USO DEL áCIDO MASLíNICO PARA EL TRATAMIENTO DE PATOLOGíAS Y

SUS SíNTOMAS MEDIANTE LA INHIBICIóN DE

COX-2

La presente invención se refiere al uso del ácido maslínico y cualquiera de sus derivados para el tratamiento de procesos patológicos relacionados con Ia inhibición de Ia ciclooxigenasa-2 endógena (COX-2). Más concretamente para el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis, artritis reumatoide, fibromialgias, ciática y otras molestias articulares de difícil diagnóstico. También se refiere a Ia administración por vía tópica de una composición, que comprende ácido maslínico, cualquiera de sus derivados, o mezclas naturales, sintéticas o semisintéticas ricas en maslínico o sus derivados.

ESTADO DE LA TéCNICA ANTERIOR

El ácido oleanólico (3-betahidroxi-28-carboxiolean-12-eno) es un ácido triterpénico ubicuamente repartido en el reino vegetal. Así, Ia base de datos fitoquímica del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos recoge su presencia en casi un centenar de plantas, entre las que se encuentra Ia Olea europaea, así como una serie de actividades biológicas comprobadas (antiabortivo, anticariogénico, antifertilidad, antihepatotóxico, antiinflamatorio, antisarcómico, preventivo del cáncer, cardiotónico, diurético, hepatoprotector y uterotónico).

El ácido maslínico (2-alfa,3-betadihidroxi-28-carboxiolean-12-eno), también denominado ácido crataególico, es un ácido mucho menos repartido en Ia naturaleza, habiendo sido detectado en una decena de plantas. Se conoce su actividad como antihistamínico y antiinflamatorio, aunque su escasez hace que no se haya estudiado extensamente. El aislamiento de los ácidos oleanólico y maslínico de las ceras de Ia superficie del fruto de Ia Olea europaea, ha sido descrito [Bianchi.G., Pozzi.N. And Vlahov, G. Phytochemistry (1994) 37, 205- 207] mediante Ia extracción metanólica de olivas previamente lavadas con cloroformo. La separación de este tipo de ácidos ha sido descrita mediante cromatografía en contracorriente de alta velocidad (HSCCC) [Du, Q.Z., Xiong, XP. and Ito, Y. ; Journal of Liquid Chromatography (1995) 18, 1997-2004].

Acido maslínico

Existe en Ia actualidad, un gran número de patentes en las que el ácido maslínico actúa como componente activo: agente antitumoral US2003153538 o WO0252956; inductor de apoptosis WO03057224; alimento anorético WO203039270 y WO03011267; agente externo para Ia piel y blanqueador US2003133958; lesiones vasculares WO02078685.

En algunas publicaciones se sugiere que este triterpeno puede tener también una actividad antiinflamatoria (Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez- Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006) Dec; 36 (5-6):211-7). En este documento también se describe que el acido maslínico inhibe Ia liberación de IL-6 y TNFα y Ia producción de NO y del peróxido de hidrogeno (ROS) en macrófagos peritoneales murinos estimulados con LPS, un efecto que los mismos autores no encuentran en células mononucleares de sangre periférica humana. En todo caso, Io que estas discrepancias ponen de manifiesto es que las respuestas no son homogéneas y por tanto no son predecibles, Io que hace necesario el estudio en cada modelo y/o tipo de tejido.

Por otro lado, las prostaglandinas son sintetizadas a partir del ácido araquidónico (y de otros ácidos grasos insaturados C20 llamados eicosanoides) siguiendo Ia vía metabólica de Ia ciclooxigenasa (COX), una enzima ampliamente distribuida que es capaz de producir un ciclo y de introducir oxígenos en los precursores para crear las prostaglandinas que derivan todas ellas ácido prostanoico. Existen dos isoformas distintas bien identificadas de ciclooxigenasa que son Ia COX-1 y COX-2. La COX-1 se expresa constitutivamente en muchos tejidos, donde regula funciones fisiológicas importantes. Por ejemplo, Ia COX-1 cataliza Ia producción de prostaglandinas por el endotelio y por Ia mucosa gástrica, Io que conduce a efectos antitrombogénicos y citoprotectores, respectivamente La COX-2, que es Ia forma inducible, es indetectable en Ia mayor parte de los tejidos La COX-2 es una

isoforma específica derivada de un gen diferente del que codifica Ia COX-1. La expresión de Ia COX-2 aumenta durante el desarrollo y Ia inflamación, pero su expresión constitutiva permanece baja en Ia mayoría de los órganos, excepto en el cerebro.

Las prostaglandinas, en particular Ia PGE ₂ , ejercen múltiples funciones fisiológicas y fisiopatológicas. Así, las concentraciones bajas de PGE ₂ mantienen Ia integridad de Ia mucosa gástrica normal y Ia homeostasis de los fluidos y electrólitos mientras que los niveles de este mediador están implicados en los procesos inflamatorios.

Otros metabolitos del acido araquidónico son los isoprostranos. Estos metabolitos son parecidos estructuralmente a las prostaglandinas y son generados por Ia oxidación de los ácidos grasos de Ia membrana plasmática.

En Ia actualidad está ampliamente reconocido que los isoprostanos representan un de los mejores marcadores celulares y sistémicos del estrés oxidativo. Ya que se ha demostrado Ia actividad antioxidante del acido maslínico es posible que este compuesto pueda inhibir Ia formación de isoprostranos (Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez-Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006) Dec; 36(5-6):211-7); Montilla MP, ágil A, Navarro MC, Jiménez Ml, Garcia- Granados A, Parra A, Cabo MM. Planta Med. (2003) May;69(5):472-4).

Según el Centro Médico de Ia Universidad de Maryland en Io que a tratamiento de Ia artritis reumatoide, este tratamiento se puede hacer, en principio, con inhibidores de Ia COX-2, indicando que "Los inhibidores COX-2 bloquean una enzima que favorece Ia inflamación, llamada COX-2" pero no contemplan tratamientos eficaces por administración tópica. Inicialmente se creía que esta clase de drogas funcionaba tan bien como las drogas anti-inflamatorias sin esteroides (NSAID), pero con menos problemas estomacales. Sin embargo, numerosos informes de ataques cardíacos y accidentes cerebrovasculares han llevado a Ia FDA a evaluar de nuevo Ia relación riesgo-beneficio de los COX-2. El rofecoxib (Vioxx®) y el valdecoxib (Bextra®) han sido retirados del mercado norteamericano después de los informes sobre ataques cardíacos en pacientes que los estaban tomando. Celecoxib (Celebrex®) aún está disponible, pero con una etiqueta de fuerte advertencia y con Ia recomendación de que sea prescrito en Ia dosis más baja y durante el menor tiempo posible. Los pacientes deben consultarle al médico si este

medicamento es apropiado y seguro para ellos.

Los medicamentos antimaláricos como hidroxicloroquina (Plaquenil®) y sulfasalazina (Azulfidine®) también son beneficiosos por Io general en unión con metotrexato. Pero los beneficios de estos medicamentos pueden tomar de semanas a meses para manifestarse y ya que están asociados con efectos colaterales tóxicos, es un imperativo realizar control frecuente con pruebas sanguíneas mientras se estén usando.

Los inhibidores del factor de necrosis tumoral (TNF) son un tipo de medicamentos relativamente nuevos que se utilizan para tratar Ia enfermedad autoinmune y son entre otros: etanercept (Enbre®l), infliximab (Remicade®) y adalimumab (Humira®). Adalimumab® y Etanercept® son medicamentos inyectables, mientras que Infliximab se suministra por vía intravenosa.

Otro medicamento relativamente nuevo es Ia Anakinra inyectable (Kineret ®), una proteína artificial que bloquea Ia proteína inflamatoria interleucina-1. Este medicamento se utiliza para disminuir Ia progresión de moderado a grave de Ia artritis reumatoidea activa en pacientes de más de 18 años que no hayan respondido a uno o más de los DMARD (en inglés Medicamentos Antirreumáticos

Modificadores de Ia Enfermedad). El Kineret® se puede utilizar con otro DMARD o con inhibidores del factor de necrosis tumoral.

Otros medicamentos que suprimen el sistema inmune, como azatioprina (Imuran®) y ciclofosfamida (Cytoxan®), se utilizan algunas veces en personas que han fracasado con otras terapias. Estos medicamentos, que están asociados con efectos secundarios tóxicos, se reservan generalmente para casos severos de artritis reumatoidea.

Se desconoce Ia existencia de un tratamiento eficaz y sencillo de administrar para el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis, de artritis reumatoide u otras molestias articulares de difícil diagnóstico que actúe directamente sobre condrocitos y logre un tratamiento eficaz con eliminación rápida y prolongada de las sintomatologías indicadas.

EXPLICACIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención describe el uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para el tratamiento de cualquier patología que curse con activación de Ia enzima ciclooxigenasa-2 (COX-2).

En este sentido, en Ia presente invención se demuestra Ia actividad del ácido maslínico como inhibidor de Ia actividad de Ia COX-2 inducida en condrocitos humanos y por tanto Ia utilidad de este ácido en el tratamiento de enfermedades que cursen con Ia activación de dicha enzima COX-2.

Se demuestra también que el ácido maslínico no solo es capaz de reducir Ia inflamación, asociada a este tipo de enfermedades, sino que además interviene en Ia reducción o eliminación de Ia sintomatología y en Ia regeneración tisular condrocitaria demostrando efectos duraderos.

Por todo Io anteriormente citado, Ia invención versa sobre el tratamiento sintomático y/o regenerativo de enfermedades tales como artrosis, artritis reumatoides, fibromialgias, ciática, síndrome del saltador, protuberancia de Ia articulación metatarsofalángica (juanete) y procesos que responden a AINES (Anti Inflamatorios No Esteroideos) específicos para COX-2, con una composición que comprende ácido maslínico o cualquiera de sus derivados. Este tratamiento se lleva a cabo con una administración sencilla y es eficaz puesto que, entre otras cosas, actúa directamente sobre los condrocitos o tejidos afectados. En particular se demuestra en Ia presente invención Ia eficacia en el tratamiento sintomático y/o regenerativo de artrosis y artritis reumatoide con Ia eliminación rápida y prolongada de sus sintomatologías.

En esta invención, se demuestra Ia eficacia del tratamiento incluso por administración tópica. Es muy importante destacar este hecho, puesto que otros AINES inhibidores de Ia COX-2 no muestran eficacia cuando se administran vía tópica y además, su administración por otras vías, presenta efectos secundarios o colaterales adversos.

El ácido maslínico, se puede obtener bien sintética o naturalmente. Las composiciones que comprenden este ácido maslínico, incluyen en su definición,

el uso de extractos de plantas que contienen ácido maslínico, extractos de los subproductos de procesado industrial de Ia planta o sus frutos o un subproducto industrial de Ia planta que contiene una concentración mayor de ácido maslínico que Ia originalmente presente en Ia planta. Por ejemplo, pero sin limitarse, extractos de plantas del género Olea, más particularmente Ia especie O. europea. Además del ácido maslínico de este tipo, también se pueden utilizar sus derivados, entendiéndose por derivados en Ia presente invención, sus sales, o derivados aceptados en farmacopeas que faciliten Ia absorción y transporte en los tejidos a tratar. Más particularmente sus sales sódicas, potásicas o de aminas biológicamente aceptables.

Estos hechos se demuestran mediante las siguientes experiencias realizadas:

• Se ha determinado el efecto del acido maslínico y derivados sobre Ia expresión de Ia proteína COX-2 en monocitos primarios humanos de sangre periférica.

• Se ha determinado el efecto del ácido maslínico y derivados en Ia actividad enzimática de Ia COX-2 en monocitos de sangre periférica.

• Se ha determinado el efecto del ácido maslínico y derivados sobre Ia formación de isoprostranos en monocitos primarios humanos de sangre periférica.

• Se ha determinado el efecto del ácido maslínico y derivados sobre Ia liberación de PGE2 en condrocitos primarios humanos.

• Se ha determinado el efecto del acido maslínico y derivados sobre Ia liberación de PGE2 en astrocitos de rata primarios y en Ia línea celular de tipo neuroblastoma SK-S-NH .

• Se ha determinado el efecto del acido maslínico y derivados sobre Ia regulación transcripcional del gen COX-2 y sobre Ia expresión de Ia proteína COX-2 en astrocitos primarios.

• Se han realizado pruebas clínicas sobre pacientes afectados por procesos atrofíeos artrósicos, artríticos, fibromiálgicos o tendinosis, entre otros, para probar Ia eficacia del tratamiento "in vivo" y muy especialmente por administración tópica.

Es preciso tener en cuenta que, a veces, los diagnósticos que previamente tenían realizados los pacientes tratados, no son muy precisos, siendo en muchas

ocasiones la sintomatología el único medio empleado para el antedicho diagnóstico.

Ya que Ia funcionalidad de COX-2 y Ia producción de PGE2 se regula a varios niveles y que el acido maslínico inhibe Ia producción de PGE2 en monocitos primarios humanos se ha estudiado en detalle el efecto de este triterpeno sobre Ia expresión y función de Ia COX-2 en diferentes tipos celulares "in vitro" como paso previo a los estudios con modelos animales específicos. Así, se ha demostrado por primera vez Ia acción "in vitro" del ácido maslínico en Ia inhibición de COX-2 inducida en condrocitos humanos y se ha llevado a cabo un amplio estudio clínico de pacientes con artrosis, artritis o fibromialgias, entre otros, pudiendo demostrar una sorprendente eficacia del ácido maslínico y sus sales incluso en tratamientos tópicos sencillos de las zonas que presentaban estos síndromes. De hecho, aunque en todos los pacientes con artrosis se observó una mejoría de los síntomas, en aquellos menores de aproximadamente 60 años los síntomas remitieron totalmente en menos de un mes de tratamiento. Además, en todos los casos, se observa de forma muy sintomática la paulatina reabsorción de calcificaciones propias de los síndromes artrósicos.

En más del 80% de los casos Ia eficacia en Io que a sintomatología se refiere se comienza a notar en 24/48 horas y entre 2 a 6 aplicaciones tópicas. Además de Ia mejora de Ia sintomatología en articulaciones (dolor y rigidez) los pacientes con inflamación evidente, por ejemplo en los dedos de Ia mano, notan en pocos minutos un aumento de temperatura en las zonas tratadas, Io que indica claramente el aumento de circulación sanguínea que el paciente empieza a experimentar en forma inmediata.

Se ha comprobado, que el ácido maslínico es un potente inmunomodulador de Ia respuesta inmune ya que inhibe Ia activación y Ia proliferación de los linfocitos T estimulados vía TCR e inhibe Ia producción de las citoquinas pro-inflamatorias TNFα e IL-6, además de Ia producción de Ia Prostaglandina E2 (PGE2) en monocitos primarios. Además, se observa que las concentraciones de ácido maslínico que actúan inhibiendo las respuestas inmunes innata y adquirida son sensiblemente más bajas que las requeridas para inducir apoptosis en líneas celulares tumorales.

En Ia presente invención, y como consecuencia de los resultados obtenidos, mostrados en Ia sección de ejemplos, se demuestra que:

1. El acido maslínico inhibe Ia producción de PGE2 en monocitos humanos. 2. El acido maslínico inhibe Ia actividad enzimática de Ia COX-2.

3. El ácido maslínico no inhibe ni Ia activación transcripcional del promotor del gen de Ia COX-2 ni Ia expresión de Ia proteína.

4. El acido maslínico a dosis altas inhibe Ia producción de PGE2 en condrocitos y en células derivadas de un neuroblastoma. 5. El ácido maslínico inhibe Ia producción de isoprostranos en monocitos humanos.

6. El ácido maslínico inhibe Ia producción de IL-6 en monocitos y condrocitos humanos.

7. La inhibición de producción de IL-6 por el MA no se debe a una inhibición transcripcional del gen de Ia IL-6.

Hay que tener en cuenta que, las uniones entre los huesos están recubiertas por el cartílago articular, un tejido que no contiene capilares ni terminaciones nerviosas. Durante el movimiento articular Ia fricción entre huesos se minimiza por este cartílago articular, que contiene condrocitos, los cuales representan el 1- 2% del volumen total, y cuya función es sintetizar proteínas de Ia matriz extracelular. Esta matriz contiene un 70-80% de agua Io que Ie permite tener una estructura que sirve para amortiguar las presiones. La interacción electrostática entre las moléculas de agua y los mucopolisacáridos sulfatados es necesaria para mantener Ia hidratación del cartílago. Por tanto los proteoglicanos lubricados por los polímeros de hialurónico es Ia sustancia que mantiene Ia integridad del cartílago. Los glucosaminoglicanos y proteoglicanos mantienen una íntima relación con las fibras de colágeno producidas por los condrocitos, los cuales también producen los proteoglicanos.

Por todo ello, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del ácido maslínico, en su definición más amplia como anteriormente se ha descrito, o cualquiera de sus derivados para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de patologías relacionadas con Ia activación de Ia COX-2.

Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del ácido maslínico o cualquiera de sus derivados para preparar un medicamento que además favorece Ia regeneración tisular condrocitaria.

En una realización preferida de Ia invención las patologías relacionadas con Ia activación de Ia COX-2 y/o en las que se produce regeneración tisular condrocitaria se seleccionan de Ia lista que comprende: artrosis, artritis reumatoides, ciática, fibromialgias, hallux valgus o protuberancia de Ia articulación metatarsofalángica (juanete), tendinitis rotuliana (rodilla del saltador) u otras patologías que responden a AINES específicos para COX-2. Una realización aún más preferida comprende su uso para el tratamiento de artrosis o artritis reumatoide.

Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende ácido maslínico en su definición más amplia (sales, metabolitos, extractos de plantas que Io contengan, extracto de los subproductos de procesado industrial de Ia planta o sus frutos, o un subproducto industrial o una combinación de cualquiera de estos componentes) o cualquiera de sus derivados para el tratamiento de enfermedades que cursen con Ia activación de Ia COX-2. Más concretamente útil para el tratamiento de enfermedades relacionadas con Ia activación de Ia enzima COX-2 en condrocitos de humanos o animales mediante Ia inhibición de esta COX-2.

En una realización preferida, dicha composición además comprende ácido oleanólico y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable. Más preferidamente, Ia relación de ácido maslínico:ácido oleanólico es de entre 2:1 y 6:1.

Es decir, el ácido maslínico, sus sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formularán en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Más particularmente, el ácido maslínico o Ia mezcla de ácido maslínico y ácido oleanólico, se encuentra en una proporción de entre 0.5 y 10% del total de Ia composición, más concretamente entre el 0.5 y el 5% y aún más concretamente entre el 1 y el 3%.

Esta composición, se puede administrar de distintas formas, entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, rectalmente, intramuscularmente, de forma tópica, de forma subcutánea, intraarticularmente o por inhalación.

Mas preferiblemente se administra de forma tópica, subcutánea o mediante infiltraciones articulares. En otra realización preferida, dicha composición se presenta en una forma adaptada a Ia administración tópica.

En cada caso Ia composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición descrita anteriormente se puede presentar bajo Ia forma de tabletas, grageas, cápsulas, soluciones, emulsiones, cremas, leche corporal, ungüentos, inhalantes, aerosoles, supositorios o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz. Mas preferiblemente en forma de solución, emulsión, crema, leche corporal o ungüento.

En otra realización preferida, esta composición contiene ácido maslínico o cualquiera de sus derivados, obtenidos de un extracto de planta del genero Olea o de un subproducto industrial de planta del genero Olea.

Por un derivado farmacéuticamente aceptable se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el ácido maslínico.

En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en

parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

FIG. 1.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en monolitos humanos

FIG. 2.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia expresión de COX-2 en monolitos humanos.

FIG. 3.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia actividad de COX-2 en monolitos humanos.

FIG. 4.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en células SK-N-SH

FIG. 5.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en astrocitos primarios.

FIG. 6.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia actividad transcripcional de Ia COX-2.

FIG. 7.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia expresión de Ia COX-2 en monocitos humanos.

FIG. 8.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en condrocitos.

FIG. 9.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de IL-6 en condorcitos.

FIG. 10.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de PGE-2 en monolitos.

FIG. 11.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia actividad del promotor de Ia IL-6 inducida por P+l.

FIG. 12.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre la actividad del promotor de Ia IL-6 inducida por IL-1.

FIG. 13.- Muestra el efecto del ácido maslínico sobre Ia producción de

¡soprostanos en monolitos primarios.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto, entre otras cosas, Ia actividad y eficacia del ácido maslínico y demuestran Io que de forma general se ha descrito en los apartados anteriores.

De forma genérica para todos los ejemplos, se describen los compuestos, materiales y métodos utilizados:

1. Compuestos:

Se utilizó ácido maslínico en su forma de sal sódica, Ia cual se disolvió en DMSO (dimetilsulfóxido) en una solución stock (10 y 50 mM). La concentración máxima final de DMSO en los cultivos fue del 1% (vol/vol), Ia cual no interfiere con los parámetros medidos.

2. Cultivos celulares

• Aislamiento y cultivo de monocitos primarios de sangre periférica. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de donantes voluntarios sanos y adultos, fueron aisladas por centrifugación de sangre venosa mediante gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque. Los monocitos fueron separados mediante adherencia al plástico y posteriormente cultivados en placas de 24 pozos a una densidad de 500.000 células/ml para los experimentos de enzimoinmunoensayos (EIA) y en placas de 6 pozos para los ensayos de inmunoblot.

• Cultivo de condrocitos primarios humanos. Los condrocitos fueron comprados a Promocell (Heidelberg, Alemania) y cultivados en medio condicionados para este tipo de células. Las células fueron cultivadas en placas de 24 pozos para Ia determinación de PGE2 e IL-6.

• Cultivo de astrocitos primarios de rata. Los cultivos primarios de astrocitos fueron preparados a partir de cerebros de rata neonatal (1 día de vida). La parte superior del cráneo fue abierta y las meninges cuidadosamente separadas para evitar Ia contaminación de los cultivos con fibroblastos. La corteza cerebral se aisló y se obtuvo una suspensión celular que se cultivo en DMEM condicionado para cultivo de astrocitos. Los cultivos fueron expandidos en placas de 6 pozos y Ia producción de PGE2 medida en células después del 3 o 4 pase.

- Cultivo de líneas celulares. La SK-N-SH (American Tissue Culture collection, HTB 11) es una línea celular derivada de un neuroblastoma humano y se mantuvo en crecimiento exponencial en DMEM suplementado con 2 mmol/l L-glutamina, antibióticos y 10% de FCS. Las células fueron cultivadas a 37 ⁰ C y en una atmósfera al 5 % de CO ₂ .

3. Western blots

Las células (monocitos primarios o SK-N-SH) fueron estimuladas como se indica en cada caso y usadas en 50 μl de solución de lisado (20 mM Hepes pH 8.0, 10 mM KCI, 0.15 mM EGTA, 0.15 mM EDTA, 0.5 mM Na ₃ VO ₄ , 5 mM NaF, 1 mM

DTT, leupeptina 1 μg/ml, pepstatina 0.5 μg/ml, aprotinina 0.5 μg/ml, 1 mM PMSF y 0.5 % NP-40). La concentración de proteínas fue determinada mediante el reactivo de Bradford (Bio-Rad, Richmond, CA, EEUU) y 30 μg de proteínas fueron hervidos en solución Laemmli y sometidos a electroforesis en gel de

SDS/poliacrilamida al 10 %. Las proteínas separadas fueron transferidas a una

membrana de nitrocelulosa (0.5 A, 100V a 4 ⁰ C) durante 1 h. Las membranas fueron bloqueadas en TBS conteniendo 0.1 % de Tween 20 y 5 % de leche en polvo desnatada. La inmunodetección de las distintas proteínas fue llevada a cabo mediante incubación con los distintos anticuerpos primarios durante dos horas, seguido de incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa durante una hora y media y revelado mediante el uso del sistema de quimioluminiscencia ECL (GE Healthcare Life Sciences).

4. Transfecciones transitorias y ensayos de luciferasa

Las células SK-N-SH fueron transfectadas con los plásmidos COX-2-Luc e IL-6- Luc usando el reactivo Jet Pei (Polyplus transfection, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ambos plásmidos contienen los promotores de los genes indicados dirigiendo el gen de Ia luciferasa como marcador de Ia activación transcripcional. Las células se mantuvieron en cultivo en condiciones normales hasta 24 ó 48 horas después de Ia transfección dependiendo del experimento y se estimularon de Ia manera indicada en cada caso. Tras los estímulos, las células fueron usadas en tampón de lisado (25 mM Tris-fosfato pH 7.8, 8 mM MgCI ₂ , 1 mM DTT, 1 % Tritón X-100, y 7 % glicerol) durante 15 minutos a temperatura ambiente. La actividad luciferasa en el extracto de proteínas fue determinada mediante el uso del luminómetro Autolumat LB9510 (Berthold) siguiendo las instrucciones del sistema Luciferase assay de Promega (Madison, Wl, USA).

5. Determinación de Ia producción de PGE ₂ en distintos tipos celulares y de Ia actividad COX-2.

Los cultivos de condrocitos, monocitos y astrocitos fueron estimulados con los correspondientes activadores (IL-1 , LPS o PMA más lonomicina) en presencia o no de varias concentraciones de ácido maslínico durante los tiempos indicados. Posteriormente los sobrenadantes fueron recogidos para determinar Ia cantidad de PGE ₂ liberada por las células estimuladas. La PGE ₂ fue determinada usando el sistema EIA de Assay Designs (numero de catalogo 901-001) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para la determinación de Ia actividad COX-2, las células se estimularon primero con LPS (10 ng/ml) durante 24 h para inducir Ia expresión celular de Ia proteína COX-2. Pasado este tiempo los cultivos fueron lavados y se añadió nuevo medio de cultivo libre de suero, acido maslínico (diferentes concentraciones) y acido araquidonico (AA) durante 15 min. En este tiempo Ia actividad enzimática de COX-2 se mide por su capacidad de producir PGE2 a partir del AA incluido en el cultivo.

6. Determinación de Ia producción de Isoprostanos e IL-6 en monocitos.

Los cultivos de monocitos fueron estimulados igual que para Ia producción de PGE2 (estimulación con LPS durante 24 h) y Ia cantidad de 8-/so-prostaglandina F _2α (isoprostranos) o IL-6 liberada por las células fue determinada respectivamente mediante los sistemas de EIA de Cayman (USA) (numero de catalogo 516351) o de Pelikine (numero de catalogo RDI-M1916clb) siguiendo las instrucciones de los fabricantes.

EJEMPLO 1

El acido maslínico (MA) inhibe Ia actividad enzimática de Ia enzima COX-2 v Ia producción de PGE? en monocitos estimulados con LPS.

En los procesos inflamatorios los monocitos producen numerosas citoquinas pro- inflamatorias como el TNFα, Ia IL-1β y Ia IL-6 y mediadores de Ia inflamación como los leucotrienos y las prostaglandinas entre otros. Ya se demostró con anterioridad que el acido maslínico (MA) inhibió la producción de PGE ₂ en monocitos humanos obtenidos de sangre de periférica y estimulados con LPS (FIG 1).

Con el fin de identificar el mecanismo de acción del MA sobre Ia producción de PGE ₂ , aspecto de gran importancia para buscar Ia causa y poder predecir aplicaciones, se realizaron una serie de experimentos destinados a estudiar el efecto del MA sobre Ia actividad transcripcional del gen de Ia COX-2 y sobre la expresión de Ia proteína. En primer lugar monocitos de sangre periférica se estimularon con LPS en presencia de dosis crecientes de MA y 12 horas después se extrajeron las proteínas celulares que fueron sometidas a

electroforesis para detectar Ia expresión de COX-2 mediante western blots. En Ia figura 2 se puede observar que el MA no inhibió Ia expresión de COX-2 inducida por LPS. (FIG.2)

Ante Ia posibilidad del que el MA actuase como inhibidor de Ia actividad COX-2, indujimos Ia expresión de COX-2 mediante tratamiento de los monocitos con LPS durante 24 h. Pasado este tiempo las células fueron lavadas tres veces con medio sin suero e incubadas durante 15 min con dosis crecientes de MA. Pasado este tiempo, se añadió ácido araquidónico a los cultivos (15 μM) durante otros 15 min y Ia conversión a PGE ₂ medida mediante EIA. En Ia figura 3 se puede observar que el MA inhibió de forma dosis dependiente Ia actividad enzimática de COX-2 v explica su efecto sobre Ia producción de PGE ₂ en este tipo celular. (FIG 3).

EJEMPLO 2

Efecto dual del acido maslínico (MA) sobre Ia producción de PGE2 en astrocitos primarios v en Ia línea celular SK-N-SH (neuroblastoma).

A continuación se estudió el efecto del MA sobre Ia actividad transcripcional del promotor del gen de Ia COX-2 y sobre Ia expresión de Ia proteína en células SK-

N-SH. Estas células fueron transfectadas de forma transitoria con un plásmido que contiene el gen de Ia luciferasa dirigido por el promotor completo del gen

COX-2. 24 h después de Ia transfección las células se incubaron con dosis crecientes de MA y se estimularon con PMA más lonomicina durante 6 horas. Pasado este tiempo Ia actividad luciferasa fue medida en los usados celulares observándose que el MA no afectó a Ia actividad transcripcional del gen COX-2

(FIG.5).

La expresión inducible de Ia proteína COX-2 tampoco se vio afectada en células SK-N-SH por Ia presencia de MA (FIG 6).

EJEMPLO 3

Efecto del acido maslínico (MA) sobre Ia producción de PGE2 e IL-6 en condrocitos humanos estimulados con IL-1.

Para determinar si el efecto del MA sobre Ia producción de PGE2 también ocurría en otro tipo celular involucrado en fenómenos inflamatorios se ha determinado Ia actividad anti-inflamatoria del acido maslínico sobre condrocitos primarios humanos. Las células fueron tratadas con dosis crecientes de MA y posteriormente estimuladas con IL-1 (10 U/ml) para determinar Ia liberación de PGE ₂ e IL-6. En Ia figura 7 (FIG.7) se muestra que el MA ejerce un efecto dual en la producción de PGE ₂ tras Ia estimulación con IL-1 en condrocitos. A dosis mas bajas (0.1 y 1 μg/ml) se produjo un incremento de la producción de PGE2, mientras que dosis más altas (25 y 50 μg/ml) se observó una completa inhibición de liberación de esta prostraglandina inducida por Ia IL-1.

Por el contrario Ia producción de IL-6 fue completamente inhibida por el MA en las mismas células y de una manera dependiente de Ia concentración (FIG. 8).

Estos resultados concuerdan totalmente con los resultados encontrados previamente en monocitos humanos donde Ia IL-6 inducida por LPS fue inhibida por el MA (FIG. 9).

A continuación se estudió si el efecto inhibitorio del acido maslínico sobre la liberación de IL-6 era debido a un efecto transcripcional sobre el gen que codifica dicha proteína. Así, las células SK-N-SH, que son productoras de IL-6, fueron transfectadas con un plásmido que contiene el gen de Ia luciferasa dirigido por el promotor completo de Ia IL-6 y estimuladas con IL-1 o una combinación de PMA mas ionomicina en presencia o ausencia de dosis crecientes de MA y Ia actividad luciferasa medida en los extractos celulares después de 4 horas de tratamiento. En las figuras 10 y 11 (FIG. 10 y 11) se muestra que el MA no inhibe Ia actividad transcripcional del promotor de Ia IL-1, por Io que actividad inhibitoria sobre Ia liberación de IL-6 es debida seguramente a una inhibición a nivel post- transcripcional.

EJEMPLO 4

Efecto del acido maslínico (MA) sobre la producción de isoprostranos en monocitos humanos estimulados con LPS.

Los isoprostranos como el endoperoxido 8-/so-prostaglandina F _2α (8-/so-PGF _2α ) son metabolitos de Ia oxidación de acido araquidónico y en Ia actualidad se considera unos de los mejores marcadores del estrés oxidativo. En Ia figura 12 (FIG.12) se muestra que el MA inhibe de forma concentración dependiente Ia liberación de 8-/so-PGF _2α producida en monocitos humanos se sangre periférica tras Ia estimulación con LPS. Este dato confirma Ia actividad anti-oxidante del MA demostrada previamente por otros autores. La potencia inhibidora del MA sobre Ia producción de isoprostanos es superior a Ia del tocoferol y el trolox y es comparable a Ia del resveratrol (FIG.13)

EJEMPLO 5

Se realizaron pruebas clínicas mediante Ia administración por vía tópica de sal sódica del ácido maslínico y mezclas, en proporciones variables, de las sales sódicas de ácido maslínico y ácido oleanólico y de ácido maslínico y ácido oleanólico en proporciones variables (de entre 70% y el 85% de maslínico y entre el 30% y el 15% de oleanólico). En el caso de utilización de sales, Ia administración por vía tópica se ha realizado debidamente distribuida en una leche corporal tipo y en el caso de los ácidos libres se utilizado Ia conocida base Beeler para su administración. La leche corporal contenía aproximadamente de entre el 0.5% al 1.5% de principio activo (sales) y Ia crema contenía aproximadamente entre el 1.5% al 2,5% del principio activo (ácidos libres) así como de extractos de residuos de Ia molturación de aceituna enriquecidos en ácido oleanólico y ácido maslínico.

Las sales sódicas se obtuvieron por tratamientos básicos con MeONa en metanol o con disoluciones acuosas de NaOH siguiendo los procedimientos usuales de laboratorio.

Algunos de los resultados obtenidos por tratamientos tópicos se muestran en Ia tabla I:

TABLA

Resultado positivo significa disminución significativa de las molestias y aumento considerable de la flexibilidad de Ia articulación, dejando transcurrir entre 12 y 24 horas hasta el siguiente tratamiento tópico, Io que demuestra un efecto antiinflamatorio eficaz en Ia zona cartilaginosa. En algunos de los casos, Ia eliminación de síntomas ha sido permanente, Io que demuestra un proceso de regeneración condrocitaria. Es sorprendente que, en Io que a sintomatología se refiere se ha logrado en muchas ocasiones desde Ia primera aplicación.

De entre muchos más de un centenar de pacientes, se localizaron únicamente dos resultados catalogados como "negativos" que se evaluaron específicamente, el primero es una mujer de 60 años con un historial de más de 20 años de artrosis en rodillas y pies, al cabo de dos meses de tratamiento admitió una apreciable mejoría en las molestias de los pies. El segundo se trata de un hombre mayor de 85 años y con graves molestias de rodillas que no reconoció mejoría en el tratamiento.