干扰素在治疗 /预防对常规抗肿瘤疗法有抗性的肿瘤中的用� �及相 关的产品和方法 技术领域

本发明涉及肿瘤 （特别是癌症）的治疗和预防， 具体而言， 本发 明提供了干扰素（IFN)在治疗和 /或预防对于常规抗肿瘤疗法有抗性的 肿瘤中的用途和 /或其与其它抗肿瘤疗法联合应用的用途，以� �相关的 产品和方法。 背景技术

许多常规使用的癌症疗法对于癌细胞的细胞毒 性是通过诱导致死 的 DNA损伤而产生的。 这些常用的癌症疗法为， 例如放射疗法（RT)、 某 些化学疗法（例如使用针对肿瘤细胞的抗体） 等。 然而， 人们发现许多 肿瘤对于这些常规的抗肿瘤疗法没有响应或响 应不佳。 目前， 仍然缺乏 有效的手段来治疗 /预防对于常规的抗肿瘤疗法（例如放射疗法� � 化学 疗法等）有抗性的肿瘤。

I 型干扰素是细胞因子的家族， 其通常以在抗病毒应答中的功能 而被人们所熟知。 然而， 在肿瘤系统中， I型 IFN的功能是被较少研 究和表征的。 一些证据显示， I型 IFN可能在控制肿瘤生长方面起某 些作用。 特别地， 利用 IFN- α/ Ρ中和抗血清的早期研究显示出， I 型 IFN可限制可移植性肿瘤的生长（Gresser等人， 1983)。 此外， 在 数种协同的可移植肿瘤模型 (包括 B16黑素瘤） 中显示， 完全缺失 I 型 IFN信号传导引起了更快的肿瘤生长和增加的死 亡率（Picaud等人， 2002)。 这些研究表明了 I型 IFN的重要性， 然而， 并没有人研究过 I 型 IFN对于肿瘤生长的抑制是否是免疫介导的. 最近， 显示了内源性 I型 IFN的产生在肿瘤免疫编辑中起关键性作用， 并且这种作用不同 于被很好地表征的、 II型 IFN (IFNy)在对于肿瘤的免疫应答中的作用 (Dunn等人， 2005; Dunn等人， 2006)。 与 I型 IFN在介导对于可移植 性肿瘤的 "天然" 免疫中所显现的作用相反， 对于 I型 IFN在已建立 的肿瘤 （例如癌症）的治疗中的作用所知甚少， 特别是那些被显示诱 导肿瘤特异性的适应性免疫应答的治疗 （例如局部烧灼辐射或某些化 学疗法） （Ma等人， 2010)。

癌症免疫编辑是这样的过程， 其中免疫系统抑制肿瘤生长并塑造 肿瘤免疫原性。 最近的研究显示出， 需要 I型 IFN来引起抗肿瘤应答 并且在癌症免疫编辑的过程中， I型 IFN的作用在时间上区别于 II型 IFN (即 IFN- Y )的作用。 在淋巴细胞介导的肿瘤排斥中， 树突细胞 ( DC ) ， 特别是 CD8 a (+) DC， 是内源性 I 型 IFN 的功能相关靶标 (Diamond等人， 2011)。 响应于生长中的肿瘤， 常常发生自发的 T细 胞引发。 然而， 未确定促进天然抗肿瘤 T细胞应答的内在免疫机制。 在人转移性黑素瘤中，转移性肿瘤组织中的 I型干扰素（IFN)的转录特 征谱和 T细胞标记物之间存在关联。 在小鼠中， 肿瘤移植后， 由 CDllc (+)细胞产生，而肿瘤诱导的 T细胞引发在缺少 IFN- α / P R或 Statl的小鼠中是有缺陷的。因此，宿主 I型 IFN通过在 CD8 a (+) DC 上的信号传导而对生长的肿瘤的内在免疫识别 是关键性的（Fuertes 等人， 2011)。

因此，迄今为止，人们仍然不清楚对于已产生 并建立的肿瘤而言，

发明内容

如上文所讨论的，许多常规使用的抗肿瘤疗法 对于癌细胞的细胞毒 性是通过诱导致死的 DNA损伤而产生的。 本发明的发明人发现， 过量的 宿主 DNA可以诱导 IFN的产生，其^ 内在免疫以及适应性免疫的级联， 从而使肿瘤消退。在缺乏 IFN或与其相关的信号传导的肿瘤细胞或肿瘤 中（或者宿主中）， 使肿瘤消退所需的免疫级联不能产生， 从而产生了 对于常规抗肿瘤免疫疗法的抗性。 因此， 本申请中描述了干扰素（例如 I型干扰素（IFN) )在局部肿瘤控制中的关键作用，特别是当将� �与常规 抗肿瘤疗法联合施用时，可产生协同效应而强 化所述常规抗肿瘤疗法的 效果或治疗和 /或滪防肿瘤对于所述常规疗法的抗性. 本发明的发明人 还发现， 需要 IFN来交叉引发 T细胞， 从而可通过旄用 IFN来使对于常 t射疗法或化学疗法有抗性的肿瘤消退。利用� �病毒介导的 IFN- β的 表达，发明人表明了将外源 I型 IFN (例如 IFN- Ρ )递送到肿瘤组织中也 足以选择性地扩增抗原特异性 Τ细胞， 这引起肿瘤完全消退。 申请 在还进一步开发了基于抗体的系统，来将 I型 IFN靶向递送到肿瘤組织 中， 而引起内在免疫和适应性免疫的^：， 以攻击所迷肿瘤。

因此， 在一个方面， 本申请中描述了 I型 IFN在肿瘤生长控制中 的关键性作用， 在一个具体实施方案中， 这是以 Τ细胞依赖性的方式 由基于抗体的 IFN融合蛋白递送介导的。肿瘤浸润性 DC的增强的交叉 引发能力不可归因于成熟的状态或常规共刺激 性分子的升高的表达， 而是取决于 I型 IFN的局部产生。 此外， 在另一个具体实施方案中， 利用临床上相关的、编码 ΙΡΝβ的腺病毒载体的局部 I型 IFN递送能够 以 CD8 ⁺ T细胞依赖性的方式介导完全的肿瘤排斥。 本发明的结果支持 了 I型 IFN在产生由连接抗肿瘤抗体的 IFN (即 Ab- IFN)产生的肿瘤特 异性 CD8+T细胞应答中的正面作用。

本发明的一个方面涉及干扰素 (优选 I型干扰素，特别是 IFN- β )、 其片段或其功能性变体用于制备药物的用途， 其中所述药物

-用于治疗和 /或预防对于常规抗肿瘤疗法（例如放射疗法� �化学 疗法）有抗性的肿瘤； 和 /或

-用于与其它抗肿瘤疗法（例如放射疗法、 化学疗法）联合应用 而治疗和 /或预防肿瘤；

其中所述常规疗法诱导肿瘤特异性的适应性免 疫应答； 并且 其中所述干扰素、 其片段或其功能性变体能够刺激产生抗肿瘤的 细胞毒性 Τ淋巴细胞。

在一个具体的实施方案中， 所述常规抗肿瘤疗法为放射疗法。 更 具体而言， 其为 X射线辐射， 辐射的剂量可以是， 例如 1 - 5Gy (例如 lGy、 2Gy、 3Gy、 4Gy、 5Gy ) 、 10Gy、 15Gy、 20Gy、 25Gy、 30Gy或更 高； 可连续进行所述辐射 1天或至少两天， 例如 3天、 4天、 5天或更 长.

在一个具体的实施方案中， 所述干扰素、 其片段或其功能性变体 被包含在病毒载体中， 所述病毒载体为例如， 腺病毒； 腺伴随病毒； 逆转录病毒，例如鼠莫洛尼白血病毒； 鼠哈维肉瘤病毒； 鼠乳腺肿瘤 病毒； 劳斯肉瘤病毒； SV40-型病毒； 多瘤病毒； EB病毒； 乳头状瘤 病毒； 疾奢病毒； 牛痘病毒； 脊髄灰貭炎病毒； 和 RNA 病毒例如逆 转录病毒； 优选地， 所述病毒载体为腺病毒载体。

在有一个具体实施方案中， 所述干扰素、 其片段或其功能性变体 与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如抗体） 相连， 其中所述靶向部 分与所述干扰素、 其片段或其功能性变体直接相连（例如作为融 合蛋 白）或通过连接子相连。

在一个具体实施方案中，所述肿瘤相关抗原为 EGFR, 所述靶向部 分为抗 EGFR抗体， 且所述肿瘤为表达 EGFR的肿瘤。

在其它的具体实施方案中， 所述肿瘤为恶性肿瘤， 例如恶性的固 体肿瘤， 其包括但不限于例如乳腺癌， 肺癌， 前列腺癌， 结肠癌， 皮 肤癌， 头颈癌， 淋巴瘤或黑色素瘤。

在其它的具体实施方案中， 本发明的所述药物用于与至少一种其 它的抗肿瘤疗法联合施用， 所述至少一种其它抗肿瘤疗法为例如放射 疗法（例如上文所述的 X射线辐射） 、 化学疗法等。 特别地， 所述化 学疗法可以为施用抗体的疗法， 所述抗体针对的是肿瘤相关抗原； 所 述化学疗法还可以是例如施用化疗剂， 所述化疗剂为例如但不限于： 坑基化试剂、 抗代谢药、 细胞毒性抗生素、 阿霉素、 放线菌素 D、 丝 裂審素、 洋红審素、 正定霉素、 多柔比星、 他莫西芬、 泰素、 泰索帝、 长春新碱、长春碱、长春瑞滨、依托泊苷（ VP- 16 )、 5-氧尿嘧啶（ 5FU )、 阿糖胞苷、 环磷酰胺、 塞替派、 氨甲蝶呤、 喜树碱、 放线菌素 D、 丝 裂霉素 C、 顺铂（CDDP ) 、 氨蝶呤、 考布他汀、 其它长春花生物碱及 其衍生物或前药等。

在具体的实施方案中， 所述常规抗肿瘤疗法为放射疗法， 并且所 述肿瘤或携带所述肿瘤的宿主在下列一项或多 项中有缺陷： 1 )干扰素 (例如 I型干扰素， 优选干扰素 α 或 β )的表达和 /或功能， 特别是 CD45+造血细胞表达的干扰素； 2 )干扰素受体的表达和 /或功能，其中 所述干扰素受体为例如 IFNa 受体和 /或 IFNP 受体.

本发明的另一个方面涉及组合物（例如药物组 合物） ， 其含有： -干扰素、 其片段或其功能性变体， 所述干扰素、 其片段或其功能 性变体与结合肿瘤相关抗原的靶向部分（例如 抗体）相连， 其中所述 靶向部分与所述干扰素、 其片段或其功能性变体直接相连（例如作为 融合蛋白）或通过连接子相连； 和

-任选地药学上可接受的载体.

在本发明的一个具体实施方案中，所述肿瘤相 关抗原为 EGFR, 所 述靶向部分为抗 EGFR抗体， 并且优选地， 所迷肿瘤为表达 EGFR的肿 瘤。 在具体的实施方案中， 所述靶向部分（例如抗 EGFR抗体）与所述 干扰素、 其片段或其功能性变体（例如 ΙΡΝβ )形成融合蛋白 （例如通 过直接连接） 。

在又一个方面中， 本发明涉及上文所定义的本发明的组合物用于 制备药物的用途，其中所述药物用于治疗和 /或预防肿瘤，例如恶性肿 瘤（特别是恶性的固体肿瘤）， 其包括例如乳腺癌， 肺癌， 前列腺癌， 结肠癌， 皮肤癌， 头颈癌， 淋巴瘤或黑色素瘤等。 在一个具体的实施 方案中， 所述肿瘤为黑色素瘤。

在另外的方面， 本发明涉及试剂盒， 其含有：

a)如上文中所限定的干扰素、 其片段或其功能性变体； 或者如上 文中所限定的本发明的组合物； 和

b)使用说明书，其中记栽了所述试剂盒用于治� ��和 /或预防对于常 规抗肿瘤疗法（例如放射疗法、 化学疗法）有抗性的肿瘤； 或者用于 与其它抗肿瘤疗法（例如放射疗法、 化学疗法）联合应用而治疗和 / 或预防肿瘤。

在其它的方面，本发明涉及一种预防和 /或治疗肿瘤的方法，所述 方法包括向患者施用：治疗和 /或预防有效量的如上文中所限定的干扰 素、其片段或其功能性变体；或者如上文中所 限定的本发明的组合物。 在具体的实施方案中， 所迷患者对于常规的抗肿瘤疗法（例如放 射疗法）没有响应。 在其它的实施方案中， 所述患者还在下列一项或 多项中有缺陷： 1 )干扰素（例如 I型干扰素， 优选干扰素 α 或 β ) 的表达和 /或功能， 特别是 CD45+造血细胞表达的干扰素； 2 )干扰素 受体的表达和 /或功能， 其中所述干扰素受体为例如 IFNa 受体和 /或 IFN 受体。

在另外的实施方案中，所述预防和 /或治疗方法还包括同时、顺次 (以任何顺序）或分别向所述患者施用至少一� �其它的抗肿瘤疗法（例 如放射疗法、 施用抗体的化学疗法、 施用其它化学治疗剂等） 。 附图说明

图 1. 辐射疗法增加了肿瘤微环境内的 IFN - & 。

a) . 对于已建立的 B16F10肿瘤（16-20天）的全部肿瘤 RNA中的 IFN-β mRNA水平进行的实时 PCR分析， 其中所述肿瘤未经处理或接受 了 20 Gy 的局部 RT 处理。 所显示的数据来自 RT后 6 小时提取的 RNA (*p=0. 0123) .

b) . 利用全肿瘤匀浆， 通过 ELISA检测 RT后 48小时的 IFNP蛋 白水平（*p=0. 0375)。

c) . 通过 RT- PCR, 在所示的时间点处对 IFN-β mRNA的水平进行 时间进程分析。 在所显示的时间点从已建立的 B16F10 肿瘤中分选出 CD45+和 CD45-细胞（所述肿瘤经 20 Gy的局部 RT处理） ， 然后提取 RNA并进行 RT-PCR, 所显示的数据是具有相似结果的三个实验的代 表 性数据。

图 2. 对于 RT的治疗性应答取决于宿主对于 I型 IFN的应答。 a) .携带已建立的 B16F10肿瘤的 WT和 IFNaRl K0小鼠的肿瘤生 长曲线， 所述小鼠未经处理或接受了局部 RT (15Gy， 连续处理三天）。 从 RT 的起始剂量开始， 对肿瘤生长作图（n=6-9 只小鼠， 汇集的数 据） (**p= 0. 0012, 在第 14天）。

b) . 对 π小鼠进行致死插射并用 π或 IFNaRl 0骨髓 (BM)进行 重构。 重构之后， 用 B16F10刺激嵌合小鼠并允许肿瘤建立 14天或者 允许肿瘤的平均体积达到 100mm ³ 。 已建立的肿瘤在第 14、 15和 16天 接受了局部烧灼 RT (15 Gy) (n= 7- 8/组， **p=0. 0011 ,对于 RT组 ψΤ→ΤΓ vs. IFNAR 0→WT ， 在处理后笫 20天）。

c) . 除了下述外与 b)相同： IFNctRl K0小鼠还被用作 WT BM的接 受者。 （***p<0. 0001 , 对于 WT→WT和 WT→IFNAR K0二者均是， 在 RT 后第 21天）。所显示的数据是具有相似结果的两个� ��验的代表性数据。

E) . 根据材料和方法部分所详细描述的程序，用来 自 WT或 IFNaRl K0小鼠的纯化的多克隆 T细胞重构 B6/RAG1+小鼠。 允许 T细胞重构 7 天， 然后用 5xl0 ⁵ B16-SIY (其中 SIY 为 2C T 细胞所识别的 SIYRYYGL-K (b)的简称）细胞通过皮下对其进行肿瘤刺激。 在肿瘤刺激 后的第 7天，用 25 Gy的总 RT处理肿瘤，此时肿瘸的体积大约为 80-100 «M ³ 。 监测肿瘤生长并根据材料与方法中所示的程序 来计算肿瘤的体 积。 n=4只小鼠 /组， 并且数据代表具有相似结果的两个实验之一。

图 3. 局部烧蚀 RT在 WT小鼠中赋予 TIDC以 T细胞刺激能力但是 在 IFNAR K0小鼠中不能产生有功能的 TIDC；。

a) 用 5xl 0 ⁵ B16-SIY肿瘤细胞接种 C57B1/6小鼠或 IFNRK0小鼠。 建立了 15天的肿瘤接受了 25 Gy的局部 RT辐射或未受处理。 从每组 3只小鼠的肿瘤（a)和引流淋巴结（d)中分离 CDllc ⁺ 细胞， 并将它们汇 集用于分析。 在不同的条件下， 将所分离的 CDl lc ⁺ 细胞与幼稚 2C TCR 转基因细胞共培养并通过掺入含氚的 -胸苷来评估 T细胞增殖。误差条 代表一式三份的孔之间的标准偏差（*P=0. 0167)。

b, c)在 72hr时分离来自 TIDC (c， d)和淋巴结 DC (f)的体外培养 物的上清液，这刚好在加入含氚的 -胸苷之前，使所述上清液经受多重 细胞因子珠阵列（CBA)以测量细胞因子浓度。� �示了来自培养物上清液 的 IFNy (b)和 TNFa (c)的水平（*ρ=0· 0192)。 所显示的数据是具有相 似结果的两个实验的代表性数据。 （除非另外指明， ***ρ<0. 001 , **ρ<0. 01 , *ρ<0. 05; 如上文所示， 可获得单独的 ρ值）。

图 4. ad-IFN- β的抗肿瘤效应是免疫介导的并且取决于 Τ细胞。 a) . 通过肿瘤内注射 2χ10 ¹⁽⁾ νρ ad-nul l或 ad- 1 FN- β来处理已建立 的 B16-SIY肿瘤， 并且监测肿瘤的生长（η=4 , **ρ=0. 0064) .

b) . 用 WT外周 T细胞或 PBS继受转移 Rag K0宿主，随后用 B16- SIY 刺激所述宿主。

c )通过肿瘤内注射， 用 2 10 1> ad-nul l或 ad-IFN- β处理已建 立的肿瘤。经 ad- IFN- β处理的小鼠亚组还接受了抗 CD4或抗 CD8耗竭 抗体（η=4， **ρ=0. 0069,对于 ad- IFN- β处理的 vs ad-IFN-β 和抗 CD8 处理的小鼠， 在第 32天）。 所显示的数据是具有相似结果的三个实验 的代表性数据。

图 5. Ad-IFN- β促进肿瘤抗原特异性细胞的优先扩增。

用经 CFSE标记的 2C Tg T细胞和 OTI/Thyr Tg T细胞的混合物 继受转移带有 12天建立的 B16- SIY肿瘤的 WT小鼠。 在第 13天和第 15天用 3xl0 ^1Q vp的 ad-nul l或 ad- IFN- β处理所述肿瘤。 三天后收集 DL 和脾脏。

a) . 代表性的 FACS图，其中显示了抗原特异性 2C细胞相对于非 特异性 0T- 1 TCR Tg T细胞的频率。

b) . 汇集的数据， 其中显示了 ad- IFN- β 处理之后， 2C细胞相对 于 0Τ- 1 TCR Tg T细胞在频率方面的显著增加（η=5- 7, **ρ=0. 0075) . c) . 汇集的数据， 其中显示了当使用对照 ad- nul l处理时， 2C与 OT-1 TCR Tg T 细胞的比率大致相等， 但是在 ad- IFN- β处理之后， 其显著增加（η=5-7) , (*ρ=0. 0128)。

d) . 代表性直方图， 其中显示了以增殖稀释 CFSE。

e) .小鼠携带有 12天建立的 B16- SIY肿瘤， 所述肿瘤经 ad- nul l 或 ad- IFN- β处理，所述小鼠在最后一次肿瘤内腺病毒注� ��后 3 - 5天， 通过静脉内注射而接受了加载了 S I Υ肽的靶细胞。转移后 18 - 24小时， 在脾脏中评估了靶细胞的特异性裂解（**ρ=0. 0015)。 所显示的数据是 具有相似结果的两个实验的代表性数据。

图 6. 用表达 IFN的腺病毒靶向肿瘤可降低肿瘤的生长。用 5*10 ⁵ 个 TUB0-EGFR细胞接种 Balb/C小鼠。 注射后两周， 通过在笫 14、 17和 20天进行肿瘤内注射而用 PBS, Ad-nul l或 Ad- IFN P (1*10 ¹⁰ vp) 处理小鼠。 每周两次测量肿瘤生长。

图 7. 抗 EGFR- 融合蛋白对于控制原发肿瘤生长是有效的。 用 5*10 ⁵ 个 TUB0- EGFR细胞接种 WT Balb/C小鼠。 注射后两周， 通过在第 14、 17和 20天进行肿瘤内注射而用 25 g的抗 EGFR或抗

EGFR- 处理小鼠。 每周两次测量肿瘤生长。

图 8.抗 EGFR- IFN β对于控制 EGFR-B16肿瘤生长是有效的。

用 5*10 ⁵ B16-EGFR-SIY细胞接种 FT Β6小鼠。 注射后 10天， 通 过在第 10、 13和 16天进行肿瘤内注射而用 254g的 hlg， 抗 EGFR或 抗 EGFR-IFN β处理小鼠。 每周两次测量肿瘤生长。

图 9.抗 EGFR-IFN p的抗肿瘤效果需要 CD8+T 细胞。 用 5*10 ⁵

B16-EGFR-SIY细胞接种 WT B6小鼠。 注射后 10天， 在第 10、 13和 16 天通过肿瘤内注射而用 25 g的 hlg、 抗 EGFR或抗 EGFR-IFN β处理小 鼠。 在第 9、 14和 19天， 通过腹膜内施用耗竭抗体抗 CD4和抗 CD8

(200μ ₈ )„ 每周两次测量肿瘤生长。 具体实施方案

术语及定义

除非特别说明， 本申请中所使用的术语和定义均是本领域中惯 常 使用的含义并且为本领域技术人员所知晓。

如本申请中所使用的， 术语 "继受性转移" 是指将 Τ细胞转移到 接受者中。

如本申请中所使用的， 术语 "肿瘤位点" 是指含有或被怀疑含有 肿瘤细胞的体内或离体位置。 所述肿瘤位点包括固体肿瘤以及接近或 邻近肿瘤生长处的位置。

如本申请中所使用的， 术语 "施用" 是指全身性和 /或局部施用。 术语 "全身性施用" 是指非局部地施用， 从而所施用的物质可能影响 整个身体中的若干器官或组织； 或者从而所施用的物质可能穿越整个 身体中的数个器官或组织而到达靶位点。 例如， 向受试者的循环系统 施用可引起治疗性产物在多于一个组织或器官 中从所施用的栽体表 达， 或者可引起治疗性产物在特异性位点处由所施 用的载体表达， 例 如， 这是由于天然的趋向性或由于与组织特异性启 动子元件的可操作 连接。本领域技术人员将理解，所述全身性施 用涵盖各种形式的施用， 这包括但不限于： 肠胃外施用、 静脉内施用、 肌内施用、 皮下施用、 经皮施用、 口服等。

术语 "局部施用" 是指在特异性位点处或其周围施用。 本领域技 术人员将理解， 局部施用涵盖各种形式的施用， 例如直接注射到特定 位点处或注射到其周围 （例如肿瘤内施用） 。

如本文中所使用的， 术语 "治疗和 /或预防有效量"是指达到治疗 和 /或预防目的疾病或病况（例如肿瘤 /癌症， 例如用于使肿瘤消退或 减小肿瘤的大小）所需的本发明的干扰素、 其片段或功能性变体， 或 者本发明的组合物的量。 可以通过实践、 按照常规的方式来关于特定 的目的而确定所述有效量。 特别地， 所述治疗有效量可以是达到下述 目的所需的量：减少癌细胞的数目；减少肿瘤 大小；抑制（即减緩或停止) 癌细胞浸润到外周器官中；抑制（即减緩或停 止）肿瘤转移；抑制肿瘤生 长;和 /或緩解与癌症相关的一种或多种症状。

术语 "抗体" 涵盖例如， 单克隆抗体、 多克隆抗体、 单链抗体、 抗体片段（其显示出所需的生物学或免疫学活 性） 。 在本申请中， 术 语 "免疫球蛋白" （Ig)与抗体可互换地使用。 所述抗体可特异性地靶 向肿瘤抗原， 例如表面肿瘤抗原， 例如 EGFR, CD4, CD8等。

术语 "片段" （例如干扰素的片段）是指生物学分子（例如 蛋白 质， 如干扰素或其编码核酸） 的一部分， 其能够实现所需的生物学功 能， 例如诱导肿瘤特异性 T细胞的扩增。

术语 "功能性变体" 是指， 经过修饰 （例如突变、 插入、 删除。 融合、 缀合、 交联等） 而与亲本分子（例如干扰素）不同， 但是保留 了所需的其生物学活性的变体。

可通过本领域已知的各种常规的方法来使干扰 素、 其片段或其功 能性变体与所述靶向部分向连接。 所述连接可以是直接或间接的 （例 如通过连接子） ， 在直接连接的情形中， 可以通过形成融合蛋白、 缀 合或化学连接而实现。 当所述连接形成融合蛋白时， 其可通过例如重 组技术或肽合成技术而实现。 在某些实施方案中， 所述融合蛋白也可 包含连接子， 所述连接子不破坏所形成的产物的目的特性（ 例如诱导 肿瘤特异性 τ细胞的扩增） 。

本领域技术人员能够根据具体的病况、疾病类 型（例如肿瘤类型、 肿瘤的发展阶段等） 、 严重程度、 患者体 、 可能联合施用的其它疗 法、 之前曾施用过的疗法等而选择适当的剂型和施 用方式。

术语 "癌症" 是指通常被表征为不受调节的细胞生长的病况 （例 如在哺乳动物、 例如人中） 。 所述癌症包括但不限于， 例如乳腺癌， 肺癌， 前列腺癌， 结肠癌， 皮狹癌， 头颈癌， 淋巴瘤或黑色素瘤等。

术语 "常规抗肿瘤疗法"是指迄今为止， 本领域中普遍用来治疗 和 /或预防肿瘤的产生、发展、转移等的疗法， 这包括但不限于， 放射 疗法（例如通过使用 X射线辐射、 放射性同位素等） 、 使用化学治疗 剂、 使用肿瘤特异性抗体等。

术语 "放射疗法抗性" （或 RT抗性 )是指肿瘤或肿瘤细胞对于常 规剂量和 /或致死剂量（例如， 15Gy的 X射线辐射， 连续施用 3天） 的放射性处理没有响应， 即例如与未进行所述放射性处理的相同形状 的肿瘤相比， 接受了所述放射性处理的肿瘤的大小没有显著 减小， 肿 瘤细胞的数目没有显著减少， 肿瘤复发的倾向没有得到抑制， 肿瘤的 转移没有得到控制等。

"I型 IFN"是指 I型干扰素，其包括例如 IFN α 、 IFNp 、 IFN w 、 IFN t 、 IFN d 、 IFNk等。

在本申请中， 术语 "病毒载体" 是指用于将目的蛋白 （例如干扰 素）递送到靶细胞或组织中的任何适当的病毒 载体， 这包括但不限于 例如腺病毒载体、 腺伴随病毒载体、 逆转录病毒载体、 鼠哈维肉瘤病 毒栽体、鼠乳腺肿瘤病毒载体、劳斯肉瘤病毒 载体、 SV40-型病毒栽体、 多瘤病毒载体、 EB病毒载体、 乳头状瘤病毒载体、 疱疹病毒载体、 牛 痘病毒载体、 脊髄灰盾炎病毒载体和 RNA病毒载体； 优选地， 所述病 毒载体为腺病毒载体。

在本申请中， 术语 "肿瘤相关抗原" 包括例如肿瘤表面抗原， 这 包括但不限于例如表皮生长因子受体家族（EGF R)的成员， 这包括 EGFR, HER1, HER2, HER4和 HER8等 (Nam, N. H. , & Parang, Κ· (2003)， Current targets for anti cancer drug discovery. Current Drug Targets, 4 (2) , 159-179) , STEAP (six-transmembrane epi thelial antigen of the prostate; Hubert等人， STEAP: a prostate-specific cel l-surface ant igen highly expressed in human prostate tumors. , Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96 (25) : 14523-8. ) , CD55 (Hsu 等人, Generation and characterizat ion of monoclonal antibodies directed agains t the surface antigens of cervical cancer cel ls. , Hybrid Hybridomics. 2004; 23 (2) : 121-5)。

能用于本发明的其它合适的抗体包括利妥昔单 抗 (RituxanTM, 嵌 合的抗 CD20抗体）， Campath-1H (抗 CD52抗体）， 和任何癌症特异性 细胞表面抗原的抗体。 下列示例性地列出了针对特定癌症类型的、 适 于与干扰素结合而用于本发明的目的的抗体： 阿仑珠单抗（CampathTM) 用于慢性白血病； 贝伐珠单抗（AvastinTM)用于结肠癌和肺癌； 西妥 昔单抗（ErbituxTM)用于结肠癌和头颈癌； 吉妥珠单抗（MylotargTM) 用于急性髄性白血病； Ibritumomab (Zeval inTM)用于非霍奇金淋巴瘤； 帕木单抗（VectibixTM)用于结肠癌； 利妥昔单抗（RituxanTM) 非霍 奇金淋巴瘤； 托西莫单抗 (BexxarTM) 用于非霍奇金淋巴瘤；和曲妥珠 单抗（HerceptinTM)用于乳腺癌。

在本发明中， "药学上可接受的载体"是指不会在所施用的细� �� 或受试者中引发过敏反应或其他不适影响， 并且不会影响药物活性的 载体。 合适的可药用载体包括但不限于， 例如， 一种或多种水、 生理 盐水、 磷酸緩冲液、 左旋糖、 甘油、 乙醇和其他类似物， 以及上述物 质的组合。 药学上可接受的载体还可进一步包括能提高核 酸、 多肽、 病毒颗粒或细胞的保存期限或效用的微量辅助 物质， 例如湿润剂或乳 化剂、 防腐剂或緩冲液。 在本申请中，在干扰素和 /或其受体中 "有缺陷"是指所述干扰素 或干扰素受体的表达不能达到实现其生物学功 能所需的水平， 或者所 表达的干扰素或干扰素受体不能发挥所需的生 物学功能（例如以突变 的形式存在）， 或者干扰素（或干扰素受体）不能够与其受体 （配体） 相互作用而引起下游的信号传导。 下面的实施例仅仅是为了更好地阐释本发明， 而不意在以任何方式 限制本发明。 实施例

材料和方法

小鼠

C57BL/6小鼠，棵鼠， B6/0TI TCR转基因小鼠， Ly5. 1小鼠和 B6/Rag- 1 K0小鼠购自 Jackson Laboratory, 为 6-7周龄。 2C TCR-转基因小鼠是 由 Jianzhu Chen, MIT, Cambridge, MA提供的， 并被保存在芝加哥大 学的无特定病原体 (SPF)设施中。 B6/IFNA1R K0小鼠是由芝加哥大学的 Anita Chong慷慨地提供的。 对于所有的实验， 小鼠均为 6-16周龄， 在 SPF 下培育小鼠并且根据动物照料和使用委员会研 究所设定的动物 实验指南（IACUC)来使用小鼠。 细胞系

Bl 6-F10 小鼠黑素瘤细胞是从美国典型培养物保藏中心 获得的。

B16-SIY黑素瘤细胞和抗 2C TCR (1B2)抗体是从 Tom Gajewski (芝加哥 大学）获得的。 在含有 L-谷氨酸盐的 RPMI 1640培养基中、在 37Ό和 5¾ C0 ₂ 中培养细胞， 在所述 RPMI 1640中补充了 10% FBS, 100U/ml青霉素， 100 U/ml链霉素， lniM丙酮酸钠， 0. ImM非必需氨基酸和 HEPES。 在含 有 G418 (lmg/ml)的培养基中维持 B16-SIY细胞系。

RNA纯化和基因阵列分析 对 B16F1肿瘤进行辐射 (20Gy)或不对其进行处理。 在辐射后 5小时， 将肿瘤切除， 在液氮中快速冷冻并储存在 -80Ό直至进一步处理。 将经 冷冻的肿瘤切为大小约 5mm ³ 的片， 并在 RNA a 产 ICE溶液（Applied Biosystems-Ambion)中浸泡过夜。 将样品离心、 在 RLT緩冲液（QIAGEN) 中清洗，并使用设置为 3000rpm的;^玻璃- Teflon匀浆器在冰上将所述 样品均质化。使用 RNeasy离心柱和 TRIzol试剂的组合而进行进一步的纯 化， 如之前所描述的（Khodarev等人， 2004) . 使用凝胶电泳（ 1. 8%琼脂 糖）和分光光度法来评估样品的质量。 相对于 lmg/ml的浓度而使 RNA样 品归一化， 以相等的量将来自至少三个肿瘤 /組的样品汇集起来， 且将 所汇集的样品转移到芝加哥大学的功能性基因 组学设施中，用于以小鼠 基因组 ⁴ 30 2. 0 GeneChips®阵列（Af fymetrix)进行标记和杂交. 对于在 经辐射 vs.未处理的肿瘤中差异表达的基因的选择和分 析是基于之前所 详细描述的过程（Khodarev等人， 2004; Kimchi等人， 2005; Pitroda等 人， 2009)。 简要地， 使每个阵列与汇集的总 RNA样品杂交。 在获取数据 后， 使用 "整体中值归一化" （Kimchi等人， 2005)在整个数据集中重新 调节数据并如所描述的对数据进行过滤（Khodar ev等人， 2004)。 随后的 分析是基于重复阵列的成对比较， 其中使用了微阵列的显著性分析 (Tusher等人， 2001)版本 3. 02, 将误发现率设置为 <1%。 对所选的探针 组 ID 进 行 基 因 注 释 并 使 用 Netaffx 分 析 中 心 (https: //www. af fymetrix. com/analysis/netaffx/index. af fx)对其 进行功能性分析' 产生骨髓嵌合体

用单一剂量的 1000 rad对野生型（WT)或 IFNAR K0小鼠进行致死辐 射。 次日， 将 2- 3xl0 ⁶ 个^^骨髄 (BM)细胞静脉内继受性转移到经辐射 的小鼠中。 重构后， 将小鼠维持在经在饮用水中稀释的磺胺曱恶唑 和曱 氧苄氨嘧啶 (复方新诺明)抗生素上 4周。 重构后 5 - 6周， 将肿瘤细胞 注射到小鼠中。 T细胞的继受性转移

淋巴结（LN)细胞和脾细胞是从 2C或 OTI Tg小鼠分离的。 然后， 将 以羧基荧光素琥珀 Bt亚胺酯（CFSE)标记的共 2 X 10 ⁶ 个 2C或 0T1 T 细 胞静脉内继受转移到带有 B16- SIY肿瘤的 C57BL/6小鼠中。在所示的时 间点从引流淋巴结（DLN)、 脾脏或肿瘤中分离细胞。 如之前所描 评 价 CFSE稀释 (Yu等人， 2004; Yu等人， 2007)。 对于 RAG K0接受者的 重构， 从^^小鼠收集脾细胞和淋巴结细胞， 并使用 Pan T细胞分离试 剂盒和自动化磁性细胞^ ^ (autoMACS™ Miltenyi Biotec)来^ i T细 胞。 流式细胞术分析

从小鼠上切除肿瘤、 DLN和脾脏（SP )，将其切碎并用 1. 5mg/ml 胶 原酶， lU/mL分散酶和 0. 4 mg/ffll DNA酶 I在 37Ό下消化 40 min, 然后 加入 EDTA至终浓度为 6mM,以将所述酶灭活。用抗 CD16/32 (抗 FCTI I I/I I 受体， 克隆 2. 4G2)将所述细胞的单细胞悬浮液在室温下孵育 20 min， 随 后用下列缀合的抗体进行染色：抗 CD45. 2 (克隆 104)， 抗 CD90. 1 (抗 Thy- 1. 1, 克隆 OX- 7) , 抗 CD8a ( 隆 53- 6. 7)， 抗 CDllc (^隆 HL3)， 抗 CDllb (克隆 M1/70) , 抗 Ly6C (克隆 AL-21) , 抗 I- A/I- E (克隆 M5/114. 15. 2) ,抗 CD80 (B7-1,克隆 16-10A1)，抗 CD86 (B7-2,克隆 GL1) , 抗 CCR7 (^隆 4B12)或抗 CD4 (^隆 GK1. 5)。 所有纯化的和经荧光标记的 单克隆抗体都是从 BD Pharmingen购买的。 在 FACSCanto流式细胞仪 (BD Biosciences)上分析样品，并用 FlowJo软件（TreeStar, Inc. )对数据进 行分析。 肿瘤生长和治疗

用胰蛋白酶消化经培养的癌细胞， 用培养基进行清洗， 并在背部将 其皮下注射到相应的小鼠中。 以 3- 4天的间隔确定肿瘤大小。 沿着三个 正交轴（a， 6和 c)测量肿瘤体积并将肿瘤体积计算为等于 a^/2。 用所 示量的 Ad-IFN- P或 Ad-null 病毒肿瘤内地接种肿瘤结节。 通过与 Biogen Idee的合作来获得 Ad- IFN- β。 为了进行抗体介导的细胞耗竭， 在原始肿瘤接种后的第 9天，第 11天和第 13天,向小鼠腹膜内给予 200 /小鼠的抗 CD4或抗 CD8 (YTS. 169. 4. 2)抗体。 使用 GE Maxi tron x射 线产生器， 以各个实验所示的剂量使小鼠接受局部的 X射线辐射。每只 小鼠都用铅盖进行保护， 露出肿瘤， 从而允许了局部 IR ( ionizing radiation )福射。 实时 PCR

在以 20 Gy进行局部 RT后， 在所示的时间点收集肿瘤。 使用由经 DNA酶 I处理的 RNA制备的 cDNA来进行实时 PCR,所述 RNA是从整个肿瘤 提取的，或者是由通过 BD FACSAria细胞分选仪分选为 CD45. 2 ^† 和 CD45. 2_ 群体的单细胞悬浮物提取的。所使用的引物和 探针如下面所述。对于 IFN β：正向 5' - ATG AGT GGT GGT TGC AGG C-3' (SEQ ID NO: 1)， 反向 5' - TGA CCT TTC AAA TGC AGT AGA TTC Α-3' (SEQ ID NO: 2)。 对于 GAPDH: 正向 5' -TTC ACC ACC ATG GAG AAG GC-3' (SEQ ID NO: 3) , 反向 5' -GGC ATG GAC TGT GGT CAT GA-3' (SEQ ID NO: 4)。 在 ABI/Prism 7300 (Appl ied Biosystems)上进行实时 PCR反应， 终体积为 25μ1， 其中含有 2. 5μΜ的 正向和反向引物， 2x Taqman Master Mix (Applied Biosystems) (其 中含有 Ampl iTaq Gold聚合酶）。 循环条件为： 单一变性步骤， 进 行 15 min; 随后进行 45个循环， 每个循环中在 94 进行 15s , 且在 60 Π进行 lmin。 利用标准曲线来分析 /？/；^和 基因的表达， 然后 使样品相对于 ί¾ ^进行归一化。 所述标准曲线具有的 R ² 值 >0. 99。

ELISA

进行局部 X射线辐射之后，在所示的时间点收集肿瘤并� �其进行称 重，在 IX磷酸盐緩冲液 (PBS)以及 IX Hal t蛋白 制剂混合物 (Thermo Fisher Scientific)中， 在水上进行均质化。 收集上清液并且使用 VeriKine小鼠 IFN- P ELISA试剂盒（PBL IFN Source) , 按照生产商的 指导;^测 IFN- β。 体内特异性裂解测定

用 0. 5xl0 ⁶ B16-SIY细胞皮下注射小鼠. 在注射后的笫 12天和笫 14天， 用 axltT ad-IFN- P或 ad-nul l肿瘤内处理小鼠。 进行所 ¾t理 3-5 ^、 将相等数目的经 CFSE标记的 脾细胞静脉内地转移到小鼠 中， 所述供体脾细胞中被补充以 SIY肽 (lyg/ml)或 0T-1 肽（lyg/ml)。 补充了 SIY的细胞经 CFSE * (ΙΟμΜ)标记， 而朴充了 0Τ- 1 的细胞经 CFSE (1. ΟμΜ)标记。 还将加载了所述肽的脾细胞转移到幼稚的、 不携带肿瘤 的小鼠中作为对照。 18- 24小时后， 收集接受者小鼠的脾， 并通过 FACS 进行分析。 如下计算特异性裂解：

%特异性裂解 = [ (%CFSE低 X A - %CFSE 高） / (%CFSE低 x A) ] x 100

其中 A=% CFSE * (特异性肽 -SI Y)除以％ CFSE低 （非特异性肽- 0T-1 ) (在幼稚对照小鼠中， 对于多个对照的结果进行了平均）。

DC交叉引发测定和细胞因子检测

将 5xl0 ⁵ 个 B16- SIY肿瘤细胞皮下注射到 C57BL/6小鼠的下背部。 在肿瘤被建立起来之后， 小鼠接受了肿瘤处的局部 RT (20 Gy) , 并且 3 天后收集肿瘤用于 DC 纯化。 用剪刀将肿瘤细细地剪碎并使用含有 1. 5mg/mL j^、醉（Sigma) , lU/mL 醉（BD Biosciences)和 0. 4mg/mL DNA酶 I (Sigma)的溶液在 37°C下、 在设置为低速的旋转培养箱中消化 40 分钟。 使来自所产生的单细胞悬浮液的活细胞经受 Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare)离心， 并将所分离的细胞用于 DC纯化， 其中使用 了 CDllc+磁珠试剂盒和自动化磁性细胞分选 (autoMACS™ Mi lteayi Biotec)。 对于体外培养， 用 2xl0 ⁵ 幼稚 2C细胞铺板 lxlO ⁵ 个 DC, 其中 添加或不添加外源性 SIY肽（ g/ml) , 3天后收集上清液， 用于按照生 产商的指导通过细胞流式珠阵列（CBA) (BD Biosciences)来进行分析。 按照与体外培养条件相似的条件来评估细胞增 殖，这是通过下列过程进 行的： 在 72小时时补充 ³ H-胸苷、在 96小时的时候收获细胞用于分析、 并在液体闪烁计数器上进 ^板。 产生表达 IFN β的腺病毒 (Ad- IFN β )

为了构建重组腺病毒" mIFN β，通过 PCR扩增小鼠 IFN β cDNA并将 其克隆到 pAdenoVator- CMV5 (CuO)的 Notl/EcoRV位点中，使其处于 CMV5 启动子的控制之下. 通过 Pa 消化使 pAdenoVator- mIFN P线性化并以 2. 5kV将其电穿孔到电感受态细胞 BJ5183中，用于与含有腺病毒基因组 的骨架载体进行重组。在卡那霉素 LB琼脂板上选择杂合粘粒。使用 Pad 消化来进一步鉴别含有插入物 mlFN P的重组粘粒。 通过 Pa 消化使 Ad-mIFN β DNA线性化，不经进一步纯化而将 Pa 消化的混合物转染到 293细胞中用于产生重组腺病毒。 腺病毒 - mIFN P被称作 Ad- IFN β。 统计学分析

使用非配对双尾 t检测来进行统计学分析。误差条代表标准偏� �。 除非特别另行说明， 否则下面的实施例中所使用的材料和方法均是 根据上文中 "材料与方法"部分的介绍而进行的。 实施例 1 辐射疗法增加肿瘤内 IFN- P的产生 由于 DC成熟不被局部的 RT可测量地影响并且单独的肿瘤抗原交叉 呈递不能解释来自接受局部 RT的肿瘤的 DC中增加功能性，发明人提出 局部的 RT可能通过局部细胞因子环境的变化而提升局� ��肿瘤微环境以 应的 DC功能。 就细胞因子基因表达的显著不同来查看所获得 的基 因阵列数据， 得到了很少的符合检测阈值的令人感兴趣的候 选者（数据 示）。 然而，发明 AJ«见察到了经处理的肿瘤中 IFNP表达的小的、但 是一致的增加。对肿瘤样品进行的 RT- PCR和 ELISA证实了局部 RT之后， IFNP的确被上调了，在 RNA (图 la)和蛋白质水平（图 lb)均是如此。通过 细胞分选进行的进一步分析显示， I型 IFN主要是由浸润肿瘤的 CD45+ 造血细胞产生的（图 lc)。 为了证实在 CD45-级分中产生的少量 IFN-β 不是来自肿瘤细胞， 发明人测试了辐射是否能在体外直接诱导来自 B16 肿瘤细胞的 IFN- β。 体外 X射线辐射肿瘤细胞之后， 在蛋白质和 mRNA 水平上都检测不到 IFN- β转录物，这表明 CD45级分中少量的 IFN-β信号 有可能是来 ϋ非造血间质细胞 (数据未显示）. 这些数据表明， 局部 RT 之后， ΙΡΝβ在肿瘤内被上调并且这些数据还支持了� ��血细胞是经辐射的 肿瘤内 IFN- β的主要来源。 实施例 1 IFN- α/β响应对于 RT的治疗效果是关键性的 为了首先测试 I型 IFN对于 RT介导的肿瘤减小是否是关键性的， 申请人在野生型（WT)和 IFN受体 1 α敲除（IFNaRl K0)小鼠两者中建立 了亲本 B16F10肿瘤。 这些小鼠缺乏 IFN-α/β受体的 cc亚基， 因此它们 对于 al ll型 IFN没有应答 (Muller等人， 1994)。 连续三天， 每天用 15 格雷（Gy)的局部 RT处理带有肿瘤的小鼠（15 Gy χ3) , 并且监测肿瘤生 长。 发明人之前确立了， 这种治疗方案能够在用 B16F10刺激的野生型 小鼠中成功地控制肿瘤的生长 (Lee, 2009)。 在 FT和 IFNotRl K0组中, 未处理的肿瘤快速地发展（图 2a) .与未经处理的小鼠中的肿瘤相比，接 受了 15 Gy X 3的 T小鼠显示出强的肿瘤生长抑制。 相反， IFNaRl 0 小鼠中的肿瘤以与未经处理的肿瘤相似的动力 学生长，并且显示出对于 甚至是高剂量 RT的几乎完全的抗性。 因此， 对于 RT的应答的确是依赖 于宿主对于 I型 IFN的应答。

I型 IFN发挥多效的效果， 这包括例如抗病毒， 抗增殖， 免疫调节 和抗血管生成的应答等。 常见的杂合二聚 IFN- α/β受体是普遍表达的但 是 IFN 受体作用的效果可根据细胞类型而变化（Uddin� �� Platanias, 2004; van Boxel-Dezaire等人， 2006)。 由于 IFN-α/β受体的普 达， 肿瘤细胞是 I型 IFN的潜在靶标，其中肿瘤细胞上的直接信号传 导能够 介导抗增殖效果（图 2)。 因此， IFNaRI KO宿主中缺^ Jt 于 RT的应答可 能是由于非造血肿瘤相关间质细胞、 免疫细胞或其組合中的受体缺陷。 为了检测这些群体中对于 I型 IFN应答的需求，发明人制备了相互骨髓 (BM)嵌合体。 用 1000 rad (即致死剂量）对 或 IFNaRl K0宿主进行 辐射， 并用 FT或 IFNaRl K0骨髄重构。 用局部烧烛 RT (15 Gy x3)处理 携带肿瘤的小鼠， 如所预期的， 肿瘤在两个未经处理的组中都逐步生长

(图 2b)。 以 WT骨髓重构的小鼠中的肿瘤以与野生型小鼠类� ��的方式应 答. 然而， 在 IFNaRl KO BM接受者中， 尽管在所有其它组织（包括肿 瘤细胞本身） 中都存在对于 IFN-α/β的敏感性， 在仅仅在 BM细胞上缺 少 IFNaRl的小鼠中， 肿瘤对于 RT不再有应答（图 2b)。 通过用 骨髄重构 WT或 IFNaRl KO接受者，测试了源 骨髄的细胞上 I型 IFN信 号传导是否充分. 如所预期的， 接受了 WT BM 的 WT接受者中的肿瘤对 于 RT的响应与野生型动物相似（图 2)。有趣地，一旦恢复了造血细胞对 于 IFN- α/β的敏感性， IFNaRl K0小鼠就对 RT有应答了（图 2c)。 因此， 在非肿瘤细胞中， 需要造血系统中的 IFN-α/β应答来实现 RT的治疗效 果。

为了特异性地研究 T 细胞对于 I 型 IFN 的响应， 发明人利用了 继受性转移方式。 用从 WT或 IFNaRl 0小鼠中纯化的总的 T细胞重构敲 除了重组酶活化基因（RAG )的小鼠， 并且在 T细胞转移后一周用肿瘤细 胞接种这些 T细胞嵌合的小鼠， 在接种的时候， 经转移的 T细胞的稳态 扩增已经停止了（数据未显示）。用局部烧蚀 RT处理在 T细胞嵌合的小鼠 中所建立的肿瘤并监测肿瘤生长。 如所预期的， 接受了 ΤΓ Τ细胞的经处 理的小鼠能够控制肿瘤生长 (图 2e)。 令人惊讶地， 接受了 IFNaRl KO T 细胞的小鼠在局部 RT之后仍然能够介导同等的肿瘤控制。 因此， 不需要 对于 I型 IFN的直接 T细胞应答来实现 RT介导的肿瘤控制。 实施例 3局部 RT恢复了肿瘤浸润性 DC以 IFN依赖性的方式引发 T细胞 的能力

本发明的发明人的数据凸显了造血细胞的 I型 IFN响应在局部 RT 的治疗效力方面的关键性作用， 然而， 发明人想了解所述系统中的 I型 IFN信号传导与 DC功能之间是否有联系。发明人希望确定对于 I型干扰 素的应答是否能够解幹他们所观察到的、未处 理的肿瘤和经局部辐射的 肿瘤的 DC之间的功能性差异。 当分析 IFNa Rl K0小鼠中来自未处理的 B16-SIY肿瘤的肿瘤浸润性树突细胞的功能时，� �现它们刺激幼稚 2C T 细胞增殖的能力严重下降了（图 3a)， 当使用来自未处理的肿瘤的 DC 时类似地观察到了这一缺陷（图 3a)。 有趣地， 在 IFNa Rl K0小鼠中对 肿瘤进行局部辐射没有能够恢复 TIDC (即肿瘤浸润性树突细胞）刺激 T 细胞的能力， 这与从接受了局部 RT的肿瘤中分离的 π DC的增加的能 力形成了鲜明的对比（图 3a)。 此外， 由？ Γ TIDC驱使的 T细胞增殖在培 养物上清中诱导了稳健的 IF 生产， 明 T细胞刺激引 得了极化 的效应子 T细胞表型（图 3b)。 从经辐射的肿瘤中纯化的 IFNa Rl K0 DC 不能刺激 T细胞增殖的能力， 这不能通过加入外源性 SIY肽而被恢复， 此外，与提供外源性 SIY肽一起在体外共培养± ^中用细菌脂多糖 (LPS) 肽刺激 TLR不能恢复 TIDC刺激 T细胞增殖的能力（图 3a) , 这些结果也 进一步证实了发明人之前在野生型小鼠中获得 的结果。 另外， 通过用 I 类 MHC， II类 MHC, B7-1, B7- 2和 CCR7进行表面染色而评估了 IFNa Rl KO DC的成熟， 示出与 FT TIDC等同的表达， 其中在来自经处理和 未经处理的肿瘤的 DC之间没有观察到显著的差异 (数据未显示）。此外， 因为与来自经辐射的肿瘤的 WT TIDC相比， 响应于 LPS的 TNFa生产是 等同的（如果没有增加的话） ， IFNa Rl KO TIDC不太可能在功能上全 面受损（图 3c)。 为了证实在 IFNa Rl KO小鼠中， DC的功能没有全面受 损， 发明人分析了从 和 IFNa Rl KO小鼠的肿瘤引流淋巴结中分离的 DC. 在其驱动 T 细胞增殖和效应子细胞因子产生的能力方面， WT和 IFNa Rl KO小鼠之间的淋巴结 DC在功能上是没有区别的（图 3d 以及未 显示的数据）。 来自 WT和 IFNa Rl KO小鼠淋巴结的 DC还显示出了对于 LPS 等同的应答， 如通过 TNFa的产生所测量的（数据未显示）。 因此， 需要 RT 导的 I型 IFN用于在肿瘤的微环境中获得 DC交叉引发能力。 实施例 4通 it^卜源局部递送 I型 IFN而产生的肿瘤减小依赖于 CD8+

T细胞

发明人的结果显示了 I型 IFN是局部 RT的关键性下游介导因子， 然而， 局部 RT有可能诱导影响肿瘤控制和排斥的许多因子� �� 为了研究 在没有 RT的情况下， I型 IFN是否能够起到充分的作用，发明人测试了 通过重组腺病毒栽体 (ad-IFNp)向肿瘤中局部递送 I型 IFN是否能够引 起肿瘤排斥。 发明人用 ad-null (空白载体对照）或 ad- IFN- P处理已 建立的 B16- SIY肿瘤并监测肿瘤生长。令人惊讶地， 甚至对于这种侵略 性的肿瘤， ad-IFN- p也显示出了非常强的抗肿瘤效果（图 4a)。

由于 ad-IFN- β对于 B16-SIY肿瘤细胞可能有多种抑制性作用， 为 了测试所述抑制需要 Τ细胞， 发明人使用了 B6/RAG K0小鼠（这些小鼠 在淋巴细胞中有缺陷）， 并比较了未经转移的宿主和以从野生型供体收 集的 Τ细胞重构的那些宿主。 有趣地， 在 Rag- 1+小鼠中不能检测到对 于 ad- IFN- β的肿瘤应答， 但是通过转移外周 Τ细胞而使其得到了恢复 (图 4b)。 因此， 与用 RT处理的情^目同， 用 ad- IFN- P进行的处理是 免疫介导的并且依赖于 T细胞。

由于意识到了 RAG- 1 K0小鼠有可能带有可影响治疗应答的其它缺 陷， 并且为了进一步区分 CD4+与 CD8+T细胞亚群的功能， 发明人利用了 WT小鼠和抗体介导的 CD8 ⁺ T细胞或 CD4 ⁺ T细胞耗竭。令人惊讶地， CD4 ⁺ T细胞的耗竭对于 ad-IFN- P处理几乎没有任何影响， 因为肿瘤在进行 和不进行 CD4耗竭时同等地应答（图 4c)。 然而， CD8+T细胞的耗竭严重 降低了治疗效力并且肿瘤快: il Ol (图 4c)。 NK细胞似乎对于肿瘤消退 不是关键性的（数据未显示）。因此， CD8 ⁺ T细胞对于 ad-IFN- β的抗肿瘤 效果是关鍵的。 实施例 5 IFN- Ρ引起抗原特异性 Τ细胞的优选扩增 因为发明人确定了 ad-IFN- Ρ的治疗效果取决于 CD8 ⁺ T细胞（图 4b, c) , 发明人假设了像辐射疗法一样， ad-IFN- Ρ能够诱导抗原特异性 T细胞引发和扩增。 为了测试这一点， 发明人将识别 SIY抗原的幼稚 2C 转基因 T细胞转移到带有 B16- SIY肿瘤的小鼠中。 用 ad-IFN- P治疗之 后， 发明人收集了引流淋巴结（DLN)并使用克隆型� �体 1B2 (抗 2C TCR) 来定量抗原特异性 CD8+T细胞扩增。 与 ad-null相比， 用 ad- 进 行处理引起抗原特异性细胞大约 6倍的增加 (数据未显示）。这一显著增 加有可能是由于抗原驱动的增殖， 然而， 也存在下述可能性： ad-IFN- β能够通过逆转抑制性的细胞因子环境或通过� �� IFN- α / β介导的 Τ细 胞凋亡创造出的空间而一般性地促进细胞的非 特异性扩增。 I型 IFN也 被显示参与介导旁观者 Τ细胞增殖 (Tough等人， 1996)。 I型 IFN对于 病毒感染是关键的，并且已显示 I型 IFN对于一些细菌（例如， 产单核 细胞李斯特菌 Listeria monocytogenes) )感染是决定性的 (Auerbuch 等人， 2004; Carrero等人， 2004; O' Connel l等人， 2004)。 因此， 还 不清楚的是，处理之后从肿瘤组织释放的 IFNP对于抗原特异性 T细胞免 疫应答将有什么作用。 为了测试这种扩增是否限于抗原特异性细胞和 / 或增加的增殖， 发明人用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE)标记� �� 2C (抗 原特异性）和 0T-1 (非特异性）细胞， 然后将它们继受转移到带有 B16- SIY肿瘤的小鼠中。 为了帮助鉴别所转移的细胞群， 发明人利用了 含有同类系标记物（Thyl. 1)的 0T-1 细胞。 笫一次 ad-nul l或 ad-IFN- P处理后 5天，确定了 DLN和脾脏中的 1B2+CD8+ (抗原特异性细胞)相对 于 Thyl. l ⁺ CD8 ⁺ (非特异性）的 CFSE稀释程度。 与非特异性 0T- 1 细胞相 比， Ad- IFN- P诱导了抗原特异性 2C细胞的优选扩增（图 5a- c)。 当使用 ad- nul l对照组时， 2C与 OT-l TCR转基因细胞的比例大致相等， 这证 实了相似数目的转基因 T细!^转移到了接受者中， 但 ad- IFN- P的治 疗效果却显著增加了（图 5c)。 此外， 2C细胞显示出旺盛的增殖， 这被 几乎完全的 CFSE稀释所证实（图 5d)。 相反， 非特异性细胞不能够增殖 (数据未显示）。 综上所述， 这些数据表明了 ad- IFN- P诱导的抗原特异 性 CD8+T细胞的扩增是相对有选择性的并且是由增� ��的增殖介导的。 实施例 6 增加了体内的抗原特异性细胞溶解活性 虽然增殖是产生有效的免疫应答的良好指示， 其并不总是转化为 强有力的效应子功能。 因此， 发明人研究了 ad- 疗法是否引起增 加的体内特异性裂解。 用 ad- nul l或 ad-IFN- P处理带有肿瘤的小鼠， 然后向其中转移加载了经 CFSE标记的肽的靶细胞。 作为阴性对照， 还 将加载了经 CFSE标记的肽的靶细胞转移到幼稚小鼠中， 而如预期的， 这些小鼠显示出正常的特异性裂解。通过比较 发现， 与经 ad-nul l处理 的小鼠相比，经 ad- IFN- P处理的小鼠显示出显著更高的特异性裂解（� � 5e)。这些数据表明，在经 ad- IFNP处理的小鼠中观察到的抗原特异性细 胞的扩增引起了强有力的效应子 CTL活性，

为了确定用 靶向肿瘤是否可引起肿瘤消退，接种了 TUB0-EGFR 细胞并且在笫 14、 17和 20天肿瘤内注射表达 IFN 的腺病毒。 ad- nul l 对 于肿瘤生长有温和的效果，而 ad- 引起肿瘤的消退（图 6)。这表明， 在 TUB0上局部递送 ad-IFN β也可诱导强的应答， 从而引起肿瘤消退。

为了测试由 CH0细胞制备的实际融^"白是否能够诱导快速的� ��瘤 消退，用编码抗体- IFN (对于抗 EGFR- ΙΡΝβ,将 Cetuximab的 3'端与 IFNp 相连，然后将其引入到栽体 pcDNA中，亚克隆均采用标准的分子生物学 技术进行， 简要地， 1 )将 HC-Fc-IFN克隆到栽体 Abvec-hlgGl中； 2 )将 抗体的轻链克隆到载体 Abvec-lamda中； 3 )从 1 ) 中得到的产物中剪切 HC-Fc-IFN, 并通过平末端连接将其克隆到 lonza的载体 pEE6.4中； 4 )从 步骤 2 )中获得的产物中剪切出轻链并通过平末端连� �将其克隆到 lonza 的载体 PEE12.4中； 5 )从步骤 4 )的产物中切出表达盒并将其克隆到步 錄 3 )的产物中，从而得到最终的质粒 pEEl ² . ⁴ -抗 -EGFR-IFNP )的质粒转 染 CH0细胞并且选择大量表达所述融合蛋白的细胞 。收集含有这种质粒 的 CH0的上清液并且通过蛋白 A柱子纯化融合蛋白 ,所述蛋白 A柱子以 高亲合力结合融合蛋白的 Fc部分。 用低剂量的抗体或者所述抗体 -IFN 处理带有 TUB0- EGFR的小鼠。仅仅是融合蛋白引起了肿瘤的怏� �消退 (图 7)。 从带有 B16- EGFR肿瘤的小鼠也获得了类似的结果（图 8)。 因此， 与单独的抗体相比，这种融合蛋白也可被用于 更好地清除肿瘤表达 EGFR 的肿瘤。

为了确定这种显著的效果是否是由 T细胞免疫引起的，用低剂量的 所述融合蛋白和 T细胞耗竭抗体处理带有 EGFR- TUB0肿瘤的小鼠。 虽然 大幅延迟了 EGFR- TUB0的生长， CD8+T细胞的耗竭引起了快速复发， 而 CD4+T细胞的耗竭则不会引起肿瘤 ^JL (图 9)。 参考文献：

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