Utilisation d'un produit de fermentation fongique comme complément alimentaire

DOMAINE DE L'INVENTION

L'invention se rapporte au domaine des compléments alimentaires pour le bétail, en particulier pour les ruminants. L'invention se rapporte plus spécifiquement au domaine des compléments alimentaires destinés à réduire la production de méthane par les ruminants.

ART ANTERIEUR

La production de méthane (CH ₄ ) et de dioxyde de carbone (C0 ₂ ) par les animaux résulte de la digestion des aliments que ces animaux ingèrent. La production de méthane et de dioxyde de carbone par les animaux est le résultat de la dégradation anaérobie, par les microorganismes présents dans le tube digestif, de la biomasse végétale qui a été ingérée. Les ruminants, en particulier les bovins, les ovins et les caprins et aussi les buffles, les cerfs et les chameaux, excrètent des quantités beaucoup plus grandes de ces gaz que les animaux monogastriques. A titre illustratif, il est estimé qu'une vache laitière produit en moyenne environ 90 kg de méthane par an, alors qu'un porc n'en produit qu'environ 1 kg par an. Chez les ruminants, le méthane produit est rejeté dans l'atmosphère essentiellement par la voie orale (95% du méthane produit) au cours d'éructations régulières et par les poumons après passage dans le sang. Une petite partie du méthane produit (5% du méthane produit) est rejetée par les flatulences.

Il a été considéré que le méthane qui est libéré dans l'atmosphère par les ruminants représente une perte d'environ 6 à 15 pour cents de l'énergie brute ingérée. Il a aussi été considéré que la production de méthane par les ruminants contribue de manière mesurable à accroître la concentration de ce gaz dans l'atmosphère. On rappelle que le méthane est actuellement considéré comme l'un des gaz contribuant à la génération d'un effet de serre susceptible de provoquer un réchauffement de la planète Terre. Du point de vue de la productivité des élevages aussi bien que du point de vue de l'écologie de la planète, il est donc apparu comme avantageux de rechercher des moyens de réduire la production de méthane par les ruminants d'élevage.

Certaines études avaient montré que l'augmentation du niveau de prise alimentaire et de la quantité d'aliments concentrés (p.ex. concentrés énergétiques) ajoutés à la ration alimentaire des ruminants avait pour effet de réduire la proportion d'énergie perdue sous forme de méthane. Toutefois, l'augmentation de la quantité d'aliments consommés entraîne nécessairement une élévation de l'émission totale de méthane par les animaux.

On a montré dans l'état de la technique que l'ajout aux aliments de certains antibiotiques ionophores, comme la monensine, provoquait une inhibition significative de la production de méthane dans le rumen (Sauer et al., 1998, J. Anim. Sci., Vol. 76 : 906-914). Toutefois, les micro-organismes méthanogènes ne sont pas directement affectés et il s'est avéré que la communauté microbienne présente dans le rumen était capable de développer une résistance aux antibiotiques ionophores, ce qui conduit, avec le temps, à une absence d'activité de ces antibiotiques sur la production de méthane par les ruminants ainsi traités (Rumpler et al., 1986, J. Anim. Sci., Vol. 62 : 1737-1741 ).

On a décrit également l'utilisation de composés de type anthraquinone afin d'inhiber la production de méthane, d'accroître la production d'acides gras volatils et d'augmenter l'efficacité d'utilisation des aliments (voir brevet n ° US 5,648,258).

On a aussi proposé d'utiliser des composés ionophores en combinaison avec des composés de quinones polycycliques (voir brevet n ° US 6,743,440).

On a aussi décrit l'utilisation de composés phthalides qui induisent un accroissement de la production de propionate et inhibent la production de méthane dans le rumen (voir brevet n ° US 4,333,923). On a aussi décrit l'utilisation de dérivés hétérocycliques du trichlorométhyle afin de réduire la production de méthane durant le métabolisme du rumen et accroître la production de propionate aux dépends de l'acétate, et ainsi améliorer la vitesse de croissance de l'animal (voir brevet n ° US 4,268,510).

On a aussi décrit l'utilisation d'inhibiteurs de la HMG-CoA réductase, telles que la mévastatine et la lovastatine, pour réduire la production de méthane dans le rumen. Ainsi, le brevet US 5,985,907 montre l'effet inhibiteur de la mévastatine sur la croissance des archaea méthanogènes. Egalement, les travaux de Miller et al. montrent l'effet inhibiteur de la lovastatine sur la croissance des bactéries méthanogènes (Miller et al., 2001 , J . Dairy Sci., Vol. 84 : 1445-1448). Ces auteurs estiment que ces inhibiteurs de la HMG-CoA réductase sont potentiellement utilisables comme additifs alimentaires pour accroître la productivité des animaux et pour réduire la production de méthane dans d'autres écosystèmes méthanogènes.

On a aussi proposé l'utilisation d'une bactériocine résistante aux protéases, qui a été isolée à partir de bactéries acido-lactiques (voir demande de brevet européen n ° EP 1 673 983).

On a également décrit l'utilisation d'acides organiques encapsulés, en particulier l'acide fumarique, afin de réduire la production de méthane chez les ruminants (voir demande PCT n ° WO 2006/040537).

On a aussi montré l'effet de l'ajout de matières grasses à la ration alimentaire des ruminants, qui provoque une réduction de la production de méthane. On a notamment montré que les acides gras alimentaires empêchent l'attachement des bactéries cellulolytiques, y compris les archaea méthanogènes, sur les particules d'aliment. Selon certaines études, les acides gras polyinsaturés pourraient également exercer un effet toxique directement sur les populations bactériennes et des archaea. Cette inhibition des populations bactériennes sont accompagnées d'un accroissement du pourcentage d'acide propionique dans le contenu du rumen et d'une réduction des émissions de méthane (Bauchart, 1981 , Bull. Tech. CRZV Theix, INRA, Vol. 46 : 45-55).

On a aussi exploré la possibilité de réaliser des prétraitements chimiques ou biologiques des aliments pour réduire la production de méthane lors de leur digestion par les ruminants. On a par exemple testé l'utilisation d'analogues halogénés du méthane pour le prétraitement chimique des aliments. On a aussi testé, comme prétraitement biologique des aliments, l'implantation de bactéries capables de réaliser l'acétogénèse réductrice aux dépens de la méthanogénèse. Toutefois, ces méthodes de prétraitement par implantation de bactéries engendrent des effets secondaires indésirables, tels qu'une réduction de la dégradation des fibres végétales, un risque d'adaptation des micro-organismes exogènes implantés, et la possibilité d'accumulation de résidus indésirables dans la viande, dans le lait ou dans l'environnement (Demeyer et al., 2000, Ann. Zootech., Vol. 41 : 37-38).

Il a été également décrit des compléments alimentaires destinés aux animaux et préparés à partir de cultures microbiennes.

La demande US20030194394 décrit la préparation de compléments alimentaires destinés aux animaux à partir de cultures microbiennes comprenant des composés hypocholestérolémiants. L'administration de ces compléments alimentaires au bétail permettrait la production de viandes et autres produits alimentaires présentant une teneur réduite en cholestérol. La demande US20030194394 décrit, entre autres, l'utilisation de cultures de Monascus purpureus et Monascus ruber obtenues à partir (i) d'un substrat constitué de glucose, d'agar et de pomme de terre ou (ii) d'un substrat constitué de glucose, de peptone et d'agar dans la préparation d'un complément alimentaire hypocholestérolémiant. La demande US20030194394 ne traite pas du problème relatif à la diminution de la production de méthane par les animaux.

La description qui précède illustre que des solutions très variées au problème de réduction de la production de méthane par les ruminants sont proposées dans l'état de la technique.

Toutefois, il existe toujours un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux moyens destinés à réduire la production de méthane par les ruminants. RESUME DE L'INVENTION

La présente invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus pour la fabrication d'une composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.

Dans certains modes de réalisation, le micro-organisme fongique appartenant au genre

Monascus est un micro-organisme fongique appartenant à l'espèce Monascus ruber.

L'invention est également relative à un procédé pour réduire la production de méthane chez les ruminants, caractérisé en ce que l'on fournit auxdits ruminants une quantité appropriée d'une composition de complément alimentaire telle que définie ci-dessus.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 illustre une courbe de la production de méthane in vivo par des moutons qui ont reçu une alimentation comprenant un complément alimentaire de l'invention pendant deux semaines. Les résultats sont exprimés en moyenne des valeurs obtenue pour un lot de six moutons. En ordonnées : production de méthane in vivo, exprimée en litres par jour et par animal. En abscisses : le temps, exprimé en jours. A : période précédant la fourniture de l'alimentation comprenant le complément alimentaire ; B : période pendant laquelle on fournit le complément alimentaire ; C : période suivant la fourniture du complément alimentaire. Les barres verticales représentent les valeurs d'écart-types.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'un produit de la fermentation d'un substrat par un micro-organisme du genre Monascus est capable, lorsqu'il est ajouté comme complément à la ration alimentaire d'un animal, en particulier d'un ruminant, de provoquer une réduction substantielle de la production de méthane par cet animal, en particulier par ce ruminant.

De manière tout aussi surprenante, on a montré selon l'invention qu'un produit de la fermentation d'un substrat organique par un micro-organisme du genre Monascus n'induit pas de changement significatif dans la production d'acétate, de propionate ni de butyrate par ledit animal, en particulier par ledit ruminant. On a aussi montré qu'un produit de la fermentation d'un substrat organique par un micro-organisme du genre Monascus n'induit pas de changement significatif dans la production d'acides gras volatils (AGVs).

Ainsi, le demandeur a montré qu'un produit de la fermentation d'un substrat organique par un micro-organisme du genre Monascus, lorsqu'il est administré à un animal, en particulier à un ruminant, en tant que supplément à sa ration alimentaire habituelle, permet de réduire la production de méthane par cet animal, sans affecter la capacité de cet animal à métaboliser normalement les aliments qu'il ingère.

La présente invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus pour la fabrication d'une composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants et autres herbivores avec une fermentation pré-gastrique, p. ex. les camelidae.

En d'autres termes, la présente invention concerne l'utilisation d'un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus, dans un complément alimentaire ou en tant que complément alimentaire, pour réduire la production de méthane chez les ruminants.

Les « ruminants » englobent: Addax, Alcelaphus, Alcelaphus buselaphus, Alcelaphus caama, Antilocapra americana, Antilope, Aurochs de Heck, Bœuf musqué, Bouc, Bouquetin, Capra, Capra aegagrus, Capra caucasica, Capra cylindricornis, Capra nubiana, Capra sibirica, Capra walie, Cervoidea, Chèvre, Chèvre Paon, Chèvre d'Appenzell, Chèvre du Toggenbourg, Chèvre à col noir du Valais, Daguet nain, Daguet rouge, Gazelle de Grant, Gazelle de Thomson, Gazelle de Waller, Gnou, Hippotrague noir, Hippotragus, Hippotragus equinus, Hippotragus leucophaeus, Markhor, Mazame nain gris Mouflon, Mouflon canadien, Mouflon de Dali, Mouflon méditerranéen, Mouton, Okapi, Oryx algazelle, Oryx d'Arabie, Oryx gazelle, Ovina, Ovis ammon, Ovis orientalis, Pecora, et Urial. Des ruminants préférés englobent les bovins, les ovins et les caprins.

Des bovins préférés englobent les veaux, les bœufs, les vaches de boucherie ainsi que les vaches laitières.

Des ovins préférés englobent les moutons et les brebis de boucherie ainsi que les brebis élevées pour leur lait.

Des caprins préférés englobent les boucs et les chèvres de boucherie ainsi que les chèvres élevées pour leur lait.

De manière générale, le micro-organisme fongique du genre Monascus est choisi parmi les espèces Monascus albidulus, Monascus argentinensis, Monascus aurantiacus, Monascus barkeri, Monascus bisporus, Monascus eremophilus, Monascus floridanus, Monascus fuliginosus, Monascus fumeus, Monascus kaoliang, Monascus lunisporas, Monascus mucoroides, Monascus olei, Monascus pallens, Monascus paxii, Monascus pilosus, Monascus pubigerus, Monascus purpureus, Monascus ruber, Monascus rubropunctatus, Monascus rutilus, Monascus sanguineus, Monascus serorubescens et Monascus vitreus.

De manière générale, le micro-organisme fongique du genre Monascus est choisi parmi les espèces Monascus bisporus, Monascus pilosus, Monascus ruber (=Monascus purpureus) (Samson, RA et al., Introduction to food and airborne fungi. 2004).

Dans certains modes de réalisation préférés, on utilise des Monascus appartenant à l'espèce Monascus ruber. Dans ces modes de réalisation, on utilise préférentiellement une souche de Monascus choisie dans le groupe constitué des souches AHU WDCM635 (AHU Culture Collection, Graduate School of Agriculture, Hokkaido University), CCFC WDCM150 (Canadian Collection of Fungal Cultures, Agriculture and Agri-Food Canada), DSMZ WDCM274 (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), IAM WDCM190 (IAM Culture Collection, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo), JCM WDCM567 (Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Center), MAFF WDCM637 (MAFF Genebank Project, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, National Institute of Agrobiological Sciences (NIAS)), UAMH WDCM73 (University of Alberta Microfungus Collection and Herbarium, University of Alberta), ATCC WDCM1 (American Type Culture Collection), CECT WDCM412 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Universidad de Valencia), DUM WDCM40 (Delhi University Mycological Herbarium, Department of Botany, University of Delhi), IFO WDCM191 (Institute for Fermentation, Osaka), KCTC WDCM597 (KCTC Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology), MUCL WDCM308 (Mycotheque de l'Université catholique de Louvain, Laboratoire de Mycologie Systématique et Appliquée, Université catholique de Louvain), UPSC WDCM603 (Uppsala University Culture Collection of Fungi, Botanical Muséum University of Uppsala), CBS WDCM133 (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast Collection), CGMCC WDCM550 (China General Microbiological Culture Collectio Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences), FRR WDCM18 (Food Science Australia, Ryde, CSIRO, Food Science Australia), IMI WDCM214 (CABI Genetic Resource Collection, CABI Bioscience UK Centre (Egham)), KUFC WDCM677 (Kasetsart University Fungus Collection, Department of Plant Pathology, Faculty of Agriculture, Kasetsart University), NCPF WDCM184 (National Collection of Pathogenic Fungi, PHLS Mycological Référence Laboratory, Central Pulbic Health Laboratories), URM WDCM604 (Universidade Fédéral de Pernambuco, Micoteca do Departmento de Micologia), CCF WDCM182 (Culture Collection of Fungi, Department of Botany, Faculty of Science, Charles University, Prague), DAR WDCM365 (Plant Pathology Herbarium, Orange Agricultural Institute), HUT WDCM195 (HUT Culture Collection, Department of Molecular Biotechnology, Graduate School of Advanced Sciences of Matter, Hiroshima University), IOC WDCM720 (Colecao de Culturas de Fungos do Instituto Oswaldo Cruz, Fundacao Oswaldo Cruz), LCP WDCM659 (Fungal Strain Collection, Laboratory of Cryptogamy, Muséum National d'Histoire Naturelle), OUT WDCM748 (Department of Biotechnology, Graduate School of Engineering, Osaka University), ou VTT WDCM139 (VTT Culture Collection, VTT Technical Research Centre of Finland).

Dans certains modes de réalisation préférés, on utilise des Monascus choisies parmi les espèces Monascus ruber et Monascus purpureus, comme décrit notamment dans les exemples. On peut par exemple utiliser la souche de Monascus ruber référencée DSM 62748 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, Allemagne).

L'homme du métier connaît des méthodes variées d'obtention d'un produit de fermentation d'un micro-organisme fongique du genre Monascus. Notamment, de nombreuses méthodes de fermentation de substrats organiques, y compris des substrats organiques solides et des substrats liquides, par des Monascus sont décrites depuis longtemps, y compris des méthodes de fermentation de Monascus qui ont été utilisées pour la fabrication de composés d'intérêt, y compris des pigments produits par Monascus.

Préférentiellement, on utilise un substrat comprenant principalement, essentiellement ou même exclusivement, des substances organiques.

Le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus peut être obtenu par culture de Monascus en milieu nutritif liquide, par exemple selon les techniques de culture submergée en milieu liquide bien connues de l'homme du métier.

Le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus peut être obtenu par culture de Monascus en milieu nutritif solide, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus peut être obtenu par culture de Monascus dans un système solide/liquide, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.

Dans certains modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat par

Monascus est obtenu par culture de Monascus sur du riz préalablement cuit à la vapeur, sur du pain, sur du son, sur des céréales ou sur des substances à base de céréales, y compris des aliments à base de céréales.

Dans certains modes de réalisation, ledit substrat peut consister en tout type de milieu nutritif adapté pour la culture de micro-organismes fongiques, bien connus de l'homme du métier. Dans d'autres modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par Monascus est obtenu par culture de Monascus dans un milieu nutritif contenant du maltitol, comme décrit dans la demande de brevet français n ° FR 2 505 856. La culture de Monascus dans un milieu nutritif contenant du maltitol peut être réalisée (i) en culture submergée en milieu liquide ou (ii) en culture en milieu solide.

Dans encore d'autres modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par Monascus est obtenu par culture de Monascus sur de la cellulose, y compris de la cellulose d'origine bactérienne, comme cela est décrit par exemple par Sheu et al. (2000, Journal of Food Science, Vol. 65(2) : 342-345).

Dans encore d'autres modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par Monascus peut être obtenu selon l'une quelconque des méthodes de culture de Monascus décrites dans les publications de Yuan-Kun et al. (1995, Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 79(5) : 516-518), Pastrana et al. (1996, Acta Biotechnologica, Vol. 16(4) : 315-319), Ahn et al. (2008, Biotechnology Progress, Vol. 22(1 ) : 338-340) ou encore Zhou et al. (2009, Vol. 228(6) : 895-901 ).

Comme indiqué ci-dessus, le Demandeur a montré qu'un substrat adapté à la préparation du produit de fermentation issu de Monascus peut être obtenu à partir de céréales, en particulier, de céréales appartenant au genre Triticum et au genre Oriza. Les substrats préparés à partir de ces sources végétales fournissent à la fois les composés nécessaires à la culture de Monascus et ceux nécessaires à la production par Monascus des métabolites permettant de limiter la production de méthane par les bactéries méthanogènes du liquide ruminai.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, le produit issu de la fermentation est obtenu par culture de Monascus sur un substrat solide préparé à partir d'un ou plusieurs produits choisis parmi le groupe constitué par les céréales appartenant au genre Triticum, les céréales appartenant au genre Oriza, et les produits dérivés desdites céréales.

Les céréales appartenant au genre Triticum, comprennent sans y être limitées, le blé dur (Triticum turgidum), le froment ( Triticum œstivum), le petit-épeautre ou engrain ( Triticum monococcum), l'épeautre (Triticum spelta) et le triticale (Triticum secale).

Les céréales appartenant au genre Oriza comprennent les différentes espèces de riz.

Toute partie de la plante céréalière peut être utilisée. Néanmoins on utilise de préférence les grains et les graines de céréales. Les graines et les grains peuvent être des graines entières, c'est-à-dire non décortiquées, ou des graines dont le son et éventuellement le germe ont été retirés. Les graines de céréales utilisées pour la préparation du substrat de fermentation peuvent provenir d'une seule espèce végétale ou constituer un mélange de graines provenant de plusieurs espèces végétales.

La préparation du substrat de fermentation comprend généralement une étape de stérilisation des grains et graines de céréales. Cette étape de stérilisation permet d'éliminer les espèces microbiennes présentes sur les céréales qui pourraient entraver le développement de Monascus. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, le substrat de fermentation est un substrat solide, stérilisé, préparé à partir de graines de céréales.

La préparation du substrat de fermentation peut comprendre plusieurs étapes se déroulant de préférence avant l'éventuelle étape de stérilisation.

Ainsi les graines de céréales peuvent être broyées ou concassées sommairement, macérées dans un liquide adapté tel que de l'eau et/ou précuites. Ces éventuelles étapes ont pour but de rendre les réserves nutritives des graines accessibles et sous une forme adaptée pour la fermentation par Monascus.

Le procédé de préparation du substrat de fermentation dépend des graines de céréales utilisées. A titre d'exemple, si le substrat est préparé à partir de graines entières telles que du blé complet, il est préférable de concasser de façon sommaire les graines. De par ses connaissances générales, l'homme du métier est capable de déterminer les procédés adaptés pour la préparation du substrat de fermentation.

Comme illustré dans les exemples de la présente description, le procédé de préparation du substrat de fermentation à partir de céréales comprend généralement une étape de macération dans un liquide adapté, de préférence de l'eau pendant plusieurs heures avant l'étape de stérilisation. Cette étape de macération permet d'ajuster la teneur en matière sèche à environ 50% à 60% en poids du poids total du substrat.

Le Demandeur a montré que l'ajout de son de céréales tel que le son de blé au substrat de fermentation peut favoriser la croissance de Monascus. Ainsi dans certains modes de réalisation, le produit issu de la fermentation d'un substrat par Monascus est obtenu par culture de Monascus sur un substrat préparé à partir de graines de céréales et de son, de préférence, de son de blé.

Dans ce mode de réalisation, le son de blé peut être rajouté au substrat avant ou après l'étape de stérilisation, et même simultanément à l'inoculation du substrat par Monascus.

De manière générale, lors de la préparation du substrat de fermentation, il est possible d'ajouter aux graines de céréales des composés nutritifs connus pour favoriser le développement de Monascus. Néanmoins, le Demandeur a montré que cet ajout de composés nutritifs n'est pas une condition nécessaire au développement de Monascus ni à la production de métabolites de fermentation capables d'agir sur la production de méthane par les bactéries méthanogènes du liquide ruminai.

Ainsi dans certains modes de réalisation, le substrat de fermentation est préparé à partir de graines de céréales, éventuellement additionnées de son, en l'absence de tout composé nutritif supplémentaire.

En d'autres termes, un substrat solide de fermentation pour la préparation du complément alimentaire selon l'invention ne comprend pas de composés nutritifs extrinsèques aux graines de céréales et au son.

On entend par composés nutritifs des composés connus pour constituer des sources de carbone ou d'azote et utilisés généralement pour la culture des levures et des moisissures. On peut citer à titre d'exemples de composés nutritifs les sucres tels que le sucrose, le glucose, le maltose, le maltitol, le sorbitol et le mannitol et les molécules organiques azotées tels que les acides aminés, les peptides et les peptones.

Dans certains modes de réalisation, le substrat de fermentation consiste en un substrat solide obtenu par concassage, macération puis stérilisation de grains de céréales appartenant au genre Triticum.

Le produit de fermentation de Monascus peut être incorporé sous différentes formes dans le complément alimentaire destiné à réduire la production de méthane chez les ruminants.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat est utilisé tel quel comme composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.

Dans d'autres modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat est utilisé tel quel, en combinaison avec un ou plusieurs autres composés alimentairement acceptables, comme un constituant inclus dans une composition de complément alimentaire ou d'une ration alimentaire destiné(e) à réduire la production de méthane chez les ruminants.

Dans encore d'autres modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat organique subit une ou plusieurs étapes d'extraction ou de raffinage, puis le produit extrait ou raffiné est utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres composés alimentairement acceptables, comme composition de complément alimentaire destinée à réduire la production de méthane chez les ruminants.

Ainsi dans certains modes de réalisation, le produit de la culture de Monascus sur un substrat organique est soumis à une ou plusieurs étapes d'extraction par des solvants, de préférence par des solvants organiques, puis l'extrait est séché afin de fournir une composition d'extrait sec qui est utilisable telle quelle en tant que complément alimentaire, ou bien ladite composition d'extrait est combinée à un ou plusieurs composés alimentairement acceptables pour obtenir ledit complément alimentaire.

Dans des modes de réalisation préférés, le produit de la culture de Monascus sur un substrat organique est soumis à une ou plusieurs étapes d'extraction par de l'éthanol, puis l'extrait éthanolique est séché afin de fournir une composition d'extrait sec qui est utilisable telle quelle en tant que complément alimentaire, ou bien ledit extrait éthanolique sec est combiné à un ou plusieurs composés alimentairement acceptables pour obtenir ledit complément alimentaire.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce que produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus consiste en un extrait d'un produit de fermentation de Monascus par un ou plusieurs solvants organiques.

Dans certains modes de réalisation, ledit extrait consiste en un extrait éthanolique. Un extrait éthanolique peut être obtenu à partir du substrat organique fermenté par un Monascus selon des techniques d'extraction éthanolique bien connues de l'homme du métier. On peut par exemple utiliser une solution d'éthanol ayant de 50% à 100% en poids d'éthanol, par rapport au poids total de la solution d'extraction. Ainsi, on peut utiliser une solution d'extraction ayant au moins 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% en poids d'éthanol, par rapport au poids total de la solution d'extraction.

Dans la pratique, un volume approprié de solution éthanolique d'extraction est ajouté au produit fermenté par Monascus et on homogénéise le mélange solide/liquide, par exemple par une étape d'exposition à une source d'ultrasons de puissance appropriée pendant une durée allant de 15 minutes à 2 heures, de préférence pendant une durée de deux heures. Puis, on sépare le liquide d'extraction des particules solides, par exemple par centrifugation, et on conserve le liquide d'extraction. On peut répéter l'extraction éthanolique sur le matériau solide issu de cette séparation. Ainsi, on réalise par exemple de 1 à 5 étape d'extraction éthanolique telle décrite ci-dessus, de préférence deux étapes d'extraction éthanolique, puis les fractions liquides d'extraction sont réunies, et de préférence filtrées afin d'éliminer les particules solides qui sont encore en suspension. Les extraits éthanoliques sont ensuite conservés, par exemple à 4 ^< C à l'abri de la lumière, ou bien l'éthanol est évaporé, par exemple à l'aide d'un dispositif de type Rotavapor®. Dans d'autres modes de réalisation, l'extrait éthanolique liquide est lyophilisé.

A titre illustratif, pour l'extraction éthanolique de riz fermenté par Monascus, 20 g de riz fermenté sont additionnés de 50 ml d'éthanol à 75% (v/v) fraîchement préparé. Après dilacération de la culture, l'extraction est réalisée aux ultrasons pendant 60 min. L'extraction est répétée une deuxième fois. Les 2 extraits sont ensuite filtrés et conservés à +4 ^< C à l'abri de la lumière en attente de son analyse.

De manière surprenante, on a montré dans les exemples qu'un produit de fermentation in vitro d'un substrat organique par au moins une souche de Monascus permettait de réduire significativement la production de méthane, par exemple de plus de 90 pour cents, alors que, dans les mêmes conditions, la monacoline K, qui a été décrite dans l'état de la technique comme inhibiteur de la production de méthane, n'induisait aucun effet de réduction de la production de méthane. Il en résulte que, dans un complément alimentaire utilisé selon l'invention, les effets du produit résultant de la fermentation de Monascus ne peuvent pas être attribués à la seule présence éventuelle de la monacoline K dans la composition.

Selon un aspect avantageux, on précise que les espèces de Monascus sont d'une grande innocuité pour l'homme et l'animal. Les champignons du genre Monascus sont utilisés en Chine depuis deux mille ans dans l'alimentation humaine et en médecine humaine. En particulier, les espèces de Monascus sont qualifiées « QPS » (c'est-à-dire « Qualified Presumption of Safety ») par l'Autorité Européenne de Sécurité des Aliments (EFSA). Egalement, les espèces de Monascus sont qualifiées « GRAS » (c'est-à-dire « Generally Recognized as Safe ») par l'Administration pour les Aliments et les Médicaments américaine (« FDA »).

On a montré dans les exemples qu'une réduction importante de la production de méthane est obtenue avec des produits de fermentation obtenus avec des souches de Monascus. On a montré dans les exemples qu'une réduction importante de la production de méthane est obtenue à la fois (i) avec des extraits obtenus à partir des produits de fermentation de Monascus et (ii) avec le produit de fermentation brut n'ayant subi aucun traitement ultérieur, par exemple un produit de fermentation de riz cuit à la vapeur n'ayant subi aucune opération ultérieure d'extraction.

On a aussi montré qu'une réduction générale de la production de gaz in vitro ainsi qu'une réduction de la production d'acides gras volatils (AGV) à la fois in vitro et in vivo sont obtenues avec un produit de fermentation d'un substrat par Monascus spp.

De plus, on a montré dans les exemples que la fourniture à des ruminants d'un complément alimentaire de l'invention à base d'un produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus provoque une réduction d'environ 30 pour cents de la production de méthane par ces ruminants. Cet effet de réduction significative de la production de méthane a été montré notamment en utilisant, comme complément alimentaire, le produit brut de fermentation de Monascus sur un substrat constitué de riz cuit à la vapeur.

Chez les ruminants ayant reçu un complément alimentaire conforme à l'invention, on a observé un accroissement de la production fermentaire de propionate dans le rumen, aux dépends de la production d'acétate.

On a aussi montré que, chez les animaux ayant reçu un complément alimentaire selon l'invention, on provoque une réduction importante du nombre d'Archaebactéries méthanogènes, sans observer simultanément de modification dans le nombre des autres organismes bactériens et des organismes protozoaires.

Il résulte donc des résultats des exemples qu'un complément alimentaire conforme à l'invention permet de réduire la production de méthane chez les animaux, y compris les ruminants, et de simultanément accroître la fermentation ruminale des aliments fournis à ces animaux.

Dans une composition de complément alimentaire utilisée selon l'invention, le produit issu de la fermentation d'un substrat organique par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus, par exemple un extrait éthanolique sec, est présent à raison de 0,1 % à 100% en poids, par rapport au poids de matière sèche de ladite composition. En conséquence, une composition de complément alimentaire utilisée selon l'invention comprend de 0% à 99,9% en poids d'un ou plusieurs composés alimentairement acceptables, par rapport au poids de matière sèche de ladite composition.

Par composé « alimentairement acceptable », on entend tout type de composé qui est admis par les réglementations administratives relatives aux aliments pour animaux, en particulier aux aliments destinés aux ruminants d'élevage, y compris les bovins, les ovins et les caprins.

Les composés alimentairement acceptables englobent les agents conservateurs alimentaires, les colorants alimentaires, les agents édulcorants, les agents exhausteurs de goût, les agents régulateurs de pH y compris les agents acidifiants, les agents anti-oxydants, les agents de texture.

Les composés alimentairement acceptables englobent les composés susceptibles d'être métabolisés par l'organisme, y compris des vitamines ou des composés précurseurs des vitamines, des composés hydrocarbonés tels que des sucres, des lipides, ainsi que des sels minéraux.

Les composés alimentairement acceptables englobent aussi des composés qui ne sont pas métabolisés par l'organisme, tels que des agents de charge, par exemple des polymères comestibles naturels ou synthétiques, y compris la gomme xanthane, des extraits d'algues.

Les composés alimentairement acceptables englobent les additifs alimentaires définis (i) par la directive 89/107/CEE de l'Union Européenne, du 18 septembre 1989 établissant les catégories dans son annexe et (ii) par la directive 95/2/CE concernant les additifs alimentaires autres que les colorants et les édulcorants. Les différentes catégories d'additifs alimentaires englobent les catégories suivantes : Acidifiant, Affermissant, Agent d'enrobage, Agent de charge, Agent de traitement de la farine, Amidon modifié, Agent moussant, Anti-agglomérant, Antimoussant , Antioxygène, Colorant, Conservateur, Correcteur d'acidité, Édulcorant, Émulsifiant, Enzyme, Épaississant, Exhausteur de goût, Gélifiant, Humectant, Poudre à lever (ou agent de levuration), Sel de fonte, Séquestrant, Stabilisant, Support.

La présente invention concerne aussi un procédé pour réduire la production de méthane chez les ruminants, caractérisé en ce que l'on fournit auxdits ruminants une quantité appropriée d'une composition de complément alimentaire telle que définie ci-dessus.

La présente invention est également relative à une composition de complément alimentaire pour réduire la production de méthane chez les ruminants, comprenant un produit issu de la fermentation d'un substrat par au moins un micro-organisme fongique appartenant au genre Monascus.

De manière générale, la composition de complément alimentaire ci-dessus est fournie au ruminant, sous la forme de prises successives et étalées dans le temps, par exemple selon des rythmes quotidiens, bi-hebdomadaires, hebdomadaires ou bien bi-mensuels.

De manière préférée, on fournit aux ruminants la quantité appropriée de composition de complément alimentaire ci-dessus selon une dose quotidienne.

Pour les ruminants qui sont nourris exclusivement au pâturage, on comprend que la composition de complément alimentaire est fournie séparément de leur alimentation principale.

Pour les ruminants qui sont nourris avec du fourrage frais ou du fourrage conservé (p. ex. du foin), ou bien avec des compositions d'aliments industrielles, y compris avec des concentrés alimentaires, la composition de complément alimentaire de l'invention peut être fournie (i) soit en mélange avec lesdits aliments, (ii) soit sous une forme séparée desdits aliments.

De manière générale, lorsque la composition de complément alimentaire telle que définie dans la présente description se présente sous la forme d'un extrait sec, par exemple sous la forme d'un extrait éthanolique sec, la quantité quotidienne apportée aux ruminants est d'environ 1 à 100 grammes de composition de complément alimentaire, par kilogramme d'aliment consommé (ou donné) par l'animal. Une quantité quotidienne d'au moins 1 gramme de ladite composition de complément alimentaire englobe une quantité d'au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 grammes de ladite composition de complément alimentaire. Une quantité d'au plus 100 grammes de ladite composition de complément alimentaire englobe une quantité d'au plus 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 , 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81 , 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71 , 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61 , 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51 grammes de ladite composition de complément alimentaire.

La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants.

EXEMPLES

Exemple 1 : Protocole de fabrication d'une composition de complément alimentaire (produit brut de fermentation de Monascus sur riz cuit à la vapeur)

Du riz incollable (par exemple du riz incollable commercialisé sous les marques Uncle Ben's® ou Lustucru®) est additionné d'eau de robinet, et laissé à macérer pendant une nuit à la température de +4 ^q C. Puis, l'excès d'eau est éliminé, par exemple par passage de la composition macérée solide/liquide à travers un tamis de taille de maille adaptée.

Le riz macéré est stérilisé, par passage dans une autoclavage à 121 °C pendant 15 min. Après refroidissement, jusqu'à température ambiante (20°C à 25°C), le riz macéré et stérilisé est inoculé avec un morceau de gélose d'une culture de Monascus ruber et l'ensemble est homogénéisé afin de bien répartir les spores de Monascus ruber dans l'ensemble de la masse du riz macéré et stérilisé.

Le mélange de riz et de Monascus ruber riz est ensuite incubé dans des conditions en aérobie à la température de 30 ^ et à l'obscurité pendant une durée de 2 à 3 semaines. Le mélange en cours de fermentation aérobie in vitro est agité quotidiennement durant les 3 premiers jours d'incubation.

Le mélange obtenu à la fin de la période de deux à trois semaines de fermentation aérobie peut être utilisé tel quel comme complément alimentaire, ou bien être séché préalablement à son utilisation.

Exemple 2 : Effets in vitro d'une composition de complément alimentaire sur la production de métabolites par des archaea méthanoqènes. A. Matériel et Méthodes

L'effet d'un extrait de riz fermenté par une souche sélectionnée de Monascus sp., préparé conformément à l'exemple 1 , sur la fermentation ruminale, en particulier sur la production de méthane, a été étudié in vitro en utilisant un système de fermentation séquentiel par lots. Trois moutons munis de canules du rumen, recevant une alimentation à base de foin deux fois par jour, ont été utilisés comme donneurs de contenu ruminai. Le contenu ruminai des trois animaux a été prélevé le matin avant le repas, filtré à travers un tissu avec une taille de maille de 400 μηι de diamètre pour obtenir la phase liquide, et mélangés en quantité égale. Soixante-quinze millilitres de ce liquide ruminai de mélange a été additionné de 300 ml de solution tampon anaérobique (Weller & Pilgrim, Br. J. Nutr. 32:341 -51 . 1974). Une fraction aliquote (5 ml) de cette solution liquide ruminai-tampon a été ensuite transféré dans des tubes de Hungate sous atmosphère de C0 ₂ contenant 100 ± 2 mg de foin de luzerne. Chaque tube a été additionné avec, respectivement : (i) 100 μΙ de l'extrait de Monascus, ou (ii) monacoline K pure, (iii) une solution d'éthanol à 25% (v/v) ou (iv) de l'eau (voir tableau 1 ci-dessous). Les tubes ont été incubés à 39 ⁰ C sous agitation pour 48 h. Chaque traitement a été faite en triple.

Tableau 1

Traitements Solutions

(100 μΙ/tube)

1 Extrait Monascus 1 mg/ml monacolin éq.

2 Monacoline K 1 mg/ml monacoline ¹¹

3 Témoin éthanol 25% d'éthanol

4 Témoin eau ddH ₂ O

^La concentration finale en monacoline K dans les tubes de fermentation est de 20 μg I ml

Après 48 h d'incubation, 2 ml de chacun des triplicat de chaque traitement ont été mélangés, et 1 ,5 ml de ce mélange utilisés pour inoculer 3 nouveaux tubes de Hungate contenant 3,5 ml de tampon, 100 mg de foin de luzerne.

Les tubes sont ensuite additionnés de 100 μΙ des différents traitements (Cf tableau 1 ci- dessus), et les tubes ont été à nouveau incubés à 39 °C sous agitation pendant une durée additionnelle de 48 h. Cette procédure a été répétée une seconde fois.

À la fin de chaque période de 48 h, la production de gaz, les concentrations en méthane et en acides gras volatiles issues de la fermentation ont été mesurées.

B. Résultats

Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2

Gaz Méthane totaux Acétate Propionate Butyrate

(ml) μπιοΙ (mmol.l ^"1 ) (mmol.l ^"1 ) (mmol.r ¹ )

1 ° transfert

Extrait Monascus 7 21 .5 ± 1.6 162.0+ 7.7 106.5+ 8.6 76.6+ 5.7 19.3+ 2.6 7.5+ 0.4 ^*

Monacoline K à 2C^g/ml 21.9+ 0.3 162.5+ 22.9 96.3+ 2.1 69.9+ 1 .5 16.7+ 0.4 6.1 + 0.1

Témoin éthanol 22.0+ 0.2 155.9+ 4.5 98.3+ 1.4 71.0+ 0.5 17.0+ 0.5 6.6+ 0.3

Témoin eau 27.1 + 0.1 132.0+ 23.3 90.0+ 1.2 60.3+ 0.8 18.5+ 0.3 6.6+ 0.1

2 " transfert

Extrait Monascus 7 16.8+ 0.4 ^* 24.6+ 37.0 77.8+ 5.5 48.3+ 3.6 23.3+ 1.1 5.0+ 0.7

Monacoline K à 2C^g/ml 17.8+ 0.5 16.2+ 17.0 76.5+ 7.4 49.1 + 3.8 19.7+ 2.8 5.9+ 0.7

Témoin éthanol 18.8+ 1 .7 57.8+ 48.6 86.3+ 17.2 58.9+ 12.3 19.1 + 3.3 6.1 + 1 .0

Témoin eau 19.9+ 0.0 79.3+ 4.0 95.0+ 1.1 60.8+ 1 .1 23.5+ 0.2 6.5+ 0.2

3 " transfert

10.4

Extrait Monascus 7 18.2+ 0.1 ^* 12.8+ 90.6+ 1.6 50.8+ 1 .0 ^* 32.1 + 0.5 ^* 5.4+ 0.2 ^*

Monacoline K à 2C^g/ml 19.2+ 0.4 59.1 + 9.4 95.1 + 1 1.5 57.3+ 6.9 28.5+ 3.5 6.6+ 1 .0

Témoin éthanol 20.3+ 0.3 90.2+ 3.1 101.1 + 2.9 64.9+ 2.4 25.7+ 0.5 6.9+ 0.1

Témoin eau 30.1 + 0.2 83.1 + 17.7 100.1 + 4.5 61.7+ 2.4 26.9+ 1.7 6.6+ 0.5

Exemple 3 : Evaluation in vitro d'un complément alimentaire selon l'invention préparé à partir d'un produit brut de fermentation de Monascus sur blé stérilisé

1. Préparation du complément alimentaire

Une composition alimentaire selon l'invention est préparée à partir d'un produit de fermentation de Monascus sur blé concassé, tamisé puis stérilisé à 120 °C pendant 30 min selon un protocole analogue à celui de l'exemple 1 .

L'étape de stérilisation permet d'éliminer les souches microbiennes présentes initialement dans le substrat qui pourraient entraver le développement de Monascus.

Après refroidissement, le blé stérilisé est inoculé avec du son de blé préalablement fermenté (30 °C durant 4 j) avec la même espèce de Monascus.

L'ensemble est homogénéisé afin de bien répartir les spores de Monascus dans l'ensemble de la masse du blé stérilisé.

Le mélange obtenu est ensuite incubé dans des conditions partielles d'anaérobie à la température de 30 ^ et à l'obscurité pendant une durée de 2 à 3 semaines. Le milieu de fermentation est agité quotidiennement durant les 3 premiers jours d'incubation.

Le mélange obtenu à la fin de la période de deux à trois semaines de fermentation peut être utilisé tel quel comme complément alimentaire, ou bien être séché préalablement à son utilisation.

2. Evaluation du complément alimentaire

L'effet in vitro du complément alimentaire obtenu par culture de Monascus sur la production de métabolites par les archaea méthanogènes a été évalué selon un protocole analogue à celui décrit dans l'exemple 2 (ajout de 10ΟμΙ d'extrait du milieu de fermentation de Monascus) à part que le temps d'incubation entre deux transferts est de 24 h et non 48 h. A titre de comparaison, deux expériences témoin ont été mises en œuvre : ^■ Expérience témoin 1 : ajout de 100 μΙ d'eau à la place de l'extrait du milieu de fermentation de Monascus

^■ Expérience témoin 2 : ajout de 100 μΙ d'un extrait d'un substrat « blé » qui n'a pas été en contact avec Monascus à la place de l'extrait du milieu de fermentation de Monascus

À la fin de chacune des périodes d'incubation de 24 h, la production de gaz et les concentrations en méthane ont été mesurées.

De manière remarquable, on observe aux temps +48h et +72h une diminution significative des quantités de méthane produites par incubation du liquide ruminai en présence du complément alimentaire selon l'invention par rapport aux expériences témoins. Plus précisément, les quantités de méthane produites en présence du complément alimentaire selon l'invention sont réduites d'un facteur 2 et d'un facteur 4, à +48 h et à +72h respectivement, par rapport aux expériences témoins. De manière remarquable, on n'observe pas de différence significative dans la production de méthane entre les deux expériences témoins ce qui confirme que la diminution des quantités de méthane observées pour le liquide ruminai incubé en présence du complément alimentaire résulte des métabolites formés par Monascus à partir du substrat à base de blé.

Exemple 4 : Effets in vivo d'une composition de complément alimentaire sur la production de métabolites par des ruminants.

A. Matériel et Méthodes

Un essai in vivo sur moutons a été réalisé pour valider l'intérêt de ce concept. Six moutons maies adultes de race Texel ont été adaptés pendant plusieurs semaines à un régime d'entretien composé de foin et de riz (1 :1 ). Les animaux, d'un poids corporel moyen de 63,5 ± 4 kg ont reçu 1 .2 kg d'aliment en matière sèche une fois par jour le matin. Chaque animal a reçu pendant 1 1 jours du riz fermenté produit dans notre laboratoire, avec un retour au régime initial pendant deux semaines.

La production de méthane a été mesurée quotidiennement avant et pendant le traitement, mais aussi 2 semaines après le traitement. La concentration des acides gras volatiles du contenu ruminai a été également analysée par chromatographie en phase gazeuse. Le suivi des archaea méthanogènes et des bactéries totales a été mesuré par les méthodes de PCR quantitative. Les protozoaires ont été dénombres par microscopie. B. Résultats

Les résultats sont présentés dans la Figure 1 et dans le Tableau 3 ci-dessous.

Les émissions journalières de méthane ont diminué en moyenne de 30% durant le traitement (P < 0.05) (Tableau 3 et Figure 1 ). Les fermentations ont été réorientées vers une proportion accrue du propionate aux dépens de l'acétate. Chez ces animaux, le traitement a entraîné une diminution significative du nombre des Archaea méthanogènes sans modification du nombre de bactéries et de protozoaires dans le rumen.

Tableau 3

Before Treatment Treatment Post-Treatment

w1 w2 w1 W2 SEM

Méthane (L/day) 59.3 a 41.8 c 43.4 c 56.3 ab 48.0 bc 3.85

Total VFA (μηΊθΙ/L) 73.4 b 61.8 c 75.3 b 94.4 a 89.6 a 3.84

Acétate (A, %) 70.7 b 59.8 c 63.6 b 66.0 a 67.4 a 3.84

Propionate (P, %) 12.6 b 17.9 ab 16.5 ab 15.7 a 15.6 ab 2.26

Butyrate (%) 13.1 16.5 15.7 13.8 12.9 1.32

Iso-acids (%) 2.5 b 3.1 b 2.0 b 3.0 a 2.5 b 0.27

A:P 5.8 a 3.5 b 4.0 b 4.6 ab 4.3 ab 0.38