L'invention concerne l'utilisation de ces microorganismes dans l'intestin pour diminuer le taux intestinal de cette TMA. L'invention a notamment pour objectif de permettre le traitement de la triméthylaminurie et/ou de diminuer le taux de triméthylamine N-oxyde (TMAO), ce qui permet de prévenir la formation des plaques d'athérome et de fournir un moyen supplémentaire pour la prévention des maladies cardio-vasculaires.

L'invention concerne aussi la délivrance in situ des enzymes permettant de métaboliser la TMA.

La triméthylaminurie (ou TMAU, urémie à TMA, ou syndrome de l'odeur du poisson pourri ou encore fish-odor syndrome) est une maladie génétique dans laquelle la personne déficiente génétiquement en une enzyme (mono-oxygénase à flavine 3 FM03) ne peut pas efficacement transformer la TMA en TMAO au niveau du foie. Dans certains cas également, la déficience en cette capacité de transformation est sporadique et acquise. La triméthylamine s'accumule alors dans l'organisme et est finalement éliminée par la sueur, l'urine et l'expiration, avec une forte odeur de poisson. Si aucune étude réelle ne montre l'incidence générale de la maladie, le chiffre de 1 % de la population américaine a été cependant avancé. Dans ce qui suit, on désignera une telle personne comme un patient déficient en métabolisme de la TMA.

La TMA intestinale a une origine alimentaire et résulte notamment de la conversion du TMAO, de la choline ou de la lécithine apportés par l'alimentation (notamment œuf, viande, foie, germe de blé, poisson, etc.). Ces composés sont transformés au niveau de l'intestin par le microbiote intestinal.

Par ailleurs chez les personnes possédant l'enzyme FM03 active, la TMA est transformée en TMAO dans le foie et ce métabolite se retrouve dans la circulation sanguine. Wang et al. (Nature 201 1 , 472(7341 ), 57-63 ; voir également K. Rak and D.J. Rader, Cardiovascular Disease, News and Views, Nature201 1 , 472, 40-41 ) enseignent que la TMAO circulante peut contribuer à un développement des plaques d'athérome dans les artères et donc aux maladies cardiaques. La vaginose bactérienne est une maladie bénigne chez la femme dont la cause est un déséquilibre de la flore microbienne vaginale. Ce déséquilibre proviendrait d'une déplétion de la flore lactobacillienne au profit de l'augmentation d'une flore anaérobie comprenant notamment Gardnerella vaginalis. La vaginose bactérienne est caractérisée par des pertes ou fluides vaginaux grisâtres et odorants. L'odeur de ces pertes ou fluides vaginaux est due à la présence de TMA (Wolrath et al. APMIS 2002, 1 10, 819-824 ; voir également Wolrath et al. APMIS 2005, 1 13, 513-516).

L'invention concerne également l'utilisation de ces microorganismes dans le vagin pour diminuer le taux de la TMA dans les fluides vaginaux. L'invention a notamment pour objectif de permettre le traitement des fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne ou de tout dérèglement ou maladie entraînant une production locale de TMA, ce qui permet de diminuer les fortes odeurs des pertes vaginales ou fluides vaginaux.

L'invention a également pour objet un nouveau microorganisme susceptible d'être utilisé dans ces applications.

Les Archaea méthanogènes sont des microorganismes qui produisent du méthane dans des conditions anaérobies. On retrouve certaines Archaea dans le système digestif d'animaux tels que les ruminants, ainsi que chez certains individus humains, en particulier les individus âgés.

Ainsi, l'équipe de B. Dridi (International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 2012, 62, 1902-1907) présente l'isolement d'un tel microorganisme dénommé Methanomassiliicoccus luminyensis dont il est décrit que sous une atmosphère avec H ₂ , cette Archaea peut réduire le méthanol en méthane. Il est également décrit que ce microorganisme est incapable de méthanogenèse à partir de la triméthylamine, ainsi que d'autres substrats, sous atmosphère de C0 ₂ . Le génome complet de cette Archaea a été publié et mentionné dans A. Gorlas, Journal of Bacteriology, Septembre 2012, Vol. 194, 17, p. 4745, le génome étant accessible dans GenBank sous les références d'accès CAJE01000001 à CAJE01000026.

A l'heure actuelle, il n'a pas été décrit, notamment chez l'homme, de microorganismes, notamment d'Archaea, capable d'utiliser et de métaboliser la TMA in vivo.

Les inventeurs ont réussi à identifier une nouvelle espèce d'Archaea méthanogène dans un échantillon de sels d'un individu humain, espèce comprenant un gène codant pour une TMA méthyltransférase (gène mttB) et un gène codant pour protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA (gène mttC), susceptibles, en présence d'hydrogène et en anaérobie, conditions rencontrées dans certains organes ou les cavités qu'ils délimitent, tels que l'intestin, le colon humain et le vagin, de métaboliser la TMA, de sorte qu'il est proposé ici d'utiliser ces microorganismes pour métaboliser la TMA pour en diminuer le taux, notamment intestinal ou vaginal. Il a en outre été découvert que cette souche d'Archaea présente également un gène de résistance aux sels biliaires, notamment un gène codant pour une hydrolyse des sels biliaires, favorisant ainsi la survie et le maintien du microorganisme au niveau intestinal. Ce microorganisme est dénommé ci-après souche 1 ou Methanomethylophilus alvus. Les inventeurs ont également identifié que la souche d'Archaea Methanomassiliicoccus luminyensis décrite par D. Didri et al. {supra), dénommée parfois ci-après souche 2, possède également les gènes codant pour une TMA méthyltransférase et pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA susceptibles de permettre le métabolisme du TMA en présence de l'hydrogène dans l'intestin. On pense que la TMA est métabolisée avec formation de protéines méthylées (protéines corrinoide méthylées) qui captent les méthyles de la TMA. Cette protéine méthylée est sans doute ensuite entraînée dans la voie de la méthanogénèse, aboutissant à la production de méthane.

Par définition, on parlera indifféremment ici d'un organe délimitant une cavité ou de la cavité elle-même, susceptible de contenir une flore microbienne anaérobie susceptible de produire ou produisant de la TMA. On peut aussi définir cette organe ou cavité comme un organe ou cavité contenant de la TMA produite par la flore microbienne. Cette production de TMA est généralement obtenue en présence d'une source d'hydrogène issue du métabolisme microbien.

L'invention a donc pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase. Le microorganisme est capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans un organe ou une cavité humaine selon la définition supra. La composition peut être utilisée comme médicament pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA au niveau de l'organe ou de la cavité humaine, et/ou traiter toute pathologie, désagrément ou dérèglement caractérisé par la présence de TMA ou dérivé de la présence de TMA.

Une composition selon l'invention contient un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans au moins une cavité humaine comprenant une flore microbienne susceptible de produire de la TMA, pour utilisation comme médicament pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA au niveau de la cavité humaine.

Selon un premier aspect, l'invention concerne une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour utilisation comme médicament pour diminuer ou supprimer la TMA au niveau intestinal et/ou dans le foie.

Plus précisément, dans un premier mode de réalisation, l'utilisation vise à traiter la triméthylaminurie. Le patient traité a un déficit en capacité à métaboliser la TMA. Notamment, il est déficient en enzyme FM03 active.

Dans un deuxième mode de réalisation, l'utilisation vise la diminution du taux du métabolite hépatique de la TMA, le TMAO, notamment du TMAO plasmatique. Cette utilisation peut viser la prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou la prévention des maladies cardiovasculaires. Le patient visé est soit un patient capable de métaboliser la TMA, soit un patient déficient en métabolisme de la TMA mais traité à l'aide d'un médicament permettant de rétablir un métabolisme de la TMA en TMAO. La métabolisation de la TMA, en amont, par exemple avec la composition selon l'invention, permet alors de limiter la production de TMAO par le foie.

L'utilisation de la composition selon l'invention chez un patient déficient en métabolisme de la TMA permet de combiner les deux effets, métabolisme de la TMA ou traitement de la triméthylaminurie et diminution de la TMAO plasmatique, prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou prévention des maladies cardiovasculaires.

L'invention a aussi pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour traiter la triméthylaminurie.

L'invention a donc aussi pour objet une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans l'intestin, pour utilisation comme médicament pour diminuer le taux de TMAO plasmatique, prévenir la formation de plaques d'athérome et/ou prévenir les maladies cardiovasculaires.

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une composition contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase, capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans le vagin, pour traiter, diminuer ou supprimer la TMA présente dans le vagin ou les fluides vaginaux.

En particulier, sans vouloir être lié à la théorie, on pense que la TMA présente dans le vagin ou les fluides vaginaux résulte de la conversion de composés, comprenant un groupement azoté substitué par trois méthyles, par la flore microbienne vaginale.

Dans un mode de réalisation, l'utilisation vise à traiter les fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne et diminuer ou supprimer les odeurs dues à la présence de TMA. Pour assurer la métabolisation de la TMA par les microorganismes selon l'invention, il est préférable que les méthyles de la TMA soient transférés à une autre molécule.

Dans un mode de réalisation, le microorganisme exprime également une protéine corrinoide susceptible de jouer ce rôle d'accepteur de méthyle. Cette protéine est en particulier une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1 ou 2, ou une séquence équivalente (d'une méthyltransférase active sur la TMA) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 1 ou 2.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 3 ou 4, ou une séquence équivalente (séquence codant pour une méthyltransférase active sur la TMA) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 3 ou 4.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5 ou 6, ou une séquence équivalente (d'une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle capable de capter les méthyles de la TMA en présence d'une méthyltransférase) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 5 ou 6.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7 ou 8, ou une séquence équivalente (séquence codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle capable de capter les méthyles de la TMA en présence d'une méthyltransférase) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 7 ou 8.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1 , ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra. Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 2, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 6, ou séquence équivalente telles que définie supra.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 4, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 8, ou séquence équivalente telles que définie supra.

Dans un mode de réalisation, le microorganisme comporte également un gène de résistance aux sels biliaires, de préférence un gène codant pour une hydrolase des sels biliaires, telle qu'une choloylglycine hydrolase.

Dans un mode de réalisation, la choloylglycine hydrolase a la séquence SEQ ID NO : 9, ou une séquence équivalente (d'une hydrolase active sur les sels biliaires) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 9. Dans un mode de réalisation, la choloylglycine hydrolase est codée par un gène ayant la séquence SEQ ID NO : 10, ou une séquence équivalente (séquence codant pour une hydrolase active sur les sels biliaires) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 10.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1 , ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase ayant la séquence SEQ ID NO : 9, ou séquence équivalente telles que définie supra.

Dans un mode de réalisation, la composition comprend un microorganisme comprenant le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 10, ou séquence équivalente telles que définie supra.

Suivant un mode de réalisation préféré, dans ces compositions, le microorganisme est une Archaea méthanogène, notamment d'origine humaine ou animale, de préférence humaine.

Dans un mode de réalisation, le microorganisme est une Archaea méthanogène dont TARN 16S est codé par la séquence ADN SEQ ID NO : 1 1 (souche 1 identifiée par les inventeurs) ou une séquence ayant plus de 85 %, notamment plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO 1 1. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1 , ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ayant la séquence SEQ ID NO : 9, ou séquence équivalente telles que définie supra. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 10, ou séquence équivalente telles que définie supra. Le génome de cette souche, dénommée ici Methanomethylophilus alvus, est présenté dans la SEQ ID NO : 13.

Dans un mode de réalisation, le microorganisme est une Archaea méthanogène dont l'ARN 16S est codé par la séquence ADN SEQ ID NO : 12 (souche 2 décrite par Dridi supra, souche DSM No. 25720 ; ou CSUR P135), ou une séquence ayant plus de 85%, de préférence plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO 12. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 2, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 6, ou séquence équivalente telles que définie supra. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 4, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 8, ou séquence équivalente telles que définie supra. Dans un mode de réalisation, la composition comprend la souche Methanomassiliicoccus luminyensis DSM No. 25720 , disponible auprès de la collection DSMZ (Inhoffenst^e 7B, 38124 Braunschweig, Allemagne).

Un moyen alternatif de diminution in situ de la TMA est l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés, en particulier des bactéries recombinées. Pour être efficientes, ces bactéries doivent à la fois exprimer un gène codant la protéine MttB (permettant la déméthylation du TMA) et la protéine MttC (protéine corrinoïde, acceptrice du groupement méthyle pris au TMA par MttB). L'expression d'une protéine MttB active nécessite que celle-ci présente une pyrrolysine en son sein. A cette fin, l'organisme recombiné doit également être (i) capable de synthétiser la pyrrolysine et (ii) d'incorporer cet acide aminé au cours de la traduction de la protéine recombinée MttB, ce qui est réalisable par l'incorporation d'une cassette dédiée d'expansion du code génétique. Ainsi, l'organisme génétiquement modifié contient:

- Le gène ou partie du gène mttC (par exemple SEQ ID NO :7 ou 8) codant une protéine corrinoïde (par exemple SEQ ID NO :5 ou 6).

Le gène ou partie du gène mttB (par exemple SEQ ID NO :3 ou 4), codant la protéine MttB (par exemple SEQ ID NO :1 ou 2). Ce gène ou partie de gène présente dans sa partie codante une interruption intermédiaire du cadre de lecture par un codon stop (idéalement un codon ambre UGA tel que le présente le cas naturel décrit ici chez les souches 1 et 2 (Methanomassiliicoccus luminyensis et "Ca. Methanomethylophilus alvus")

Les gènes permettant la synthèse de la pyrrolysine: ces gènes sont portés par l'opéron pyl, et concernent plus particulièrement les gènes pylB, pylC et pylD (mentionnés comme pylBCD) codant respectivement une lysine mutase / proline-2 méthylase, une pyrrolysine synthétase et une proline réductase/pyrrolysine synthase. Ces enzymes codées permettent la synthèse de pyrrolysine à partir de deux lysines.

Le gène codant un ARN de transfert suppresseur du codon stop utilisé (idéalement, un ARNt suppresseur du codon ambre UGA, c'est-à-dire un ARNt présentant l'anticodon TCA). Idéalement ce gène est celui d'un des microorganismes décrits (Methanomassiliicoccus luminyensis et "Ca. Methanomethylophilus alvus"), dénommé pylT.

Le gène codant une amino-acyl ARNt synthétase, permettant le greffage du bon acide aminé sur l'ARNt correspondant: dans ce cas, une Pyrrolysine ARNt synthétase doit être utilisée, codée par le gène pylS. Comme microorganisme, on peut utiliser Escherichia coli. La souche E. coli recombinée comprend les gènes mttB, mttC, pylBCD, pylT et pylS. La souche exprime ainsi les protéines nécessaires à la synthèse de Pyrrolysine. Cette pyrrolysine est greffée à un ARNt spécifique (ARNt ambre Pyl, codé par py/T) par l'action de la Pyrrolysine-ARNt synthétase. Un exemple de ce type d'organisme modifié a été décrit par ailleurs (Longstaff et al, 2007, PNAS 104 (3), pp 1021-1026: "a natural genetic code expansion cassette enables transmissible biosynthesis and genetic encoding of pyrrolysine" ; Namy et al., 2007, FEBS letters 581 (27), pp 5285-5288: "Adding pyrrolysine to the Escherichia coli genetic code") et une telle souche est viable: elle incorpore une pyrrolysine dans ces protéines dès lors que l'ARNm contient un codon stop ambre en phase de lecture.,)

Cet £. coli recombiné exprime également le gène mttB, interrompu en son sein par un codon stop ambre en phase de lecture (cas des gènes mttB archéen). Ce codon est ainsi reconnu par une telle souche recombinée comme un codon ambre-Pyl et permet l'obtention d'une protéine contenant en son sein une pyrrolysine, enzymatiquement active. Ce procédé mime ce que réalisent naturellement les microorganismes méthanogènes méthylotrophes tels que par exemple les Methanosarcinales. De plus, ce procédé s'est avéré effectif pour le gène mtmB1 de Methanosarcina acetivorans, contenant un codon interne ambre, codant une pyrrolysine: La protéine codée par mtmB1 (monomethylamine methyltransférase), exprimée dans une souche d'E. coli exprimant pylBCD, pylS, et pylT contient alors une pyrrolysine (Longstaff et al, op. cit.; Namy et al, op. cit.). Ce procédé est utilisable de la même manière pour MttB. Cette dernière, synthétisée sous forme contenant de la pyrrolysine, peut alors déméthyler la TMA en diméthylamine (DMA), par transfert de ce méthyle à une protéine acceptrice (protéine corrinoïde codée par mttC), diminuant ainsi la concentration de TMA.

Comme autre microorganisme, on peut utiliser un Lactobacillus. Des souches de

Lactobacillus peuvent être utilisés selon les mêmes principes que décrits pour £. coli, en utilisant des vecteurs et des techniques de transformation bactérienne propre à ces bactéries Gram positives (voir par exemple Berthier et al., 1996, Microbiology, 142, pp 1273-1279 ou Alegre et al., 2006, FEMS Microbiology Letters, 241 (1 ), pp 73-77). Dans ce cadre-là, on dispose d'un organisme génétiquement modifié dérivé directement d'hôtes naturels commensaux de l'intestin humain et du vagin, et pour certains d'entre eux, pouvant également présenter des activités initiales probiotiques.

Dans un mode de réalisation les microorganismes naturels ou recombinés de l'invention sont vivants.

Dans d'autres modes de réalisation, ils peuvent être tués ou inactivés. Les compositions selon l'invention peuvent comprendre en outre un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation, la composition est un extrait de culture, de préférence un extrait concentré. Notamment, un extrait concentré de microorganisme vivant est employé.

Dans un mode de réalisation, la composition ou un extrait servant de principe actif dans la composition comprend une population de microorganismes consistant essentiellement ou consistant exclusivement en microorganismes méthanogènes conformes à l'invention. La composition peut en comprendre une espèce ou une souche unique, ou bien en comprendre au moins deux espèces ou souches différentes.

Dans un autre mode de réalisation, la composition ou un extrait servant de principe actif dans la composition comprend une population de microorganismes comprenant au moins une espèce ou une souche de microorganisme méthanogène conforme à l'invention, et un ou plusieurs autres microorganismes, notamment venant de culture. La composition peut comprendre une espèce ou une souche unique de microorganisme méthanogène conforme à l'invention, ou bien en comprendre au moins deux espèces ou souches différentes.

Dans un mode de réalisation, les microorganismes sont lyophilisés. La lyophilisation est réalisée par une technique standard. La composition peut alors comprendre un excipient et/ou un stabilisant de lyophilisation standard, et tout autre additif utile.

L'invention concerne aussi un autre moyen alternatif de piéger et diminuer la concentration en TMA au site désiré, basé sur la délivrance in situ au moins de l'enzyme active MttB et de la protéine acceptrice du groupement méthyle MttC. Ceci peut reposer sur deux principes distincts :

D'une part, la purification de ces protéines à partir de microorganismes naturellement producteurs de MttB et MttC, tels que par exemple les archées méthanogènes de l'ordre des Méthanosarcinales ou des méthanogènes reliés aux Thermoplasmatales, telles que M. luminyensis ou Ca. M. alvus, cultivables in vitro. II peut également s'agir d'autres microorganismes de type bactérien codant naturellement la pyrrolysine, une MttB contenant une pyrrolysine et une MttC, cultivables in vitro: par exemple, les bactéries Acetohalobium arabaticum, Desulfitobacterium hafniense, D. dehalogenans ou Bilophila wadsworthia. Une liste de ces microorganismes connus à ce jour est référencée par Prat et al., 2012, PNAS, 109 (51 ), pp 1070-1075 et documents supplémentaires annexés à cette publication. D'autre part, la purification de ces protéines à partir de microorganismes recombinants. Cette production/purification peut aussi être facilitée par l'utilisation de systèmes de production et de sécrétion de protéines hétérologues. Ceci peut alors être effectué dans un microorganisme tel que ceux décrits ci-dessus (£. coli ou Lactobacillus), de manière à avoir une production conjointe de pyrrolysine, des systèmes permettant son incorporation au niveau de codons ambre et l'expression d'une protéine MttB contenant une pyrrolysine. Par ailleurs, la production de la protéine MttC peut être effectuée en parallèle dans un autre organisme.

Une solution combinée des 2, pour obtenir d'une part une protéine MttB active contenant de la pyrrolysine, et d'autre part la protéine corrinoïde MttC.

L'invention concerne donc une composition comprenant une TMA méthyltransférase, notamment une protéine MttB, de préférence une protéine MttB ayant la séquence SEQ ID NO : 1 ou 2 ou une séquence équivalente (d'une méthyltransférase active sur la TMA) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 1 ou 2.

L'invention concerne aussi une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5 ou 6, ou une séquence équivalente (d'une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle capable de capter les méthyles de la TMA en présence d'une méthyltransférase) ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO : 5 ou 6.

En variante, la même composition comprend ces deux protéines.

Toujours en variante, la composition est sous forme de kit comprenant les deux compositions, pour une administration séparée, simultanée ou décalée dans le temps.

Ces protéines obtenues peuvent donc être associées à un système galénique adéquat permettant selon la cible choisie, une délivrance intestinale (vecteurs permettant une gastro-résistance), rectale ou vaginale. Délivrées in situ, la protéine MttB active permet la conversion de la TMA en DMA par déméthylation d'un groupement, ce groupement méthyle pouvant alors être transféré à la protéine MttC. Ceci régénère la protéine MttB pour une autre déméthylation de TMA et aboutit à la diminution de la quantité de TMA.

Les compositions de l'invention se présentent sous une forme adaptée à la cavité ou à l'organe à traiter. Elles comprennent un véhicule ou excipient adapté et/ou sont associées ou incluses à une forme galénique adaptée à la voie d'administration. Dans un mode de réalisation, la composition se présente de préférence sous une forme d'administration par voie orale.

Pour l'intestin notamment, cette forme orale peut avantageusement comprendre une forme d'administration entérique, notamment une capsule entérique, une gélule entérique, un comprimé comportant un coating entérique, une encapsulation, e.g. microencapsulation, avec un matériau procurant une protection entérique, la combinaison d'au moins deux de ces moyens dont l'un au moins procure une protection entérique, etc. Le terme entérique signifie que la forme d'administration protège la composition jusqu'à ce qu'elle atteigne l'intestin. Par exemple, la composition, notamment le lyophilisât de microorganismes, peut être revêtu par coating à l'aide d'agents protecteurs, notamment choisis de manière usuelle parmi les protéines, polysaccharides, gommes, et autres agents de coating entériques. Dans un mode de réalisation, un double coating est réalisé suivant l'enseignement de EP 1 514 553.

La forme d'administration peut aussi être adaptée à une administration directe dans une cavité du corps telle que le vagin, par exemple sous forme d'ovules.

La forme d'administration peut aussi être adaptée à une administration par la voie rectale, par exemple suppositoire ou analogue.

Dans ce mode de réalisation, les compositions selon l'invention contiennent de 10 à 10 ¹³ microorganismes.

La présente invention a aussi pour objet une méthode de traitement destinée à diminuer la teneur en TMA chez un patient qui en a besoin.

L'invention a donc pour objet une méthode pour diminuer ou supprimer la TMA au niveau d'une cavité ou d'un organe humain, notamment au niveau intestinal, vaginal et/ou dans le foie, comprenant l'administration à un patient qui en a besoin, d'une quantité suffisante d'une composition selon l'invention, contenant un microorganisme exprimant une TMA méthyltransférase ou une telle enzyme. Ce microorganisme, par l'expression de l'enzyme, ou l'enzyme directement administrée est capable de métaboliser la triméthylamine (TMA) en présence d'hydrogène dans la cavité, notamment l'intestin ou le vagin. De préférence, le microorganisme exprime également une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ou encore on administre également cette protéine. De préférence encore, le microorganisme exprime également une hydrolase des sels biliaires, notamment une choloylglycine hydrolase. Dans un mode de réalisation, la composition comprend une Archaea méthanogène, notamment Methanomethylophilus alvus ou Methanomassiliicoccus luminyensis. Dans une premier mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de traitement de la triméthylaminurie. Le patient traité a un déficit en capacité à métaboliser la TMA. Notamment, il est déficient en enzyme FM03 active.

Dans un deuxième mode de réalisation, l'invention concerne une méthode permettant de diminuer le taux du métabolite hépatique de la TMA, le TMAO, notamment le TMAO plasmatique. Cette méthode peut viser la prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou la prévention des maladies cardiovasculaires. Le patient visé est soit un patient capable de métaboliser la TMA, soit un patient déficient en métabolisme de la TMA mais traité à l'aide d'un médicament permettant de rétablir un métabolisme de la TMA en TMAO, par exemple avec la composition selon l'invention. La métabolisation de la TMA, en amont, permet alors de limiter la production de TMAO par le foie.

La méthode appliquée chez un patient déficient en métabolisme de la TMA permet de combiner les deux effets, métabolisme de la TMA ou traitement de la triméthylaminurie, et diminution de la TMAO plasmatique, prévention de la formation de plaques d'athérome et/ou prévention des maladies cardiovasculaires.

Dans un troisième mode de réalisation, l'invention concerne une méthode de traitement des fluides vaginaux dans le cas d'une vaginose bactérienne. La méthode vise notamment à diminuer ou supprimer la TMA et/ou les odeurs associées à la présence de TMA.

Dans un mode de réalisation préféré les microorganismes sont vivants.

Dans un mode de réalisation, on administre au patient au moins une dose contenant une quantité suffisante de microorganismes ou d'enzyme pour obtenir l'effet recherché entre diminution du taux de TMA, diminution du taux de TMAO, ou encore combinaison des deux. Des doses supplémentaires peuvent être administrées de manière étalée dans le temps, notamment à intervalles de temps régulier, par exemple à chaque repas, pour maintenir l'effet recherché.

Dans un autre mode de réalisation dans lequel le microorganisme est forcément vivant, on administre au patient soit au moins une dose immédiatement efficace pour obtenir l'effet recherché entre diminution du taux de TMA, diminution du taux de TMAO, ou encore combinaison des deux, soit une dose d'ensemencement, le développement intra-intestinal ou intra-vaginal du microorganisme permettant ensuite d'obtenir l'effet recherché.

Dans un mode de réalisation, le microorganisme s'implante dans l'intestin sur le long terme. On peut alors envisager une ou plusieurs (e.g. de 1 à 5) doses initiales, par exemple prises au moment des repas, puis des compléments à intervalles de temps régulier, ou après des épisodes de dérangement intestinal (diarrhées ou autres). Dans un autre mode de réalisation, le microorganisme s'implante dans le vagin sur le long terme. On peut alors envisager une ou plusieurs (e.g. de 1 à 5) doses initiales, par exemple prises au lever et/ou au coucher, puis des compléments à intervalles de temps régulier, ou après des épisodes de pertes vaginales odorantes importantes

Dans un mode de réalisation, on associe l'administration de microorganismes selon l'invention et de l'enzyme et/ou de la protéine acceptrice.

Les compositions utilisées dans ces méthodes de traitement peuvent avoir les différentes caractéristiques développées supra.

La présente invention a aussi pour objet une culture contenant une Archaea méthanogène dont l'ARN 16S est codé par la séquence ADN SEQ ID NO : 1 1 (souche 1 identifiée par les inventeurs) ou une séquence ayant plus de 90% d'identité, notamment ayant 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'identité, avec la SEQ ID NO 1 1 . Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase ayant la séquence SEQ ID NO : 1 , ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ayant la séquence SEQ ID NO : 5, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ayant la séquence SEQ ID NO : 9, ou séquence équivalente telles que définie supra. Ce microorganisme comprend le gène codant pour une TMA méthyltransférase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 3, ou séquence équivalente telles que définie supra, le gène codant pour une protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 7, ou séquence équivalente telles que définie supra, et le gène codant pour une choloylglycine hydrolase, ce gène ayant la séquence SEQ ID NO : 10, ou séquence équivalente telles que définie supra. Le génome de cette souche, dénommée ici Methanomethylophilus alvus, est présenté dans la SEQ ID NO : 13.

La culture peut correspondre à un consortium de microorganismes, issu par exemple d'une mise en culture de selles de patient humain ou d'un animal, contenant entre autres Methanomethylophilus alvus, et de préférence, ce microorganisme représente plus de 10 %, de préférence plus de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % des microorganismes dans le consortium. Notamment, ce microorganisme représente dans le consortium, plus de 10 %, de préférence plus de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % des souches méthanogènes les plus fréquemment rencontrées chez l'homme (Methanobacteriales de type Methanobrevibacter smithii et Methanosphaera stadtmanae).

La culture peut aussi être une culture pure de Methanomethylophilus alvus.

La culture comprend un véhicule adapté. La culture est maintenue en conditions d'anaérobie. Liste des séquences

SEQ ID Acides aminés Nucléotides

NO :

1 TMA méthyltransférase souche 1

2 TMA méthyltransférase souche 2

3 Gène mttB codant pour la TMA méthyltransférase souche 1

4 Gène mttB codant pour la TMA méthyltransférase souche 2

5 protéine corrinoïde acceptrice de

groupement méthyle de TMA

souche 1

6 protéine corrinoïde acceptrice de

groupement méthyle de TMA

souche 2

7 Gène mttC codant pour la protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA souche 1

8 Gène mttC codant pour la protéine corrinoïde acceptrice de groupement méthyle de TMA souche 2

9 Hydrolase de sels biliaires souche 1

10 Gène codant pour hydrolase de sels biliaires souche 1

1 1 ADN codant pour l'ARN 16S souche 1

12 ADN codant pour l'ARN 16S souche 2

13 Génome souche 1

14 Amorce mttb Fw

15 Amorce mttb Rv

16-21 Amorces L'invention va être maintenant décrite plus en détail à l'aide d'exemples de mise en œuvre non limitatifs.

Exemple 1 : Méthode d'isolement et de culture d'une Archaea méthanogène consommatrice de TMA :

1.1. méthode de détection moléculaire :

Les méthodes de biologie moléculaire permettent de mettre en évidence et distinguer les Archaea méthanogènes consommatrices de TMA (appelées ici Methanomethylophilales) entre eux. Une première phase peut consister à mettre en évidence des Archaea méthanogènes à l'aide de l'ARN 16S en prenant les ARN 16S des souches 1 et 2 décrites supra, ou des ADN codant pour ces ARN16S, à l'aide des amorces appropriées. Une deuxième phase (ou première phase si la classification a déjà été réalisée) consiste à détecter la présence d'un gène mttb (ou mttB), et éventuellement, en plus, un gène mttc (ou mttC). Des amorces utilisables pour la détection du gène mttb sont les suivantes :

Fw: SEQ ID NO : 14 : GCACTTCCACCACATCG

Rv: SEQ ID NO : 15 : AGCTG RGACAG RACGAT

Où R correspond à une base purique, A ou G

Amplicon: 270-300 pb.

1.2. méthode de culture, d'enrichissement et d'isolement

La culture / l'isolement est initialement réalisé à partir de selles fraîches, provenant d'un humain : cet humain peut être une personne chez laquelle préalablement la présence de méthanogènes en général, et de Methanomethylophilales en particulier aura été mise en évidence avec les techniques de détection moléculaire citées ci-dessus (à partir d'ADN extraits de ces selles, selon les méthodologies standards= par le kit QIAGen DNA Stool Kit). Alternativement, la mise en évidence de la présence de Methanomethylophilales pourra être réalisée en parallèle de la mise en culture, selon cette même méthodologie.

Toutes les manipulations sont effectuées en conditions stériles et anaérobie stricte (flux de N ₂ ). Les selles, une fois récupérées sont traitées immédiatement. Sinon, alternativement, leur conservation peut être réalisée avant emploi, plusieurs heures à 4°C, en pot fermé, dans lequel une anaérobie a été instaurée, sans modification dramatique apparente sur les résultats et la survie des méthanogènes dans l'échantillon.

Environ 500 à 600 mg de selles sont récupérés à l'aide d'une seringue 1 ml insuline, dont l'extrémité est coupée (soit environ 0.4 ml). Ils sont placés dans 10 ml de milieu 141 DSMZ (Methanogenium médium) spécifique pour les microorganismes méthanogènes, en atmosphère H ₂ /C0 ₂ (80/20, pression de 2 atm.) ou en atmosphère N ₂ (100% initial, pression de 2 atm) en fiole antibiotique de 60 ml. Pour favoriser le développement des Methanomethylophilales, et ainsi enrichir la culture en consortium, on dispose en plus dans le tube :

• d'un substrat spécifique de ce groupe = méthanol (à 80 mM final),

• ou, alternativement, d'une de ses « sources » naturelles dans le colon humain, à savoir la pectine qui sera hydrolysée par d'autres microbes du consortium (et potentiellement les Methanomethylophilales) de manière à donner entre autres du méthanol.

• Divers antibiotiques tels que la bacitracine ou le metronidazole, (100 mg/L) ; Dridi et al {supra) ont proposé divers antibiotiques pour lesquels Methanomassiliicoccus luminyensis est résistant (bacitracine, metronidazole, ordinazole, squalamine)

Cette culture est ensuite réalisée à 37°C, sous agitation légère ; le suivi de la culture est assuré continuellement, par PCR quantitative, de préférence quotidiennement. Selon les types de souches de Methanomethylophilales, divers temps de doublement sont observés, et peuvent varier du simple au triple, voire davantage. A titre d'exemple, le cas de figure rencontré avec des selles d'un patient porteur de Methanomethylophilus alvus est illustré, depuis l'inoculation d'un échantillon de selles. Il s'agit d'un patient présentant 10 ⁶ nombre de copies de gènes 16S rRNA /ml de culture de Methanobrevibacter smithii (Mbs), 10 fois plus de M. alvus {Mx), et encore 10 fois plus de bactéries (selles au moment de la mise en culture, temps 0). Dans les premiers jours d'une culture en milieu standard, sans apport de pectine ou de méthanol, les Mbs et certaines bactéries se développent beaucoup plus vite et supplantent Mx, avant une stabilisation et un développement retardé de Mx, à des taux se rapprochant de la quantité initiale dans l'échantillon. Ce taux peut être amélioré en ajoutant du méthanol, ou même de la pectine, substrat générateur de méthanol, comme dans ce cas au jour 20 : on observe alors une nette amélioration de la proportion de Mx au cours du temps par rapport aux bactéries et à Mbs. Cette méthode peut être répétée : lors du suivi (de préférence quotidien), il est alors possible de déterminer le meilleur moment pour repiquer le consortium ou simplement re-supplémenter la culture en méthanol / pectine (par exemple sur une phase de plateau observée à partir du jour 20). Après un certain nombre de cycle d'enrichissement, on est en mesure de réaliser des isolements d'une souche de Mx à partir de ce mélange, par cultures individualisées d'un clone de ce milieu liquide en consortium. Ceci est effectué par la méthode des Roll-Tubes, méthode qui permet, en anaérobie, d'obtenir des colonies isolées en milieu solide DSMZ 141 + agar, en présence de méthanol (atmosphère anaérobie, contenant au moins de ΙΉ ₂ ). Dans cette culture en milieu solide, les premières colonies qui apparaissent (l ^ere semaine) ne sont pas les Mx recherchés. Les colonies, petites, qui apparaissent par la suite (notamment après 2 ou 3 semaines de culture), sont récupérées et servent à inoculer individuellement, colonie par colonie, des tubes de milieu DSMZ-141 . En parallèle, on détermine, par PCR quantitative, si la colonie repiquée est ou non un Mx. Dans le cas positif, l'isolement est alors réalisé, la culture repiquée selon la vitesse de croissance de Mx en milieu liquide 141 supplémenté avec du méthanol, sous atmosphère H ₂ /C0 ₂ . La pureté de la souche isolée peut alors être vérifiée, soit en reproduisant une seconde fois la méthode décrite ci-dessus (colonies isolées en milieu solide selon la technique des Roll-Tube), soit en analysant les courbes de dissociation obtenues sur les amplicons des -PCR quantitatives, soit encore en séquençant l'amplicon 16S.

1.3. Protocole de quantification rapide de lignées procarvotiques en culture Ce protocole sert au suivi en parallèle des Methanomethylophilales ou Mmp

(Mx=M. alvus, M. luminyensis, autres), des Methanobacteriales (Mbac, telles que Methanobrevibacter smithii ou Methanosphaera stadtmanae) et des bactéries totales (Bac) dans les cultures d'enrichissement afin de définir les meilleures conditions pour la croissance de M. alvus.

- Principe :

Lyse d'un petit aliquote (0,1 à 0,2 ml) de culture à haute température + choc osmotique

Réduction de la concentration des inhibiteurs de PCR par centrifugation et dilution du surnageant

Quantification des groupes d'intérêts en PCRq

Les gammes étalons de quantification sont préparées à l'avance, et consistent en des amplicons PCR, réalisés avec les amorces décrites, purifiées et quantifiées selon les méthodes classiques.

- Matériel :

Centrifugeuse (mettre à 4°C)

Thermomixeur (mettre à 99°C)

Thermocycleur

- Amorces Mmp, Mbac et Bac:

MxF (AS-05_Fw ; 77) : ggg g TA ggg g TA AAA TCC TG (SEQ ID NO : 16)

MxR (AS-06_Rv; 78) : Cgg ggT ATC TAA TCC CgT TT (SEQ ID NO : 17)

MbacF (MbS-01_Fw; 75) : gCg AAC Cgg ATT AgA TAC CC (SEQ ID NO : 18) MbacR (MbS-02_Rv; 76) : AgT CTT gCg ACC gTA CTT CC (SEQ ID NO : 19) BacF (ES-06_Fw; 71 ) : ACT CCT ACg ggA ggC Ag (SEQ I D NO : 20)

BacR (ES-07_Rv; 72) : gTA TTA CCg Cgg CTg CTg (SEQ ID NO : 21 )

Note : Les amorces MxF et MxR ciblent à la fois les Methanomethylophilales proches de M. alvus et celles proches de M. luminyensis. Il est possible de déterminer laquelle de ces lignées domine sur l'autre (ou s'il y a codominance), de manière qualitative, par l'observation des courbe de dissociations : les amplicons de M. alvus se dissocient autour de 84°C alors que ceux de M. luminyensis se dissocient autour de 85,5°C. Cette différence de température de dissociation n'a pas été clairement définie pour les Methanobacteriales.

- Composition du Mix :

Utilisation du kit Eurogentec MESA GREEN qPCR Master Mix

Mix Volume (μΙ)

Volume final 18

Master Mix

Amorce F 0,8

Amorce R 0,8

H ₂ 0 5,4

ADNg

Condition de a PCRq avec les amorces ci-dessus :

Premier segment :

95 °C pendant 10 min

Second segment :

95 °C pendant 30 sec

59 °C pendant 20 sec

72 °C pendant 30 sec

80 °C pendant 20 sec -> lecture de la fluo

Troisième segment (courbe de dissociation, défini par l'appareil):

95 °C pendant 1 min

59 °C pendant 30 sec

95 °C pendant 30 sec

Note : la lecture se fait à 80°C afin que l'ADN double brin aspécifique soit dénaturé (autour de 76 °C) avant la lecture.

- Extraction de l'ADN à la chaleur et préparation de la quantification par PCRq

- Transférer un peu plus de 100 μΙ de culture (avec une seringue 1 ml de type 23G, traversant le septum du tube de culture anaérobie) dans un tube Eppendorf

- Re-transférer 100 μΙ de ce prélèvement (avec une P100) dans un autre tube

- Centrifuger à 16000g ; 4°C ; 10 min ; ceci permet de culoter les cellules, et de se débarrasser d'inhibiteurs présents dans le milieu de culture

- Pendant la centrifugation, mettre 90 μΙ d'eau milliQ dans des Eppendorf de 1 ,5 ml - Remplacer le surnageant par 100 μΙ d'H ₂ 0 distillée ; permet d'enlever les ADN libres des cellules mortes, les inhibiteurs de PCR, de créer un choc osmotique qui facilite la lyse.

- Ajouter une pointe de spatule de billes de verre de 0,2 μηι, et vortexer 5 s - Placer dans le Thermomixeur ; 99°C sans agitation pendant 3min, avec agitation

1400 tr/min pendant 7 min, sans agitation pendant 10 min ; les cellules sont lysées par la chaleur

- Préparer le mix PCR en mélangeant l'eau et les amorces.

- Centrifuger à 16000g ; 4°C ; 10 min ; les débris cellulaires sont culotés et le contenu dissous des cellules, dont l'ADN, reste dans le surnageant.

- Ajouter le master mix dans le mix PCR, et commencer à le répartir sur la plaque.

- Reprendre 10 μΙ de surnageant dans un tube propre et l'ajouter aux 90 μΙ d'eau milliQ ;

- Placer les tubes dans la glace jusqu'à la quantification.

- A partir de l'appareil de PCRq, sur l'ordinateur, lancer le logiciel MxPro et choisir

« Sybr assay with dissociation curve » pour permettre le préchauffage de la lampe pendant la répartition des ADNg sur la plaque PCR.

- Répartir les échantillons d'ADNg sur la plaque.

- Vérifier que tous les puits sont bien fermés.

- Centrifuger la plaque à 500g max. pendant 5 s pour faire descendre les mix au fond des puits.

- Rentrer le programme PCR et le plan de plaque dans le logiciel.

Exemple 2 : Préparation d'une composition :

La culture finale obtenue à l'exemple 1.1 , contenant le microorganisme méthanogène de l'invention, est utilisée pour préparer une composition administrable. Elle est cependant de préférence utilisable comme stock, pour effectuer des cultures en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol, propager le microorganisme et préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Le milieu et les conditions de culture sont alors celles décrites précédemment (milieu DSM 141 , supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H ₂₎ . Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des gélules entériques.

Exemple 3 : Préparation d'une composition :

On réalise une culture de la souche DSM No. 25720, et les cultures sont utilisées pour préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Les cultures sont effectuées en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol (par exemple, milieu DSM 141 , supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H ₂ ). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des gélules entériques.

Exemple 4 : Préparation d'une composition :

On réalise une culture de la souche DSM No. 25720, et les cultures sont utilisées pour préparer des lots pour la fabrication de la composition selon l'invention. Les cultures sont effectuées en anaérobie et en présence d'hydrogène et d'un substrat contenant du méthanol (par exemple, milieu DSM 141 , supplémenté en méthanol, sous atmosphère anaérobie contenant du H ₂ ). Les cultures obtenues, sont éventuellement concentrées, et sont lyophilisées, avant d'être incorporées à des ovules. Ces ovules sont des formes d'administration adaptées à être placées dans le vagin.

Exemple 5 : Culture pure de Methanomassiliicoccus luminyensis en absence et en présence de TMA

- Composition du milieu de culture

Préalablement à la préparation de la composition du milieu de culture, trois solutions aqueuses comprises dans la composition du milieu de culture sont préparées. Ces trois solutions sont une solution aqueuse de vitamines, une solution aqueuse d'éléments traces et une solution aqueuse d'acides gras.

Composition de la solution aqueuse d'élément traces :

Tableau 1 : Composition de la solution aqueuse d'éléments traces La solution aqueuse d'éléments traces est préparée par mélange des composés avec les proportions indiquées dans le tableau 1 dans 1000 mL d'eau distillée à température ambiante et à pression atmosphérique.

Composition de la solution aqueuse de vitamines :

Tableau 2 : Composition de la solution aqueuse de vitamines

La solution aqueuse de vitamines est préparée par mélange des composés avec les proportions indiquées dans le tableau 2 dans 1000 mL d'eau distillée à température ambiante et à pression atmosphérique.

Composition de la solution aqueuse d'acides gras

Tableau 3 : Composition de la solution aqueuse d'acides gras

La solution aqueuse d'acides gras est préparée par mélange des composés avec les proportions indiquées dans le tableau 3 dans 1000 mL d'eau distillée à température ambiante et à pression atmosphérique. Composition du milieu de culture :

Tableau 4. Composition du milieu de culture

Préparation des tubes comprenant la composition du milieu de culture La composition du milieu de culture est portée à ébullition pendant 5 minutes, puis est ensuite refroidie sous atmosphère azotée (N ₂ ). Lorsque la température est inférieure à 50°C, 4g de bicarbonate de sodium (NaHC0 ₃ ) sont ajoutés par litre de composition du milieu de culture. La composition du milieu de culture ainsi obtenue est répartie dans des tubes de culture anaérobie de type « Hungate » ou « Balch » sous une atmosphère de N ₂ , puis ces tubes sont placés dans un autoclave pendant 20 minutes à 120°C.

La composition du milieu de culture comprise dans les tubes a un pH de 7,4.

Préparation des cultures pures de Methanomassiliicoccus luminvensis (M. luminyensis)

Trois séries de tubes présentant des différences dans la composition de leur phase gazeuse, en présence ou en l'absence de H ₂ et dans la composition du milieu de culture, en présence ou en l'absence d'hydrochlorure de triméthylammonium (TMA.HCI), sont dénommées A, B et C, et sont préparées de la manière suivante à partir des tubes comprenant la composition du milieu de culture initiale décrit ci-dessus.

0,1 mL d'une solution stérile de sulfure de sodium (Na ₂ S) à 15g/L (0,2 M) est ajouté à la composition du milieu de culture comprise dans les tubes des séries A, B et C, de telle manière qu'une concentration finale de 3,5 mM de Na ₂ S est obtenue dans chacun des tubes.

Une solution aqueuse anoxique et stérile de hydrochlorate de triméthylammonium (TMA-HCI) a également été ajoutée (0,2 mL à 1 M) dans chacun des tubes des séries A et B de telle manière qu'une concentration finale comprise entre 35 et 40 mM de TMA.HCI est obtenue dans chacun des tubes des séries A et B.

La préculture de la souche M. luminyensis B10 (DSM25270) est inoculée à raison de 10% du volume de la composition du milieu de culture comprise dans chacun des tubes.

L'atmosphère des tubes (contenant initialement uniquement du N ₂ ) est modifiée par ajout de C0 ₂ dans l'ensemble des tubes des série A, B et C et par ajout d'H ₂ dans l'ensemble des tubes des séries A et C afin d'obtenir les compositions gazeuses décrites dans le tableau 5.

Tableau 5. Compositions de l'atmosphère anaérobie

Les tubes de séries A, B et C sont incubés à 37°C, et un suivi de la culture de M. luminyensis est réalisé au cours du temps, ponctué par des prélèvements et dosages indiqués par une croix selon le programme décrit dans le tableau 6 ci-dessous.

5

Tableau 6. Programme de prélèvements et de dosages au cours du temps afin d'assurer le suivi de culture de M. luminyensis dans les tubes de séries A, B et C

Les mesures effectuées afin de suivre la culture de M. luminyensis dans les tubes 0 de séries A, B et C sont la mesure de la densité optique (D.O.) à une longueur d'onde de

600 nm, la mesure de la concentration de triméthylamine restante dans chaque tube, la mesure de la proportion de dihydrogène (H ₂ ) dans la phase gazeuse et la mesure de la proportion de méthane (CH ₄ ) dans la phase gazeuse.

La mesure de la proportion de dihydrogène (H ₂ ) est un indicateur d'une 5 consommation d'H ₂ lors de la production de méthane (CH ₄ ) à partir de la triméthylamine) et la mesure de la proportion de méthane (CH ₄ ) dans la phase gazeuse.

La mesure de la D.O. permet de quantifier par turbidimétrie la croissance cellulaire de M. luminyensis.

La mesure de la quantité de triméthylamine par M. luminyensis est effectuée selon la 0 méthode décrite par Kratzer et al (2009, Journal of Bacteriology, 191 (16), pp 5108-51 15, « Transcriptional Profiling of Methyltransferase Gènes during Growth of Methanosarcina mazei on Trimethylamine »), avec les modifications suivantes :

- 200 μί de culture sont prélevés dans chaque tube comprenant la culture et placés dans un tube stérile,

5 - le tube comprenant 200 μί de culture est centrifugé à 13000 g pendant 10 minutes, et 50 μΙ_ de surnageant sont prélevés de ce tube puis placés à nouveau dans un tube stérile,

- 783 μΙ_ d'eau distillée et 125 μΙ_ de bicarbonate de sodium (Na ₂ C0 ₃ ) à 20% (m/v) sont ajoutés dans le tube comprenant 50 μΙ_ de surnageant, Puis 42 μΙ_ de réactif de Fiolin-Ciocalteu sont ajoutés.

le tube ainsi obtenu est laissé sans agitation pendant 60 min, puis l'absorbance de la solution comprise dans ce tube est mesurée à 745 nm par rapport à une gamme étalon couvrant une concentration de 0 à 50 mM de TMA réalisée selon le même protocole.

La composition en gaz de l'atmosphère anaérobie dans laquelle sont placés les tubes de séries A, B et C est déterminée par chromatographie phase gazeuse, à partir d'un volume de gaz de 2 ml_ prélevé à travers le septum.

Une moyenne des valeurs mesurées pour la D.O., des quantités de triméthylamine et des quantités de H ₂ dans chaque tube au cours du temps selon les cultures de M. luminyensis comprises dans chaque série de tubes est indiquée dans le tableau 7 ci- dessous.

Temps de 0 24 48 72 104 149 173 197 247 295 388 prélèvements

en heure

Moyenne des 0 0 0,01 0,03 0,05 0,08 0,10 0,12 0,14 0 ,16 0,19 mesures de

la D.O. pour

la culture de

M

luminyensis

dans les

tubes de

série A

Moyenne des 0 0 0,01 0 0,01 0,01 0 0 0 0 0 mesures de

la D.O. pour

la culture de

M.

luminyensis

dans les

tubes de

série B

Moyenne des 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 mesures de

la D.O. pour

la culture de M.

luminyensis

dans les

tubes de

série C

Moyenne de X 39,9 X X X 24,0 X 22,6 X X 12,2 la

concentration

en mM de

TMA dans

les tubes de

série A

Moyenne de X 38,0 X X X 35,6 X 35,7 X X 34,2 la

concentration

en mM de

TMA dans

les tubes de

série B

Moyenne de X 0 X X X 0 X 0 X X 0 la

concentration

en mM de

TMA dans

les tubes de

série C

Moyenne du 0,02 X X 2,65 X 8,15 X X X X 20,49 pourcentage

de CH ₄

produit par la

culture de M

luminyensis

dans les

tubes de

série A

Moyenne du 0,03 X X 0,04 X 0,38 X X X X 0,33 pourcentage

de CH ₄

produit par la

culture de M

luminyensis

dans les

tubes de

série B

Moyenne du 0,03 X X 0,03 X 0,04 X X X X 0,03 pourcentage

de CH ₄

produit par la

culture de M

luminyensis

dans les

tubes de

série C Moyenne du 55,42 X X 50,14 X 44,02 X X X X 30,46 pourcentage

de H ₂ dans

les tubes de

série A

Moyenne du 0,10 X X 0,89 X 0,71 X X X X 0,67 pourcentage

de H ₂ dans

les tubes de

série B

Moyenne du 55,10 X X 55,20 X 54,20 X X X X 55,10 pourcentage

de H ₂ dans

les tubes de

série C

Tableau 7. Moyennes des valeurs de la D.O., des quantités de triméthylamine et des quantités de H ₂ mesurées dans les tubes de séries A, B et C au cours du temps pour les cultures de M. luminyensis comprises dans chacune des séries A, B et C de tubes

On observe une croissance de la culture de M. luminyensis, uniquement dans les tubes de série A apportant à la fois de la TMA, qui est utilisée par M. luminyensis et décroit au cours du temps, et de ΙΉ ₂ . Cette croissance de la culture de M. luminyensis passe par une production de méthane (CH ₄ ) dont la teneur augmente au cours du temps.