DES PRODUITS DE LA MER

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne la biopréservation des produits alimentaires, de préférence des produits de la mer. Plus spécifiquement, la présente invention concerne la souche bactérienne Lactobacillus sakei LHIS2885 et son utilisation pour limiter la formation d'histamine dans les produits alimentaires, de préférence les produits de la mer.

ÉTAT DE LA TECHNIQUE

Les produits de la mer sont responsables de 10 à 20% des intoxications alimentaires humaines. Parmi celles-ci, l'histamine est la première cause de toxi-infections liées à la consommation de poisson. Ainsi, 30 à 40% des épidémies liées à la consommation de poisson sont dues à l'histamine. Cette toxi-infection se traduit par des symptômes cutanés (rougeurs, urticaires), neurologiques (maux de tête), gastro-intestinaux (diarrhées, vomissements), palpitations et œdèmes pouvant parfois conduire à l'hospitalisation et au décès de patients fragilisés.

Les intoxications histaminiques sont liées à la consommation de poissons riches en histidine (tels que, par exemple, le thon, le maquereau, la sardine ou l'anchois) et contaminés par des concentrations en histamine supérieures à 500 mg/kg.

L'histamine est formée dans des poissons riches en histidine par une enzyme bactérienne, l'histidine décarboxylase. L'histamine étant résistante à la cuisson, à l'appertisation, au fumage et à la congélation, la lutte contre les toxi-infections causées par l'histamine implique l'inhibition de la production de cette aminé biogène, par exemple via l'inhibition du développement de bactéries productrices d'histamine sur les produits, ou via l'inhibition de l'histidine décarboxylase. L'histamine peut être formée par des espèces bactériennes mésophiles, à des températures supérieures à 7-10°C. Ces dernières sont cependant incapables de former de l'histamine à des températures comprises entre 0-5°C, c'est-à-dire la température requise pour la conservation des produits de la mer selon les normes américaines ou européennes. Cependant, des études récentes ont démontré l'existence de bactéries psychrotolérantes fortement productrices d'histamine entre 0 et 5°C (Emborg et al., 2005; Kanki et al., 2004). Des exemples de ces bactéries sont Morganella morganii et Morganella psychrotolerans qui a été récemment isolée par l'équipe de Paw Dalgaard (Emborg et al., 2006), ainsi que les bactéries Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae.

La formation d'histamine en cas de rupture de chaîne du froid, et même à des températures recommandées pour le stockage des produits de la mer représente donc un problème majeur pour les industriels de la pêche.

L'une des stratégies de lutte contre la contamination des produits alimentaires concerne la biopréservation. La biopréservation correspond à l'ajout au produit de microorganismes sélectionnés pour leur capacité à inhiber la croissance de microorganismes indésirables, responsables de l'altération du produit ou inducteurs de pathogénicité. L'ajout de ces microorganismes peut ainsi permettre d'augmenter la durée de conservation du produit, et de préserver ses propriétés organoleptiques. Ainsi, par exemple, le brevet américain US 5,576,035 décrit l'utilisation de bactéries pour la préservation de produits alimentaires, notamment de la viande. D'autre part, le brevet européen EP 1 456 350 décrit l'utilisation d'une souche de bactérie lactique, Lactococcus lactis, pour la conservation des produits de la mer.

Cependant, à la connaissance de la Demanderesse, aucun procédé de biopréservation n'a été décrit à ce jour, permettant de prévenir ou de maîtriser la production d'histamine dans les produits de la mer.

Lors de ses recherches d'un ferment pouvant être utilisé dans un tel procédé de biopréservation, la Demanderesse a identifié et isolé la bactérie Lactobacillus sakei LHIS2885. L'addition de cette bactérie sur un produit alimentaire, de préférence un produit de la mer, tel que, par exemple, un poisson cuit, permet, de façon surprenante, de réduire la production d'histamine dans celui-ci. De plus, cet effet est observé non seulement à la température de préservation habituelle, c'est-à-dire 4°C, mais également à une température de 15°C, ce qui permet de protéger le produit d'une contamination à l'histamine également en cas de rupture de la chaîne du froid.

RÉSUMÉ

La présente invention concerne donc l'utilisation d'une souche de Lactobacillus sakei, de l'un de ses fragments ou d'une composition la comprenant pour la conservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer. Selon un mode de réalisation de l'invention, la production d'histamine dans lesdits produits alimentaires est inhibée. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la croissance de bactéries histaminogènes dans lesdits produits alimentaires est inhibée.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les produits alimentaires sont des produits de la mer, de préférence des poissons, plus préférentiellement du thon, du maquereau, de la sardine ou du hareng. Selon un mode de réalisation de l'invention, lesdits produits alimentaires sont des produits cuits, des produits frais, des produits congelés, des produits emballés sous vide, des produits conditionnés sous atmosphère modifiée, des produits fumés, des produits conditionnés en boîte de conserve, et/ou des produits marinés.

Selon un mode de réalisation de l'invention, on applique sur le produit alimentaire une quantité de bactéries variant d'environ 10 2 à environ 1012 ufc de L. sakei I g de produit alimentaire.

La présente invention concerne en outre une souche de Lactobacillus sakei appelée souche Lactobacillus sakei LHIS2885 et déposée à la CNCM sous le numéro CNCM I- 4704. La présente invention concerne également une souche dérivée de Lactobacillus sakei obtenue par mutation, variation ou recombinaison de la souche telle que décrite ci- dessus. Par exemple, ladite souche dérivée peut comprendre un génome présentant plus de 70% d'identité avec le génome de la souche Lactobacillus sakei LHIS2885. La présente invention concerne également une composition comprenant la souche bactérienne ou la souche dérivée telles que décrites ci-dessus ou l'un de leurs fragments.

La présente invention concerne donc également l'utilisation de la souche LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, ou d'une composition les comprenant pour la conservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer.

Selon un mode de réalisation, la production d'histamine dans lesdits produits alimentaires est inhibée, de préférence la croissance de bactéries histaminogènes dans lesdits produits alimentaires est inhibée.

Selon un mode de réalisation, les produits alimentaires sont des produits de la mer, de préférence des poissons, plus préférentiellement du thon, du maquereau, de la sardine ou du hareng.

Selon un autre mode de réalisation, lesdits produits alimentaires sont des produits cuits, des produits frais, des produits congelés, des produits emballés sous vide, des produits conditionnés sous atmosphère modifiée, des produits fumés, des produits conditionnés en boîte de conserve, et/ou des produits marinés.

Selon un mode de réalisation, on applique sur le produit alimentaire une quantité de bactéries variant d'environ 10 2 à environ 101 ¹ 2" ufc de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée / g de produit alimentaire.

La présente invention concerne également un procédé de préparation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer, comprenant une étape d'application sur lesdits produits d'une souche de L. sakei ou de l'un de ses fragments, telle que, par exemple, la souche de L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de L. sakei LHIS2885 ou de l'un de leurs fragments.

L'invention a également pour objet un produit alimentaire, de préférence produit de la mer, comprenant une souche de L. sakei, telle que, par exemple, la souche de L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de L. sakei LHIS2885 ou de l'un de leurs fragments. DÉFINITIONS

Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :

- " Environ " placé devant un nombre, signifie plus ou moins 10% de la valeur nominale de ce nombre.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

La présente invention concerne une nouvelle souche de bactérie lactique, à savoir la souche bactérienne Lactobacillus sakei LHIS2885. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 est isolée. Cette souche bactérienne appartient au genre Lactobacillus et à l'espèce sakei. Il s'agit d'un bacille Gram+ catalase- oxydase-, homo hétérofermentaire facultatif. Si la taxonomie devait être modifiée, l'homme du métier pourrait adapter les modifications de taxonomie pour en déduire la bactérie utilisable dans la présente invention.

La souche L. sakei LHIS2885 a été isolée de la chair de sardine fraîche conditionnée sous atmosphère modifiée (50% N ₂ + 50% C0 ₂ ).

Un échantillon de la culture du microorganisme conforme à la présente invention, appelée souche Lactobacillus sakei LHIS2885 a été déposé le 12 décembre 2012 sous le Traité de Budapest dans la collection nationale de culture de microorganismes française (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15. L'échantillon a reçu le numéro N° CNCM 1-4704.

Les inventeurs ont démontré que la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 était capable d'inhiber la croissance de bactéries histaminogènes, et d'inhiber la production d'histamine sur des produits alimentaires contaminés par des bactéries histaminogènes. Des exemples de bactéries histaminogènes incluent, sans y être limités, Morganella psychrotolerans, Morganella morganii, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et Hafiiia alvei. Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur boîte de pétri, via la mesure de halos d'inhibition.

Les tests d'inhibition de la croissance bactérienne sur boîte de pétri sont bien connus de l'homme du métier. Un exemple de test d'inhibition de la croissance bactérienne sur boîte de pétri est décrit ci-dessous.

Selon un mode de réalisation, ce test peut être réalisé par la méthode de la double couche. Avantageusement, la souche L. sakei LHIS2885 est mise en culture en bouillon, de préférence en bouillon MRS (de Man, Rogosa et Sharpe), de préférence pendant 24 à 48 heures, puis des spots de la suspension bactérienne sont déposés sur un milieu gélosé, de préférence un milieu gélosé à base de jus de thon comprenant 1.5% d'agar.

Avantageusement, le volume des spots de suspension bactériennes varie de 1 à 50 μί, de préférence de 5 à 20 μί, plus préférentiellement est d'environ 10 μL· Après ensemencement, les boîtes de pétri sont incubées en anaérobiose, de préférence à une température variant de 10 à 20°C environ, plus préférentiellement à une température d'environ 15°C, pendant une période de 5 à 20 jours environ, de préférence d'environ 10 jours.

Au terme de la période d'incubation, des tapis de bactéries histaminogènes sont coulés sur les spots. L'homme du métier sait comment évaluer la dilution adéquate des souches histaminogènes pour obtenir un tapis bactérien homogène sur les boîtes.

Les boîtes gélosées sont ensuite incubées, de préférence en aérobiose, à une température variant de 10 à 20°C environ, de préférence à une température d'environ 15°C, pendant une période de 24 à 192 heures, de préférence de 36 à 144 heures, encore plus préférentiellement d'environ 96 heures. A l'issue de la période d'incubation, les halos d'inhibition sont mesurés.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche LHIS2885 de l'invention présente un halo d'inhibition de la souche histaminogène testée. Selon un second mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur un échantillon alimentaire, par exemple du thon cuit. Un exemple de test d'inhibition sur un échantillon alimentaire est présenté ci-dessous. Dans une première étape, des suspensions bactériennes sont préparées. Avantageusement, la souche histaminogène est cultivée en bouillon, de préférence en bouillon BHI (Brain Heart Infusion) salé (2% NaCl), de préférence à une température de 15 à 25°C environ, plus préférentiellement à une température d'environ 20°C, jusqu'à atteindre une concentration variant d'environ 1.10 8 à environ 1.1010 UFC/ml, de préférence d'environ 2.10 ⁹ UFC/ml. En parallèle, la souche L. sakei LHIS2885 est cultivée, de préférence en bouillon, plus préférentiellement en bouillon MRS, de préférence à une température variant de 10 à 37°C environ, de préférence de 20 à 30°C environ, plus préférentiellement d'environ 26°C, jusqu'à atteindre une concentration variant d'environ 1.10 8 à environ 1.1010 UFC/ml, de préférence d'environ 2.10 ⁹ UFC/ml.

Dans une seconde étape, la souche histaminogène, ainsi que la souche LHIS2885 sont de préférence diluées dans de l'eau stérile, puis ensemencées sur le produit alimentaire. Avantageusement, la quantité de bactéries histaminogènes inoculées varie de 1 à 100 UFC/g environ, de préférence d'environ 5 à environ 50 UFC/g, plus préférentiellement est d'environ 10 UFC/g de produit alimentaire. De préférence, la quantité de bactéries L. sakei LHIS2885 inoculées varie de 10 3 ^J à 108° UFC/g environ, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 10 ⁷ UFC/g, encore plus préférentiellement est d'environ 10 ⁵ -10 ⁶ UFC/g de produit alimentaire.

Selon un mode de réalisation, les produits alimentaires ensemencés sont ensuite incubés, de préférence à une température variant de 10 à 20°C environ, plus préférentiellement d'environ 15°C, pendant une période variant de 24 à 120 heures, de préférence de 48 à 96 heures, plus préférentiellement pendant 72 heures. Avantageusement, les produits alimentaires ensemencés sont incubés sous-vide. A l'issue de la période d'incubation, la quantité de bactéries histaminogènes dans le produit est mesurée, par exemple par la méthode de dénombrement sur milieu gélosé, tel que, par exemple sur milieu VRBG (Violet Red Bile Glucose) incubé à environ 20°C pendant 48 heures. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche de LHIS2885 de l'invention permet de réduire la croissance de la bactérie histaminogène dans le produit alimentaire par rapport à un témoin, ledit témoin ayant été ensemencé uniquement avec la bactérie histaminogène.

Un autre objet de l'invention est une souche bactérienne obtenue par mutation, variation ou recombinaison de la souche L. sakei LHIS2885 telle que décrite ci-dessus. Selon l'invention, une telle souche est appelée « souche dérivée de LHIS2885 ». Selon un mode de réalisation de l'invention, ces souches dérivées de L. sakei LHIS2885 présentent une capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes et/ou une capacité d'inhibition de la production d'histamine équivalente, ou au moins égale à celle de la souche L. sakei LHIS2885.

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur boîte de pétri, comme décrit ci-dessus. Avantageusement, la souche dérivée de LHIS2885 de l'invention présente un halo d'inhibition de la souche histaminogène testée. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche dérivée de LHIS2885 présente un halo d'inhibition égal ou supérieur à celui mesuré pour la souche L. sakei LHIS2885 de l'invention.

Selon un second mode de réalisation de l'invention, la capacité d'inhibition de la croissance des bactéries histaminogènes est évaluée par un test d'inhibition sur un échantillon alimentaire tel que décrit ci-dessus.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche dérivée de LHIS2885 de l'invention permet de réduire la croissance de la bactérie histaminogène dans le produit alimentaire par rapport à un témoin, ledit témoin ayant été ensemencé uniquement avec la bactérie histaminogène. De préférence, cette inhibition de croissance est environ égale ou supérieure à celle mesurée pour la souche L. sakei LHIS2885.

Des exemples de méthodes d'obtention de souches dérivées de L. sakei LHIS2885 incluent, sans y être limitées, la mutagenèse aléatoire ou la mutagenèse dirigée. Selon un mode de réalisation de l'invention, les souches dérivées de L. sakei LHIS2885 selon l'invention comprennent un génome présentant plus de 70% d'identité avec le génome de L. sakei LHIS2885, de préférence plus de 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% d'identité.

Au sens de la présente invention, le terme «identité», lorsqu'il est utilisé dans une relation entre les séquences de deux ou plusieurs séquences nucléotidiques, se réfère au degré de parenté entre ces séquences nucléotidiques, tel que déterminé par le nombre de correspondances entre les chaînes de deux bases ou plus.

Selon l'invention, « identité » correspond à un pourcentage d'identité entre deux séquences ou plus. Ce pourcentage est défini comme le nombre de positions pour lesquelles les bases sont identiques lorsque les séquences sont alignées de manière optimale, divisé par le nombre total de bases de la plus petite des 2 séquences. Les différences entre les séquences peuvent être réparties au hasard et sur toutes leurs longueurs.

Deux séquences sont dites alignées de manière optimale lorsque le pourcentage d'identité est maximal. Par ailleurs, comme cela apparaîtra de manière claire à l'homme du métier, il peut être nécessaire de faire appel à des ajouts de positions lacunaires (des « gaps ») de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences. Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques peut donc être déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale dans laquelle la séquence d'acides nucléiques à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est alors calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Préférentiellement, les méthodes de détermination de l'identité sont conçues pour donner la plus grande concordance possible entre les séquences comparées. Le pourcentage d'identité peut être déterminé par un modèle mathématique particulier ou par un programme d'ordinateur (généralement désigné par le terme d' « algorithme »). Des méthodes de calcul de l'identité entre des séquences nucléotidiques sont bien connues de l'homme du métier. Des exemples non limitatifs de telles méthodes incluent celles décrites dans les documents suivants : Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., éd., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Génome Projects, Smith, D. W., éd., Académie Press, New York, 1993; Computer Analysis of Séquence Data Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G, eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Séquence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Académie Press, 1987; Séquence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; et Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073 (1988).

Des méthodes de détermination de l'identité ont été décrites dans des programmes d'ordinateurs accessibles au public. Des exemples préférés de méthodes utilisant des programmes d'ordinateurs incluent, sans y être limités, le progiciel GCG, incluant GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Le programme BLASTX est disponible auprès du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et d'autres sources (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). L'algorithme de Smith-Waterman, qui est bien connu de l'homme du métier, peut également être utilisé pour déterminer le pourcentage d'identité entre deux séquences.

La présente invention concerne une composition comprenant une souche de L. sakei, de préférence la bactérie L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de celle-ci ou l'un de leurs fragments. Par « fragment », on entend, au sens de la présente invention, des composants cellulaires, des métabolites, des molécules sécrétées, des composés résultant du métabolisme de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée, des enzymes de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée, etc .. Selon un mode de réalisation de l'invention, les fragments de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée peuvent être obtenus par récupération du surnageant de culture de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée, ou par extraction d'une culture de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée de composants ou de fractions cellulaires, de métabolites ou de composés sécrétés. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, un fragment peut également désigner un produit de dégradation de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée. Selon un mode de réalisation, le terme fragment peut désigner un composé sous une forme isolée, ou un mélange de plusieurs composés dérivés de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend des cellules vivantes de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885, de préférence des cellules en phase de croissance, plus préférentiellement en phase stationnaire ou en phase exponentielle de croissance, et encore plus préférentiellement en phase exponentielle de croissance.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend des cellules viables de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend des cellules non-viables de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885.

Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition est sous forme liquide. Des exemples de véhicules liquides utilisables dans la composition de l'invention incluent, sans y être limités, de l'eau, du tampon phosphate, ou tout milieu liquide adapté à la culture de la souche bactérienne L. sakei, de préférence adapté à la culture de L. sakei LHIS2885 ou d'une souche dérivée de LHIS2885, tels que, par exemple, le milieu MRS (de Man, Rogosa et Sharpe) ou le milieu BHI à 2% de NaCl (Infusion cervelle cœur). Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition est sous la forme d'un liquide congelé. De préférence, lorsque la composition de l'invention est sous la forme d'un liquide congelé, ce liquide comprend de 1 à 20% de glycérol environ, de préférence de 5 à 15% environ, encore plus préférentiellement environ 10% volume/volume de glycérol.

Selon un second mode de réalisation de l'invention, la composition est sous forme solide. Des exemples de forme solides adaptées au conditionnement de la composition selon l'invention incluent, sans y être limités, une poudre, telle que, par exemple, une poudre comprenant des cellules de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885 de celle-ci lyophilisées ; une pâte ; un comprimé ; une formulation solide devant être extemporanément dissoute dans un véhicule liquide, par exemple de l'eau ; un fragment de milieu de culture solide ensemencé par la souche L. sakei, de préférence par L. sakei LHIS2885, ou une souche dérivée de LHIS2885, tel que, par exemple, du milieu MRS.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprenant une souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, ou une souche dérivée de LHIS2885 est conditionnée sous la forme d'un dosage unitaire. Des exemples de dosages unitaires incluent, sans y être limités, un tube de culture bactérienne, un sachet de poudre comprenant des cellules de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou une souche dérivée de LHIS2885 lyophilisées...

Habituellement, la concentration d'une composition bactérienne s'exprime en ufc par unité de volume ou de masse. Le terme ufc est bien connu de l'homme du métier et désigne un nombre d' « unités formant colonie », i.e. un nombre de cellules vivantes, pouvant former une colonie sur un milieu de culture solide.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la composition comprend une concentration de cellules d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885 variant d'environ 10 à environ 10 ¹² ufc/ml, de préférence d'environ 10 ⁵ à environ 10 ¹⁰ ufc/ml, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 10 ⁹ ufc/ml, et encore plus préférentiellement la concentration g

est d'environ 10 ufc/ml.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition comprend une concentration de cellules d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de LHIS2885 variant d'environ 10 à environ 10 ¹² ufc/g, de préférence d'environ 10 ⁵ à environ 10 ¹⁰ ufc/g, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 10 ⁹ ufc/g, et encore plus préférentiellement la concentration est

g

d'environ 10 ufc/g.

Les inventeurs ont démontré, de façon surprenante, que l'application de la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 sur des produits alimentaires, tels que, par exemple, des produits de la mer permet de maîtriser la production d'histamine dans ces produits, permettant ainsi de prévenir toute toxi-infection.

La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'une souche bactérienne L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant, pour la conservation, de préférence la biopréservation de produits alimentaires, de préférence de produits de la mer. Plus précisément, la présente invention concerne l'utilisation de L. sakei, de préférence de L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant pour maîtriser la production d'histamine dans un produit alimentaire, de préférence un produit de la mer.

Au sens de la présente invention, la conservation correspond à un procédé de traitement d'un produit alimentaire ayant pour but de préserver ses caractéristiques organoleptiques, ses propriétés gustatives et nutritives, ses caractéristiques de texture et de couleur, et d'éviter d'éventuelles intoxications alimentaires. Selon un mode de réalisation de l'invention, la conservation comprend la prévention ou l'inhibition du développement de microorganismes, en particulier de microorganismes indésirables, responsables de l'altération du produit ou inducteurs de pathogénicité, tels que des bactéries ou des champignons. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la conservation comprend la prévention ou l'inhibition de la production de molécules responsables de l'altération dudit produit ou inductrices de pathogénicité.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la conservation d'un produit alimentaire au sens de la présente invention ne correspond pas à la fermentation du produit alimentaire. De préférence, l'application d'une souche bactérienne L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'une souche dérivée de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant sur le produit alimentaire, ne modifie pas les propriétés organoleptiques dudit produit alimentaire.

Au sens de la présente invention, la biopréservation d'un produit correspond à l'ajout audit produit d'un ou plusieurs microorganismes afin de conserver ledit produit.

Des exemples de microorganismes indésirables incluent, sans y être limités, les bactéries histaminogènes telles que, par exemple, Morganella psychrotolerans, Hafnia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et Morganella morganii. Des exemples de molécules responsables de l'altération dudit produit ou inductrices de pathogénicité incluent, sans y être limités, l'histamine.

La présente invention concerne donc également un procédé de conservation, de préférence de biopréservation d'un produit alimentaire, de préférence d'un produit de la mer, comprenant l'ajout au dit produit d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'un dérivé de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant. Plus précisément, le procédé comprend la maîtrise de la production d'histamine au sein dudit produit.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant inhibe la croissance et le développement de souches bactériennes productrices d'histamine. Des exemples de souches bactériennes productrices d'histamine pouvant être inhibées incluent, sans y être limités, Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et Morganella morganii.

La présente invention concerne donc un procédé de conservation, de préférence de biopréservation d'un produit alimentaire, de préférence d'un produit de la mer, comprenant l'ajout au dit produit d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou d'un dérivé de L. sakei LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant, dans lequel la souche de L. sakei, de préférence la souche bactérienne L. sakei LHIS2885, ou le dérivé de L. sakei LHIS2885, ou l'un de leurs fragments inhibe la croissance et le développement de souches bactériennes productrices d'histamine, de préférence choisies parmi Morganella psychrotolerans, Hafiiia alvei, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium damselae et/ou Morganella morganii, permettant ainsi la maîtrise de la production d'histamine au sein dudit produit.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de conservation d'un produit alimentaire ne comprend pas, ou ne consiste pas en la fermentation du produit alimentaire.

De préférence, le procédé de conservation d'un produit alimentaire ne modifie pas les propriétés organoleptiques dudit produit alimentaire.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant permet de maintenir la concentration de bactéries productrices d'histamine dans le produit alimentaire, de préférence le produit de la mer à un niveau inférieur à environ 10 ⁵ ufc/g de produit alimentaire, de préférence inférieur à environ 10 ⁴ ufc/g, plus préférentiellement inférieur à environ 10 ufc/g. Selon un mode de réalisation, ces niveaux d'inhibition sont observés après incubation du produit alimentaire jusqu'à 4 jours à environ 15°C, de préférence pendant au moins 5, 6, 7 ou 8 jours d'incubation à 15°C environ.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant inhibe la production d'histamine et/ou permet l'élimination de l'histamine produite dans le produit alimentaire, de préférence dans le produit de la mer.

La présence d'histamine dans les poissons riches en histidine est réglementée en Europe (Règlement CE n° 1441/2007, 2007) avec une limite à 100 mg/kg.

Selon un mode de réalisation de l'invention, l'application d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant permet de maintenir la concentration d'histamine dans le produit alimentaire à un niveau inférieur à 100 mg/kg, de préférence inférieur à 75 mg/kg, plus préférentiellement inférieur à 50 mg/kg. Selon un mode de réalisation, ces niveaux d'histamine sont mesurés après incubation du produit alimentaire jusqu'à 4 jours à 15°C, de préférence pendant au moins 5, 6, 7 ou 8 jours d'incubation à 15°C environ.

Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885 ou l'un de leurs fragments inhibe le développement de souches productrices d'histamine, et/ou inhibe la production d'histamine et/ou permet l'élimination de l'histamine produite dans un produit alimentaire à une température variant d'environ 0°C à environ 37°C, de préférence d'environ 4°C à environ 30°C, plus préférentiellement d'environ 4°C à environ 15°C. Selon un mode de réalisation, l'effet de biopréservation de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition selon l'invention sont observés à 15°C pendant au moins 1 jour, de préférence au moins 2 jours, plus préférentiellement pendant au moins 4 jours, et encore plus préférentiellement pendant au moins 5, 6, 7 ou 8 jours. Selon un mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée en une quantité efficace sur le produit alimentaire. Au sens de la présente invention, le terme « quantité efficace » désigne la quantité de la souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant à appliquer sur le produit pour observer l'effet souhaité d'inhibition des souches productrices d'histamine et/ou l'inhibition de la production d'histamine et/ou l'élimination de l'histamine déjà formée. Selon un mode de réalisation de l'invention, la quantité efficace varie d'environ 10 à environ 10 12 ufc de la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885 / g de produit alimentaire, de préférence d'environ 10 ⁴ à environ 10 ⁹ ufc/g, plus préférentiellement d'environ 10 à environ 10 ⁷ ufc/g et encore plus préférentiellement d'environ 10 à environ 5.10 ⁶ ufc/g. Au sens de la présente invention, le terme « produit alimentaire » désigne un produit destiné à l'alimentation humaine ou animale (par exemple à l'alimentation des animaux de compagnie (chat, chien, cheval, hamster, cochon d'inde, furet, etc .), des animaux d'élevage (bovins, caprins, ovins, porcins, équidés, camélidés, etc ..) ou des animaux de zoo). De préférence, le terme « produit alimentaire » désigne un produit destiné à 1 ' alimentation humaine .

Selon un mode de réalisation de l'invention, le produit alimentaire est un produit de la mer, de préférence un poisson, plus préférentiellement un poisson riche en histidine. Des exemples de produits riches en histidine incluent, sans y être limités, le thon et autres thonidés (tels que, par exemple, les bonites, les marlins et les espadons), le maquereau, la sardine et l'anchois.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le produit alimentaire est un produit frais, un produit cuit, un produit congelé, un produit emballé sous vide, un produit conditionné sous atmosphère modifiée (telle que, par exemple, une atmosphère comprenant 50% de N ₂ et 50% de C0 ₂ ), un produit fumé, un produit conditionné en boîte de conserve, un produit mariné ou un produit fermenté...

Selon un mode de réalisation, le produit alimentaire n'est pas un produit fermenté.

Selon un mode de réalisation, le produit alimentaire est du thon cuit conditionné sous- vide. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un produit alimentaire, de préférence d'un produit de la mer pour la consommation, de préférence la consommation humaine, ledit procédé de préparation comprenant une étape d'application sur le produit alimentaire d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant.

Selon un mode de réalisation, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, la souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire avant emballage, de préférence juste avant l'emballage.

Selon un mode de réalisation, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, la souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est ajoutée sur le produit alimentaire frais, avec ou sans emballage.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire après la cuisson dudit produit.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :

(a) cuisson du produit alimentaire ;

(b) application sur ledit produit alimentaire cuit d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ; et

(c) emballage dudit produit alimentaire.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire avant le salage et/ou le fumage dudit produit.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :

(a) application sur le produit alimentaire d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ;

(b) salage et/ou fumage dudit produit alimentaire ; et

(c) emballage dudit produit alimentaire. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885, une souche dérivée de LHIS2885, l'un de leurs fragments ou une composition les comprenant est appliquée sur le produit alimentaire après le salage et/ou le fumage dudit produit.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :

(a) salage et/ou fumage du produit alimentaire ;

(b) application sur ledit produit alimentaire salé ou fumé d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ; et

(c) emballage dudit produit alimentaire.

Selon un mode de réalisation de l'invention, le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes :

(a) application sur ledit produit alimentaire salé ou fumé d'une souche de L. sakei, de préférence de la souche L. sakei LHIS2885, d'une souche dérivée de

LHIS2885, de l'un de leurs fragments ou d'une composition les comprenant ;

(b) mise sous atmosphère protectrice dudit produit alimentaire ; et (c) emballage hermétique dudit produit alimentaire, de préférence par operculation.

Dans un mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du thon, et l'atmosphère modifiée comprend de 30 à 70% de C0 ₂ , de préférence de 40 à 60% de C0 ₂ ; de 10 à 70% d'0 ₂ , de préférence de 15 à 60% d'0 ₂ et de 0 à 30% de N ₂ , de préférence de 0 à 25% de N ₂ . Selon un premier mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du thon, et l'atmosphère modifiée comprend environ 40% de C0 ₂ et environ 60% d'0 ₂ . Selon un second mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du thon, et l'atmosphère modifiée comprend environ 60% de C0 ₂ , environ 15% d'0 ₂ et environ 25% de N ₂ . Dans un mode de réalisation, ledit produit alimentaire est du hareng ou de la sardine, et l'atmosphère modifiée comprend de 30 à 70% de C0 ₂ , de préférence environ 60% de C0 ₂ ; et de 30 à 70% de N ₂ , de préférence environ 40% de N ₂ .

La présente invention concerne également un produit alimentaire, de préférence un produit de la mer, comprenant une souche de L. sakei, de préférence la souche L. sakei LHIS2885 de l'invention, une souche dérivée de LHIS2885, ou l'un de leurs fragments.

La souche L. sakei LHIS2885 selon l'invention présente les avantages suivants :

- la souche L. sakei LHIS2885 se développe dans les produits alimentaires, tels que, par exemple, les produits de la mer, notamment cuits, fumés ou conditionnés sous atmosphère contrôlée ou sous-vide, à une température variant d'environ 0 à environ 37 °C ;

- l'application de la souche L. sakei LHIS2885 sur un produit alimentaire, tel que, par exemple, un produit de la mer, contaminé par une bactérie histaminogène inhibe le développement de ladite souche histaminogène ;

- l'application de la souche L. sakei LHIS2885 sur un produit alimentaire, tel que, par exemple, un produit de la mer, contaminé par une bactérie histaminogène inhibe la production d'histamine ;

- l'application de la souche L. sakei LHIS2885 sur un produit alimentaire, tel que, par exemple, un produit de la mer, ne modifie pas de façon majeure les propriétés organoleptiques de ce produit. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 est un histogramme montrant la croissance de M. pyschrotolerans seule (MP) ou en coculture avec Lactococcus piscium EU2258 (MP + EU2258) ou Lactobacillus sakei LHIS2885 (MP+LHIS2885) (MP) sur des longes de thon cuites conservées à 15°C sous-vide.

La Figure 2 est un histogramme montrant la production d'histamine par Morganella psychrotolerans seule (MP) ou en coculture avec Lactococcus piscium EU2258 (MP + EU2258) ou Lactobacillus sakei LHIS2885 (MP+LHIS2885) dans du thon cuit conservé à 15°C sous-vide. La Figure 3 est une combinaison de deux graphiques montrant (A) l'effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la croissance de M. morganii (Mm) sur du thon cuit conservé à 15°C sous vide, et (B) l'effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la production d'histamine.

La Figure 4 est un histogramme montrant la croissance de Morganella psychrotolerans en absence (Témoin Mp) ou présence (Essai Mp) de Lactobacillus sakei LHIS2885 à 4°C pendant 18 jours.

La Figure 5 est un histogramme montrant la croissance de Lactobacillus sakei en absence (témoin LHIS2885) ou présence (essai LHIS2885) de Morganella psychrotolerans à 4°C pendant 18 jours. La Figure 6 est un histogramme montrant la production d'histamine dans le thon cuit à 4°C par M. psychrotolerans en absence (témoin - Mp) ou présence de L. sakei (Essai - Mp/LHIS2885).

La Figure 7 est une combinaison de deux graphiques montrant l'effet de la souche LHIS2885 (Ls) de l'invention sur la bactérie Photobacterium phosphoreum (Pp) sur du thon cuit conservé à 15°C sous vide. (A) Effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la croissance de Photobacterium phosphoreum. (B) Effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la production d'histamine. La Figure 8 est un graphique montrant l'effet de la souche LHIS2885 de l'invention sur la croissance de la bactérie Photobacterium damselae sur du thon cuit conservé à 15°C sous vide.

EXEMPLES

La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l'invention.

Cet exemple décrit le protocole ayant permis l'isolement et l'identification de la bactérie L. sakei LHIS2885 comme pouvant être utile pour la biopréservation des produits alimentaires tels que, par exemple, des produits de la mer, et plus particulièrement pour prévenir ou maîtriser la production d'histamine dans ces produits.

Isolement de bactéries lactiques sur des poissons riches en histidine Matériels et méthodes

Dans un premier temps, l'isolement de bactéries lactiques issues de chair de poissons riches en histidine a été réalisé. Des produits de la mer frais ou fumés (thon fumé, longe de thon frais, filet de sardine, filet de maquereau, maquereau entier ou hareng fumé) ont été conditionnés, puis incubés à 8°C pendant une (produits frais) ou deux (produits fumés) semaines, puis les bactéries lactiques ont été isolées de ces produits incubés.

Résultats

132 souches de bactéries Gram+ ont été isolées. Test d'inhibition sur boîtes de pétri

La capacité des 132 souches identifiées à inhiber in vitro la souche histaminogène Morganella psychrotolerans a ensuite été testée sur boîte de Pétri par la méthode de la double couche. Matériels et Méthodes

Le test d'inhibition est réalisé selon la méthode de Matamores et al. (2009). Les 132 bactéries lactiques sont mises en culture en bouillon dans du milieu BHI (2% NaCl) à 20°C pendant 24h ou 48h. Après ce temps de pré-culture, des spots de 10 μΐ de suspension bactérienne sont déposés sur le milieu Jus de thon (JT) (1,5% d'Agar). Après ensemencement, les boites de Pétri sont incubées à 15°C en anaérobiose pendant 10 jours. Au terme du temps d'incubation des bactéries lactiques, les tapis bactériens sont coulés sur les spots. La dilution adéquate pour le tapis bactérien est de l/100 ^eme pour la souche psychrotolérante M. psychrotolerans. Les tapis bactériens sont réalisés dans le milieu JT. Les boites sont placées en aérobiose pendant 96 heures à 15°C. Elles sont observées à 36, 72 et 96h et les halos d'inhibitions sont mesurés.

Résultats

Sur les 132 souches bactériennes testées, 39 ont présenté une inhibition de la souche psychrotolérante M. psychrotolerans. Inhibition des bactéries histaminogènes Morganella psychrotolerans, Morganella morganii, Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae par la bactérie LHIS2885 sur du thon cuit conservé sous-vide à 15°C

Six souches identifiées lors du test d'inhibition sur boîte de pétri, ainsi que six autres souches préalablement isolées de produits de la mer, ont ensuite été testées pour leur capacité à inhiber la bactérie M. psychrotolerans sur des longes de thon cuit.

Matériels et Méthodes

Bactéries : La souche de M. psychrotolerans provient de la collection de l'Institut Pasteur, son n° d'accession est CIP109403 . Elle est cultivée en bouillon BHI salé (2% NaCl) à 20°C pendant 24 h pour les expérimentations (environ 2.10 ⁹ UFC/ml). Les douze souches de bactéries lactiques sont cultivées sur milieu MRS ou Elliker à

g

26°C pendant 24 h pour les expérimentations (concentration finale variant de 2.10 à 6.10 ⁹ UFC/ml selon les souches).

Matrice alimentaire : Des longes de thon frais conditionnées sous-vide congelées ont été décongelées une nuit à 4°C dans une étuve. Les longes sont découpées en cubes de 2 cm ³ et réparties dans un plateau préalablement nettoyé à l'alcool. Les cubes sont déposés dans des sacs à hauteur de 200 g puis scellés et conditionnés sous-vide. Le thon est cuit pendant 5 min dans de l'eau bouillante. La température à cœur finale du produit est de 81,2°C. Les cubes de thon sont refroidis dans une cellule de refroidissement rapide. Les produits sont conservés à 4°C s'ils sont utilisés le lendemain ou à -20°C si leur utilisation est reportée.

Méthode : a) Préparation de M. psychrotolerans : La préculture de M. psychrotolerans est diluée 6 fois successivement au l/10 ^eme . La concentration obtenue est de 2.10 ³ UFC/ml. b) Préparation des bactéries lactiques : Les précultures des bactéries lactiques sont

g

diluées (ou non) jusqu'à obtenir une concentration finale de 2.10 UFC/ml. c) Préparation des mélanges M. psychrotolerans - bactérie lactique : 10 ml de la préculture de M. psychrotolerans sont mélangés avec 10 ml de la préculture de bactérie lactique. Chaque bactérie lactique est testée séparément ce qui fait que 12 mélanges différents sont préparés. d) Ensemencement sur le thon : Le thon préalablement préparé est malaxé dans le sac de 200 g manuellement afin d'en faire une pâte homogène. A l'aide d'une cuillère stérile, la chair est répartie en sachets de 40 g de thon. L'inoculum de départ est fixé à 5% en volume par rapport à la masse totale de chair de thon (v/m). Le mélange M. psychrotolerans - bactérie lactique est préparé extemporanément et vortexé pendant 15 sec à vitesse maximale. 2 ml du mélange sont ajoutés à 40 g de thon à l'aide d'une pipette stérile de 2ml. Le témoin positif est ensemencé uniquement avec M. psychrotolerans, les 10 ml de bactérie lactique ayant été remplacés par 10 ml d'eau physiologique stérile. Le témoin de stérilité est constitué de thon non inoculé. Les concentrations bactériennes sur la matrice sont d'environ 50 UFC/g de M. psychrotolerans et au minimum 10 ⁶ UFC/g de bactéries lactiques. e) Incubation : Les produits ensemencés sont mis sous vide puis congelés à -20°C pendant 48 h. Ils sont ensuite décongelés et conservés à 15°C pendant 8 jours. Analyse : Les produits sont analysés le jour-même (J0) puis à 24 (Jl), 48 (J2) heures, 4 jours (J4) et 8 jours (J8). M. psychrotolerans est spécifiquement dénombré sur le milieu VRBG à 20°C (48 h d'incubation). Les bactéries lactiques sont dénombrées soit sur MRS ou Elliker en anaérobiose à 20°C pendant 48 h. La production d'histamine est analysée après le dénombrement sur boites grâce au kit Veratox, selon les instructions du fabricant ou par HPLC. La dilution primaire du dénombrement (1/5) est utilisée pour effectuer ce test, un volume de 30 ml sont récupérés sur chaque échantillon et congelé à -20°C.

Toutes les expérimentations sont faites en duplicat. Résultats Deux souches de bactéries lactiques ont présenté des inhibitions de la production d'histamine ou de la croissance de M. psychrotolerans : EU2258 (Lactococcus piscium, préalablement isolée de grenadier sous atmosphère modifiée) et LHIS2885 (Lactobacillus sakei, isolée lors de cette étude d'échantillons de sardine).

Ces deux souches se développent efficacement sur le thon cuit, pour atteindre environ 9 log UFC/g en 8 jours.

A 24 h et 48 h de culture, une inhibition statistiquement significative d'environ 1 à 2 log UFC/g de M. psychrotolerans est visible pour les deux cocktails bactérie lactique / M. psychrotolerans. Par contre, à 4 jours d'incubation à 15°C, la bactérie Lactobacillus sakei LHIS2885 limite la croissance de M. psychrotolerans à 3 log UFC/g alors que le témoin se situe à 8 log UFC/g (différence statistiquement significative). A 8 jours d'incubation à 15°C, la bactérie Lactobacillus sakei LHIS2885 limite la croissance de M. psychrotolerans à 6 log UFC/g alors que le témoin se situe à 9 log UFC/g (différence statistiquement significative). La bactérie EU2258 ne semble pas avoir d'effet statistiquement significatif sur la croissance de M. psychrotolerans à partir de 4 jours (Figure 1).

L'effet des bactéries lactiques sur la production d' histamine a ensuite été mesuré avant décongélation, le jour de la décongélation (J0), puis 1, 2, 4 et 8 jours après décongélation (Jl, J2, J4 et J8, respectivement). Les résultats sont exprimés en mg/kg d'histamine et sont présentés sur la Figure 2.

Comme le montre la Figure 2, avant congélation, les produits contiennent tous moins de 50 mg/kg d'histamine. Le taux d'histamine reste constant après décongélation, et à 24h et 48h où il est toujours inférieur à 50 mg/kg. A 4 jours d'incubation, la quantité d'histamine augmente jusqu'à 3600 mg/kg d'histamine dans le témoin. Lactobacillus sakei LHIS2885 réduit la production d'histamine à 38 mg/kg (différence statistiquement significative). La bactérie lactique EU2258 réduit aussi la production d'histamine mais plus faiblement avec 1279 mg/kg (différence statistiquement significative).

A 8 jours d'incubation, cette inhibition de la production est encore bien marquée pour L. sakei LHIS2885 avec une quantité d'histamine de 245 mg/kg alors que le témoin est arrivé à une concentration de 8900 mg/kg (différence statistiquement significative). Pour la souche EU2258, la quantité d' aminé biogène est équivalente au témoin et se situe à 7425 mg/kg.

La bactérie lactique L. sakei LHIS2885 est donc capable d'inhiber la croissance de M. psychrotolerans et la production d'histamine par cette dernière, et ce jusqu'à 8 jours après décongélation du produit à 15°C.

Dans un second temps, le même type d'expérience a été réalisé avec la souche histaminogène M. morganii pour vérifier l'efficacité de la souche bio-protectrice Lactobacillus sakei, LHIS2885. Les résultats présentés Figure 3 montrent les effets de la souche LHIS2885 sur la croissance de M. morganii sur des échantillons de thon cuit (Figure 3A), ainsi que la production d'histamine dans ces mêmes échantillons (Figure 3B). Comme le montre la Figure 3, la souche LHIS2885 de l'invention permet également l'inhibition statistiquement significative de la croissance de M. morganii sur du thon cuit, ainsi que l'inhibition statistiquement significative de la production d'histamine des échantillons de thon cuit contaminés par la bactérie histaminogène M. morganii. Ces expériences ont ensuite été réalisées avec les souches histaminogènes Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae. Les résultats présentés sur les Figures 7 et 8 montrent que la souche LHIS2885 inhibe la croissance de Photobacterium phosphoreum et Photobacterium damselae (respectivement) sur des échantillons de thon cuit. De plus, comme le montre la Figure 7, la souche LHIS2885 de l'invention permet également l'inhibition de la production d'histamine des échantillons de thon cuit contaminés par la bactérie histaminogène Photobacterium phosphoreum.

Inhibition de la bactérie histaminogène Morsanella psychrotolerans par la bactérie LHIS2885 sur du thon cuit en conserve conservé à 4°C

Matériel & méthodes Bactéries - millieux de culture et d'isolement : Les pré-cultures de la bactérie histaminogène Morganella psychrotolerans CIP 109403 ont été effectuées en milieu Brain Heart Broth salé à 2% (BHI salé 2%) à 20°C pendant 24h (concentration de 2.10 ⁹ CFU/ml). Les pré-cultures de la bactérie L. sakei LHIS2885 ont été effectuées en bouillon Man, Rogosa and Sharpe (MRS) à 26°C pendant 24h (concentration de 1,29.10 ⁹ CFU/ml).

Matrice alimentaire : Pour effectuer ces expérimentations, de la chair de thon albacore cuit en conserve a été choisie pour vérifier les capacités bioprotectrices de L. sakei LHIS2885 contre M. psychrotolerans CIP109403 . 25g de thon sont utilisés pour préparer chaque point d'analyse. 6 temps d'analyses et 3 lots de thon ont été analysés:

· Lot T : Témoin positif (thon ensemencé avec M. psychrotolerans CIP 109403 T ),

• Lot L : Témoin lactique (thon ensemencé avec LHIS2588),

• Lot E : Essai (LHIS2885 + CIP109403 ^T ). Les expérimentations ont été réalisées en triplicat. Méthode : a) Préparation des sachets : Les conserves de thon ont été ouvertes sous hotte à flux laminaire et le thon a été déposé dans un bac stérilisé à l'alcool puis mélangé. Le thon a ensuite été réparti en sachets de 25g, avec une spatule stérilisée à l'alcool. Ces sachets de thon ont ensuite été ensemencés et conservés sous vide. b) Préparation du témoin M. psychrotolerans pure : La préculture de M. psychrotolerans CIP109403 est diluée dans une solution de tryptone-sel à 0.85% pour obtenir une solution à 10 UFC/ml. Les sachets de thon sont ensuite ensemencés à 5% (v/m), soit 1,25 ml dans 25g de thon. Les sachets sont ensuite malaxés à la main pour homogénéiser la répartition dans la chair (concentration finale dans la chair 48 UFC/g). c) Préparation du lot Lactique (LHIS2885) et Essai (Mp+LHIS2885) : La préculture de L. sakei LHIS2885 est diluée dans une solution de tryptone-sel (TS) à 0.85% pour préparer l'ensemencement de la chair de thon. Pour le lot Lactique, une solution de L. sakei est préparée à 6,5.10 UFC/ml. Les sachets de thon sont ensemencés à 5% (v/m), soit 1,25 ml dans 25g de thon. Les sachets sont ensuite malaxés à la main pour homogénéiser la répartition dans la chair (concentration finale dans la chair 3,25.10 ⁶ UFC/ml). Pour le lot Essai, une solution avec 10 ³ UFC/ml de CIP109403 ^T et 6,5.10' UFC/ml de LHIS2885 est préparée. Les sachets de thon sont ensuite ensemencés à 5% (v/m). Ils sont malaxés à la main pour homogénéiser la répartition dans la chair et obtenir une concentration finale de bactérie de 3,25.10 ⁶ UFC/g (LHIS2885) et 48 UFC/g (CIP109403 ^T ). d) Conditionnement et incubation des sachets : Une fois ensemencés, les sachets sont conditionnés sous vide. Ils sont mis au congélateur à -20°C pendant 48h (sauf les sachets à analyser avant congélation). Après ce laps de temps, les échantillons sont décongelés à 4°C et incubés à 4°C pendant 18 jours. e) Analyses Microbiologiques : Des prélèvements sont effectués à J ₀ après décongélation, à J ₄ , J ₇ , Jn et J ₁₄ et ½. A chaque temps d'analyse, 3 sachets de chaque lot ont été analysés. 20g de thon ont été prélevés stérilement et sont ensuite dilués au l/5 ^e par ajout de 80 ml de milieu TS. Le contenu du sac est broyé au Stomacher à vitesse normale pendant 120 secondes.

Des prélèvements de la solution mère obtenue sont ensuite effectués : 15 ml de solution de thon broyé déposés dans un tube Falcon vide pour les analyses d' aminés biogènes par la méthode HPLC et 10 ml pour les dénombrements microbiologiques. A partir des 10ml de solution de thon broyé, des dilutions en cascade sont effectuées selon les concentrations supposées de bactéries. M. psychrotolerans CIP109403 est dénombré en profondeur sur milieu VRBG tandis que L. sakei LHIS2885 est dénombré sur milieu MRS en surface. Les milieux ont ensuite été incubés pendant 48h à 20°C pour le milieu VRBG et à 20°C en jarre anaérobiose pour le milieu MRS.

Aminés biogènes (HPLC) et pH : Le pH a été mesuré à partir du sac Stomacher de solution de thon broyé. Un pré-dosage avec le kit Neogen Veratox a été effectué sur 3 échantillons pour vérifier la concentration en histamine dans les produits à J ₄ , J ₇ , Jn - Les échantillons à J ₇ , Jn et J ₁₄ ont été analysés par HPLC par dansylation des aminés biogènes.

Résultats

Les croissances de M. psychrotolerans et de L. sakei sont observables sur les Figures 4 et 5. La concentration initiale de M. psychrotolerans est inférieure à 1 log UFC/g (Figure 4), après 11 jours d'incubation, elle approche de 7 log UFC/g pour arriver à 18 jours à une concentration de 8,3 log UFC/g. En présence de L. sakei (Figure 4), la croissance de M. psychrotolerans est faiblement inhibée, la concentration initiale est inférieure à 1 log UFC/g, puis la croissance suit celle du témoin avec une inhibition maximale de 0,5 log UFC/g à J ₇ , J _n , Ji ₄ .

L. sakei se développe correctement dans le thon à 4°C (Figure 5), la concentration de départ est de 6,5 log UFC/g et augmente jusqu'à 9 log UFC/g après 11 jours d'incubation. A 14 et 18 jours on observe une baisse de sa concentration à 8.6 et 7,5 log UFC/g respectivement. Il n'y a pas de différence significative du taux initial et de la croissance de L. sakei entre le témoin et l'essai. L'évolution de la concentration en histamine dans les produits est décrite sur la Figure 6. La production d'histamine en présence de M. psychrotolerans s'initie à partir de 7 jours avec des concentrations inférieures à 50 mg/kg. Après 11 jours d'incubation la moyenne entre 3 échantillons indépendants est de 93 mg/kg, et après 18 jours la concentration est au-delà du seuil réglementaire et atteint une moyenne de 582 mg/kg. En présence de L. sakei, cette production d'histamine est limitée après 7 jours d'incubation (6 mg/kg de différence par rapport au témoin). Après 11 et 14 jours d'incubation, la concentration moyenne en histamine est de 23 et 249 mg/kg respectivement soit 75% et 57 % d'inhibition par rapport au témoin. La bactérie L. sakei permet de rester à un taux d'histamine inférieur à la norme américaine et européenne après 11 jours d'incubation et limite la production en très forte concentration à 14 jours.

Ces résultats démontrent que L. sakei LHIS2885 présente des capacités bio-protectrices intéressantes à 4°C, avec une réduction de la production d'histamine de 75% et 57 % après 11 et 14 jours d'incubation respectivement. Analyse sensorielle de thon cuit sous-vide en présence de M. psychrotolerans et de Lactobacillus sakei LHIS2885 conservé à 15°C

Nous avons ensuite analysé l'impact de l'ensemencement d'un produit de la mer par la bactérie L. sakei LHIS2885 sur les qualités sensorielles dudit produit.

Matériels et Méthodes Matière première : Les longes de thon Albacore proviennent de l'entreprise Cobreco à Douarnenez. Elles ont été récupérées sur la chaîne de découpe de l'usine après leur processus de décongélation/parage sur du thon entier congelé. Cette matière première a été préparée pour les tests selon les étapes ci-dessous :

- Décongélation du thon 1 nuit à 4°C,

- Découpe du thon et répartition en sachets de 200g,

- Conditionnement sous vide des sachets,

- Cuisson des sachets (70°C à cœur pendant 5 minutes) dans l'eau, - Refroidissement des sachets et entreposage à 4°C.

Préparation des échantillons : 10 lots d'échantillons ont été préparés afin de tester les modifications sensorielles apportées au produit par les souches pures et par les souches en cocktail.

- Lot 1 : Témoin (thon cuit)

- Lot 2 : Témoin + Morganella psychrotolerans (Mp)

- Lot 3 : Témoin + Lactococcus piscium : Lp (EU2258)

- Lot 4 : Témoin + Lactobacillus sakei : Ls (LHIS2885)

- Lot 5 : Essai Mp + Lp (EU2258)

- Lot 6 : Essai Mp + Ls (LHIS2885)

Les sachets ont été inoculés puis stockés selon le protocole décrit précédemment, dans les conditions suivantes :

- Pesée des sachets de 40g de thon cuit + ensemencement des sachets,

- Conditionnement sous vide des sachets,

- Congélation des sachets à -20°C pendant 48h,

- Décongélation des sachets à 8°C (sauf 4 sachets de Témoin dont 2 seront décongelés à J4 et 2 autres à J8, pour servir de référence au cours des tests sensoriels),

- Incubation des sachets à 15°C. Protocole d'analyse : Les produits sont analysés après 4 jours et 8 jours d'incubation. A chaque point, 2 sachets de chaque échantillon sont prélevés pour les tests sensoriels.

Les tests ont été réalisés par le jury interne d'analyse sensorielle de l'Ifremer de Nantes. Ce panel a une longue expérience des produits de la mer; il est sollicité une à deux fois par semaine pour tester des produits ou pour des séances d'entraînement. Un groupe de 9 personnes bien entraînées sur les odeurs d'altération des produits de la mer a participé à cette étude. Les séances d'évaluation sensorielle se déroulent dans une pièce climatisée, composée de 10 cabines individuelles de dégustation, éclairées par une lumière blanche standard (T = 6500°K) répondant aux spécifications de la norme AFNOR V-09-105 concernant les recommandations relatives à l'implantation des locaux destinés à l'analyse sensorielle. Un système informatique permet l'acquisition automatique des données (logiciel Fizz, Biosystèmes, Dijon) et leur traitement statistique.

Le contenu des 2 sachets de chaque échantillon est réparti dans 5 pots inodores en polystyrène munis d'un couvercle, soit environ 15 g de miettes par pot provenant pour moitié de chaque sachet. Les pots sont entreposés dans une étuve à 18°C pendant le déroulement de la séance. Chacune des 5 séries de 10 échantillons est sentie par 2 juges différents. Le témoin de référence, décongelé le matin du test, est proposé en même temps. Les échantillons sont présentés aux juges selon un plan équilibré pour éviter un biais dû à l'effet du 1er produit testé.

La séance se compose de 2 épreuves :

- un test de notation du niveau d'altération de l'odeur sur une échelle non structurée de 0 à 10. Il est précisé au panel qu'une note voisine de 6 est représentative d'une altération relativement forte. Cette valeur a été déterminée lors de précédents essais,

- un test de caractérisation par attributs. Une liste de 22 odeurs est proposée aux juges qui doivent sélectionner au moins une odeur : sardine, maquereau, thon, pâté, poisson gras, marine/iodée, laiteuse, pomme de terre, végétale, serpillière, saumure, fruitée, métallique, beurre/caramel, pyrrolidine/sperme, rance/huile de lin, aminée/urine, acide/piquante, aigre/fermentée, pied/fromage, chou/gaz, H ₂ S/œuf. Résultats

Pour le test de caractérisation par attribut, le critère « aminée/urine » a été supprimé car très rarement cité. Des regroupements de fréquences de citation ont été effectués pour les 5 premiers descripteurs (poisson gras/thon), pour rance et végétal, pour aigre/fermenté et pied/fromage (aigre/fromage) et pour chou/gaz et H ₂ S (soufrée). Les juges ayant cité de 1 à 5 descripteurs d'odeur par produit, le nombre de citations n'est pas toujours le même pour chaque échantillon. Aussi, la fréquence de citation, pour un produit et un critère d'odeur donné, a été calculée en prenant en compte le nombre de citations total pour le produit.

Les notes obtenues par les produits non ensemencés (témoin) ou les produits ensemencés par les souches pures sont présentées dans le Tableau 1 ci-dessous :

Tableau 1

Comme démontré dans le Tableau 1, le témoin évolue peu entre J4 et J8. En effet, le produit ayant été cuit et congelé, il est très peu contaminé quand débute l'entreposage à 15°C. Le produit ensemencé avec la souche M. psychrotolerans (Mp) est fortement altéré à J4 et n'évolue plus par la suite ; l'odeur est de type soufré (mélange de Diméthylsulfure et d'H ₂ S). Dans le thon ensemencé par la souche EU2258 seule, l'odeur « thon » persiste mais la note « pyrrolidine » a été clairement détectée à J4 ; un peu moins à J8 car probablement masquée par les autres odeurs plus présentes. La pyrrolidine est une aminé cyclique dont l'odeur à l'état pur ressemble à celle de l'ammoniac, diluée elle évoque plutôt l'odeur du sperme ou de l'eau de javel. Enfin, le thon ensemencé par la souche LHIS2885 seule ne présente pas d'altération au cours du temps. Les notes obtenues par les produits ensemencés avec la souche M. psychrotolerans en mélange avec une bactérie lactique (EU2258 ou LHIS2885) sont présentées dans le Tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2

Comme montré dans le Tableau 2, le produit ensemencé par les souches M. psychrotolerans (MP) et EU2258 présente une note soufrée; elle peut provenir de M. psychrotolerans ou de EU2258. Le thon est fortement altéré à J8. Par contre, le thon ensemencé avec M. psychrotolerans et LHIS2885 ne présente pas d'altération au cours du temps.

Ces résultats montrent que la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 inhibe la croissance des bactéries histaminogène M. psychrotolerans et M. morganii, de 4 à 5 log UFC/g. L'inhibition la plus importante est observée après 4 jours d'incubation de thon cuit conditionné sous-vide à 15°C. La production d'histamine est inférieure à 50 ppm (le seuil retenu par la législation Européenne est de 100 ppm, celui retenu par la législation américaine est de 50 ppm) alors que dans des produits qui pourraient être naturellement contaminés la quantité d'histamine serait de 4000 ppm. Au niveau sensoriel, la souche Lactobacillus sakei LHIS2885 n'est pas altérante par elle même. La souche permet même de réduire l'altération du produit à 4 et 8 jours d'incubation. La souche Lactobacillus sakei LHIS2885 apporte donc des éléments intéressants pour avoir une meilleure maîtrise de la production d'histamine dans le thon et pour limiter l'altération du produit dans le temps.