VERWENDUNG VON LEKTINZUBEREITUNGEN BEI DER BEKAMPFUNG VON HARNBLASENKARZINOMEN Die Erfindung betrifft die Verwendung von Lektinzubereitungen zur Behandlung von Harnblase.der Harnblasenkarzinome gehören zu den häufigsten urologischen Tu- moren mit stetig steigenden Fallzahlen. Oberflächliche 31asen- <BR> <BR> <BR> <BR> tumore machen ca. 70 k aller neu diagnostizierten Fälle aus.@Auch wenn die vollständigentferntwerden,operativ bleibt das Risiko des Wiederauftretens von Tumoren sehr hoch.

Häufig ist dies von einem weiteren Fortschreiten der Erkrankung begleitet. Obwohl die Häufigkeit von Rezidiven abhängig ist von der Infiltracionstiefe in das umgebende Gewebe und dem Differenzierungsgrad des Tumors, muß dennoch in zwei Drittel aller Fälle innerhalb von 5 Jahren mit dem Wiederauftreten von Tumoren gerechnet werden.

Die am häufigsten anaewandte Therapie zur Behandlung oberfläch- licher Harnblasenkarzinome und zur Verhinderung von Rezidiven nach operativer Entfernung der Primärrumore, ist die Verab- reichung von Bacillus Calmette-Guérin (BCG). Als vorteilhaft hat sich hier die intravesikale Anwendung erwiesen, die einen bes- seren Kontakt zwischen inuratumoralen Immunzellen und BCG ermög- licht als bei systemischer Therapie. Der Wirkungsmechanismus von BCG nochnichtinallenEinzelheitengeklärt,eswirdzwar jedoch angenommen, da$ die Wirkuncr über eine Aktivierung des Immunsystems erfolgt. Als gro#er Nachteil dieser Therapie hat sich die schlechte Verträglichkeit von BCG erwiesen (D. Lamm et Urol.114(1990)1328;D.Lammetal.,J.Urol.147al.;J.

(1992) 596. Es wird eine hohe Nebenwirkungsrate beobachtet, die von zysuischen Beschwerden und fieberhaften Infekten bis zu schweren bakteriellen Infektionen reichen, die nicht selten ein tödliches Ende nehmen. Diese schwerwiegenden Risiken lassen sich auch mit einer verbesserten Behandlungsmethode, wie sie die EP 488 583 beschreibt, nicht vermeiden. Weitere Nachteile der BCG- Therapie sind die Variabilität der Bakterienstämme, Unterschiede in deren Lebensfähigkeit und Immunogenität sowie Schwierigkeiten bei deren Handhabung. existiertdieadjuvanteintravesikaleBehandlungAlsAlternative mit ZytosLatika wie Doxorubicin, Mitomycin, Thiotepa oder Adria- mycin. Therapieschemata dieser Art haben sich ais weniger effek- tiv ais die BCG-Therapie herausgestellt und tragen ebenso das Risiko häufiger und schwerwiegender Nebenwirkungen.

Es besteht daher dringender Bedarf an einem Pharmazeutikum, das eine sichere und effektive Behandlung von Harnblasenkarzinomen und eine Vermeiduna von Rezidiven oder Metastasierungen ermög- licht.

Überraschenderweise hat sich nun herausgestellt, daß durch Verwendung Zubereitungen,insbesonderemitlektinhaltigen wä#rigenwirksameundbeiwirk-eine samen Dosierungen gut verträgliche Behandlung dieser Karzinome ermöglicht wird.

Die Misé (Viscum album) ist als Arzneipflanze lange bekannt. Wäßrige Extrakte aus der Mistel finden seit Jahrzehnten Anwendung zur StimulationdesImmunsystemsinunspezifischen der Krebstherapie. Als Hauptwirkstoffe sind Verbindungen aus der Substanzklasse der Lektine, die Mistellektine I, II und III er- kannt worden (T. Hajto et al., Cancer Res. 49 (1989), 4803 ; J.

Beuth Arzneim.-Forsch.43(1993),166).Mistelextrakteal., sind in der Lage, die Freisetzung immunstimulierender Zytokine, wie Interleukin Interleukin6(IL-6),Interferon-γ(IL-1), (IFN-Y) und Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-a) anzuregen (T. Hajto ei al., Oncology 43 (1986), 93).

Lektine vom RIP-2-Typ (doppelkettige ribosomeninaktivierende Proteine ; wie die aus Euphorbiaceen erhältlichen Ricine, die aus Fabaceen stammendenAbrineunddieausPas-precatorius) sifloraceen (Adenia digitata) isolierbaren Modeccine und insbesondere Mistellektine besitzen die Fähigkeit, unspezifische Abwehrmechanismen zu aktivieren und dadurch eine klinisch re- levante Immunmodulation zu induzieren. Die für die Abwehr von malignen Zellen entscheidenden Bestandteile des Immunsystems sind die Natural-Killer-Zellen (NK-Zellen), T-Zellen, B-Zellen, Mono- zyten, Makrophagen sowie dendritische Zellen. aufaktivesMistellektinstandardisiertsind,Mistelextrakte,die können dosisabhängig klinisch relevant Immunparameter beein- flussen. Solche Extrakte zeigen auch bei in-vivo Studien mit BALB/c-Mäusen und (L-1SarkomundRAW117-HTumormodellen 10 Lymphosarkom) ReduktionvonLungen-undsignifikante Lebermetastasen nach subkutaner Verabreichung und zeigen so ihre (J.Beuth,Z.All.Med.70(1994)159).antitumoröseWirksamkeit Grundlage der Entwicklung der zytotoxischen wie auch der immun- modulierenden Eigenschaften bei in-vivo-Anwendungen war immer die systemische Gabe der Mistelextraktzubereitungen. Umso berraschender ist es nun festzustellen, daß auch bei einer eher topischen Anwendung, wie sie die intravesikale Instillation darstellt, die Mistelextraktzubereitungen in vorteilhafter Weise wiezytotoxischeEffekteaufweisen,sowohlimmunstimulatorische wie es im Tiermodell demonstriert werden kann.

Als Mistelextraktzubereitungen werden wäßrige Auszüge (1 :1,1 - 1, 5) aus unverholzten Mistelzweigen mit Blättern oder Lektinkon- zentrate aus Mistelextrakten nach EP 602 686 oder stan- dardisierte, stabilisierte Mistelextraktzubereitungen nach DE 195 48 367 verwendet.

Studie zur Wirksamkeit von Mistelextraktzubereitunoen im Harn- blasenkarzinom-Modell Es wurde der Einfluß von einer lokal applizierten, auf aktives <BR> Mistellektin standardisierten Mistelextraktzubereitung auf das Wachstum von Harnblasenkarzinomen bei Mäusen untersucht. Dazu wurden murine MB49 Karzinomzellen in die Harnblase (A. Shapiro et al., Cancer Res. 44 (1984) 3051) und nach Eta- solidenTumorswurdenDosierungenvon0bzw.3undblierungeines 30 ng/0, 5 ml Mistellektin (entsprechend 100-1000 µl/kg Mistelexcraktzubereitung) 3 x wöchentlich über 4 Wochen in- travesikal appliziert. Die Mistelextraktzubereitung hatte einen signifikanten Einfluß auf die Überlebensrate, das Wachstum des Primärtumors in der Harnblase sowie auf die Metastasierung (Abb.

3).1bis Aus den Daten der Tiere zum Verlauf des Körperaewichts während der Behandlung, des Verhaltens bei Nahrungsaufnahme und allge- meinen Lebensqualitätsparametern läßt sich die gute Verträg- lichkeit der genannten wirksamen Dosierungen erkennen. Auch toxische Effekte auf andere Organe sind bei diesen Dosierungen nicht beobachtet worden.

Mistellektine gehören zur Substanzklasse der Glykoproteine und bestehen aus einer leichteren Untereinheit (A-Kette) mit riboso- meninaktivierenden Eigenschaften und einer schwereren Unter- einheit (B-Kette), die sich durch spezifische zuckerbindende Aktivität auszeichnet. Die Untereinheiten sind über Disulfid- brücken miteinander verknüpft. Die A-Kette des Mistellektins besitzt teilweise hydrophobe Eigenschaften und hat eine hohe Fähigkeit zur Membranbindung, so da$ die Mistelextraktzubereitung bei lokaler Anwendung rasch aus dem wäßrigen Milieu des Blasen- inhalts in das tumortragende Gewebe der Harnblase aufgenommen wird.

Immunstimulatorischer Effekt Mistellektin 1 und auf Mistellektin standardisierte Mistelex- traktzubereitungen sind in der Lage, die Freisetzung von Zy- tokinen aus PBM-Zellen (peripheral blood mononuciear cells) wie TNF-α,undInterleukin6zuverstärken.Überdie1 verschiedenen Zytokine wird die Aktivität der natürlichen Kil- lerzellen angeregt, deren Effekt als zytotoxische Aktivität gegen die Blasenkrebszellinie Fen gemessen werden kann. (B. Naume et al., Scand. J. Immuns. 40 (1994) 128 und A. Nouri et al., J. Im- munol. Methods 180 (1995) 63). So wird über die Stimulierung von Immunzellen indirekt die Steigerung der zytotoxischen Aktivität erreicht (Abb. 4).

Die zytotoxische Aktivität wurde als zellenvermittelte Lyse über einen MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromid) Assay bestimmt. Exponentiell wachsende Fen-Zellen wurden 10 Minuten mit Trypsin (2, 5 %) plus EDTA (0, 2 %) behandelt, ge- waschen, in Nährmedium resuspendiert und auf Microtiterplatten gegeben. Nach 24 Stunden wurde die Zellkultur gewaschen und die Effektor-Zellen (PBMC) in das gleiche Medium gegeben, so daS das Verhältnis von Effektorzellen und Zielzellen 40 : 1 betrug. Die <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Kokulturen wurden 4 Stunden mit bzw. ohne Mistellektin 1 inku- biert und weitere 2 Stunden nach der Zugabe von MTT in einer End- konzentration von 0,16 mg/ml. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen und nach der Zugabe von Isopropanol und Essigsäure wurde nach 30 Minuten die optische Dichte des klaren Formazans, das von mitochondrialen Enzymen der lebenden Zellen gebildet wurde, gemessen. Die zellvermittelte Lyse (in %) wurde nach fol- gender Formel berechnet : -ODE)100(ODEZ [%]=100---------------Zell-vermittelteLyse ODZ OD EZ = optische Dichte aus der Kokultur von Effektor und Zielzelien =optischeDichtederKulturenvonEffektor-oderDZ,ODE Zielzellen allein, jeweils mit oder ohne Mistel- lektin I.

Durch die Zugabe von Mistellektin I @ 3 bzw. 6 ng/ml) wurde eine Erhöhung der zytotoxischen Aktivität der Effektorzellen um 370% erreicht.

Direkter zytotoxischer Effekt Der direkte zytotoxische Effekt wird an der Einwirkung von Mi- stelextraktzubereitung auf die humane epitheliale Harnblasenkar- zinom-Zellinie Fen deutlich. Durch den Einfluß des Mistelexr. rakts sinkt konzentrationsabhängig die Vitalität der Zellen deutlich ab (Abb. 5).

FEN-Zytotoxizitätsbioassay Die menschliche Blasenuumorepithelzellinie FEN wurde von Herrn Dr. A. M. E. Nouri (The Royal London Hospital, Department of Medi- cal Oncology, London, UK) zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden in MDC-I-Medium (PAN-Systems GmbH, Aidenbach, Deutschland) bei 37°C und 5% CO2 in einem Begasungsbrutschrank kultiviert.

Jeweils 150 SuspensionvonFEN-Zellen(1,5x105Zellen/-einer ml) wurden in die Vertiefungen von 96er-Mikrotiterplatten mit flachen loden pipettiert. Nach 24 Stunden wurde nach der Erneu- erung des Zellkulturmediums die Misueiexuraktzubereitung bzw. die GleichzeitigwurdeinbestimmteVertie-Kontrollösungzugegeben. fungen, die die Mistelextraktzubereitung enthielten, ein Anti- Mistellektin-Antiserum (Charge Nr. 101092, Endverdünnung: 1:1000) zugefügt. Das Antiserum wurde von Prof. Dr. U. Pfüller (Univer- sität Witten/Herdecke, Institut für Phytochemie, Witten-Annen, Deutschland) bezogen. Die Zellen wurden 72 Stunden lang mit Brutschrankinkubiert.DanachwurdediedenPrüfsubstanzenim Anzahl metabolisch aktiver Zellen mit der MTT (3-[4,5 Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Methode photometrisch bestimmt. Hierzu wurden die Extinktionen des gebil- der-en, blauen Formazans bei der Wellenlänge 550 nm (Referenz- wellenlänge 690 nm) bestimmt. Damit wird erstmals gezeigt, da# für Miscellektine und diese enthaltende Zubereitungen nicht nur über Immunmodulation ausge- löste zytotoxische Effekte möglich sind, sondern daß auch über eine nicht zellvermittelte, direkte Einwirkung von Mistellektin die Bekämpfung von Krebszellen in der Harnblase gelingt.

Aus den vorstehenden Ausführungen ergibt sich deutlich die vor- teilhafte Verwendung von Lektinen des RIP-2-Typs, insbesondere des Miscellektins in Form von standardisierten Mistelextrakt- zubereitungen zur Behandlung von Harnblasenkarzinomen, zur Ver- hinderung von Metastasierungen und zur Vermeiduna von Rezidiven als Ergänzung zur operativen Behandlung.

Mistelextraktzubereitungen können sein wäßrige Auszüge aus Mistelpflanzen, Lektinkonzentrate aus Mistelextrakten und ent- sprechende standardisierte, stabilisierte Mistellektinpräparate und standardisierte, stabilisierte wäßrige Auszüge aus Missel- zweigen mit Blättern.

Bevorzugt verwendet wird ein wäßriger Auszug Ll:l,l-l,5jaus unverhoizten Mistelzweigen mit Blättern, der auf aktives Mistel- lektin standardisiert ist.

Als Darreichungsform werden Ampullen verwendet, die in 5 ml Lö- suna 500 ng aktives Mistellektin enthalten. Die Dosierung erfolgt durch Herstellung einer physiologischen Kochsalzlösung von 50 mi, die 500 ng bis 6000 ng aktives Mistellektin in Form des wäßrigen Auszugs enthalten kann. Die 50 mi dieser Lösung werden per intra- vesikaler Instillation in die Blase verbracht und verbleiben dort ein bis vier Stunden. Die Behandlung erfolgt einmai cro Woche Wochenhinweg.übermehrere Die beschriebenen Mistelextraktzubereitungan werden gut vertragen und die Gefahr von Nebenwirkungen ist damit minimiert.

Zur Förderung der Internalisierung der Wirkstoffe können intrave- sikaie Formulierungen gut verträgliche Hilfsstoffe wie Ethanol, Methylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Oleylalkohol, Octanol, oderDimethylsulfoxident-Linolsäure,Propylenglykolglycerin halten.

Stabilisatoren wie Alkanole, insbesondere Polyole und Kohle- hydrate, hydrophile Polymere, insbesondere Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, nichtionische Tenside wie Polyalkylenglykole und Polyoxyethylenfettsäureester oder Proteine wie Albumin können ebenfalls zur Zubereitung der gewünschten Formulierung gegebenen- falls erforderlich sein.

Erklärung der Abbildungen Abbildung 1 zeigt die Überiebensrate von Mäusen, die nach Indu- zierung von Harnblasenkarzinomen über mehrere Wochen mit verschiedenen Konzentrationen von Mistelextraktzubereitungen behandelt wurden im Vergleich zu einer unbehandelten Kontroll- gruppe.

Abbildung 2 zeigt den Anteil der nach Behandlung noch tumortra- genden Mäuse im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe.

Abbildung 3 zeigt den Anteil der Mäuse, bei denen nach Behandlung noch Metastasen festgestellt wurden im Vergleich zur unbehandel- ten Kontrollgruppe.

Abbildung 4 zeigt die zellvermittelte zytotoxische Aktivität von menschlichen PBM-Zellen gegen die Fen-Harnblasenkrebs-Zellinie in vitro mit oder onne Einwirkung von Misiellektin I.

Abbildung 5 zeigt die Vitalität (Anzahl meiabolisch aktiver Zel- <BR> HarnblasenkarzinomzellenunterEinwirkunglen)#vonmenschlichen der Mistelextraktzubereitung und unter der Wirkung einer Kom- bination von Misteiextraktzubereitung und eines aegen Mistel- lektin wirkenden Antiserums.