hasta el momento al 1 /- -indol-3-metanol y su dímero el 3,3'-diindolilmetano (DIM).

El 1 /- -indol-3-metanol, más conocido en el área de la biomedicina como indol- 3-carbinol (I3C), es un compuesto derivado de la glucobrassicina o indol-3- glucosinolato. Son compuestos naturales que están presentes en vegetales cruciferos, particularmente en plantas del género Brassica como la coliflor y el brócoli. El I3C es una molécula inestable en medio ácido, por lo que, una vez ingerido y en contacto con el ácido gástrico del estómago, se transforma mediante una reacción de deshidratación y condensación catalizada por el medio ácido en varios tipos de oligómeros indólicos, siendo el más frecuente el 3,3'-diindolilmetano (DIM), pero también el indolo[3,2b]-carbazol y otros compuestos triméricos lineales o cíclicos o tetraméricos cíclicos (Aggarwal BB, lchikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle. 2005;4:1201 -1215; Weng JR, Tsai CH, Kulp SK, Chen CS. lndole-3-carbinol as a chemopreventive and anti-cancer agent. Cáncer Lett. 2008;262:153-163. Numerosos estudios describen la posible utilidad del I3C y derivados, en particular el DIM, como agentes quimiopreventivos (Weng JR, Tsai CH, Kulp SK, Chen CS. lndole-3-carbinol as a chemopreventive and anti-cancer agent. Cáncer Lett. 2008;262:153-163), en lesiones precancerosas en cérvix (Bell MC, Crowley-Nowick P, Bradlow HL, et al. Placebo-controlled trial of indole-3- carbinol in the treatment of CIN. Gynecol Oncol. 2000;78:123-129) y en el tratamiento sintomático de algunas enfermedades autoinmunes (McAlindon TE, Gulin J, Chen T, Klug T, Lahita R, Nuite M. lndole-3-carbinol in women with SLE: effect on estrogen metabolism and disease activity. Lupus. 2001 ; 10:779- 783). También se ha visto actividad en cáncer de mama y en neoplasia intraepitelial vulvar, aunque los mecanismos de acción que operan en su actividad antitumoral son aún controvertidos, lo que puede deberse tanto a su inestabilidad metabólica como a su complicado comportamiento farmacológico (Bradlow HL. Review. lndole-3-carbinol as a chemoprotective agent in breast and prostate cáncer. In Vivo. 2008;22:441 -445).

Estudios farmacocinéticos en humanos han demostrado la baja toxicidad del I3C y del DIM administrados oralmente (Reed GA, Peterson KS, Smith HJ, et al. A phase I study of indole-3-carbinol in women: tolerability and effects. Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14:1953-1960; Reed GA, Arneson DW, Putnam WC, et al. Single-dose and multiple-dose administration of indole- 3-carbinol to women: pharmacokinetics based on 3,3'-diindolylmethane. Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15:2477-2481 . A los individuos en estos ensayos se les administró hasta 800 mg de I3C al día (470 mg/m ² ) durante 4 semanas. Algunos pacientes sufrieron molestias abdominales, náuseas, vómitos y dolor de cabeza, efectos que no correlacionaron con la dosis de I3C, dado que también los padecieron individuos a los que se les había administrado un placebo, concluyendo que no eran debidos al tratamiento. Estos compuestos, a dosis no tóxicas (hasta 400 mg en el caso del DIM y 1200 mg en el caso de I3C), alcanzan concentraciones en sangre del rango de micromolar (analizado como la concentración de DIM en suero a las 3 h de la ingestión) (Reed GA, Arneson DW, Putnam WC, et al. Single-dose and multiple-dose administration of indole-3-carbinol to women: pharmacokinetics based on 3,3'-diindolylmethane. Cáncer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15:2477-2481 ). Por último, en varios ensayos clínicos en fase I en humanos se ha comprobado su eficacia en la regresión de lesiones precancerosas inducidas por papilomavirus en cérvix (Bell MC, Crowley- Nowick P, Bradlow HL, et al. Placebo-controlled trial of indole-3-carbinol in the treatment of CIN. Gynecol Oncol. 2000;78:123-129), y en laringe (Auborn K, Abramson A, Bradlow HL, Sepkovic D, Mullooly V. Estrogen metabolism and laryngeal papillomatosis: a pilot study on dietary prevention. Anticancer Res. 1998;18:4569-4573), y en el tratamiento sintomático de algunas enfermedades autoinmunes (McAlindon TE, Gulin J, Chen T, Klug T, Lahita R, Nuite M. lndole-3-carbinol in women with SLE: effect on estrogen metabolism and disease activity. Lupus. 2001 ;10:779-783)

Diversos estudios han identificado distintos efectos fisiológicos alterados por el I3C y derivados, habiéndose descrito que inhibe procesos inflamatorios, proliferativos y la invasión tumoral, y que tiene un efecto inmunomodulador e inductor de apoptosis, entre otros. A nivel molecular, existen evidencias que muestran que el I3C y sus derivados alteran distintas vías de señalización, aunque no se ha encontrado ninguna evidencia concluyente que implique a una vía concreta con el efecto antitumoral observado. Una de las primeras actividades descritas para el I3C y sus análogos fue como moduladores del receptor de estrógenos y del receptor de andrógenos (revisado en Aggarwal BB, lchikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle. 2005;4:1201 -1215). Estas actividades sobre los receptores hormonales han hecho cuestionar recientemente el uso continuado del I3C como suplemento quimioprotector (Bradlow HL. Review. lndole-3- carbinol as a chemoprotective agent in breast and prostate cáncer. In Vivo. 2008;22:441 -445). Así mismo, se ha descrito que el I3C inhibe distintos factores de transcripción, como NFkB, Nrf2, ATF3, ATF4, β-catenina y STAT3. También induce modulación del ciclo celular alterando la expresión de distintas kinasas de ciclinas (CDK2, CDK6 y p16 CDK) y de la ciclina D1 . Se ha descrito también que altera la expresión de distintas proteínas implicadas en apoptosis. Así, el I3C y derivados reducen la expresión de BCL2, BCLX _L , clAP, XIAP y FLIP, y aumenta la de los receptores de muerte DR4 y DR5. El I3C y derivados también tienen un efecto en la actividad de distintas kinasas, como AKT, JNK y PTEN. Existen numerosas evidencias que indican que el I3C induce la activación del sistema de detoxificación p450 e induce la síntesis de proteínas antioxidantes. Por último, también existen evidencias que indican que el I3C previene la formación de aducios de DNA inducidos por carcinógenos (revisado en Aggarwal BB, lchikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle. 2005;4:1201 -1215; Kim YS, Milner JA. Targets for indole-3-carbinol in cáncer prevention. J Nutr Biochem. 2005;16:65-73; Rogan EG. The natural chemopreventive compound indole-3- carbinol: state of the science. In Vivo. 2006;20:221 -228).

EXPLICACION DE LA INVENCION Breve descripción de la invención

El problema técnico a resolver es el tratamiento de neoplasias linfoides B mediante el uso de un compuesto indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 y sus variantes diméricas.

Constituye el objeto de la invención el uso de un compuesto de fórmula general (I) o (II) sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la preparación de una composición farmacéutica que es útil para el tratamiento de neoplasias linfoides B que se seleccionan de entre leucemia linfática crónica/linfoma de células B pequeñas, y linfomas B y de Hodgkin dependientes de infección por el herpesvirus de Epstein-Barr,

(I) donde:

Ri representa un átomo diferente a hidrógeno, de naturaleza electronegativa, libre seleccionado de entre -NH ₂ , -OH, -SH, -PH ₂ , -Cl, -Br, -F y -I, o unido a cadenas alquílicas seleccionado de entre -OR, -NR ₂ , -SR y PR ₂ , donde cada R es independientemente un grupo alquilo; o bien estos mismos grupos mencionados unidos al esqueleto de indol por un átomo de carbono, seleccionado de entre -CH ₂ OH, -CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ SH, -CH ₂ PH ₂ , -CH ₂ CI, -CH ₂ Br, - CH ₂ F y -CH ₂ l; y

R ₂ representa hidrógeno, un grupo alquilo, un átomo halógeno seleccionado de entre cloro, bromo, flúor u yodo, o un átomo electronegativo unido a cadenas alquílicas seleccionado de entre-OR, -NR ₂ , -SR y -PR ₂ , donde cada R es independientemente un grupo alquilo, lineales o ramificados; y

O") donde:

R ₂ y R3 son sustituyentes iguales o distintos y representan hidrógeno, un grupo alquilo, un átomo halógeno seleccionado de entre cloro, bromo, flúor u yodo, o un átomo electronegativo unido a cadenas alquílicas seleccionado de entre -OR, -NR ₂ , -SR y -PR ₂ , donde cada R es independientemente un grupo alquilo, lineales o ramificados.

En un aspecto de la invención, la neoplasia linfoide B es una leucemia linfática crónica/linfoma de células B pequeñas de cualquiera de sus variantes y estados.

En otro aspecto de la invención, la neoplasia linfoide B es un linfoma B que está asociado a infecciones del herpesvirus de Epstein-Barr, y se selecciona de entre linfoma de Burkitt, linfoma difuso de células B grandes del anciano y linfoma plasmablástico del anciano.

En otro aspecto de la invención, la neoplasia linfoide B es un linfoma de Hodgkin asociado a la infección por el herpesvirus de Epstein-Barr, El compuesto de formula general (I) se elige de entre- indol-3-carbinol , 1 H- indol-3-ol, 1 /- -indol-3-amina, y (6-metil-1 /-/-indol-3-il)-metanol y preferentemente es indol-3-carbinol.

El compuesto de fórmula general (II) preferentemente es 3,3'-diindolilmetano. Descripción detallada de la invención: La presente invención se basa en que los inventores han descubierto que un derivado indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 de fórmula general (I), es un potente inductor de muerte de células de pacientes con leucemia linfática crónica/linfoma B de células pequeñas (ver Ejemplos 1 a 4). Adicionalmente, también se ha observado que tanto dicho compuesto de fórmula general (I) como su derivado indólico dimérico de fórmula general (II), presentan actividad frente a líneas celulares de linfomas de Burkitt positivas (ver Ejemplos 7 a 9, 14, 15 y 16).

Los inventores también han observado que el derivado indólico de fórmula general (I), sinergiza con fármacos utilizados en el tratamiento de la leucemia linfática crónica/linfoma B de células pequeñas como la fludarabina (ver Ejemplo 2) o la vincristina (ver Ejemplo 3) y que es capaz de revertir la resistencia a la fludarabina en células de pacientes con leucemia linfática crónica/linfoma B de células pequeñas con resistencia a este tratamiento (ver Ejemplo 2). La baja toxicidad demostrada en ensayos preclínicos y clínicos en humanos contra otras patologías, que se pueden encontrar tanto en el estado de la técnica, como en el Ejemplo 17, convierten al uso de los compuestos de fórmulas generales (I) o (II) en una estrategia excepcional para el tratamiento de las neoplasias linfoides B reivindicadas.

Los inventores de esta solicitud de patente han observado que los compuestos de fórmula general (I) o (II) son capaces de inducir muerte celular eficientemente en líneas celulares derivadas de linfomas de Burkitt infectados con el virus de Epstein-Barr (EBV+), pero no en aquellas líneas derivadas de pacientes con linfoma de Burkitt esporádico (EBV-), lo que sugiere que la infección por el virus predispone a que estos compuestos produzcan un efecto tóxico sobre este tipo de células tumorales.

Adicionalmente, y tal y como el experto en la materia conocerá, la infección por herpesvirus y concretamente por el virus Epstein-Barr (EBV) también está implicada en la etiología de otras neoplasias de células B, como por ejemplo en el linfoma difuso de células B grandes del anciano, el linfoma plasmablástico del anciano, y en un porcentaje de linfomas de Hodgkin que se sitúa entre el 20 y 25%.

Por los motivos anteriormente reseñados, ejemplos de neoplasias linfoides B que se encuentran dentro del ámbito de la presente invención, son la leucemia linfática crónica/linfoma B de células pequeñas de cualquiera de sus variantes y estados; linfomas B específicamente asociados a infecciones del herpesvirus de Epstein-Barr, como son por ejemplo, el linfoma de de Burkitt, el linfoma difuso de células B grandes del anciano y el linfoma plasmablástico del anciano; y el linfoma de Hodgkin asociado a infección del virus Epstein-Barr (EBV).

Se entiende por "leucemia linfática crónica o LLC" a una leucemia de células B maduras que es denominada en su fase de linfoma como "leucemia linfática crónica/linfoma de células B pequeñas o LLC/linfoma de células B pequeñas" y que mayoritariamente se caracteriza por la expansión monoclonal u oligoclonal de células B que expresan CD5 y CD23 en sangre, médula ósea y en órganos linfoides secundarios. Es una enfermedad incurable que con los tratamientos actuales presenta una esperanza de vida del paciente entre 2 y 15 años, dependiendo de la agresividad de la enfermedad. La mayoría de pacientes desarrollan con el tiempo resistencia a los tratamientos actuales, lo que eventualmente causa su muerte por la enfermedad.

Por "linfoma de Burkitt" se entiende una neoplasia tipo B con translocación de c-MYC. Es un linfoma B agresivo que representa el 2,5% de los casos de linfoma no Hodgkin. Su mayor incidencia ocurre en África y su tratamiento requiere quimioterapia agresiva y hospitalización, que no siempre está al alcance de los afectados, en su mayoría niños. Los linfomas de Burkitt se pueden dividir en 3 tipos, aquellos en los que el virus de Epstein-Barr tiene un papel en su etiología y desarrollo, y que son comunes en África y otros países del tercer mundo y que se denominan la variante endémica, aquéllos que son más comunes en países desarrollados y que en más de un 80% de los casos no están asociados a infección por EBV (variante esporádica) y los asociados a procesos de inmunodeficiencia (pacientes transplantados o infectados por el virus de la inmunodeficiencia adquirida).

Por "linfoma difuso de células B grandes del anciano" se entiende una neoplasia de células B grandes que presenta un inmunofenotipo activado, una prominente activación nuclear del factor de transcripción NFKB y que es positiva para el virus de Epstein-Barr. Es un linfoma de curso clínico agresivo y de mal pronóstico que ocurre en pacientes con una edad media de 71 años. Es más frecuente en la población asiática y tiene una media de supervivencia en esta población de 2 años.

Por 'linfoma plasmablástico del anciano' se entiende un linfoma agresivo de células B terminalmente diferenciadas. La mitad de los pacientes presentan infección por el virus de Epstein-Barr, y es una enfermedad también asociada a infección por el virus de la inmunodeficiencia adquirida, a inmunodeficiencias o a inmunosenescencia en ancianos.

Por "linfoma de Hodgkin" se entiende una neoplasia de células B que es de las más frecuentes en adolescentes y jóvenes. Existen distintas categorías basadas en las características clínico-patológicas. La más común es el linfoma de Hodgkin clásico, caracterizado por la presencia de unas células denominadas Reed-Sternberg. En torno al 40% de pacientes con linfoma de Hodgkin clásico en países en desarrollo están infectados con el virus de Epstein-Barr, que parece tener un papel específico en la etiología de estos tumores.

Las neoplasias de células B son causadas por la transformación tumoral de linfocitos B en distintos estadios de maduración y activación. Se diferencian de las neoplasias T en los tipos celulares afectados, ya que la ontogenia, desarrollo, diferenciación y función de los linfocitos B y T son muy diferentes. Aunque existen principios activos anti-tumorales que pueden utilizarse para el tratamiento tanto de algunas neoplasias B como T, es reseñable que existen principios activos que son específicos para el tratamiento de cada una de éstas, no pudiendo extrapolarse que el uso de un principio activo que funcione en una neoplasia B lo haga también en otros tipos de neoplasias T. Así por ejemplo, la fludarabina, que es un tratamiento de elección para la LLC/linfoma de células B pequeñas, no se utiliza en el tratamiento de ninguna neoplasia T.

Constituye el objeto de la invención, el uso de un derivado indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 de fórmula general (I), sus sales o profármacos o solvatos farmacéuticamente aceptables, en la preparación de una composición farmacéutica, que es útil para el tratamiento de las neoplasias linfoides B definidas en el presente documento, en adelante uso de la invención:

(I) donde: Ri representa un átomo diferente a hidrógeno, de naturaleza electronegativa, libre seleccionado de entre -NH ₂ , -OH, -SH, -PH ₂ , -Cl, -Br, -F y -I, o unido a cadenas alquílicas seleccionado de entre -OR, -NR ₂ , -SR y PR ₂ , donde cada R es independientemente un grupo alquilo; o bien estos mismos grupos mencionados unidos al esqueleto de indol por un átomo de carbono, seleccionado de entre -CH ₂ OH, -CH ₂ NH ₂ , -CH ₂ SH, -CH ₂ PH ₂ , -CH ₂ CI, -

CH ₂ Br, -CH ₂ F y -CH ₂ l; y

R ₂ representa hidrógeno, un grupo alquilo, un átomo halógeno seleccionado de entre cloro, bromo, flúor u yodo, o un átomo electronegativo unido a cadenas alquílicas seleccionado de entre -OR, -NR ₂ , -SR y -PR ₂ , donde cada R es independientemente un grupo alquilo, lineales o ramificados.

En una realización preferida, R ₂ representa hidrógeno o un metilo.

En otra realización más preferida, Ri se selecciona de entre -NH ₂ , -OH, -SH, - OR, -NR ₂ , -SR, -CH ₂ OH, -CH ₂ NH ₂ y -CH ₂ SH; donde cada R es independientemente un metilo.

En la definición anterior del compuesto de fórmula general (I), los siguientes términos tienen el significado indicado.

Los términos "alquilo", "alquílico", o "alquílicas" se refieren a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n- hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 átomos de carbono. Los radicales alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes tales como un cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxilo, halógeno, haloalquilo, nitro, amino, aminoalquilo, aminocicloalquilo, amonioalquilo, amoniocicloalquilo o, en general, cualquier sustituyente situado en cualquier posición.

En un aspecto de la invención, el uso de la invención también incluye un compuesto de estructura dimérica de fórmula general (II), definido por dos moléculas de la fórmula general (I),

O") donde: R2 y R3 son sustituyentes iguales o distintos y representan hidrógeno, un grupo alquilo, un átomo halógeno seleccionado de entre cloro, bromo, flúor u yodo, o un átomo electronegativo unido a cadenas alquílicas seleccionado de entre -OR, -NR ₂ , -SR y -PR ₂ , donde cada R es independientemente un grupo alquilo, lineales o ramificados. En una realización preferida R ₂ y R3 son sustituyentes iguales o distintos y representan un hidrógeno, un metilo o un halógeno.

En la definición anterior del compuesto de fórmula general (II), los términos tienen el mismo significado que el indicado en la fórmula (I).

El uso de la invención, incluye compuestos de fórmulas generales (I) o (II) que se obtienen o producen mediante una vía sintética química, o a partir de una materia natural de distinto origen, como es la glucobrassicina que está presente en vegetales cruciferos, particularmente en plantas del género Brassica como la coliflor y el brócoli.

En una realización preferida del uso de la invención, el compuesto de fórmula general (I) incluye un CH ₂ OH en el R1 y un H en R2 y es el indol-3-carbinol o I3C.

En otra realización particular del uso de la invención, el compuesto de fórmula general (I) incluye un OH en el R1 y un H en el R2 y es el 1 H-indol-3-ol o l3-ol. En otra realización particular del uso de la invención, el compuesto de fórmula general (I) incluye un NH ₂ en el R1 y un H en el R2 y es el 1 /- -indol-3-amina o l3Amina.

En otra realización particular del uso de la invención, el compuesto de fórmula general (I) incluye un CH ₂ OH en el R1 y un CH3 en el R2 y es el (6-metil-1 /- - indol-3-ii)metanol o MI3Metanol.

En otra realización particular del uso de la invención, el compuesto de fórmula general (II) es el 3,3'-diindolilmetano o DIM.

El uso de la invención, incluye los compuestos definidos en las fórmulas generales, en las reivindicaciones y los descritos en los ejemplos.

El uso de la invención, incluye compuestos de fórmula general (I) o (II) que se presentan en forma cristalina, o de compuesto libre o de solvato.

El uso de la invención, también incluye a isómeros de los compuestos de fórmula general (I) o (II), dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.

Dentro del alcance de esta invención, se encuentran las sales, solvatos y profármacos farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula general (I) o (II) que, cuando se administran a un paciente son capaces de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales farmacéuticamente no aceptables también están dentro del alcance de la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, solvatos, profármacos y derivados puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto original que contiene un resto básico o ácido. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de los compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluensulfonato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilenodiamina, etanolamina, N,N- dialquilenetanolamina, trietanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos.

El término "pro-fármaco o pro-droga" se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten in vivo en derivados indólicos adecuados para el tratamiento de las neoplasias linfoides B definidas en este documento. Tales derivados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los compuestos: ésteres, ésteres de aminoácido, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos y amidas. Los pro-fármacos particularmente favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los derivados indólicos cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba más fácilmente por la sangre), o que potencian la liberación del compuesto original en un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con relación a la especie original. La preparación de dicho pro-fármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

En un aspecto del uso de la invención, adicionalmente se utiliza al menos un excipiente, un adyuvante y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto del uso de la invención, adicionalmente se incluye, al menos, otro principio activo, como por ejemplo la fludarabina.

Dentro del ámbito de esta invención se incluye cualquier composición farmacéutica útil para el tratamiento de neoplasias linfoides B definidas en el presente documento y que se caracteriza por comprender una dosis terapéuticamente eficaz de un derivado indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 de fórmula general (I) o un dímero de este derivado indólico de fórmula general (II), una sal, un solvato o un pro-fármaco del mismo farmacéuticamente aceptables, en adelante composición farmacéutica de la invención.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar por cualquier vía de administración apropiada, por ejemplo, oral, parenteral (subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, etc.), rectal, etc.

La composición farmacéutica de la invención puede estar en una forma farmacéutica de administración por vía oral, bien en forma sólida o líquida. Ejemplos ilustrativos de formas farmacéuticas de administración por vía oral incluyen comprimidos, cápsulas, granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser preparadas por métodos convencionales. Las composiciones farmacéuticas también pueden ser adaptadas para su administración parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, estériles, en la forma de dosificación apropiada; en este caso, dichas composiciones farmacéuticas incluirán los excipientes adecuados, tales como tampones, tensoactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegirán en función de la forma farmacéutica de administración seleccionada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos y de su preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, 10 Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones, o en cualquier libro de similares características que exista en cada país.

Como el experto en la materia conocerá, la combinación de varios principios activos buscando efectos sinérgicos o cooperativos en el tratamiento de patologías es una práctica habitual dentro del campo de la medicina. Por ese motivo, en el ámbito de la presente invención, se incluye la administración de la composición farmacéutica de la invención conjuntamente con radiación o combinado con al menos un agente farmacológico, o como terapia adyuvante o neoadyuvante.

Se entiende como terapia adyuvante el uso de la composición farmacéutica de la invención que se administra después de la terapia principal para potenciar su efecto y/o aumentar la posibilidad de una supervivencia prolongada. Se entiende como terapia neoadyuvante al tratamiento que se administra antes de la terapia principal para potenciar el efecto de ésta.

Los agentes farmacológicos se seleccionan de entre los siguientes: - un alquilante, seleccionado de entre, clorambucil, bendamustina, cisplatino o cualquier otro agente que presente este mecanismo de acción,

- un antimetabolito con actividad citotóxica, seleccionado de entre, metotrexato, fluoropirimidina, citarabina o cualquier otro agente que presente este mecanismo de acción, - un antimicrotúbulo, seleccionado de entre un alcaloide derivado de la vinca, un taxano o cualquier otro agente que presente este mecanismo de acción,

- un inhibidor de la topoisomerasa, seleccionado de entre antraciclina, mitoxantrona, epipodofilotoxina o cualquier otro agente que presente este mecanismo de acción,

- un inhibidor del proteasoma, como el bortezomib o cualquier otro agente que presente este mecanismo de acción,

- otro tipo de agente farmacológico, seleccionado de entre fludarabina, hidroxiurea, epotilonas o cualquier otro agente que presente mecanismos de acción similares,

-un anticuerpo antitumoral, seleccionado de entre Rituximab, Alentuzumab o cualquier otro agente perteneciente a esta familia de compuestos. En un aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención potencia sinérgicamente el efecto citotóxico de la F-ara-A y/o de la vincristina en células de pacientes de LLC/linfoma B de células pequeñas.

La fludarabina, utilizada de forma estándar en el tratamiento de la LLC/linfoma B de células pequeñas, se convierte en el hígado en F-ara-A, que es el fármaco activo que se utiliza en los ensayos in vitro. Los pacientes de LLC/linfoma B de células pequeñas desarrollan al cabo del tiempo resistencia a la fludarabina y otros agentes quimioterapéuticos, lo que marca el inicio de la fase terminal de la enfermedad. El mecanismo de acción de la F-ara-A se basa en su función como antimetabolito del adenilato, y, como tal, es capaz de inhibir la síntesis de ADN, impidiendo la proliferación celular. No obstante, dado el bajo índice proliferativo de las células de LLC/linfoma B de células pequeñas, la incorporación de la F-ara-A se supone que se produce mayormente en los procesos de reparación de gaps en el DNA. Por su parte, la vincristina (VCR) es un fármaco que ejerce sus efectos citotóxicos interfiriendo con los microtúbulos que forman los haces mitóticos durante la metafase, interrumpiendo el ciclo celular.

En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención restaura la sensibilidad a la F-ara-A de células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas resistente a fludarabina.

En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención restaura la sensibilidad a la F-ara-A de las células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas con translocación del gen p53. En otro aspecto de la invención, la composición farmacéutica de la invención, se utiliza conjuntamente con fludarabina o vincristina.

En otra realización particular de la invención, la composición farmacéutica de la invención se utiliza para el tratamiento de la LLC/linfoma B de células pequeñas que es resistente a fármacos, como por ejemplo, fludarabina o vincristina.

En el ámbito de la presente invención, también se incluyen aquellos métodos de tratamiento de las neoplasias linfoides B definidas en este documento, que consisten en la administración de un compuesto de fórmula general (I) o (II), o de la composición farmacéutica de la invención, tanto solos como combinados con otros fármacos o técnicas médicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. El I3C induce muerte celular en células sanguíneas mononucleares de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas en mayor proporción que en células de donantes sanos. Se muestra la media aritmética ± error estándar de los resultados de viabilidad obtenidos utilizando las concentraciones indicadas de I3C en 23 pacientes de LLC/linfoma B de células pequeñas y en 4 donantes sanos a las 24 horas (A) y 48 horas (B) según el Ejemplo 1 . Figura 2. Cooperación sinérgica del I3C con la F-ara-A en la inducción de muerte de las células leucémicas de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas sensibles o resistentes a Fludarabina. A la izquierda se representan los porcentajes de células viables de LLC/linfoma B de células pequeñas cultivadas por triplicado con fludarabina, I3C o con una combinación de F-ara-A:l3C con un ratio constante de 1 :14 (μΜ:μΜ) y la derecha las gráficas Fa-CI (fracción afectada (Fa) frente a índice combinatorio (Cl)) a las 48 horas en un paciente sensible a la F-ara-A (A) y en otro resistente a la F-ara-A (B). Figura 3. El I3C sinergiza con la vincristina. Se muestran los Cl para LD50 (dosis letal 50) del efecto citotóxico de la combinación de I3C y VCR para 7 pacientes de LLC/linfoma B de células pequeñas a las 24 y 48 horas.

Figura 4. El I3C solo o en combinación con fludarabina induce apoptosis en células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas como indican la inducción de la rotura de PARP y de las caspasas, el mareaje de apoptosis temprana con anexina V y la protección de la muerte celular con Z-VAD-fmk. (A) viabilidad celular mediante luminiscencia a las 24 y 48 horas. (B) viabilidad celular por mareaje con anexina V y con ioduro de propidio a las 24 horas. (C) Análisis de la expresión y procesamiento de caspasas y de PARP mediante Western blot en estractos de células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas a las 24 h del tratamiento.

Figura 5. El I3C reduce la expresión de proteínas antiapoptóticas e induce la acumulación de p53, pero no su fosforilación en células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas (A) Expresión de las proteínas MCL1 , XIAP, clAP y β-actina mediante Western blot en estractos de células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas tratadas con I3C durante 24 horas. (B) Expresión de de p53 y de la fosforilación de p53 en distintos residuos de Ser mediante Western blot en estractos de células de pacientes con LLC/ linfoma B de células pequeñas a las 24 del tratamiento. Figura 6. El I3C potencia el efecto de la F-ara-A en la acumulación y activación de la proteína supresora de tumores p53 en muestras de pacientes de LLC/ linfoma B de células pequeñas con el p53 no mutado.

(A) Dos casos representativos de pacientes con el gen de p53 no mutado. (B) Un caso representativo de una muestra de un paciente con el p53 mutado.

Figura 7. El I3C induce muerte celular en líneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL) (A), pero no en líneas de linfoma de Burkitt negativas para el virus de Epstein-Barr EBV- (B) o en líneas linfoblastoides no tumorales (LCL) infectadas con EBV (C). Figura 8. Análisis comparativo del efecto citotóxico del I3C con el (6-Metil- 1H-indol-3-il)metanol, el 1H-lndol-3-ol, el 1H-lndol-3-amina y con otros derivados indólicos con distintos radicales en el C3 en líneas de linfoma de Burkitt EBV-positivas. (A) Viabilidad de las células BL-60.2 y Raji a las 24 del tratamiento determinada mediante colorimetría tomando la condición control como el 100% de viabilidad (B) Formulación de los diferentes compuestos indólicos utilizados.

Figura 9. El 1H-lndol-3-ol (l3-ol) induce muerte celular a dosis más bajas que el I3C y esta muerte se revierte al incubar las células con el inhibidor de las caspasas ZVAD-fmk Figura 10. El I3C induce muerte celular por un mecanismo apoptótico dependiente de caspasas. (A) Se muestra un caso representativo de células de linfoma de Burkit BL-60.2 en las que se observa que el I3C induce apoptosis y la presencia de Z-VAD-fmk protege de la misma. (B) el I3C induce la activación de las caspasas 3, 8 y 9 y la ruptura de PARP en las líneas de linfoma de Burkitt EBV+ BL60 y Raji, mientras que no lo hace en la línea Ramos (Burkitt EBV-) o en Dana (linfoblastoide EBV+).

Figura 11. El I3C causa la despolarización mitocondrial. Células de BL-60.2 y Raji se cultivaron con 200 μΜ I3C durante 3, 5 y 8 horas, se marcaron con TMRM y se analizaron por citometría de flujo. Figura 12. El I3C no afecta al ciclo celular. Células de BL-60.2 se cultivaron con 200 μΜ I3C durante 9, 15 y 24 horas, se tiñeron con ioduro de propidio (IP) y el contenido de DNA se analizó y cuantificó por citometría de flujo.

Figura 13. El I3C modifica la expresión de diversas proteínas señalizadoras y de proteínas pro y antiapoptóticas, como XIAP, clAP o MCL1 , en líneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein- Barr (EBV+ BL) pero no en líneas de linfoma de Burkitt negativas para EBV (EBV-) o líneas no tumorales (LCL) infectadas con EBV. (A) BL-60.2. (B) Ramos. (C) Raji. (D) Dana. Figura 14. El I3C modifica la expresión de diversos factores de transcripción y proteínas virales en líneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL) pero no en líneas de linfoma de Burkitt negativas para EBV (EVB-) o en líneas linfoblastoides (no tumorales) (LCL) infectadas con EBV. (A) BL-60.2. (B) Ramos. (C) Raji. (D) Dana.

Figura 15. El tratamiento con I3C o con su dímero el diindolilmetano (DIM) reduce el tamaño tumoral y aumenta la supervivencia de ratones xenotransplantados con células de la línea de linfoma de Burkitt positivo para EBV Daudi. (A) Comparación del peso de los tumores desarrollados por animales tratados con I3C y no tratados. Análisis estadístico t de Student para muestras no pareadas (p = 0.038). (B) Curvas de supervivencia de Kaplan- Meier entre ratones del grupo tratado con I3C y del grupo control. (C) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier entre ratones del grupo tratado con DIM y del grupo control. Figura 16. Análisis de la toxicidad causada en ratones por los tratamientos con fludarabina (Flu), I3C o por una combinación de ambos tratamientos. (A) Medida del peso a lo largo de los tratamientos. (B) Determinación de la toxicidad hepática y renal mediante la medida de GOT, GPT y urea antes (día 0) y después de los tratamientos (dia 53). (C) Determinación de la variación de las poblaciones leucocitarias antes (día 0) y después de los tratamientos (dia 53).

MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION

Ejemplo 1. El I3C induce muerte celular en células mononucleares de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas en mayor proporción que en células de donantes sanos

Las células de los pacientes diagnosticados con LLC/linfoma B de células pequeñas y de los donantes sanos se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad y se cultivaron por triplicado en presencia de distintas concentraciones de I3C (5-100 μΜ).

Se utilizaron muestras de 23 pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas y de 4 donantes sanos. El porcentaje de viabilidad celular se determinó con el kit CelITiter-Glo® de Promega considerando la condición control (sin I3C) como el 100% de viabilidad. El I3C fue capaz de inducir apoptosis de células de LLC/linfoma B de células pequeñas con una LD50 (dosis a la cual se induce la muerte del 50% de las células) de 38 μΜ a las 48 h, mientras que en el caso de las células de donantes sanos ésta fue superior a 100 μΜ. Los análisis estadísticos se realizaron con el test de Student para muestras no pareadas, ^* p > 0,05 y ^** p < 0,005 (ver Figura 1 ).

Ejemplo 2. El I3C sinergiza con la fludarabina y además es capaz de revertir la resistencia a fludarabina en pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas refractaria

Las células de LLC/linfoma B de células pequeñas se cultivaron por triplicado con concentraciones crecientes F-ara-A, que es la forma activa de la fludarabina (0,1 , 0,2, 0,5, 1 Mg/ml), de I3C (5, 10, 25, 50 μΜ) o con combinaciones de F-ara-A:l3C con un ratio constante de 1 :14 (μΜ:μΜ) en un paciente sensible a la F-ara-A (paciente A; Figura 2A) y en otro resistente a la F-ara-A (paciente B; Figura 2B).

Se midió la viabilidad celular a las 48 horas mediante luminiscencia utilizando el kit Cell Titer-Glo® (Promega) y se calculó el porcentaje de células viables considerando la condición control (sin ninguna droga) como el 100% de viabilidad.

En las condiciones experimentales seleccionadas, la inducción de muerte tanto por el I3C como por la F-ara-A fue muy moderada en ambos pacientes. Sin embargo, la combinación del I3C y la F-ara-A indujo muerte celular de las células tumorales de ambos pacientes de forma muy eficiente y claramente superior al mero efecto aditivo de ambos fármacos (ver Figura 2).

Se hallaron los índices de combinación (Cl) de las drogas y se determinó el efecto sinérgico utilizando el programa Calcusyn (Biosoft, Cambridge, USA), según el modelo descrito por Chou y Talalay (1981 ) (Chou TC, Talalay P. Generalized equations for the analysis of inhibitions of Michaelis-Menten and higher-order kinetic systems with two or more mutually exclusive and nonexclusive inhibitors. Eur J Biochem. 1981 ;1 15:207-216). Se considera un índice combinatorio = 1 como efecto aditivo, < 1 sinérgico y > 1 antagónico. Se muestra un caso representativo de un paciente de LLC/linfoma B de células pequeñas no resistente a fludarabina (Cl para LD50 = 0,4; sinergismo) (A) y de un paciente de LLC/linfoma B de células pequeñas resistente a fludarabina (Cl para LD50 = 0,77; sinergismo) (B).

Transcurridas 48 horas se comprobó que I3C cooperó sinérgicamente con la F- ara-A para inducir la muerte de las células de LLC/linfoma B de células pequeñas (índice combinatorio (Cl) para LD50 (dosis letal 50): paciente A = 0,4; paciente B = 0,44) (ver Figura 2). Estos resultados sugieren que los mecanismos moleculares de inducción de muerte del I3C y la F-ara-A podrían ser complementarios a nivel farmacológico. Además, estos datos indican que la F-ara-A vuelve a ser activa en presencia del I3C incluso en pacientes que habían desarrollado resistencia a este fármaco. Ejemplo 3. El I3C sinergiza con la vincristina, compuesto alcaloide que inhibe la formación de los microtúbulos

Las células de LLC/linfoma B de células pequeñas se cultivaron por triplicado con concentraciones crecientes de vincristina (VCR; 0,01 , 0,02, 0,05, 0,1 Mg/ml), de I3C (5, 10, 25, 50 μΜ) o con combinaciones de VCR:I3C con un ratio constante de 1 :415 (μΜ:μΜ).

Se midió la viabilidad celular a las 48 horas mediante luminiscencia utilizando el kit Cell Titer-Glo® (Promega) y se calculó el porcentaje de células viables considerando la condición control (sin ninguna droga) como el 100% de viabilidad. Los resultados mostraron los Cl para LD50 (dosis letal 50) de 7 pacientes de LLC/ linfoma B de células pequeñas a las 24 h (media ± desviación estándar = 0,54 ± 0,38) del efecto citotóxico de la combinación de I3C y VCR. y a las 48 h (0,61 ± 0,23) (ver Figura 3).

Se hallaron los índices de combinación (Cl) de las drogas y se determinó el efecto sinérgico utilizando el programa Calcusyn (Biosoft, Cambridge, USA), según el modelo descrito por Chou y Talalay (Chou TC, Talalay P. Generalized equations for the analysis of inhibitions of Michaelis-Menten and higher-order kinetic systems with two or more mutually exclusive and nonexclusive inhibitors. Eur J Biochem. 1981 ;1 15:207-216). Se considera un Cl = 1 como efecto aditivo, < 1 sinérgico y > 1 antagónico.

Transcurridas 48h se determinaron los Cl que fueron < 1 , lo que indica que ambos fármacos presentaron un efecto sinérgico.

Ejemplo 4. El I3C solo o en combinación con fludarabina induce apoptosis en células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas, como indican la inducción de la rotura de PARP y el procesamiento proteolítico de las caspasas, así como el mareaje de apoptosis temprana con anexina V y la protección de la muerte celular con Z-VAD-fmk

Las células de los pacientes diagnosticados con LLC/linfoma B de células pequeñas se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad y se cultivaron sin otras adiciones o en presencia de I3C (25 μΜ), F-ara A (0,5 g/ml) o una combinación de ambos (I3C (25 μΜ) ± F-ara A (0,5 Mg/ml)), y en presencia o ausencia de Z-VAD-fmk 100 μΜ. Se midió la viabilidad celular mediante luminiscencia a las 24 y 48 horas (ver Figura 4A) o por mareaje con anexina V/ioduro de propidio a las 24 horas (ver Figura 4B). Se calculó el porcentaje de células viables considerando la condición control (sin ningún fármaco) como el 100% de viabilidad. En un experimento en paralelo las células se lisaron y sonicaron a las 24 horas y se analizó la expresión y procesamiento de PARP y de las caspasas 3, 8 y 9 mediante Western blot (ver Figura C). La expresión de β-actina se utilizó como control de carga.

Como muestran los resultados, la muerte inducida por I3C se previno con la inclusión del inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk en el cultivo. Así mismo, el tratamiento con I3C y F-ara-A indujo un mayor porcentaje de muerte celular que también fue parcialmente prevenido con Z-VAD-fmk. Como demostración adicional de la inducción de apoptosis por el I3C como tratamiento único y por el tratamiento combinado con F-ara-A, se muestra la exposición en superficie celular de la anexina V (ver Figura B) y la activación proteolítica de las caspasas 3, 8 y 9, así como la ruptura de PARP (ver Figura C).

Ejemplo 5. El I3C reduce la expresión de proteínas antiapoptóticas e induce la acumulación de p53, pero no su fosforilación

Las células de los pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas se incubaron con concentraciones crecientes de I3C (10-100 μΜ). En el caso del I3C a 100 μΜ, las células se preincubaron en presencia o ausencia del inhibidor de las caspasas Z-VAD-fmk 100 μΜ. A las 24 h las células se lisaron y sonicaron y se analizó mediante inmunoblot la expresión de las proteínas antiapoptóticas MCL1 , XIAP, clAP y β-actina ,así como los niveles de expresión de p53 y su fosforilación en distintos residuos de Ser (p53Ser15, p53Ser37 y p53Ser392). La expresión de β-actina se utilizó como control de carga.

La incubación de células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas con cantidades crecientes de I3C causó la reducción de la expresión de las proteínas antiapoptóticas MCL1 , XIAP y clAP1/2 (ver Figura 5A). En el caso de MCL1 y de XIAP, la reducción en su expresión inducida por el I3C se observó claramente a concentraciones de 100 μΜ y se previno parcialmente por la incubación con el inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk. Sin embargo, el efecto del I3C sobre la expresión de la clAP1/2 fue evidente a concentraciones de I3C de 25 μΜ y no fue prevenida por la incubación con Z-VAD-fmk.

Por otra parte, el I3C causó la acumulación de p53. Sin embargo, esta acumulación no vino acompañada de la fosforilación de p53 en las serinas 15, 37 o 392, (ver Figura 5B) lo que indica que el I3C no induce per se daño en el DNA ni la activación de las kinasas ATR, ATM o DNA-PK, lo que sugiere que la acumulación de p53 es causada por inhibición de la degradación de p53 por el proteasoma o por activación transcripcional.

Ejemplo 6. El I3C potencia el efecto de la F-ara-A en la acumulación y activación de la proteína supresora de tumores p53 en muestras de pacientes con el p53 no mutado

Las células de los pacientes diagnosticados con LLC/linfoma B de células pequeñas se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad y se incubaron sin otras adiciones o en presencia de I3C (25 μΜ), F-ara A (0,5 g/ml) o una combinación de ambos (I3C (25 μΜ) ± F-ara A (0,5 μg/ml)). En el caso del I3C + F-ara-A las células se preincubaron con o sin Z-VAD-fmk 100 μΜ. A las 24 h las células se lisaron y sonicaron y se analizó la expresión de las proteínas indicadas o su fosforilación en serinas mediante Western blot. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga.

Para dilucidar el mecanismo por el cual el I3C coopera con la F-ara-A en la inducción de muerte de las células de pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas se procedió a estudiar el efecto en la activación de p53 de dosis subletales de F-ara-A (0,5 μg/ml) y de I3C (25 μΜ), tanto como tratamiento único como en combinación (ver Ejemplo 6). En la Figura 6A se muestran los resultados obtenidos en muestras de 2 pacientes con LLC/linfoma B de células pequeñas que respondieron al tratamiento con F-ara-A. El tratamiento con I3C (25 μΜ) no produjo ningún efecto significativo sobre la acumulación de p53, su fosforilación (en los residuos Ser15, 37 o 392) o su activación, determinada por la inducción de la expresión de dos proteínas dependientes de p53 como son p21 ^WAF y PUMA. Por otra parte, el efecto del tratamiento con F-ara-A causó únicamente un ligero incremento en estos parámetros. Sin embargo, el tratamiento combinado de I3C (25 μΜ) y F-ara-A (0,5 Mg/ml) causó un claro incremento en la acumulación y fosforilación de p53, así como en la inducción de la expresión de PUMA y de p21 ^WAF , lo que correlaciona con el efecto sinérgico en la inducción de muerte celular observado en el tratamiento combinado de I3C y F-ara-A (ver Ejemplo 2). Este dato sugiere que el I3C potencia la actividad antitumoral de la F-ara-A en muestras de LLC/linfoma B de células pequeñas sensibles a este fármaco potenciando la activación de p53. Es interesante el hecho de que el I3C es capaz de sinergizar con la F-ara-A en muestras con p53 mutado. Esta cooperación no parece ser causada ni por un incremento en la fosforilación de p53, ni en los niveles de PUMA causado por ambos fármacos. Sin embargo, sí se observó que la fosforilación de H2A.X (que es dependiente de daño al DNA) fue significativamente incrementada por la administración conjunta de I3C y F- ara-A (ver Figura 6B). Estos resultados sugieren que existe un mecanismo de cooperación entre el I3C y la F-ara-A que sería independiente de la activación de p53 y explicaría por qué el I3C restaura el efecto anti-tumoral de la fludarabina en pacientes con p53 mutado y/o resistentes a este fármaco (ver Figura 2).

Ejemplo 7. El I3C induce muerte celular en líneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL, A), pero no en líneas de Burkitt negativas para este virus (EBV-) (B) ni en líneas linfoblastoides no tumorales (LCL) infectadas con EBV (C)

Las células de las distintas líneas celulares se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 μΜ) por triplicado. Las líneas celulares fueron: EBV+BL: BL-60, Jijoye, Raji, Mutu-1 , Daudi, Namalwa. Akata y Rael; EBV-: BL-2, BL-41 , DG-75 y Ramos; EBV+LCL:Alewife, IB4, JY y Dana.

A las 48 horas se midió la viabilidad mediante colorimetría y se determinó el porcentaje de células vivas tomando la condición control como el 100% de viabilidad. Se realizaron un mínimo de tres experimentos por cada línea celular.

Los resultados indicaron que el I3C fue capaz de inducir muerte celular eficientemente en líneas celulares derivadas de linfomas de Burkitt infectados con el virus de Epstein-Barr (EBV+) (ver Figura 6A) pero no en aquellas líneas derivadas de pacientes con linfoma de Burkitt esporádico (EBV-) (ver Figura 6B).

La susceptibilidad al I3C mostrada por los linfomas de Burkitt EBV+ y la resistencia a este fármaco de los EBV- sugiere que la infección por el virus estaría implicada en que el I3C tenga un efecto tóxico sobre las células. Sin embargo, el tratamiento con I3C de líneas linfoblásticas infectadas con EBV no causó ningún efecto en la viabilidad de estas células (ver Figura 6). Este resultado puede deberse a que los genes virales expresados y los niveles de expresión de las distintas proteínas virales en las células de linfoma de Burkitt RBV+ y en las LCL EBV+ son muy diferentes.

Ejemplo 8. Análisis comparativo del efecto citotóxico del I3C con el (6- Metil-1H-indol-3-il)metanol, el 1H-lndol-3-metanol y con otros derivados indólicos con distintos radicales en el C3 en líneas de linfoma de Burkitt EBV+

Las células de linfoma de Burkitt EBV-positivo BL-60.2 y Raji se cultivaron por triplicado en presencia de concentraciones crecientes (10-200 μΜ) de diferentes compuestos indólicos: lndol-3-carbinol (l3Carbinol), (6-Metil-1 H- indol-3-il)metanol (MI3Metanol), 1 H-lndol-3-amina (l3Amina), 1 H-lndol-3-ol (I3- ol), 2,3-Dihidroindol (Indolina), 1 H-lndol-2-metanol (l2Metanol), Ácido-indol-3- acético (AI3Acetico), lndol-3-acetonitrilo (l3Acetonitrilo), 3-Formilindol (3-Formil- I), Ácido-indol-3-carboxílico (AI3Carboxilico), 3-Dimetilaminometilindol (Gramina), 3-(2-Hidroxietil)-indol (3-(2-Hidroxietil)-l), 5-Metoxiindol-3- ilacetonitrilo (Metoxl3Acetonitrilo), 2-Metil-1 H-indol-3 carboxamida (MI3Carboxamida), 3-(Metoximetil)-1 H-indol (3-(Metoximetil)-l), y triptófano (Trp). A las 24 horas se midió la viabilidad mediante colorimetría y se determinó el porcentaje de células vivas tomando la condición control como el 100% de viabilidad (Figura 8A).

Los resultados indicaron que los compuestos indólicos con sustituyentes nucleofílicos, como el 1 /- -indol-3-ol y el 1 /- -indol-3-amina, son citotóxicos a concentraciones inferiores al I3C. Así, la LD50 a las 48 h del I3C en BL60.2 y Raji fue de 129 μΜ y 135 μΜ, respectivamente, mientras que la del l3-ol fue 2 μΜ y 21 μΜ, respectivamente, y la del 13-amina fue 103 μΜ y 87 μΜ, respectivamente. Es interesante mencionar que la adición de un radical metilo en posición C6 en el I3C (potenció su efecto citotóxico (LD50= 124 μΜ y 96 μΜ, respectivamente). Otros compuestos indólicos con sustituciones en C3 no alteraron la viabilidad de estas células, ni lo hizo el 1 /- -indol-2-metanol, lo que es indicativo de la necesidad de un residuo nucleofílico en posición C3 para el efecto citotóxico.

Ejemplo 9. El 1H-lndol-3-ol (l3-ol) induce muerte celular a dosis más bajas que el I3C y esta muerte se revierte al incubar las células con el inhibidor de las caspasas ZVAD-fmk

Las células BL-60.2 fueron mantenidas en cultivo sin tratar o fueron preincubadas con ZVAD-fmk a 100 μΜ durante 30 min. Posteriormente las células se trataron con l3-ol (1 , 5 y 10 μΜ) y 48 horas después se midió su viabilidad mediante colorimetría y se determinó el porcentaje de células vivas tomando la condición control (sin tratamiento) como el 100% de viabilidad.

El l3-ol indujo muerte celular muy eficientemente en células BL-60.2. Además, la muerte celular a concentraciones de 5 μΜ puede revertirse eficientemente con el inhibidor de caspasas ZVAD-fmk, lo que indica que el l3-ol induce apoptosis. TABLA 1 : Efecto del I3C y de la F-ara-A sobre la viabilidad de líneas celulares derivadas de distintos tipos de neoplasias B

CELULAS Control I3C I3C F-ara-A

100 μΜ 200 μΜ 4 pg/ml TIPO CELULAR

RS11846 100 101 ± 37 linfoma folicular

6,1

Raji 100 58 ± 36 ± 1 34 linfoma de Burkitt EBV

1 ,7 positivo

BL-60.2 100 52 ± 3 14 ± 65 linfoma de Burkitt EBV

2,6 positivo

RPMI8226 100 104 ± 103 ± 59 mieloma/plasmacitoma

1 ,2 1 ,7

RL 100 89 ± 95 ± 90 linfoma difuso de células B

4,2 3,3 grandes

, EBV negativo

Daudi 100 42 ± 35 ± 98 linfoma de Burkitt EBV

2,6 1 ,3 positivo

Ramos 100 105 ± 99 ± 57 linfoma de Burkitt EBV

6,8 0,4 negativo

380 100 94 ± 97 ± 29 linfoma de células preB

1 ,4 1 ,9

SUDHL.4 100 97 ± 91 ± 31 linfoma difuso de células B

4,2 3,1 grandes,

EBV negativo

Granta519 100 103 ± 93 ± 53 linfoma de manto

3,6 6,5

Z138 100 100 ± 91 ± 53 linfoma de manto

1 ,5 2,1 Ejemplo 10. El efecto citotóxico del I3C en células tumorales derivadas de distintas neoplasias de células B es diferente al de la F-ara-A

Se comprobó el efecto del I3C sobre distintas líneas celulares derivadas de linfomas B, incluyendo, además de las líneas B de Burkitt EBV+ (BL-60.2, Raji y Daudi) y EBV- (Ramos), líneas celulares B derivadas de linfoma folicular (RS1 1846), de mieloma/plasmacitoma (RPMI8226), de linfoma difuso de células B grandes (SUDHL-4 y RL), de linfoma preB (380) y de linfoma de manto (Granta 519 y Z138). Para ello las células dejaron sin tratar (control) o se trataron con I3C 100 μΜ o 200 μΜ o con 4 μ9/ΐΎΐΙ de F-ara-A durante 48 h antes de determinar la viabilidad celular mediante colorimetría. El porcentaje de viabilidad se determino tomando como referencia la viabilidad de las células sin tratar (control). Se realizaron 3 experimentos independientes por triplicado en el caso del I3C (se muestra la media del porcentaje de viabilidad ± la desviación estándar) o 1 experimento por triplicado en el caso de la F-ara-A. Los resultados indicaron que el efecto más significativo del I3C sobre la viabilidad celular ocurrió en las líneas de Burkitt EBV+. Además, también se comprobó el efecto de la F-ara-A sobre la viabilidad de estas líneas celulares, observándose que las células sensibles a la F-ara-A no lo fueron al I3C y viceversa. De hecho, es interesante mencionar que las células que fueron muy resistentes a la F-ara-A como inductor de muerte, como las células Daudi, son altamente sensibles al I3C.

Ejemplo 11. El I3C induce la muerte celular de las células de las líneas de Burkitt EBV+ por un mecanismo apoptótico dependiente de caspasas

Las células de la línea de linfoma de Burkitt BL-60.2 se cultivaron sin ninguna adición (control) o con I3C 200 μΜ en presencia del inhibidor de las capasas Z- VAD-fmk (100 μΜ) A las 15 horas se determinó el porcentaje de células viables por mareaje con anexina V FITC/ioduro de propidio y análisis por citometría de flujo. Los resultados mostraron que la muerte celular inducida por el I3C conlleva la exposición en la superficie celular de la anexina V, la cual se previene por el inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk, lo que demuestra que la muerte celular se debió a apoptosis (ver Figura 10A).

Por otra parte, células de las líneas celulares EBV+BL: BL-60.2, Raji; EBV- BLRamos; y EBV+LCL: Dana se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 μΜ). En el caso del I3C a 200 a μΜ las células se dejaron sin tratamiento adicional o se preincubaron con Z-VAD-fmk. A las 24 horas las células se lisaron y sonicaron y se determinó la concentración proteica. Se analizó la expresión y el procesamiento de PARP, caspasa 3, 8 y 9 mediante Western blot. La expresión de p65 NFCKB se utilizó como control de carga. Los resultados indicaron que el I3C indujo la activación proteolítica de las caspasas 3, 8 y 9 y la ruptura de PARP en las líneas de linfoma de Burkitt EBV+ BL60 y Raji, mientras que no lo hizo en la línea Ramos (Burkitt EBV-) o en Dana (linfoblastoide EBV+) (ver Figura 10B).

Ejemplo 12. El I3C causa la despolarización mitocondrial Las células BL-60.2 y Raji se cultivaron con o sin I3C 200 μΜ durante 3, 5 y 8 horas. Posteriormente se marcaron con el reactivo fluorescente tetrametilrodamina metil éster (TMRM), para medir la despolarización mitocondrial, y se analizaron por citometría de flujo. Como controles positivos se utilizaron células cultivadas con medio en presencia de CCCP 25 μΜ. Los resultados indican que el I3C fue capaz de inducir eficientemente la pérdida de potencial de membrana en células BL-60.2 y Raji, como lo refleja la pérdida de tinción mitocondrial con TMRM (ver Figura 1 1 ).

Ejemplo 13. El I3C no afecta al ciclo celular en las líneas de linfoma de Burkitt EBV+ BL-60.2 Las células BL-60.2 se cultivaron con o sin I3C 200 μΜ durante 9, 15 y 24 horas. Posteriormente se tiñeron con ioduro de propidio (IP) y el contenido de DNA se analizó por citometría de flujo (ver Figura 12). Aunque se observó la inducción de muerte celular (pico subG1 ), esto no se correspondió con ninguna alteración significativa de los porcentajes de células en fase Gi , S o G ₂ /M en respuesta al tratamiento con I3C comparadas con las células control (tratadas con vehículo) en ninguno de los tiempos analizados, lo que indica que la muerte celular inducida por el I3C es estas células es independiente de la fase de ciclo, dado que el incremento en eventos apoptóticos no correlacionó con la disminución del porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular.

Ejemplo 14. El I3C modifica la expresión de diversas proteínas señalizadoras y proteínas pro y antiapoptóticas, como XIAP, clAP o MCL1 , en líneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+BL) (A y B), pero no en líneas de Burkitt EBV- (C) ni en líneas linfoblastoides no tumorales (LCL) infectadas con EBV (D)

Se determinó el efecto de distintas concentraciones de I3C en los niveles de expresión de proteínas implicadas en el control de la muerte celular, en concreto en una selección de proteínas de las familias BCL2, IAP y TRAF, todas ellas implicadas en señalización y en el control de la apoptosis, en las líneas celulares de linfoma de Burkitt EBV+ BL-60.2 (Figura 13A) y Raji (Figura 13B), en la línea de linfoma de Burkitt EBV- Ramos (Figura 13C) y en la línea linfoblastoide EBV+ Dana (Figura 13D).

Las células indicadas se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 μΜ). En el caso de las células incubadas con 200 μΜ de I3C, éstas se preincubaron o no con 100 μΜ de Z-VAD-fmk. A las 24 horas las células se lisaron y sonicaron y se determinó la concentración proteica. Se analizó la expresión de las proteínas indicadas mediante Western blot. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga.

Como se puede observar en las líneas de linfoma de Burkitt EBV+ BL-60.2 (Figura 13A) y Raji (Figura 13B) que fueron sensibles al I3C, las concentraciones de I3C 150 μΜ o superiores fueron capaces de reducir drásticamente los niveles de expresión de la proteína antiapoptótica MCL1 , aunque no tuvieron un efecto significativo sobre la expresión de BCL2, BCLXL O BAX. Igualmente, los niveles de expresión de los miembros de la familia de los inhibidores de apoptosis XIAP y clAP1/2 fueron drásticamente reducidos, en particular los de clAP1/2. En contraste con estos resultados, los niveles de expresión de FLI P _L (Flice-like inhibiting protein long form) fueron claramente incrementados por el I3C. Existen múltiples evidencias que demuestran que FLI P _L puede actuar como un activador de las caspasas apicales 8 y 10, aunque también se han descrito ejemplos en los que actúa como un modulador de la especificidad de la caspasa 8 para determinados sustratos o incluso como un inhibidor de la activación de las caspasas apicales. En el caso que nos ocupa, la acumulación de FLI PL parece correlacionar con la inducción de la proteólisis y activación de la caspasa 8 (ver Ejemplo 1 1 ), lo que sugiere que actúa como un modulador positivo de la actividad caspasa.

También se estudió el efecto del I3C sobre miembros de la familia de las proteínas asociadas a los receptores de TNF (TRAF)1 , 2 y 3. El I3C redujo hasta niveles indetectables la expresión de TRAF1 y TRAF3, mientras que afectó parcial pero significativamente la expresión de TRAF2. En todos los casos descritos, los efectos sobre la expresión de las proteínas estudiadas no parecieron ser dependientes de apoptosis ni de la actividad caspasa, ya que el Z-VAD-fmk no fue capaz de prevenir estos cambios en expresión. Además, en la línea de linfoma de Burkitt EBV- Ramos (Figura 13C) y en la linfoblastoide EBV+ Dana (Figura 13D), que fueron resistentes a muerte inducida por el I3C (ver Ejemplo 7), no existió ninguna alteración en los niveles de expresión de estas proteínas en respuesta al I3C, lo que sugiere que el efecto de este fármaco sobre la expresión de estas proteínas está implicado en la sensibilidad de estas líneas celulares a apoptosis.

Ejemplo 15. El I3C modifica la expresión de diversos factores de transcripción y proteínas virales en líneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL) (A y B), pero no en líneas de linfoma de Burkitt EBV- (C) ni en líneas linfoblastoides (no tumorales) (LCL) infectadas con EBV (D)

Las células de las líneas celulares BL-60.2 (A), Raji (B), Ramos (C) y Dana (D) se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 μΜ). En el caso del I3C a 200 a μΜ las células se dejaron sin tratamiento adicional o se preincubaron con 100 μΜ de Z-VAD-fmk. A las 24 horas las células se lisaron y sonicaron y se determinó la concentración proteica. Se analizó la expresión de los factores de transcripción p53, E2F1 , E2F4, c-MYC, TCL-1 , de la proteína represora p130 y de la proteína viral EBNA1 mediante Western blot. La expresión de β-actina se utilizó como control de carga.

Los resultados indicaron que, como era previsible, cMYC está sobreexpresado en las líneas de linfoma de Burkitt BL-60.2 (ver Figura 14A), Raji (ver Figura 14B) y Ramos (ver Figura 14C), pero no en la linfoblastoide EBV+ Dana (ver Figura 14D). Como se puede observar, el I3C indujo una drástica reducción en la expresión de cMYC a partir de 50 μΜ en BL-60.2 y de 100 μΜ en Raji, ambas líneas de linfoma de Burkitt EBV+. Sin embargo, el I3C no tuvo ningún efecto sobre la expresión de cMYC en la línea de Burkitt EBV- Ramos. La desaparición de cMYC correlaciona con la inducción de muerte celular inducida por I3C. No obstante, el efecto del I3C sobre la expresión de cMYC fue independiente de apoptosis, ya que la inhibición de la actividad caspasa por el Z-VAD-fmk no previene la desaparición de cMYC.

Otros factores de transcripción que han sido implicados en la etiología del linfoma de Burkitt, como son p53, E2F1 y TCL1 , no vieron su expresión afectada por el I3C en ninguna de las líneas celulares estudiadas. Sin embargo, otros, como E2F4 y la proteina represora p130 sí presentaron una disminución en su expresión causada por el I3C en BL-60.2 y en Raji, pero esta inhibición fue prevenida por el Z-VAD-fmk, lo que sugiere que fue causada una vez se ha inducido el proceso apoptótico. Es interesante mencionar que EBNA1 , una proteína del EBV que controla la expresión de genes virales también fue afectada en su expresión por el I3C (150 μΜ) en las líneas de Burkitt EBV+ BL-60.2 y Raji, pero nuevamente fue un proceso dependiente de apoptosis (ver Figuras 14A y B). Confirmando este punto, EBNA1 no fue afectada por el I3C en la línea linfoblastoide EBV+ Dana. Estos resultados sugieren, sobre todo en el caso de cMYC, que el efecto del I3C sobre su expresión no fue directo, sino que requiere de la participación de algún factor presente únicamente en las líneas de linfoma de Burkitt infectadas con EBV. Ejemplo 16. El tratamiento con I3C o con su dímero el diindolilmetano (DIM) reduce el tamaño del tumor en ratones xenotransplantados con células de la línea de linfoma de Burkitt EBV+ Daudi y aumenta la expectativa de vida de estos ratones

Se inocularon intraperitonealmente 10 x 10 ⁶ células de linfoma de Burkitt EBV+ Daudi en ratones inmunodeprimidos NOD/SCID (n = 28). Esta línea celular genera linfoma diseminado intraperitoneal que causa la muerte del ratón entre los 50 y 70 días desde su inoculación.

Los ratones comenzaron a tratarse 2 semanas después del xenotransplante con I3C o con DIM, diariamente y mediante sonda gástrica durante 5 días y descanso de 2, hasta el sacrificio del animal. En el primer caso las dosis diarias administradas fueron 200 mg/Kg de I3C en etanol:aceite de maíz (1 :9 v/v; 150 μΙ) (grupo I3C, n = 9) o con etanol:aceite (1 :9 v/v; 150 μΙ) (grupo control, n = 8).

En el segundo caso, las dosis diarias administradas fueron 200 mg/kg de DIM en etanol:aceite de maíz (1 :9 v/v; 150 μΙ) (grupo DIM, n = 6) o con etanol:aceite (1 :9 v/v) (grupo control, n = 5).

Se determinaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier entre los grupos de ratones tratados con I3C y los tratados con etanol:aceite (ver Figura 15 B). Los ratones control comenzaron a presentar síntomas de enfermedad terminal entre los días 50 y 70 desde la implantación del tumor, por lo que se sometieron a eutanasia. Sin embargo, en el caso de los ratones tratados con I3C, éstos sobrevivieron una media de 7 días más que los no tratados. Aunque el efecto del I3C en supervivencia no fue significativo (p = 0,2) en este experimento, sí lo fue el crecimiento del tumor. Como se observa en la Figura 15 A, el tamaño del linfoma en los ratones control fue de 8,9 ± 2,9 g mientras que en los tratados con I3C fue de 3,9 ± 1 ,9 g en el momento del fallecimiento.

En el caso de los ratones tratados con DIM, sí que se observó un incremento muy significativo en supervivencia (p = 0,012), y un 50% de los ratones sobrevivieron hasta la finalización del experimento (ver Figura 15C). El análisis patológico de estos ratones tratados con DIM que sobrevivieron demuestra la ausencia de linfoma en la cavidad intraperitoneal de los ratones, lo que sugiere que el DIM fue capaz de eliminar in vivo eficientemente a las células de linfoma de Burkitt EBV+ Daudi (panel C).

Aunque existen múltiples estudios sobre la actividad del DIM en distintos procesos biológicos, hemos observado que el DIM es altamente insoluble en medios acuosos (precipita a concentraciones superiores a 24 μΜ), por lo que no se ha podido realizar ningún estudio in vitro relevante sobre la efectividad antitumoral y el mecanismo de acción del DIM. Además, la baja solubilidad del DIM en medio acuosos pone en cuestión las conclusiones de los estudios previamente publicados con concentraciones de DIM superiores a 50 μΜ.

Ejemplo 17. Análisis de la toxicidad causada en ratones por los tratamientos con I3C, con fludarabina (Flu), I3C o por una combinación de ambos fármacos Ratones C57 (n=24) se pretrataron durante 5 días con 200 mg/Kg de I3C disuelto en etanol:aceite (1 :9, v/v; 150 μΙ) o únicamente con etanol:aceite (1 :9, v/v; 150 μΙ) mediante sonda gástrica. El tratamiento con I3C se continuó durante todo el experimento con una pauta de 5 días de administración consecutivos y descanso de 2. Transcurrida la semana de pretratamiento con I3C, los ratones se dejaron sin tratar o se inocularon intraperitonealmente con 8,75 mg/Kg o 35 mg/Kg de fludarabina durante 5 días consecutivos, manteniéndose el tratamiento con I3C o con vehículo. Los grupos de tratamiento fueron: Control, n = 3; I3C, n = 3; Flu 8,75 mg/Kg, n = 4; Flu 35 mg/Kg, n = 4; Flu 8,75+l3C, n = 5; Flu 35+I3C, n = 5. Después de 3 semanas se inició un segundo ciclo de tratamiento con fludarabina de 5 días consecutivos.

Los resultados indican que los distintos tratamientos no causaron una variación significativa en el peso de los animales (ver Figura 16A). El análisis de las transaminasas hepáticas glutamato-piruvato-transaminasa (GPT) y glutamato- oxalacetato-transaminasa (GOT) demostró que los tratamientos no produjeron ninguna alteración patológica de estas enzimas (ver Figura 16B). Igualmente, el análisis de la urea en sangre reflejó que no se produjo toxicidad renal aparente (ver Figura 16B). El análisis de las poblaciones linfocitarias de los ratones antes y después de los tratamientos, mostró que el tratamiento continuado con I3C no produce ninguna alteración en el número de granulocitos, linfocitos B o linfocitos T en sangre, ni lo hace en el número total de leucocitos (ver Figura 16C). El tratamiento con 35 mg/Kg de fludarabina sí causó una disminución en el número de granulocitos y linfocitos B, aunque solo en el caso de los linfocitos B esta disminución fue mayor en el tratamiento conjunto l3C/Fludarabina.