PORTAMUESTRAS O UN RECIPIENTE DE CULTIVO CELULAR

DESCRIPCIÓN

La presente invención se refiere al uso de un material que comprende un recubrimiento capaz de reflejar total o parcialmente y de forma selectiva luz de longitudes de onda entre 350 nm y 800 nm, correspondientes a las regiones del espectro electromagnético del VIS, del IR y del UV, y un sustrato transparente a la luz VIS, para la fabricación de un cubreobjetos, un portamuestras o un recipiente de cultivo celular, particularmente un cubreobjetos, un portamuestras o un recipiente de cultivo celular que se utilizan en microscopía óptica.

Por tanto, la invención se podría encuadrar en el sector de las técnicas de análisis y caracterización de muestras, particularmente por microscopía óptica.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Normalmente, el enfoque automático de una imagen en microscopía óptica se realiza midiendo la luz reflejada sobre un portamuestras o cubreobjetos transparente, cuando se utiliza una luz IR como fuente de iluminación, donde la detección de la luz reflejada se realiza en paralelo al sistema de iluminación. El problema de escasa estabilidad/nitidez de la imagen enfocada automáticamente aparece, por ejemplo, cuando se utilizan objetivos de inmersión de aceite cuyo índice de refracción es similar al del cubreobjetos o el del portamuestras comúnmente un material de vidrio, cuarzo o un material plástico transparente y, por tanto, la luz que se refleja es pequeña.

En la bibliografía se pueden encontrar diferentes formas de mejorar la estabilidad/nitidez de la imagen enfocada automáticamente en un microscopio óptico.

Por ejemplo, US201003381 1 describe un sistema de autoenfoque del microscopio que corrige la imagen de una muestra a lo largo del camino óptico utilizando un divisor de haz. US2011017902 describe sistema de autoenfoque y su procedimiento de operación para alcanzar una mayor velocidad y una robustez en las medidas de muestras biológicas por microscopía. El sistema de autoenfoque del microscopio se basa en corregir las imágenes de las muestras a lo largo del camino óptico; la alta velocidad de medida del sistema de autoenfoque se alcanza realizando un patrón con luz sobre la muestra y midiendo, con un detector espacial, al menos dos patrones de reflexión de dicho patrón.

WO2013063096 describe un sistema de enfoque automático multifunción basado en enfocar la imagen de la muestra con la ayuda de un posicionamiento por reflexión y correcciones de astigmatismo y aberración cromática a lo largo del eje z, es decir, corregir las imágenes de las muestras a lo largo del camino óptico.

Dichos sistemas son complicados y costosos, por lo que es necesario desarrollar nuevos sistemas que ayuden a mejorar la estabilidad/nitidez de las imágenes obtenidas por microscopía óptica.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere ai uso de un material que comprende un recubrimiento capaz de reflejar total o parcialmente y de forma selectiva luz de longitudes de onda entre 350 nm y 800 nm, correspondientes a las regiones del espectro electromagnético del visible, del IR y del UV, y un sustrato transparente a la luz VIS, para la fabricación de un cubreobjetos, un portamuestras o un recipiente de cultivo celular, particularmente un cubreobjetos, un portamuestras o un recipiente de cultivo celular que se utilizan en microscopía óptica.

Como el cubreobjetos, portamuestras o recipiente de cultivo celular de la presente invención refleja total o parcialmente y de forma selectiva luz de longitudes de onda entre 350 y 800, correspondientes a las regiones del espectro electromagnético del visible, del IR y del UV, dicho recubrimiento puede reflejar la luz que emite el sistema de autoenfoque de un microscopio óptico, por lo que se corrige la estabilidad y nitidez de la imagen enfocada automáticamente mediante un sistema autoenfoque en un microscopio óptico. Cabe señalar que esta mejora de la nitidez, la estabilidad y la calidad de la imagen se obtiene también cuando se utilizan objetivos de aceite de inmersión.

El cubreobjetos de la presente invención refleja luz UV, es decir, bloquea el paso de la luz UV a su través. Este hecho le confiere una ventaja a la hora de analizar muestras biológicas que se deterioran bajo luz UV.

El uso de un material que además es capaz de transmitir la fluorescencia de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra de tejido humano, para la fabricación de un cubreobjetos, un porta muestras o un recipiente de cultivo celular tiene especial interés en microscopía óptica de fluorescencia.

Por tanto, el primer aspecto de la presente invención se refiere al uso (a partir de aquí el uso de la invención) de un material que comprende un sustrato y un recubrimiento caracterizado por que

» dicho sustrato es transparente a la luz visible,

® el índice de refracción del material de dicho recubrimiento es mayor que el índice de refracción del material de dicho sustrato,

® dicho recubrimiento está depositado sobre ai menos una cara del sustrato,

» dicho recubrimiento tiene un espesor inferior a 1 μπι, y

• dicho recubrimiento es capaz de reflejar total o parcialmente y de forma selectiva, luz de longitudes de onda entre 350 nm y 800 nm, correspondientes a las regiones del espectro electromagnético del visible, del IR y del UV, para la fabricación de un cubreobjetos, un porta muestras o un recipiente de cultivo celular.

En la presente invención se entiende por "recipiente de cultivo celular" como aquel recipiente en los que se puede preparar un cultivo celular. Ejemplos de dichos recipientes son una placa Petri, o una placa de pocilios múltiples. En una realización preferida de ¡a presente invención, el recubrimiento está depositado sobre ambas caras del sustrato. De este modo, si una cara se estropea o se ensucia, se podría utilizar la otra.

En otra realización preferida de ia invención, el recubrimiento es una lámina delgada de óxido de tantalio de espesor de entre 25 nm y 200 nm. Más preferiblemente, la lámina delgada de óxido de tantalio tiene un espesor de entre 75 nm y 125 nm. En ia presente invención se entiende por "sustrato transparente a la luz visible" como aquel sustrato formado por un material capaz de transmitir la luz correspondiente a un rango de longitudes de onda del espectro electromagnético de entre 350 nm y 800 nm.

En otra realización preferida, el soporte transparente se selecciona de entre un vidrio, cuarzo o una composición poiimérica y un copoiímero.

Ejemplos de polímeros transparentes susceptibles de ser utilizados como sustrato son polidimetilsiioxano (PD S), polimetiimetacriiato (PM A), hidroxi-etii-metacriiato (HE A) ó resina epoxi fotosensible negativa que comprende 8 grupos epoxi (SU8).

Ejemplos de copoiímeros transparentes susceptibles de ser utilizados como sustrato son copoiímeros basados en estireno y poiimetiipenteno (PMP).

En una realización preferida, el cubreobjetos, el portamuestras o el recipiente de cultivo celular se utilizan en microscopía óptica, por lo que el recipiente de cultivo celular debe tener el tamaño adecuado para poder situarse en la zona de visuaiización de un microscopio óptico.

En otra realización preferida, el cubreobjetos, el portamuestras o el recipiente de cultivo celular reflejan la luz del sistema de autoenfoque de un microscopio óptico y dicha luz del sistema de autoenfoque incide sobre ia superficie de dicho cubreobjetos, dicho portamuestras o dicho recipiente de cultivo celular, por la cara que comprende el recubrimiento. El ángulo de incidencia depende de la apertura numérica del objetivo. En ¡a presente invención, el cubreobjetos, el portamuestras o el recipiente de cultivo celular refleja la luz del sistema de autoenfoque de un microscopio óptico y dicha luz del sistema de autoenfoque incide a cualquier ángulo y con cualquier objetivo sobre la superficie de dicho cubreobjetos, dicho portamuestras o dicho recipiente de cultivo celular, por la cara que comprende el recubrimiento.

En la presente invención, se entiende por "enfocar automáticamente" al uso de un sistema de autoenfoque de un microscopio óptico que enfoca una imagen de un microscopio mediante la medida o detección de la reflexión de una luz incidente procedente de un sistema de iluminación sobre una placa que comprende a una muestra o una placa que cubre una muestra, donde la medida o detección de la luz reflejada se realiza en paralelo al sistema de iluminación.

El término "luz incidente del sistema de autoenfoque" se refiere a aquella luz que emite una luz LED o un sistema láser que forma parte de un sistema de enfoque automático de un microscopio óptico en el rango del espectro electromagnético correspondiente a unas longitudes de onda λ de entre 350 nm y 800 nm.

En la presente invención, concretamente en la interfaz entre el recubrimiento y el sustrato se produce un cambio de índice de refracción que también ofrece ventajas en sistemas de microscopía óptica, en concreto en microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (en inglés, Total infernal refiection fluorescence microscopy o TIRFM), en la microscopía de iluminación delgada inclinada (en inglés Highly inciined thin illumination o HILO), así como en técnicas de nanoscopía, es decir de microscopía de resolución nanométrica como el sistema por depleción del estado basa! (en inglés Ground state depletion and single-molecule return o GSDI ) o Depleción de emisión por estimulación (en inglés stimuiated emission depletion o STED).

El cambio en el índice de refracción que se produce en el interfaz entre el recubrimiento y el sustrato en la presente invención permite la optimización de la ruta lumínica en los microscopios TIRFM e HILO.

El cambio de índice de refracción que se produce en la interfaz entre el recubrimiento y el sustrato en la presente invención produce una mejora de la reflexión de la luz incidente que utilizan los microscopios de resolución nanométrica GSDi y STED resultando en una mayor resolución.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un material (a partir de aquí el material de la invención) que comprende un recubrimiento formado por una lámina delgada de óxido de tantalio de espesor de entre 25 nm y 200 nm y un sustrato transparente a la luz visible, donde el recubrimiento está depositado sobre ai menos una de las caras de dicho sustrato. En una realización preferida del material de la invención, el recubrimiento está depositado sobre ambas caras de dicho sustrato.

En otra realización preferida del material de la invención, la lámina delgada de óxido de tantalio del material de la invención tiene un espesor de entre 75 nm y 125 nm.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para ios expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS F¡G. 1. Ejemplo de rutina de autoenfoque y esquema de microscopio equipado con sistema de enfoque de luz infrarroja, (a) Ejemplo de rutina de autoenfoque y (b) Esquema ejemplo de microscopio equipado con sistema de enfoque por luz infrarroja.

F¡G. 2. Sección transversal de las muestras 1 a 5 obtenida por reflexión óptica en un microscopio confocal.

FIG. 3. Imágenes de reflexión de la luz con o sin el empleo del recubrimiento en objetivos secos y de inmersión. FIG, 4, Imágenes adquiridas con un objetivo de 20X de inmersión en aceite para 3 marcadores (azul verde y rojo) que emiten a lo largo del visible.

FIG. 5. Curva de transmisión de luz de un recubrimiento diseñado para reflejar la radiación ultravioleta

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por ios inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.

La FIG. 1a muestra un ejemplo de rutina de autoenfoque, donde el sistema de autoenfoque comprende ios siguientes elementos: (a) Situación del objetivo con la muestra enfocada

1 Plano de foco

2 Objetivo

3 Distancia del cubreobjetos al piano de foco (b) Perdida del piano de enfoque

1 Posición de foco (desenfocada)

2 Cubreobjetos

(c) Corrección de posición del objetivo y enfoque

1 Láser o Led de enfoque

2 Movimiento de objetivo

(d) Mecanismo de recuperación de enfoque

1 Muestra

2 Distancia del cubreobjetos ai piano de foco

La FIG. 1 b muestra un esquema ejemplo de microscopio equipado con sistema de enfoque por luz infrarroja que comprende ios siguientes elementos.

1 Medio de montaje 2 Muestra

3 ¡nterfaz entre muestra y cubreobjetos

4 Cubreobjetos

5 Medio de inmersión (aceite, agua o aire)

6 Objetivo

7 Sistema de autoenfoque

8 Luz infrarroja

9 Led o láser

10 Cámara ccd en línea

1 1 Cámara del Microscopio para toma de imagen

Las muestras están compuestas por placas de vidrio (portaobjetos) recubiertas con óxido de tantalio y cuyo índice de refracción está alrededor de 2 y es transparente en una amplia región del espectro visible. El recubrimiento es una película delgada depositada por pulverización catódica. Cada muestra tiene un espesor diferente.

Se han realizado 5 deposiciones sobre 5 placas de vidrio con 5 espesores diferentes, que son 100 nm (1), 75 nm (2), 50 nm (3), 25 nm (4) y 200 nm (5), para ilustrar el efecto del espesor del recubrimiento sobre la nitidez de la imagen observada por microscopía óptica.

Se han realizado medidas de transmisión óptica en un microscopio confocal de cada una de las muestras de 1 a 5 preparadas. Las imágenes 1 a 5 corresponden a ios espesores 100 nm, 75 nm, 50 nm, 25 nm y 200 nm, respectivamente. La imagen 0 corresponde a una placa de vidrio sin recubrimiento.

La FIG. 2 muestra a sección transversal de las muestras 1 a 5. La FIG. 2a corresponde al reflejo de la luz en 488 nm y la FIG. 2b en 833 nm en cada una de ¡as dos caras.

En las muestras de 1 a 5 se obtuvo una mejora del enfoque automático independientemente de la magnificación del objetivo utilizado con o sin aceite de inmersión. En general es deseable que la luz de color verde, típica de la fluorescencia, se refleje con poca intensidad, por lo que en este caso el mejor espesor del recubrimiento corresponde ai caso numero 1 (100 nm de espesor).

La FlG. 3 muestra imágenes de reflexión de la luz con o sin el empleo del recubrimiento en objetivos secos y de inmersión, en ambos casos se produce un aumento claro de dicha reflexión.

La FlG. 4 muestra imágenes adquiridas con un objetivo de 20X de inmersión en aceite para 3 marcadores (azul verde y rojo) que emiten a lo largo del visible. Se observa una mejora de la calidad de imagen gracias a la mejora de autoenfoque.

La FlG. 5 muestra la curva de transmisión de luz diseñado para reflejar la radiación ultravioleta. En la FlG. 5 se observa cómo se bloquea el paso de la luz ultravioleta.