BARBRY PASCAL (FR)
WALDMANN RAINER (FR)
MARI BERNARD (FR)
CORAUX CHRISTELLE (FR)
MARCET BRICE (FR)
BARBRY PASCAL (FR)
WALDMANN RAINER (FR)
MARI BERNARD (FR)
CORAUX CHRISTELLE (FR)
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| REVENDICATIONS 1. Méthode de diagnostic in vitro de la capacité de conduire une ciliogénèse fonctionnelle d'un tissu épithélial cilié d'un sujet vertébré, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes : (i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN par les cellules dudit tissu épithélial cilié dudit sujet ; (ii) d'établissement du profil d'expression des miARN dudit tissu épithélial cilié dudit sujet ; (iii) de comparaison du profil d'expression des miARN dudit sujet avec le profil d'expression de miARN du tissu épithélial cilié, dans lequel le niveau d'expression est exprimé en niveau d'intensité d'expression en Iog2, d'un ou plusieurs autres sujets sains, figurant dans le Tableau I ci-après : (iv) d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'expression par ledit sujet diffère d'au moins un facteur 2, c'est-à-dire d'au moins une unité de Iog2, par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets sains ; et (v) de mise en évidence d'un défaut de la capacité d'un tissu épithélial cilié de conduire une ciliogénèse fonctionnelle relié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN dudit premier sujet si au moins un miARN dudit profil établi à l'étape (ii) présente un niveau d'expression qui diffère d'au moins un facteur 2, c'est-à-dire d'au moins une unité de Iog2 par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets sains. 2. miARN identifié par la méthode selon la revendication 1 choisi parmi hsa-miR-100, hsa-miR-106b, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-130a, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181a, hsa-miR-191 , hsa-miR-193b, hsa-miR-1975, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa- miR- 200c, hsa-miR-203, hsa-miR-205, hsa-miR-21 , hsa-miR-210, hsa-miR-22, hsa-miR- 224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b, hsa-miR-25, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR- 27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-29c, hsa-miR-30b, hsa-miR-30c, hsa-miR-30d, hsa-miR- 30e, hsa-miR-31 , hsa-miR-34a, hsa-miR-34b, hsa-miR-34c-5p, hsa-miR-365, hsa-miR- 374a, hsa-miR-378, hsa-miR-425, hsa-miR-429, hsa-miR-449a, hsa-miR-449b, hsa- miR-449c, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-92b, hsa-miR-939, hsa-miR-96, hsa-miR-99a, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f et hsa-let-7g de séquence SEQ ID N°1 à 6, 8 à 52, 157 à 162 et 201 (voir le tableau B ci-dessous), leur brin complémentaire « star » de séquence SEQ ID N°53 à 58, 60 à 104, 163 à 168 et 202, ou le brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N°105 à 110, 112 à 156, 169 à 174, 193 à 200 et 203 pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement de désordres liés à un dysfonctionnement des cils de tissu épithélial cilié. 3. miARN selon la revendication 2 pour son utilisation pour la prévention et/ou le traitement des ciliopathies primaires telles que la dyskinésie ciliaire primaire ou syndrome de Kartagener ; situs invertus ; l'infertilité masculine et féminine ; le syndrome d'Alstrom ; le syndrome de Bardet-Biedl ; le syndrome de Meckel-Gruber ; la polykystique des reins ; la dégénération rétinienne ; le syndrome de Senior-loken ou des ciliopathologies secondaires telles que : la mucoviscidose ; les broncho- broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BCPO) ; l'asthme ; la bronchiolite et les infections respiratoires d'origine virale. 4. miARN selon la revendication 2 ou 3, pour la prévention et/ou le traitement des pathologies impliquant un désordre de la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire. 5. miARN selon la revendication 4, caractérisée en ce que lesdites pathologies sont sélectionnées dans le groupe constitué par des maladies respiratoires chroniques et/ou héréditaires telles que les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BCPO), la mucoviscidose, l'asthme, la dyskinésie ciliaire primaire, les inflammations et infections chroniques des voies respiratoires et les insuffisances respiratoires. 6. miARN selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en que ledit miARN est sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR- 34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa- miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-449c (SEQ ID N°201), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR- 378 (SEQ ID NM3), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa-miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsa-miR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-31* (SEQ ID N°89), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-29a (SEQ ID N°31), hsa-miR- 193b (SEQ ID N°14), hsa-miR-210 (SEQ ID N°22) et hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), leur brin complémentaire « star » de séquence SEQ ID N°55 à 57, 63, 65 à 67, 71 à 74, 77, 78, 83, 84, 90 à 92, 95, 98, 100, 101 , 104 et 202, leur brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leurs précurseurs de SEQ ID N°107 à 109, 115, 117 à 119, 123 à 126, 129, 130, 135, 136, 141 à 144, 147, 151 à 153, 156 et 203. 7. miARN selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en que ledit miARN est sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR- 34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa- miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-449c (SEQ ID N°201), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR- 378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°107, 117, 119, 123, 130, 142 à 144, 147, 150, 151 , 153, 156 et 203 et/ou au moins un brin complémentaire « star » des miARN éventuellement modifié chimiquement choisis parmi hsa-miR-205, hsa-miR-31 , hsa-miR-21 , hsa-miR-17, hsa-miR-29a, hsa-miR- 193b, hsa-miR-31*, hsa-miR-210 hsa-miR-130a : hsa-miR-205* (SEQ ID N°72), hsa- miR-31 et hsa-miR-31* (SEQ ID N°37 et 89), hsa-miR-21* (SEQ ID N°73), hsa-miR-17* (SEQ ID N°63), hsa-miR-29a* (SEQ ID N°83), hsa-miR-193b* (SEQ ID N°66), hsa- miR-210* (SEQ ID N°74), hsa-miR-130a* (SEQ ID N°56) et leur précurseurs de séquence SEQ ID N0108, 115, 118, 124 à 126, 135 et 141. 8. miARN selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisée en ce que ledit miARN comporte en région 2-7 ou en région 3-8, une séquence de reconnaissance sélectionnée dans le groupe consitué par GGCAGUGA (SEQ ID N°175), AAUCACU (SEQ ID N°176) et AUCACUA (SEQ ID N°177). 9. miARN selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit miARN est sélectionné dans le groupe constitué par hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa- miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47) et hsa-miR-449c (SEQ ID N°201). 10. miARN sélectionné dans le groupe constitué parhsa-miR-125a- 5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), hsa-miR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa- miR-151-5p (SEQ ID N°8), hsa-miR-15a (SEQ ID N°9), hsa-miR-16 (SEQ ID N°10), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-181a (SEQ ID N°12), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-193b (SEQ ID N°14), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-200b (SEQ ID N°17), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-22 (SEQ ID N°23), hsa-miR-224 (SEQ ID N°24), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-25 (SEQ ID N°27), hsa-miR-26a (SEQ ID N°28), hsa-miR-26b (SEQ ID N°29), hsa-miR-27b (SEQ ID N°30), hsa-miR- 29a (SEQ ID N°31), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsa-miR-30b (SEQ ID N°33), hsa- miR-30c (SEQ ID N°34), hsa-miR-30d (SEQ ID N°35), hsa-miR-30e (SEQ ID N°36), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-365 (SEQ ID N°41 ), hsa-miR-374a (SEQ ID N°42), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-425 (SEQ ID N°44), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449c (SEQ ID N°201), hsa-miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa- miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-939 (SEQ ID N°50), hsa-miR-96 (SEQ ID N°51) et hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), leur brin complémentaire « star » de séquence SEQ ID N°55-57, 60, 61 , 63-67, 69, 71 , 72, 75-78, 80-84, 87-89, 91-96, 98-104 et 202, leur brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N0107-109, 112, 113, 115-119, 121 , 123, 124, 127-130, 132-136, 139-141 , 143-148, 150-156, 194, 195, 197 et 203 pour une utilisation comme médicament. |
La présente invention se rapporte au domaine de la régénération et de la différenciation des épithélia ciliés de vertébrés, notamment de mammifères, et en particulier d'hommes, conduisant à une ciliogénèse fonctionnelle et à l'implication de microARN dans le processus de régénération et de différenciation desdits épithélia ainsi qu'aux gènes modulés par lesdits microARN.
La présente invention se rapporte plus particulièrement à l'utilisation de microARN dans le traitement des maladies liées à un dysfonctionnement des cils des cellules épithéliales multiciliées, en particulier, les désordres résultant d'une ciliogénèse non fonctionnelle, telles que les maladies respiratoires chroniques pour lesquelles la régénération et/ou la différenciation de l'épithélium respiratoire est défectueuse.
Les cellules ciliées qui tapissent la surface apicale des épithélia sont essentielles pour divers processus physiologiques tels que le nettoyage des voies respiratoires, l'implantation de l'embryon ou encore la circulation du fluide céphalo- rachidien. Une ciliogénèse défectueuse provoque directement ou est associée à une grande variété de pathologies.
Le processus de ciliogénèse comporte une séquence d'événements qui débute par l'acquisition de l'identité de la cellule ciliée (phase 1). Cette première étape consiste en une inhibition latérale entre deux cellules adjacentes par le système de signalisation Notch via une interaction entre Notch et son ligand tel que delta-like 1 (DLL1). La cellule exprimant le ligand DLL1 devient une cellule progénitrice de cellules ciliées, simultanément, l'activation de Notch dans les cellules voisines empêche la transformation de ces cellules en cellules progénitrices de cellules ciliées. Les inventeurs ont montré que la cellule progénitrice de cellules ciliées exprime les microARN de la famille miR-449 et le facteur de transcription FOXJ1. Au cours d'une seconde phase, les miR-449 inhibent la division cellulaire et induisent la différenciation. La multiplication des centrioles débute dans la cellule progénitrice des cellules ciliées, cette multiplication est suivie l'ancrage des corps basaux aupôle apicale des cellules ; cette étape est suivie par l'assemblage de l'axonème et la synthèse des cils proprement dite.
Les épithéliua assurent une fonction de barrière entre le milieu interne et l'environnement extérieur. Les voies respiratoires sont tapissées par un épithélium pseudo-stratifié hautement différencié constitué de cellules basales, sécrétrices de mucus et ciliées (chaque cellule ciliée disposant de centaines de cils). Le battement coordonné de ces nombreux cils présents à la surface de cet épithélium permet l'élimination des déchets portés par le mucus au cours d'un processus appelé clairance mucociliaire. A ce titre, les cils jouent un rôle important dans les processus de défenses contre les infections de première ligne des voies aériennes (Puchelle et al. Proc Am Thorac Soc (2006) 3, 726-733).
L'exposition permanente de l'épithélium respiratoire à des stress environnementaux causés par des micro-organismes pathogènes, des allergènes, des molécules toxiques, etc.. conduit à des lésions tissulaires. A la suite de telles lésions, un processus physiologique de régénération de l'épithélium respiratoire se met en place. Ce processus, lorsqu'il aboutit, répare la lésion et restaure l'intégrité du tissu respiratoire, un tissu différencié et à nouveau fonctionnel se substituant à la lésion.
Cette régénération met en jeu plusieurs étapes :
1) les cellules épithéliales prolifèrent et/ou migrent afin de combler le lit de la blessure ;
2) ces premières étapes sont suivies par la mise en place d'une étape de polarisation cellulaire caractérisée par la formation de jonctions serrées et par un adressage différentiel et spécifique de protéines membranaires (canaux, transporteurs d'ions...) entre le pôle apical et le pôle basolatéral (Puchelle et al. 2006 ; Hajj, R. et al. J Pathol (2007) 211, 340-350) ;
3) un stade de différenciation terminale conduisant à la formation de cils à la surface des cellules ciliées (ciliogénèse) et à la présence de cellules sécrétrices responsables de la synthèse et de la sécrétion de mucus.
Un épithélium pseudostratifié mucociliaire se substitue ainsi à la lésion, reconstituant un tissu cilié fonctionnel disposant de propriétés identiques à celles du tissu initial.
L'ensemble de ces phénomènes biologiques est associé à des mécanismes de transduction de signaux et à des profils d'expression géniques particuliers. Parmi certains acteurs connus et impliqués dans la différenciation et la ciliogénèse de l'épithélium respiratoire, le facteur de transcription Foxji est l'un des mieux documentés (Yu, X. et al. (2008) Nat Genêt 40, 1445-1453). Foxji agit à une phase tardive de la ciliogénèse, jouant un rôle dans l'ancrage des corps basaux (petits organites d'organisation structurale voisine des centrioles indispensables à la formation de la base des cils) à la membrane apicale durant la formation de l'axonème (Gomperts, B.N. et al. (2004) J CeII Sci 117, 1329-1337 (2004).
Dans certaines maladies respiratoires chroniques telles que les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BPCO), la mucoviscidose, l'asthme ou encore la dyskinésie ciliaire primaire (DCP), des inflammations et infections chroniques aboutissent à une destruction du tissu respiratoire (Marshall, W.F. (2008) J CeII Biol 180, 17-21). Pour des raisons encore mal élucidées, ces maladies sont associées à des défauts de régénération et de différenciation épithéliale. Ces défauts aboutissent à une restructuration anormale du tissu, à une fibrose et à une perte fonctionnelle irréversible (Marshall, W.F., 2008). De nos jours, aucun traitement curatif pour ces différentes maladies n'a été trouvé, et seuls des traitements symptomatiques permettent de lutter avec plus ou moins d'efficacité contre la destruction évolutive du tissu respiratoire. Dans cette perspective, l'élucidation des mécanismes conduisant à la formation de cils fonctionnels (ciliogénèse) représente un enjeu majeur avec des retombées thérapeutiques évidentes.
La différenciation cellulaire implique des régulations temporelles et spaciales fines de la transcription et de la traduction gouvernant l'expression de gènes spécifiques. Ces événements sont contrôlés par divers signaux moléculaires et mécaniques. La compréhension des mécanismes physiologiques sous-jacents qui président la mise en place de la différenciation et de la ciliogénèse est donc un prélude indispensable à l'élaboration d'approches thérapeutiques plus spécifiques et plus efficaces.
Les microARN (miARN), petits ARN non-codants d'environ 22 bases découverts en 1993 et dotés de propriétés régulatrices, jouent un rôle clé dans la régulation des phénomènes cellulaires tels que la survie, l'apoptose, la prolifération, l'homéostasie ou la différenciation (Lu, Y. et al. (2007) Dev Biol 310, 442-453).
Leurs mécanismes d'action impliquent la formation d'un complexe entre plusieurs bases du miARN et la partie 3'-non codante de l'ARNm cible. Cette interaction induirait une déstabilisation de l'ARNm cible et/ou une inhibition de la synthèse protéique. La reconnaissance entre un miARN et sa cible est principalement contrôlée par une séquence d'environ 7 bases, située dans la partie 5' du miARN (ci- après séquence de reconnaissance ou seed). De ce fait, chaque miARN aurait la capacité de réguler la stabilité d'un large spectre d'ARNm distincts.
Plus de 750 miARN ont été caractérisés à ce jour chez l'homme où ils réguleraient plus de 30% des transcrits. La régulation par les miARN apparaît donc comme une régulation majeure de l'expression génique dont l'impact a été jusqu'à présent sous-estimé (Berezikov, E. et al. (2005) CeII 120, 21-24; Xie, X. et al. (2005) Nature 434, 338-345).
Les miARN sont transcrits dans le noyau sous forme de longs précurseurs. Ils subissent une première maturation dans le noyau pour donner un précurseur de miARN (pré-miARN) possédant une structure en épingle à cheveux de plus petite taille. Ce précurseur est exporté du noyau vers le cytoplasme où il va subir une dernière maturation. Une dégradation de sa boucle par l'enzyme Dicer génère deux miARN simple brin (un brin 5p et un brin 3p) ; le brin dit mature est pris en charge par un complexe multi-protéique (le complexe RISC, RNA induced silencing complex) qui interagit avec la partie 3'-non-codante des ARNm cibles, tandis que le brin complémentaire dit « star » va subir une dégradation ; le brin complémentaire d'un miARN miR-xy, miR-xy-z ou let-7x est annoté, respectivement, miR-xy * , miR-xy-z * ou let-7x*.
Des études ont récemment montré l'importance jouée par les microARN chez la souris dans les mécanismes de différenciation et de morphogénèse ; en particulier dans le développement embryonnaire et la prolifération des précurseurs des cellules épithéliales de l'épiderme (Lena, A.M. et al. (2008) CeII Death Differ 15, 1187-1195; Yi, R. et al. (2008) Nature 452, 225-229) ou bien encore le développement pulmonaire (Lu, Y. et al. (2007) Dev Biol 310, 442-453 (2007); Harris, K.S. et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2208-2213; Lu, Y. et al. (2008) Proc Am Thorac Soc 5, 300-304). Plus précisément, Lena et al. ont démontré l'implication des miARN du locus miR-17-92 dans la morphogénèse pulmonaire chez la souris. Bien qu'il y ait des preuves de l'implication des miARN au cours de la morphogénèse pulmonaire chez la souris, leur(s) rôle(s) précis et leur(s) mécanismes d'action demeurent encore inexplorés.
Enfin, plusieurs études suggèrent un rôle particulier de certains miARN dans des pathologies telles que les cancers, l'hypertrophie cardiaque, le diabète ou certaines infections virales (Triboulet, R. et al. (2007) Science 315, 1579-1582 ; CaNn, G.A. & Croce, CM. (2006) Nat Rev Cancer 6, 857-866 ; Grassmann, R. & Jeang, K.T. (2008) Biochim Biophys Acta 1779, 706-711 ; Latronico, M.V., (2008) Physiol Genomics 34, 239-242; Poy, M. N. et al. (2004) Nature 432, 226-230).
Aucune étude n'a, à ce jour, montré le rôle ou l'implication des miARN dans la régénération et la différenciation des épithélia ciliés, tel que l'épithélium respiratoire, et le contrôle de la ciliogénèse des vertébrés.
C'est donc pour la première fois que les Inventeurs ont mis en évidence l'implication de certains miARN dans le contrôle de la ciliogénèse de tissus épithéliaux de vertébrés et, en particulier, dans la régénération et la différenciation de cellules épithéliales respiratoires humaines en un épithélium de surface mucociliaire.
Les Inventeurs ont plus particulièrement utilisés différentes approches expérimentales conjuguant le séquençage à haut-débit des miARN, les biopuces miARN ainsi que la RT-PCR quantitative et identifié les miARN intervenant spécifiquement à différents stades de la différenciation de l'épithélium respiratoire humain et des cellules épidermiques ciliées des embryons de grenouille Xenopus laevis, à savoir des signatures des miARN spécifiques 1) de l'étape de prolifération, 2) de la polarisation cellulaire et 3) de la différenciation terminale et de la ciliogénèse. Ils ont également confirmé le rôle des miARN ainsi identifiés dans le contrôle de la ciliogénèse de tissus épithéliaux notamment via la répression du ligand DLL1 de Notch.
Ils ont ainsi montré que le rôle des microARN mis en évidence sur la régénération et la ciliogénèse d'un tissu épithélial respiratoire humain était extrapolable au mécanisme de ciliogénèse de tout tissu épithélial multicilié chez les vertébrés.
Il a ainsi été mis en évidence que 63 miARN sont exprimés ou réprimés et/ou présents en quantité significative dans le tissu épithélial respiratoire sain au cours de la régénération et de la différenciation (voir les Tableaux III, IV, V et Vl). La constatation d'une variation de l'expression d'un ou plusieurs miARN chez un individu malade par rapport à un individu sain est un indicateur d'un défaut de régulation de l'expression d'un ou plusieurs gènes ; cette variation pourra donc être compensée en administrant le ou les miARN sous-exprimés et/ou en administrant les antagomirs du ou des miARN sur-exprimés.
La présente invention trouve ainsi des applications pour l'évaluation de la capacité de régénération et de la différenciation, et ainsi de conduire une ciliogénèse fonctionnelle, du tissu épithélial cilié d'un sujet ; l'invention permet également l'évaluation de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire dudit sujet ; la méthode selon l'invention trouve également un intérêt particulier dans le domaine du diagnostic in vitro et in vivo. La présente invention se rapporte ainsi à une méthode d'évaluation de la capacité d'un tissu épithélial cilié de conduire une ciliogénèse fonctionnelle chez un sujet vertébré, notamment mammifère et, de préférence, humain, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes :
(i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN du tissu épithélial cilié dudit sujet ;
(ii) d'établissement du profil d'expression des miARN du tissu épithélial cilié dudit sujet ;
(iii) de comparaison du profil d'expression des miARN dudit sujet avec le profil d'expression de miARN du tissu épithélial cilié sain d'un ou plusieurs autres sujets, ledit profil comprenant tout ou partie des miARN du Tableau I ci-après ;
(iv) d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'expression par ledit sujet diffère d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets, c'est-à-dire dont l'un quelconque des niveaux d'expression représente au moins deux fois l'autre niveau d'expression ; et
(v) de mise en évidence d'un défaut de la capacité de conduire à une ciliogénèse fonctionnelle d'un tissu épithélial cilié relié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN dudit sujet si au moins un miARN dudit profil établi à l'étape (ii) présente un niveau d'expression qui diffère d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau d'expression du même miARN dans le profil d'expression du Tableau I. Lorsque le niveau d'expression est exprimé en Iog2 (comme dans le Tableau I), cela signifie qu'un défaut de la capacité de régénération et/ou de différenciation, et donc de ciliogénèse, d'un tissu épithélial ciliérelié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN est observé lorsque le niveau d'expression en Iog2 du sujet à tester varie d'au moins une unité par rapport au profil d'expression chez un ou plusieurs autres sujets sains.
La mise en œuvre de la méthode selon l'invention nécessite l'établissement du profil d'expression des miARN du tissu épithélial cilié d'un sujet pour lequel on souhaite établir un diagnostic relatif à la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial cilié et du profil d'expression des miARN du tissu épithélial cilié d'un ou plusieurs sujets sains, c'est-à-dire choisis pour ne pas présenter de désordre de la différenciation et/ou de la régénération et de la ciliogénèse du tissu épithélial cilié.
Selon un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à une méthode d'évaluation de la capacité de régénération et/ou de différenciation et de conduire une ciliogénèse fonctionnelle d'un tissu épithélial respiratoire d'un sujet mammifère, de préférence humain, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes :
(i) de mesure quantitative du niveau d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire dudit sujet ;
(ii) d'établissement du profil d'expression des miARN du tissu épithélial respiratoire dudit sujet ;
(iii) de comparaison du profil d'expression des miARN dudit sujet avec le profil d'expression de miARN dudit tissu épithélial respiratoire sain d'un ou plusieurs autres sujets, ledit profil comprenant tout ou partie des miARN du Tableau I ci-après ;
(iv) d'identification d'au moins un miARN dont le niveau d'expression par ledit sujet diffère d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau d'expression du même miARN par le ou lesdits autres sujets, c'est-à-dire dont l'un quelconque des niveaux d'expression représente au moins deux fois l'autre niveau d'expression ; et
(v) de mise en évidence d'un défaut de la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire relié à une anomalie d'expression d'au moins un miARN dudit sujet si au moins un miARN dudit profil établi à l'étape (ii) présente un niveau d'expression qui diffère d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau d'expression du même miARN dans le profil d'expression du Tableau I. Définitions
- Par sujet, on entend un individu vertébré, en particulier mammifère et, de préférence, l'homme. De préférence, le sujet pour lequel on souhaite établir un diagnostic relatif à la capacité d'un tissu épithélial cilié à conduire une ciliogénèse fonctionnelle, il pourra plus spécficiquement s'agir de diagnostiquer la capacité de régénération et/ou de différenciation d'un tissu épithélial respiratoire et le ou les sujets sains appartiennent à la même espèce.
- dans le cadre de la présente invention, on utilise indifféremment les termes « cilié » et « multicilié » étant entendu que les tissus épithéliaux considérés sont tels que leurs cellules portent plusieurs cils.
- Par profil d'expression des miARN dans un tissu donné, on entend l'ensemble des miARN ayant un niveau d'expression supérieur ou égal à une valeur choisie.
- Le niveau d'expression d'un miARN dans une cellule ou un tissu est déterminé par mesure des miARN présents dans la cellule ou le tissu.
- La mesure du niveau d'expression d'un miARN peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier ; on peut notamment citer, après une étape d'extraction des ARN, le séquencage à haut débit des miARN, le séquençage par NASBA (nucleic acid strand based amplification), par extension d'amorce, ou encore, les puces à ADN permettant l'hybridation des miARN.
- Le niveau d'expression des miARN peut être exprimé par différents moyens tels que :
* le niveau d'intensité d'expression en Iog2, cette valeur est représentative de la quantité de miARN présent dans une cellule ou un tissu ; pour l'établissement d'un profil d'expression, on retiendra de préférence les miARN qui présentent un niveau d'intensité d'expression en Iog2 supérieur ou égal à 3 ;
Ce niveau d'intensité d'expression peut être calculé par différents moyens en fonction de technique utilisée pour mesurer les miARN exprimés.
Dans le cas d'une mesure de fluorescence sur des puces du type Agilent (voir les exemples ci-après), la mesure du niveau d'expression correspond à une intensité de fluorescence dont est ensuite calculé le Iog2. Dans le cas d'un séquençage à haut débit, le niveau d'intensité d'expression comptabilise le nombre de fois où la séquence d'un miARN est séquencée, ce nombre est normalisé par rapport au nombre total de séquences puis son Iog2 est calculé.
* l'abondance qui représente le pourcentage d'expression d'un miARN dans une cellule ou un tissu par rapport à la quantité totale de miARN exprimés dans la même cellule ou le même tissu, dans ce cas, seront retenus les miARN dont l'abondance est supérieure ou égale à 0,1%, de préférence à 0,5%, de façon encore préférée à 1 %.
De préférence, les valeurs caractérisant le niveau d'expression sont exprimées en Iog2.
Le Tableau I ci-dessous décrit le profil d'expression dans lequel le niveau d'expression est exprimé en niveau d'intensité d'expression en Iog2 des miARN d'un tissu épithélial respiratoire humain sain :
La méthode selon l'invention peut présenter une étape additionnelle consistant à comparer le profil d'expression de microARN du tissu épithélial cilié, notamment respiratoire, du sujet pour lequel on souhaite établir un diagnostic relatif à la capacité de conduire une ciliogénèse fonctionnelle dudit tissu, notamment de la capacité de régénération et/ou de différenciation, avec un profil d'expression de miARN du tissu épithélial cilié sain d'un ou plusieurs sujets établi à un stade de différenciation particulier, un tel profil peut être établi avec le Tableau IV.
La présente invention se rapporte ainsi à au moins un miARN identifié par la méthode selon l'invention choisi parmi hsa-miR-100, hsa-miR-106b, hsa-miR- 125a-5p, hsa-miR-130a, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-141 , hsa-miR-151-5p, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-191 , hs ' a-miR-193b, hsa-miR-1975, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa- miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-205, hsa-miR-21 , hsa-miR-210, hsa-miR-22, hsa-miR-224, hsa-miR-23a, hsa-miR-23b, hsa-miR-25, hsa- miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-29c, hsa-miR-30b, hsa- miR-30c, hsa-miR-30d, hsa-miR-30e, hsa-miR-31 , hsa-miR-34a, hsa-miR-34b, hsa-miR- 34c-5p, hsa-miR-365, hsa-miR-374a, hsa-miR-378, hsa-miR-425, hsa-miR-429, hsa- miR-449a, hsa-miR-449b, hsa-miR-449c, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-92b, hsa-miR-939, hsa-miR-96, hsa-miR-99a, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f et hsa-let-7g de séquence SEQ ID N°1 à 6, 8 à 52, 157 à 162 et 201 (voir le tableau I ci- dessous), leur brin complémentaire « star » de séquence SEQ ID N°53 à 58, 60 à 104, 163 à 168 et 202, ou le brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N°105 à 110, 112 à 156, 169 à 174, 193 à 200 et 203 pour leur utilisation pour la prévention et/ou le traitement de désordres liés à un dysfonctionnement des cils de tissu épithélial cilié.
On entend par tissu épithélial cilié un tissu dont les cellules portent sur leur surface apicale des cils ; chez les mamifères, il s'agit notamment de l'épithélium respiratoire ou encore de l'épithélium des trompes utérines et l'endomètre de l'utérus, du plexus choroïdien et cellules épendymaires dans le cerveau, et des spermatozoïdes, rete testis et les canaux déférents chez le mâle.
Par brin de séquence complémentaire d'un premier fragment d'acide nucléique simple brin donné, on entend le fragment d'acide nucléique simple brin dont la séquence est le complément de la séquence dudit premier fragment et capable de s'apparier avec ledit premier fragment.
Dans le cadre de l'invention, il peut être utilisé des brins de séquence complémentaires modifiés chimiquement, c'est-à-dire que leur séquence comprend une ou plusieurs bases modifiées chimiquement, afin d'améliorer leur stabilité intracellulaire et extracellulaire et les rendre moins sensibles à l'hydrolyse dans des conditions acides ou basiques ainsi que sous l'action de nucléases ; les modifications envisageables sont notamment celles listées pour les ARN interférants (siRNA) dans la revue de T. M. Rana (Nature Reviews, 2007, vol 8: 23-36) ou telles que décrites dans la Demande WO 2007/021896 ; en particulier, les brins de séquence complémentaires peuvent comprendre un nucléotide modifié chimiquement choisi parmi les nucléotides modifié en 2' tels qu'une base 2'-désoxy, 2'-désoxy-2'-fluoro, 2'-O-méthyl, 2'-O-méthoxyéthyl (2'-O- MOE), 2'-O-aminopropyl (2'-OAP), 2'-0-diméthylaminoéthyl (2'-O-DMAOE), 2'-O- diméthylaminopropyl (2'-0-DMAP), 2'-O-diméthylaminoéthyloxyéthyl (2'-0-DMAEOE) ou 2'-O-N-méthylacétamido (2'-O-NMA).
Tableau II - miARN selon l'invention et référence de leur séquence nucléotidique, de la séquence nucléotidique de leur brin complémentaire et de celle de leur précurseur
Les miARN selon la présente invention trouvent ainsi un intérêt particulier pour la prévention et/ou le traitement de ciliopathies dites primaires, c'est-à- dire qui sont directement associées à un dysfonctionnement des cils, ces ciliopathies primaires sont notamment :
- la dyskinésie ciliaire primaire ou syndrome de Kartagener ;
- situs invertus ;
- l'infertilité masculine (mobilité des spermatozoïdes) et féminine (e.g. grossesses extra-utérines) ;
- le syndrome d'Alstrom ;
- le syndrome de Bardet-Biedl ;
- le syndrome de Meckel-Gruber ;
- la polykystique des reins ;
- la dégénération rétinienne ;
- le syndrome de Senior-loken.
Les miARN selon la présente invention trouvent également un intérêt pour la prévention et/ou le traitement des ciliopathologies dites secondaires, c'est-à-dire qui sont associées à un défaut de fonctionnement des cils telles que :
- la mucoviscidose ;
- les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BCPO) ;
- l'asthme ;
- la bronchiolite ;
- les infections respiratoires d'origine virale.
L'utilisation selon la présente invention trouve donc plus particulièrement des applications dans la prévention et/ou le traitement des pathologies impliquant un désordre de la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire ; ces pathologies sont notamment des maladies respiratoires chroniques et/ou héréditaires telles que les broncho-pneumopathies obstructives chroniques (BCPO), la mucoviscidose, l'asthme, la dyskinésie ciliaire primaire, les inflammations et infections chroniques des voies respiratoires et les insuffisances respiratoires.
Les pathologies respiratoires chroniques et/ou héréditaires (e.g.
BPCO, mucoviscidose, asthme, DCP, rhinite allergique...) représentent un problème majeur de santé publique, quatrième cause de mortalité dans les pays industrialisés, et dont la prévalence est en augmentation rapide, d'où la nécessité importante de mieux appréhender les causes et les mécanismes de ces maladies afin de mieux cibler leurs traitements.
L'asthme est la plus commune des maladies respiratoires chroniques chez l'enfant (5 à 20%) et représente une des causes majeures d'hospitalisation. La recrudescence d'allergies respiratoires et l'augmentation de la pollution industrielle participent à l'augmentation importante des cas d'asthme dans la population (O van Schayck, et al. IPAG DIAGNOSIS & MANAGEMENT HANDBOOK. Chronic Airways Diseases. A Guide for Primary Care Physicians. 1-34, 2005).
Les BPCO sont un groupe de maladies respiratoires associées à une forte morbidité et à une forte mortalité. Les BPCO sont causées par des particules toxiques inhalées, dont le tabac est la plus représentative, qui vont conduire à une inflammation et à des infections chroniques fragilisant le tissu respiratoire. Environ 15% des fumeurs sont susceptibles de développer une BPCO dans leur vie. L'organisation mondiale de la santé estime qu'il existe près de 1 ,1 milliard de fumeurs dans le monde, avec une prévalence de BPCO de 0,8 à 6% de la population mondiale. En 2020, des études prédisent que les BPCO représenteront la troisième cause de mortalité dans le monde. Bien que les causes et les mécanismes de ces maladies demeurent largement inconnus, il est probable que d'autres facteurs (géniques, épigénétiques) soient susceptibles d'agir sur le développement de BPCO (O van Schayck, et al. 2005).
La mucoviscidose est la maladie génétique héréditaire la plus fréquente dans la population caucasienne (1 naissance sur 2500), affectant les glandes exocrines et donc l'ensemble du tissu épithélial sécréteur des différents organes (poumons, pancréas, foie, glandes sudoripares, intestins). Des défauts de transport d'ions à travers les épithéliums conduisent à un épaississement du mucus responsable notamment d'inflammation et d'infections respiratoires chroniques, aboutissant à une destruction tissulaire irréversible et à une insuffisance respiratoire sévère. Il n'existe aucun traitement curatif de cette maladie, mais l'avancée des connaissances scientifiques et médicales a permis d'instaurer des traitements symptomatiques qui ont fait progresser l'espérance de vie des patients de 3 ans dans les années 60 à environ 45 ans aujourd'hui.
La dyskinésie ciliaire primaire (DCP) est une maladie autosomique récessive rare (1 naissance sur 15000) causant un défaut de mobilité des cils de l'épithélium respiratoire conduisant à une clairance mucociliaire défectueuse, des inflammations et infections chroniques et une destruction tissulaire irréversible.
L'intérêt de ces miARN en vue du traitement de pathologies impliquant un désordre de la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire est confirmé par la régulation par ces miARN de gènes connus pour être impliqués dans la régénération et/ou de la différenciation de l'épithélium respiratoire (voir l'exemple III ci- après).
Dans le cadre de l'invention, on préfère utiliser des miARN qui sont présents en quantité significative au sein du tissu épithélial cilié au cours du processus de ciliogénèse (de préférence, dont l'abondance est d'au moins 1% des miARN totaux, voir le Tableau III). Ainsi, on préfère utiliser au moins un miARN choisi parmi hsa-miR- 34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa- miR-449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b * (SEQ ID N°99), hsa-miR-449c (SEQ ID N°201), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), hsa-miR-574-3p (SEQ ID N°48), hsa-miR-29c (SEQ ID N°32), hsa-miR-140-3p (SEQ ID N°5), hsa-miR-205 (SEQ ID N°20), hsa-miR-23a (SEQ ID N°25), hsa-miR-31 (SEQ ID N°37), hsa-miR-31 * (SEQ ID N°89), hsa-miR-21 (SEQ ID N°21), hsa-miR-17 (SEQ ID N°11), hsa-miR-29a (SEQ ID N°31), hsa-miR-193b (SEQ ID N°14), hsa-miR- 210 (SEQ ID N°22) et hsa-miR-130a (SEQ ID N°4), leur brin complémentaire « star » de séquence SEQ ID N°55 à 57, 63, 65 à 67, 71 à 74, 77, 78, 83, 84, 90 à 92, 95, 98, 100, 101 , 104 et 202, leur brin de séquence complémentaire éventuellement modifié chimiquement, et leurs précurseurs de SEQ ID N°107 à 109, 115, 117 à 119, 123 à 126, 129, 130, 135, 136, 141 à 144, 147, 151 à 153, 156 et 203.
Parmi ces miARN, on peut distinguer ceux dont l'expression est induite de ceux dont l'expression est réprimée (Tableau IV) ; afin de reproduire un profil d'expression de miARN comparable à celui d'un individu sain, il apparaît avantageux d'utiliser un ou plusieurs miARN dont l'expression est induite et/ou un ou plusieurs antagomirs de miARN dont l'expression est réprimée au cours du processus de ciliogénèse des tissus épithéliaux ciliés et, notamment, de régénération et de différenciation du tissu épithélial respiratoire. Ainsi, selon une variante avantageuse de l'invention, on utilise selon l'invention au moins un miARN choisi parmi hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR- 449a (SEQ ID N°46), hsa-miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449b* (SEQ ID N°99), hsa-miR-449c (SEQ ID N°201 ), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°107, 1 17, 119, 123, 130, 142 à 144, 147, 150, 151 , 153, 156 et 203 et/ou au moins un brin complémentaire « star » des miARN choisis parmi hsa-miR-205, hsa-miR-31 , hsa-miR-21 , hsa-miR-17, hsa-miR-29a, hsa-miR-193b, hsa-miR-31 * , hsa-miR-210 hsa-miR-130a ; ces brins complémentaires « star » sont hsa-miR-205 * (SEQ ID N°72), hsa-miR-31 et hsa-miR-31 * (SEQ ID N°37 et 89), hsa-miR-21 * (SEQ ID N°73), hsa-miR-17 * (SEQ ID N°63), hsa- miR-29a* (SEQ ID N°83), hsa-miR-193b * (SEQ ID N°66), hsa-miR-210 * (SEQ ID N°74), hsa-miR-130a* (SEQ ID N°56) et leurs précurseurs de séquence SEQ ID N°108, 115, 118, 124 à 126, 135 et 141.
De préférence selon l'invention, on utilise, parmi lesdits miARN dont l'expression est modulée au cours du processus de ciliogénèse des tissus épithéliaux ciliés et, notamment, de régénération et/ou de différenciation du tissu épithélial respiratoire, ceux dont l'expression est induite : hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR- 34b (SEQ ID N°39), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46), hsa- miR-449b (SEQ ID N°47), hsa-miR-449c (SEQ ID N°201), hsa-miR-449b * (SEQ ID N°99), hsa-miR-92b (SEQ ID N°49), hsa-miR-1975 (SEQ ID N°15), hsa-miR-99a (SEQ ID N°52), hsa-miR-191 (SEQ ID N°13), hsa-miR-378 (SEQ ID N°43), hsa-miR-23b (SEQ ID N°26), hsa-miR-125a-5p (SEQ ID N°3), hsa-miR-203 (SEQ ID N°19), et leur précurseurs de séquence SEQ ID N°107, 117, 119, 123, 130, 142 à 144, 147, 150, 151 , 153, 156 et 203.
L'objet de la présente invention se rapporte également à l'utilisation de vecteurs d'expression exprimant au moins un miARN dont l'expression est induite au cours du processus de ciliogénèse d'un tissu épithélial ou au cours du processus de régénération et/ou de différenciation du tissu épithélial respiratoire. Tout vecteur d'expression capable d'exprimer des ARN dans une cellule eucaryote et dans lequel est clonée une cassette d'expression d'un miARN pourra être utilisé dans le cadre de la présente invention.
L'invention se rapporte également à l'utilisation de miARN comportant la séquence de reconnaissance GGCAGUG (SEQ ID N°175) positionnée sur la région 2-7 du miARN, c'est-à-dire du 2 ème au 7 ème nucléotide du miARN, ou sur la région 3-8 du miARN, c'est-à-dire du 3 ème au 8 ème nucléotide du miARN ; il s'agit notamment des miARN hsa-miR-34a (SEQ ID N°38), hsa-miR-34c-5p (SEQ ID N°40), hsa-miR-449a (SEQ ID N°46),hsa-miR-449b (SEQ ID N°47) et hsa-miR-449c (SEQ ID N°201).
L'invention se rapporte aussi à l'utilisation de miARN comportant la séquence de reconnaissance AAUCACU (SEQ ID N°176) positionnée sur la région 2-7 ou sur la région 3-7 du miARN ; il s'agit notamment du miARN hsa-miR-34b (SEQ ID N°39).
L'invention se rapporte encore à l'utilisation de miARN comportant la séquence de reconnaissance AUCACUA (SEQ ID N°177) positionnée sur la région 2-7 ou sur la région 3-7 du miARN ; il s'agit notamment du miARN hsa-miR-34c-3p (SEQ ID N°40).
L'invention se rapporte enfin à l'utilisation d'au moins un miARN décrit précédemment choisi parmi le miARN de séquence SEQ ID N°3-5, 8, 9, 1 1-15, 17, 19, 20, 23-26, 28-32, 35-37, 39-44, 46-52 et 201 , leur brin complémentaire ou antagomir de séquence SEQ ID N°55-57, 60, 61 , 63-67, 69, 71 , 72, 7578, 80-84, 87-89, 91-96, 98-104 et 202, éventuellement modifié chimiquement, et leur précurseur de séquence SEQ ID N°107-109, 112, 113, 115-119, 121 , 123, 124, 127-130, 132-136, 139-141 , 143-148, 150-156, 194, 195, 197 et 203 pour une utilisation comme médicament.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en œuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles :
FIGURES
La Figure 1 représente des clichés de cultures primaires de cellules épithéliales respiratoires humaines observées par microscopie confocale et électronique permettant d'observer la morphologie des cellules marquées à l'hématoxyline et à l'éosine. Les cellules ont également été immunomarquées afin d'examiner l'expression de marqueurs épithéliaux de différenciation (tubuline-β4 pour les cellules ciliées (Figure 1E-F), mucine MUC5AC pour les cellules sécrétrices à mucus (Figure 1G-H) 1 et la cytokératine 13 pour les cellules basales (Figure 11-J)). Les états de différenciation ont été évalués.
La Figure 2A représente les histogrammes cumulatifs montrant les 26 miARN ayant la plus forte expression dans l'un au moins des différents stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain chez 3 patients distincts : ALI-DO (DO, prolifération), ALI-D7 (D7, prolifération et polarisation), ALI-FC (FC, début de ciliogénèse), ALI-WD (WD, épithélium pleinement différencié). La Figure 2B représente les histogrammes cumulatifs montrant les 22 miARN ayant la plus forte expression et étant significativement modulés dans l'un au moins des différents stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain chez 3 patients distincts : ALI-DO (DO, prolifération), ALI-D7 (D7, prolifération et polarisation), ALI-FC (FC, début de ciliogénèse), ALI-WD (WD, épithélium pleinement différencié).
La Figure 3 représente un cluster hiérarchique obtenu par puces miARN Agilent® montrant les variations d'intensité de l'expression des miARN statistiquement exprimés (A>8, P<0.05) et modulés dans au moins une condition de culture cellulaire (1<M<-1 ) (plus les cases sont foncées, moins les miARN sont exprimés) en fonction des états de différenciation des cultures cellulaires.
La Figure 4 est un graphe montrant la corrélation entre les résultats obtenus en séquençage haut-débit (HTS) et en puces miARN (Agilent®).
La Figure 5 représente un histogramme des variations observées par
PCR quantitative des brins 5p de chacun des miARN testés à chaque stade de différenciation comme indiqué sur le graphique. Les résultats représentent la moyenne de 3 donneurs distincts.
La Figure 6 regroupe deux graphes représentant les microARN régulés au cours de la ciliogénèse. Les diagrammes a et c représentent l'abondance des microARN en pourcentage par rapport aux microARN totaux dans des cellules HAEC non différenciées (non ciliées, stade ALI-DO) (diagramme a) et dans un explant épidermique d'embryon de Xénope avant le stade embryonnaire E11.5 (gastrula) et après le stade E26 (bourgeon caudal) (diagramme c). Les diagrammes b et d reprennent ces mêmes données et illustrent l'abondance quantitative des miRNA.
La Figure 7 présente des clichés permettant de visualiser la localisation spécifique de miR-449 dans les cellules ciliées. Ces essais ont été réalisés par hybridation in situ sur des coupes congelées de culture de cellules HAEC à 21 jours (stade ALI-D21) (clichés a, b, c), de tissus bronchiques humains (clichés e, f, g) ou à partir d'embryons de Xenope au stade bourgeon caudal (clichés h, i, j, k, I) en utilisant des sondes LNA marquées à la digoxigénine et dirigées contre miR-449 (clichés a, e, f, h, i, j, I) ou contre miR-31 (cliché b) et des sondes aléatoires (« scramble ») comme contrôle négatif (clichés c, g, i). Les cellules ciliées d'embryon de Xenope ont été identifiées par un immunocytomarquage avec un anticorps primaire dirigé contre la tubuline acétylée. Les sondes LNA dirigées contre miR-449 marquent les cellules cylindriques ciliées (clichés a, e, h). Inversement, les sondes dirigées contre miR-31 ont marqué préférentiellement les cellules basales (cliché b). Les cellules muco-sécrétrices ont été marquées à l'aide d'anticorps anti-mucine MUC5AC (indiquées par des flèches dans le panneau e). Le diagramme d illustre les niveaux d'expresion des miR-449, miR- 31 et miR-34 dans les cellules basales du tissu épithélial des voies respiratoires humaines et dans les cellules cylindriques ciliées.
La Figure 8 représente une cartographie (Heat-map) des microARN significativement régulés entre des cellules pyramidales (ciliées+sécrétrices) versus des cellules basales. Les 5 microARN positionnés en haut de la colonne sont spécifiques des cellules pyramidales (ciliées+sécrétrices) ; en dessous, plus les miARN apparaissent clairs, plus ils sont spécifiques des cellules basales.
La Figure 9 est un graphe montrant les relations existant entre le log 2 du ratio à deux stades de différenciation (abscisse) et la valeur de significativité statistique (ordonnées) pour chacune des comparaisons 2 à 2 indiquées sur le graphique. Les gènes significativement surexprimés sont indiqués en gris foncé (partie droite du graphe) et les gènes significativement réprimés sont indiqués en gris moyen (partie gauche du graphe). La Figure 10 est un histogramme montrant le log 2 de l'intensité d'expression de l'ARNm de la cavéoline-1 dans chacune des conditions de cultures étudiées, comme indiqué sur le graphique.
La Figure 11 est un histogramme montrant l'effet de chacun des miARN sélectionnés sur l'activité de la luciférase (exprimée par rapport au % de l'effet maximal obtenu avec le vecteur contrôle PSICHECK) quand le gène rapporteur de la luciférase est fusionné à la partie 3' non-codante de l'ARNm de la Cav-1 versus le contrôle (PSICHECK). Les données ont été normalisées par rapport aux résultats obtenus avec un miARN contrôle négatif.
La Figure 12 regroupe des graphiques illustrant l'enrichissement de gènes contenant la séquence de la séquence de reconnaissance (« seed ») commun aux mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b * et mir-34c. En abscisse est représenté le nombre de gènes analysés (environ 25000) ; ces gènes sont positionnés en fonction de leur niveau de répression ou d'expression : de la gauche vers la droite, figurent les gènes du plus réprimé au plus induit. L'ordonnée représente la valeur statistique en Iog10 du niveau d'enrichissement (le score d'enrichissement reporté sur l'axe des ordonnées correspond à la valeur absolue du Iog10 de la valeur P, calculée suivant un modèle cumulatif hypergéométrique et binomial décrit par van Dongen S et al. Nat Methods. 2008 Dec;5(12): 1023-5). Sur chaque graphe est indiqué le miARN qui a été transfecté dans les cellules HAECs.
La Figure 13 représente le résultat de l'identification à l'aide du software IPA de fonctions biologiques et de maladies en relation avec les gènes trouvés modulés par l'expression des miARN selon l'invention.
La Figure 14 illustre l'inhibition de la ciliogénèse par la suppression de l'expression de miR-449.
(a,b) les cellules HEACs sont traitées à plusieurs reprises avec des antagomirs anti-miR-449 ou un antagomir de contrôle (20 nM) au cours de leur régénération (généralement 21 jours). Le pourcentage de cellules ciliées a été défini comme le ratio du nombre de cellules positives à la -tubuline-β4 par rapport au nombre de noyaux (20 champs/filtre et 3 filtres/donneur). Le cliché (a) représente un immunomarquage typique de cellules HAEC traitées avec un antagomir de contrôle (Antago-Neg) ou un antagomir anti-miR-449 (Antago-449). L'histogramme indique le pourcentage de cellules ciliées par champ pour chaque condition expérimentale (n = 6, *** , P <0,001 , Student-test). Le cliché (b) montre que l'antagomir anti-miR-449 supprime l'expression des miR449a et miR-449b, en revanche, il n'a pas d'effet dur l'expression de miR-21 (n = 6, ns = non significatif, ** , P<0,01 , *** , P<0,001 , Student-test). Essais sur Xenope : un mélange comprenant 30 ng d'oligonucléotides morpholino (MO) de contrôle (clichés c, d, h) ou de MO miR-449a/b/c (10 ng chacun) et
2,5 ng de lysine-dextran fluorescent (FLDx, colorés en orange/marron, clichés c et f) ou
500 pg de I 1 ARNm de TD-tomato-CAAX pour tracer les cellules injectées (clichés g, i) est injecté dans l'épiderme d'embryons de Xenope au stade de la segmentation.
Les clichés e et f permettent la détection de progéniteurs de cellules ciliées par un marquage à la tubuline-α avec la technique d'hybridation in situ.
Cliché f : la région déplétée en miR-449 (haut) montre un excès de cellules positives à la tubuline-α par rapport à la région non injectée (bas). Les clichés h et i montrent la détection de cils chez les embryons au stade de têtard avec un anticorps anti-tubuline acétylée. L'image est prise dans la région de la nageoire caudale. Aucun cil n'est détecté dans les cellules co-injectées avec le MO miR-449 et l'ARNm TD-tomato- CAAX. Le graphe g représente le pourcentage de cellules injectées (positive pour la fluorescence rouge TD-tomato) qui développent des cils dans l'expiant de contrôle (225 cellules, 8 queues) et dans celui modifié avec le MO miR-449 (242 cellules, 8 queues, p=0,036, test de Kruskall-Wallis).
La Figure 15 illustre l'induction de la spécialisation des cellules ciliées par la suppression de miR-449. Un mélange de MO anti-miR-449 ou de MO contrôle et de FLDx est injecté dans l'épiderme d'embryons au stade de la segmentation. Les embryons sont fixés au stade neurula précoce puis soumis à une hybridation in situ avec des ribosondes de tubuline-α, Tex15 et Foxji , ils sont ensuite immunomarqués pour révéler la présence de FLDx (lysine-dextran fluorescente). Les embryons ont ensuite été sectionnés pour mieux visualiser la densité de progéniteurs des cellules ciliées dans les domaines injectés. Pour les trois marqueurs, la suppression de l'expresion des miR-449 a conduit à une augmentation des progéniteurs des cellules ciliées.
Les quatre sections de la Figure 16 illustrent les résultats d'enrichissement des gènes comme expliqué sur le site http://www.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideFrame.ht ml. Le GSEA calcule un score d'enrichissement (ES) qui reflète le degré auquel un gène est surexprimé au sein d'une liste de gènes donnés. Un ES positif indique l'enrichissement d'un gène à gauche de l'ensemble des gènes (correspondant à un gène sur-régulé), un ES négatif indique l'enrichissement d'un gène à droite dudit ensemble de gènes (correspondant à un gène sous-régulé). Pour chaque section, le panneau du haut est une représentation graphique du score d'enrichissement d'un ensemble de gènes comme indiqué sur la gauche. La partie du milieu du panneau montre où les membres de l'ensemble de gènes apparaissent dans la liste (« cycle cellulaire » ou « ciliogénèse »). La partie basse du panneau montre la valeur d'ordonnancement métrique qui mesure la coorélation entre l'expression d'un gène et le phénotype cellulaire ; une valeur positive indique une corrélation avec le premier phénotype (différenciation ou surexpression des miR-449) et une valeur négative indique une corrélation avec le second phénotype (non différencié ou contrôle). Toutes ces données expérimentales sont stockées dans la Base Gène Expression Omnibus sous le numéro d'accession GSE22147.
La Figure 17 présente les résultats montrant que miR-449 cible le cycle cellulaire et la voie Notch.
Cycle cellulaire : le graphe (a) représente la modulation de l'activité du gène rapporteur de la luciférase fusionné à la partie 3' non codantes de l'ARNm de Areg, Ccnbi, Ccne2, Cdc25a par miR-449a/b et miR-34a/c5-p.
Voie de signalisaiton Notch : Le graphe (c) représente la modulation de l'activité du gène rapporteur de la luciférase fusionné à la partie 3' non codantes de l'ARNm de DLL1 et Notch 1 par miR-449a/b et miR-34a/c5-p.
Toutes les expériences ont été effectuées au moins deux fois en trois exemplaires. Les valeurs ont été normalisées au contrôle interne de luciférase de Renilla. Les barres d'erreur indiquent l'écart-type.
Le graphe (b) représente le blocage du cycle cellulaire en phase G1 par miR-449 et miR-34.
Le graphe (d) représente l'impact de l'inhibition de la voie Notch par DAPT (10 μM) sur la ciliogénèse des cellules HAECs.
Les clichés (e) et (f) représentent des embryons au stade de segmentation dont l'épiderme a reçu une injection d'un mélange de MO anti-miR-449 et de lysine-dextran fluorescent (FLDx).
Une coloration par hybridation in situ révèle l'expression soutenue de DLL1 dans l'épiderme déficient en miR-449.
Le panneau (g) montre des embryons au stade de la segmentation dont l'épiderme a reçu une injection de MO de contrôle, de MO anti-miR-449 et de MO DIH ou d'ARNm DLL1. Les cils ont été colorés avec un anticorps anti-tubuline acétylée (en rouge). Pour chaque condition, au moins 200 cellules positives au FLDx (en vert), sur 6 à 8 queues, présentent des cils (P <0,03). Il convient de noter que l'injection d'ARNm de DIH supprime la ciliogénèse, bien qu'elle augmente le nombre de progéniteurs des cellules ciliées. L'extinction de l'expression de DIH induit la ciliogénèse.
EXEMPLES
I- Préparation du modèle cellulaire biologique
I-A. cellules épithéliales respiratoires humaines
Les essais ont été réalisés avec des cultures primaires de cellules épithéliales respiratoires humaines saines isolées à partir de cornets ou de polypes nasaux collectés chez des patients devant subir une septoplastie, une turbinectomie ou une polypectomie. Les cellules ont ensuite été cultivées sur support poreux recouvert de collagène de type IV (Transwell® clear, polyester, 0.4 μm, Costar) en interface air- liquide (ALI) dans le but d'induire la différenciation (Puchelle, E et al., 2006). Les caractéristiques morphologiques et physiologiques de l'épithélium respiratoire ont été par ailleurs bien décrites (Puchelle, E et al., 2006).
I- A.1. Matériels et méthodes
Patients et échantillons tissulaires
Des cornets inférieurs ou des polypes nasaux ont été collectés à partir de 3 patients devant subir une turbinectomies ou des polypectomies pour obstruction nasale ou septoplastie (Dr. Castillo, Département ORL, Hôpital Pasteur, Nice, France). Les patients atteints d'asthme, de mucoviscidose ou d'allergies ont été exclus de l'étude. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université de Nice-Sophia-Antipolis.
Isolement et culture de cellules épithéliales respiratoires humaines saines (HAECs)
Les cultures primaires de HAECs saines dérivées de muqueuse nasale ont été réalisées à l'aide d'une méthode adaptée d'études précédentes (Wu et al., 1985; Marcet et al., 2007; LeSimple et al., 2007). Après excision, le tissu est immédiatement immergé dans une solution équilibrée en sels (HBSS (sans Ca 2 VMg 2+ ) Invitrogen) contenant de l'HEPES (25 mM, Invitrogen), 100 U/ml pénicilline (Gibco, Invitrogen), 100 mg/ml streptomycine (Gibco, Invitrogen), 100 mg/ml de sulfate de gentamicine (Gibco, Invitrogen), et 2,5 mg/ml d'amphotéricine B (Gibco, Invitrogen). Après 3 rinçages avec du milieu HBSS-HEPES-antibiotiques, le tissu est digéré avec 0,1 % de pronase (Sigma) à 4°C, toute la nuit. Le tissu est ensuite délicatement retiré du milieu de digestion, et les cellules épithéliales respiratoires à la surface de la muqueuse nasale sont détachées du stroma par de légères agitations avec du milieu HBSS-HEPES-antibiotiques contenant 10% de sérum de veau fœtal (SVF). La suspension cellulaire est centrifugée à 150g, 10 min à 4°C et le culot cellulaire est resuspendu dans 10% SVF-HBSS-HEPES- antibiotiques et centrifugé à nouveau. Le second culot cellulaire est alors resuspendu dans un milieu 10% SVF-antibiotiques-Dulbecco's modified Eagle's (DMEM, Invitrogen) à l'aide d'une aiguille (0,8 mm) et d'une seringue de 10 ml pour dissocier les agrégats cellulaires. Les cellules sont ensuite ensemencées (10 4 /cm 2 ) sur des supports poreux perméables (Transwell®, Costar, Sigma) recouverts de collagène de type IV (Sigma) et incubées dans une atmosphère humidifiée à 37°C, 5% CO 2 . Le lendemain, le milieu de culture est remplacé par du milieu de prolifération (BEGM) reconstitué à l'aide du milieu BEBM (Lonza) contenant les suppléments hormonaux et autres facteurs de croissances suivants : insuline, apo-transferrine, facteur de croissance épidermique (EGF), épinéphrine, hydroxycortisone, 3,30,5-triiodothyronine, supplément de croissance pour cellules endothéliales (endothelial cell growth supplément), acide rétinoïque (à faible concentration, environ 10 nM), amphotéricine B (2,5 mg/ml), streptomycine (100 mg/ml), pénicilline (100 U/ml), sulfate de gentamicine (50 mg/ml) et L-glutamine (2 mM).
La confluence de la monocouche de cellules épithéliales respiratoires est typiquement achevée après 7 jours de culture. Le milieu de surface apicale est alors retiré afin de mettre les cellules en interface air-liquide et le milieu basolatéral est changé par du milieu de différenciation : BEBM/DMEM ratio (1 : 1) et contenant les mêmes suppléments que cités ci-dessus mis à part l'acide rétinoïque qui est cette fois ajouté à forte concentration, environ 300 nM, pour induire la différenciation mucociliaire de l'épithélium respiratoire. Les expériences sont ensuite réalisées sur des cultures différenciées ayant une résistance transépithéliale supérieure à 500 ohm/cm 2 .
Marquage immunocvtochimique et microscopie confocale et électronique
Les coupes de membranes de cultures de cellules respiratoires cultivées en interface air-liquide sont fixées dans l'acétone ou dans le méthanol (10 min, -20 0 C). Après rinçage dans du PBS, les sites non-spécifiques sont bloqués dans du PBS-BSA 3%, puis l'anticorps primaire est incubé dans du PBS-BSA-1% de 1h à température ambiante à 16h à 4°C selon l'anticorps utilisé. Après rinçage, l'anticorps secondaire couplé et mis en solution dans du PBS-BSA 1% est incubé 1 h à température ambiante. Après rinçage, les noyaux sont marqués au DAPI et contre colorés à l'hématoxyline de Harris. Après rinçage, les lames sont montées et observées au microscope confocal. Dans le cas de doubles marquages séquentiels impliquant deux anticorps de souris, une étape de blocage des sites libres des anticorps primaires est réalisée à l'aide d'anticorps anti-souris anti-Fab (H+L) 30 minutes à température ambiante.
Pour la microscopie électronique, les cellules sont fixées dans du tampon phosphate monosodique 0.1 M contenant 1 ,6% de glutaraldéhyde.
Tri des cellules épithéliales respiratoires
Après dissociation du stroma de polypes nasaux, les cellules épithéliales (environ 20.10 6 ) sont incubées en PBS-BSA-EDTA pendant 30 min puis incubées avec l'anticorps marqué CD151-PE et l'anti-FT (facteur tissulaire)-FITC pendant 20 min, 4°C (voir Hajj, R. et al., Stem CeIIs 25, 139-148 (2007)). Après deux lavages, les cellules sont reprises dans du PBS-EDTA et incubées avec du DAPI pour marquer les cellules dont l'intégrité est altérée. Le tri cellulaire a été effectué sur le trieur FACSAria (BD Biosciences) équipé de 3 lasers, bleu, rouge et violet. Les cellules mortes, les agrégats et les doublets cellulaires ont été exclus. La population doublement positive de cellules basales (CD151+/FT+) et la population négative de cellules cylindriques (contenant les cellules ciliées et les cellules sécrétrices de mucus) (CD151-/FT-) ont été sélectionnées et triées à la vitesse de 5000 événements/s (30 MHz de fréquence). La pureté et l'identité des cellules triées ont ensuite été vérifiées par cytomètre et immunocytochimie.
I-A.2. Observation de la morphologie des cellules marquées à l'hématoxyline et à l'éosine
Des immunomarquages ont été réalisés afin d'examiner l'expression de marqueurs épithéliaux de différenciation (tubuline-β4 pour les cellules ciliées (Figure 1E-F), mucine MUC5AC pour les cellules sécrétrices à mucus (Figure 1G-H), et la cytokératine 13 pour les cellules basales (Figure 11-J)).
Les états de différenciation ont été évalués par microscopie confocale et électronique. Il a été choisi d'étudier quatre temps clés de la différenciation :
(1) durant les premiers jours de l'établissement de l'interface air-liquide (ALI-DO), les cellules prolifèrent et forment un épithélium squameux stratifié;
(2) après 5-7 jours d'interface air-liquide (ALI-D7), la polarisation cellulaire débute;
(3) après environ 14 jours d'interface air-liquide, les cellules forment un épithélium pseudostratifié où les premiers cils apparaissent à la surface des cellules (ALI-FC), ainsi qu'un allongement cellulaire, indiquant le début de la ciliogénèse (Figure 1C);
(4) après environ 21 jours d'interface air-liquide (ALI-WD), l'épithélium respiratoire devient pseudostratifié, stade complètement différencié où la plupart des cellules sont cylindriques et ciliées, avec une couche sous-jacente de cellules basales, ainsi que des cellules sécrétrices de mucus (Figure 1D).
Après 3-4 semaines de culture, les critères morphologiques et les marqueurs spécifiques de différenciation des 3 types cellulaires de l'épithélium respiratoire de surface (i.e. basales (Figure 11-J), sécrétrices (Figure 1G-H), et ciliées (Figure 1 E-F) peuvent être observés.
Il- Mesure de l'expression des miARN dans les cellules sélectionnées au cours de la cilioqénèse
Les techniques de séquençage à haut-débit permettent d'établir l'abondance de certains miARN au sein d'un mélange complexe. Sur la base du nombre de séquences spécifiques d'un miARN au sein d'une condition expérimentale, il est possible d'évaluer l'abondance dudit miARN au sein de l'ensemble des miARN.
11-1. Matériels et méthodes
Cellules épidermiques ciliées d'embryons de Xenopus laevis
L'épiderme cilié des embryons de Xenopus laevis est utilisé comme un modèle d'épithélium mucociliaire comme décrit par Hayes et al. (Dev Biol 312 (1), 115 (2007)).
Extraction d'ARN totaux et contrôles qualité
Les ARN totaux ont été extraits à partir des HAECs cultivées en interface air-liquide à quatre stades de différenciation : ALI-DO (0 jour), ALI-D7 (7 jours), ALI-FC (lors de l'apparition des premiers cils à environ 14 jours) et ALI-WD (pleinement différenciées à environ 21 jours). Les cellules sont lysées dans du réactif au Trizol® (Invitrogen). Les ARN totaux contenant les petits ARN et les microARN sont purifiés sur colonnes Qiagen RNEasy (Qiagen) selon les instructions du fournisseur.
La pureté et la concentration des échantillons d'ARN totaux sont d'abord évalués en utilisant le spectrophotomètre Nanodrop. Les ratios 260/280 (ratio des valeurs d'absorbance à 260 et 280 nm d'un échantillon mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre) et 260/230 (ratio des valeurs d'absorbance à 260 et 230 nm d'un échantillon mesurées à l'aide d'un spectrophotomètre) ; ces ratios reflètent la pureté en ARN lorsqu'ils sont compris entre 1 ,5 et 2 ; ils sont vérifiés et doivent avoir une valeur proche de 2.
Les ARN totaux de cellules embryonnaires de Xenope ont été purifies avec un kit "Qiagen RNeasy kit » (Qiagen).
Les ARN sont ensuite chargés sur une puce « RNAnano chip »
(Agilent Technologie, France) et leur qualité (intégrité et niveau de dégradation des ARN) est analysée à l'aide du Bioanalyzer System (Agilent Technologies, France).
Séquençage haut-débit de microARN
Les ARN totaux contenant les petits ARN et les microARN sont isolés comme précédemment. La procédure est basée sur la technologie Applied Biosystems Ligase-Enhanced Génome Détection (LEGenD™) ; le kit SOLiD™ Small RNA Expression (Applied Biosystems, France) a été utilisé. Cette méthode permet de convertir les petits ARN d'un échantillon dans une librairie d'ADN double brin ; elle a été développée par Applied Biosystems SOLiD™ System pour faire du séquençage haut- débit de nouvelle génération.
Le séquençage haut-débit des microARN a été réalisé selon les recommandations du fournisseur. Brièvement, les ARN totaux contenant les petits ARN sont hybrides (65 0 C, 10 min, puis à 16°C, 5 min) et ligués (16°C, 2-16 h dans un thermocycleur) à l'Adaptor Mix A pour produire une matrice pour le séquençage de l'extrémité 5' des petits ARN, ou à l'Adaptor Mix B pour séquencer l'extrémité 3'. Les échantillons sont ensuite reverse-transcrits (42°C, 30 min) pour synthétiser l'ADN complémentaire (ADNc). L'amplification de la bibliothèque des petits ARN est effectuée par PCR et après migration sur gel de polyacrylamide les petits ARN amplifiés sont découpés et extraits du gel suivant leur taille (environ 105-150 bases de longueur, selon les instructions du fournisseur), élues et resuspendus dans de l'eau exempte de nucléases. La concentration d'acides nucléiques est ensuite mesurée et normalisée avant de procéder à la préparation des échantillons pour le séquençage.
Analyses statistiques des données de séquençage haut-débit
Les analyses statistiques sont réalisées à l'aide du logiciel R de Bioconductor® (Peter Dalgaard, statistics and Computing, Introductory statistics with R. Springer, 2002 ; R. Gentleman, VJ. Carey, W. Huber, R.A. Irizarry, S. Dudoit. Statistics for biology and health. Bioinformatics and computational biology solutions using R and bioconductor. Springer, 2005).
Pour chaque microARN séquence, le nombre de séquences du brin 5p et du brin 3p du microARN a été normalisé à 10 6 séquences et converti en pourcentage d'abondance d'expression pour chacun des microARN. Les données ont ensuite été normalisées suivant un modèle linéaire et une méthode Bayésienne empirique en utilisant le logiciel R. Pour les analyses ultérieures, n'ont été retenus que les microARN dont le pourcentage d'expression (ou abondance) est supérieure à 1 % du total des microARN dans au moins une condition de culture, avec un |Log 2 Ratio| inférieur à 0,5 et une P-Value ajustée inférieure à 0,05.
Analyse du microARNome par puces microARN (Aqilent Technologies)
En parallèle du séquençage haut-débit des microARN, le répertoire d'expression des microARN (microARNome) est étudié à l'aide de la technologie de puces microARN Agitent®. Pour cela, les échantillons ARN des mêmes patients que précédemment ont été utilisés, marqués et hybrides sur puces miARN Agilent® (Human miRNA Microarray v2, contenant 866 miARN humains et 89 miARN viraux humains, Le. l'ensemble des miARN humains contenus et référencés dans Sanger miRBase v.12.0, Agilent Technologies, France) à l'aide du kit « miRNA labelling and hybridization » suivant les instructions du fournisseur (Agilent Technologies).
Analyses du transcriptome par puces ADN (Affymetrix®) Pour les analyses du transcriptome, les ARN totaux sont purifiés et leur qualité est vérifiée comme précédemment. L'analyse est ensuite réalisée sur des puces ADN GeneChip® Human
Gène 1.0 ST Array (Affymetrix®). Chacun des 28869 gènes est représenté sur la puce par environ 26 sondes recouvrant la longueur entière du gène. Les ARN totaux sont marqués et hybrides à l'aide de "whole Transcript (WT) Sensé Target Labeling and Control Reagents, fluidics and scanning instrumentation and basic analysis software".
Analyses des données de transcriptome obtenues par puces ADN (Affymetrix®)
Les analyses de données sont réalisées à l'aide du logiciel R
Bioconductor développé par le consortium statistique R. Puis, les données sont visualisées à l'aide de l'interface Mediante, un système d'information développé pour l'analyse et le stockage d'informations à large échelle obtenues lors d'analyses de puces
(Le Brigand and Barbry, 2007).
Pour les puces Affymetrix®, les données sont analysées en utilisant l'algorithme RMA (Robust Multi-Chip Average), qui réalise une correction du bruit de fond, une étape de normalisation, et un compte-rendu des niveaux des sondes. Cette méthode montre une précision élevée, particulièrement pour des valeurs d'expression faibles, et montre une spécificité et une sensibilité plus élevée que de nombreuses autres méthodes connues (Irizarry et al., 2003). Les données sont normalisées suivant un modèle linéaire et une méthode Bayesienne empirique à l'aide du logiciel R Bioconductor. Des graphiques en forme de Volcano plots (Figure 7) sont utilisées pour montrer le niveau de régulation quantitatif des gènes exprimé en Iog2 en fonction de leur significativité statistique par rapport à des réplicas expérimentaux.
Hybridation in situ
Après fixation dans du paraformaldéhyde à 4% (Electron Microscopy Sciences), des coupes congelées de cultures cellulaires au stade ALI-D21 ou de tissus des voies respiratoires de l'homme ont été acétylées, incubées une nuit à 55°C avec
0,3 ng/μl de sondes LNA marquées avec la digoxigénine ciblant des microARN
(Exiquon, Woburn, MA ) dans du formamide désionisée 50%, 0,3 M NaCI, 20 mMTris-
HCI pH 8,0, 5 mM EDTA, 10 mM NaPO4 pH 8,0, 10% sulfate de dextran, 1X de solution de Denhardt, et de 0,5 mg/ml d'ARN de levure.
Les séquences des sondes sont :
pour miR-449 : ccagctaacaatacactgcc (SEQ. ID. N°204)
pour miR-31 : agctatgccagcatcttgcct (SEQ. ID. N°205)
pour le microARN de contrôle négatif (« scramble ») : gtgtaacacgtctatacgccca (SEQ. ID. N°206).
Les sondes ont été révélées par incubations séquentielles à la peroxydase conuguée avec des anticorps anti-digoxigénine (Roche) avec le kit d'amplification de signal « Tyramide Signal Aplificatin Plus DNP AP System » (Perkin Elmer) sur le substrat BCIP/NBT (DakoCytomation).
Certaines lames ont ensuite été exposées à des anticorps de souris anti-MUC5AC et révélées avec le kit « LSAB2 System-HRP » (Dako). Les coupes ont été contremarquées avec le colorant éosine/safran « Nuclear Fast Red », et montées à l'aide milieu de montage Eukitt (Electron Microscopy Sciences).
Chez le Xenope, des œufs obtenus de femelles NASCO sont fécondées in vitro, cultivées et injectées tel que décrit par Marchai, L et al. (Proc Natl Acad Sci U S A 106 (41), 17437 (2009)). Les ARNc de DIH et de la centrin-2-GFP sont préparées avec le kit « Ambion mMessage Machine ». le vecteur Td-tomato-CAAX lié à la membrane (don de Chenbei Chang) est linéarisé avec l'Asel et I 1 ARNc est synthétisé avec la Sp6 polymerase. La lysine-dextran fluorescente (FLDx, 2.5 ng/cellule) est co- injectée avec les oligonucléotides morpholino (MO) pour marquer les embryons vivants et une immunodétection anti-fluorescéine est réalisée pour suivre la distribution des MO dans les embryons. Toutes les injections sont dupliquées.
Une sonde LNA anti-miR-449a marquée à la mono-digoxygénine (Exiqon) a été utilisée pour l'hybridation in situ qui a été réalisée comme décrit par Kloosterman et al. (Nat Methods 3 (1), 27 (2006)). Des sondes ribosomiques antisens de la tubulin-α, DIH , Tex15 et Foxji ont été préparées comme décrit par : Deblandre et al. {Development 126 (21), 4715 (1999)) pour la tubulin-α et DIH ; Hayes et al. (Dev Biol 312 (1), 115 (2007)) pour Tex15 et Pohl et al. (Dev Gènes Evol 214 (4), 200 (2004)) pour Foxjl
11-2. Expression des miRNA dans les cellules sélectionnées
II-2.A. cellules HAECs
Sur l'ensemble des miARN humains connus aujourd'hui (environ 750), les Inventeurs ont ainsi trouvé dans un premier temps à l'aide de la technique de séquençage haut-débit (HTS) de miARN que 115 miARN se retrouvaient exprimés au cours de la différenciation avec une valeur d'intensité supérieure à 8 (correspondant au Log2 du nombre normalisé de miARN séquences).
A l'aide de la technique de séquençage, il est possible de rendre compte de l'abondance en pourcentage de chacun des miARN séquences. Les Inventeurs ont ainsi pu établir de manière surprenante que 26 miARN étaient présents au sein des différents stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain avec une abondance supérieure à 1 % (indiqués dans la Figure 2 et le Tableau IUA ci- dessous).
Les 26 miARN identifiés couvrent à eux-seuls de l'ordre de 80% de tous les miARN exprimés dans l'épithélium respiratoire humain ; cette quantité montre leur implication dans le processus de régénération et/ou de diffrenciation du tissu épithélial respiratoire.
Une analyse plus fine de ces 26 miARN montre que 22 sont significativement régulés dans au moins un des quatre stades de différenciation de l'épithélium respiratoire humain et représentent environ 70 % du total des miARN : 13 miARN sont surexprimés tandis que 9 miARN sont réprimés (voir la Figure 2B et le
Tableau IV ci-après).
La valeur de modulation (aussi désignée ratio du niveau d'intensité d'expression en Iog2 à deux stades de différenciation) est calculée par la différence entre les niveaux d'intensité d'expression en Iog2 aux deux stades de différenciation indiqués en haut de chaque colonne.
Tableau IHA. miARN significativement exprimés dans l'épithélium respiratoire humain et avec une abondance supérieur à 1% à au moins un stade de différenciation, identifiés par séquençage de miARN haut-débit (HTS).
O
Tableau IV. miARN significativement exprimés et modulés au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire, avec une abondance supérieur à 1% identifiés par séquençage de miARN haut-débit (HTS).
W
Les Inventeurs ont ensuite utilisé les puces miARN Agilent pour étudier le répertoire d'expression des miARN de répithélium respiratoire humain et comparer les résultats obtenus en séquençage haut-débit avec ceux obtenus avec des puces commerciales miARN Agilent®. A l'aide de cette technique, 48 miARN sont retrouvés significativement exprimés et modulés (Log2 du niveau d'intensité de l'expression > 8 ; 1 < Iog 2 (ratio) < -1 et une valeur P ajustée < 0,05) dans au moins un des quatre stades de différenciation (voir la Figure 3 et le Tableau V).
Tableau V. miARN significativement exprimés et modulés au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire identifiés par puces miARN Agilent®
En comparant les miARN que l'on retrouve significativement modulés et exprimés dans au moins une condition de culture cellulaire en séquençage haut-débit de miARN (HTS) ou en puces miARN Agilent®, il est obtenu une forte corrélation entre les résultats obtenus avec les deux techniques, avec un coefficient de corrélation r=0,9106 (voir la Figure 4).
En résumé, 26 miARN ont été détectés et sélectionnés en HTS dans au moins une des conditions de culture (avec une abondance d'expression supérieure à 1%) et 48 miARN sur puces miARN Agilent® (avec un niveau d'intensité d'expression en Iog2 supérieure à 8). Ce qui fait en comptant les miARN communs obtenus par les deux techniques, 61 miARN distincts significativement exprimés dans au moins une des conditions de différenciation de l'épithélium (60 figurent dans le Tableau Vl auxquels il faut ajouter hsa-miR-1975, voir le Tableau III).
Les 22 miARN identifiés comme significativement régulés et suffisamment abondants en HTS, sont retrouvés aussi modulés sur puces miARN Agilent® avec plus ou moins de significativité et avec des intensités plus ou moins fortes.
Comme décrit plus haut, les miARN sont synthétisés sous forme de précurseurs ayant une structure en épingle à cheveux puis subissent une dernière maturation par l'enzyme Dicer pour donner deux petits ARN simple brin (5p et 3p) dont un des deux brins dit mature va interagir avec le complexe RISC pour exercer sa fonction modulatrice tandis que l'autre brin complémentaire dit star (annoté mir-xy * ) va être dégradé. De ce fait, les Inventeurs ont mesuré systématiquement les deux brins de chacun des miARN à l'aide des différentes techniques utilisées (puces miARN, séquençage, PCR). Les Inventeurs ont pu observer que pour certains des miARN sélectionnés les deux brins (5p et 3p) sont modulés, mais un seul des deux brins pour un miARN sélectionné donné est retrouvé plus abondamment exprimé. W
Ul
. On peut noter que mir-449a, mir-449b, mir-449b*, mir-34a, mir-34b (3p), mir-34b* (5p), mir-34c (5p) sont retrouvés significativement modulés au cours de la différenciation et donc impliqués dans l'initiation et le maintien de l'état de différenciation de l'épithélium respiratoire.
Ces cinq miARN : mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b, mir-34c sont retrouvés fortement induits au cours de la différenciation, plus particulièrement au début de la ciliogénèse. Une fois induite, leur expression demeure élevée et stable tout au long de la différenciation y compris dans l'épithélium pleinement différencié. Le répertoire des miARN de l'épithélium complètement différencié se caractérise par une abondance remarquable de ces 5 miARN qui représentent près de 20% du nombre total de tous les miARN exprimés dans ce tissu. Concernant mir-34a, son induction est néanmoins moins forte que les quatre autres miARN et est retrouvée de manière plus précoce au stade ALI-D7.
De manière intéressante, les brins 5p de chacun des miARN mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b et mir-34c partagent une homologie de séquence au niveau de leur séquence de reconnaissance suggérant qu'ils ciblent en commun certains transcrits.
C'est pourquoi les Inventeurs ont ensuite concentré leurs efforts sur ces 5 miARN. Les niveaux de régulations de ces miARN ainsi que de mir-31 (qui est retrouvé réprimé au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire) ont été validés par une troisième approche par PCR quantitative (voir la Figure 5).
Ces 5 miARN surexprimés au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire appartiennent à deux familles de miARN distinctes : mir-449 et mir-34. Par ailleurs, la localisation génomique de mir-449a et de mir-449b est identique : tous deux sont localisés au niveau du deuxième intron du gène cdc20b, situé sur le chromosome 5 humain (5q11.2, chr5:54456388-54504760). La famille mir-34 est composée de mir-34a qui est localisé dans une région intergénique du chromosome 1 alors que les miARN mir-34b et mir-34c appartiennent au même cluster et sont localisés tous deux dans une région intergénique du chromosome 11. La famille mir-34 a été fonctionnellement reliée à la voie de signalisation p53.
II-2.B. Cellules épidermiques ciliées d'embryons de Xenope
Les réusltats obtenus pour ce modèle sont présentés dans le Tableau IMB ci-après et à la Figure 6 qui présente également des résultats pour les cellules HAEC.
Ces essais montrent que, là encore, la famille de microARN miR-449, et plus particulièrement le miR-449a, constituent de loin les microARN les plus fortement induits au cours ciliogénèse.
Tableau IMB - miARN significativement exprimés dans les cellules ciliées de l'épiderme d'embryon de xénope, comparaison avec des cellules non ciliées
II-2.C. Discussions
Alors que les miR-449 représentent moins de 0,01% de toutes les séquences de microARN dans les cellules HAECs au cours de leur multiplication, ces miR-449 représentent plus de 8% des microARN exprimés dans les cellules HAECs différenciées (voir la Figure 6 graphes a et b). De même, le miR-449a dans les cellules de Xenope augmente significativement au cours de la différenciation, représentant jusqu'à 39% de toutes les séquences de microARN dans ciliées d'expiants épidermique (voir la Figure 6, graphes c-d).
Comme indiqué plus haut, les miR-449 et les miR-34 appartiennent à une même superfamille de microARN. De façon intéressante, on note que l'expression des membres de la famille miR-34 a été également été induite au cours de la ciliogenèse dans les deux modèles (voir la Figure 6, graphes a et b), même si elle l'est dans une moindre mesure que celle des miR-449.
La famille des miR-449 semble être conservée chez les vertébrés : l'étude des loci synténiques de Cdc20b (où est localisé le cluster miR-449 chez l'homme et chez la grenouille) a révélé l'existence de miR-449 dans tous les génomes de vertébrés totalement ou partiellement séquences. Les cellules HAECs différenciées et les cellules ciliées de l'épiderme de Xenopus laevis sont constitués d'un mélange de différents types cellulaires, incluant des cellules basales, des cellules muco-sécrétrices et des cellules multiciliées.
L'hybridation in situ sur les cultures primaires HAEC (voir les clichés a et c de la Figure 7) et sur le tissu bronchique de l'homme (voir les clichés e et g de la
Figure 7) a révélé que les miR-449 ont été exprimées dans les cellules cylindriques multiciliées mais pas dans les cellules basales (voir le cliché a de la Figure 7) ou dans les cellules sécrétrices mucδAC-positives (voir le cliché e de la Figure 7).
Ces résultats ont été confirmés par les essais de séquençage haut débit sur des fractions enrichies en cellules cylindriques (principalement composées de cellules multiciliées et de quelques cellules muco-sécrétrices) et en cellules basales, dérivées de l'épithélium des voies respiratoires de l'homme.
Le graphe d de la Figure 7 montre un enrichissement des miR-449 dans la fraction de cellules ciliées, tandis que l'expression des miR-34 observée est plus uniforme et a été observée dans les deux types de cellules.
Enfin, l'hybridation in situ sur les cellules d'embryons de Xenope a révélé que l'expression des miR-449 a été restreinte aux cellules ciliées, cellules qui sont positives au marquage à la tubuline acétylée (voir les clichés h et I de la Figure 7).
L'ensemble de ces résultats montrent que les miR-449 sont les microARN les plus abondants des cellules multiciliées de vertébrés.
III- Détermination des cibles spécifiques des miARN sélectionnés
111-1. Identification du type cellulaire spécifique de chaque miARN
Comme l'épithélium respiratoire natif, le modèle de différenciation in vitro utilisé dans ces essais est constitué de cellules basales, de cellules ciliées et de cellules sécrétrices de mucus. En vue d'identifier les répertoires des miARN spécifiques à chacun des types cellulaires, les Inventeurs ont utilisé le tri cellulaire par cytométrie de flux à l'aide de marqueurs spécifiques (Hajj, R. et al. 2007). A l'aide de cette technique, des cellules respiratoires adultes progénitrices (correspondant a priori à des cellules basales) ont été isolées, sélectionnées et triées (de telles cellules apparaissent doublement positives pour la tétraspanine CD151 et pour le facteur tissulaire) des cellules pyramidales (/.e. les cellules ciliées et les cellules sécrétrices de mucus) qui apparaissent négatives pour ces mêmes marqueurs. Ces purifications ont été réalisées à partir de polypes ou de cornets nasaux issus de 3 donneurs distincts.
Après avoir extrait les ARN totaux, les profils d'expression des miARN ont été établis à l'aide de puces commerciales Agilent® ou par séquençage à haut-débit
(HTS). Les deux approches expérimentales corroborent pour plusieurs miARN sélectionnés dont mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b, mir-34b* (mir-34b-5p), mir-34c et mir-34c* (mir-34c-3p) leur expression spécifique dans les cellules épithéliales ciliées. De plus, cette expérience de tri cellulaire permet de montrer que les miARN réprimés dans les cellules en culture (e.g. mir-31 , mir-31 * , mir-205, mir-130a, mir-193b) sont plus spécifiques des cellules basales (voir la Figure 8 et le Tableau VII). Pour la première fois, les Inventeurs attribuent ainsi de manière spécifique un répertoire d'expression des miARN à des types cellulaires distincts de l'épithélium respiratoire au cours de la différenciation.
Tableau VII. miARN spécifiques des cellules basales ou des cellules pyramidales (ciliées+sécrétrices) identifiés par HTS et puces Agilent®.
111-2. Identification des ARNm cibles des miRNA sélectionnés
Un enjeu majeur dans la biologie des miARN est de pouvoir identifier et caractériser expérimentalement les ARNm cibles qu'ils régulent. Dans cette perspective, ont été combinées des approches in silico (logiciels bioinformatiques prédictifs de cibles), des approches expérimentales (puces transcriptomes, expression ectopique de miARN ainsi que de vecteurs rapporteur contenant la partie 3'-UTR du gène d'intérêt fusionné à la luciférase). Des expériences complémentaires ont utilisé des approches d'immunocytochimie, de vidéo-microscopie et de biochimie.
Plusieurs algorithmes de prédiction de cibles ont été proposés. Ils sont basés généralement sur : i) la complémentarité entre le miARN et le 3'UTR de l'ARNm cible au niveau de la région 5' du miARN (séquence de reconnaissance) ; ii) la conservation phylogénétique de cette séquence dans le 3'UTR de l'ARNm cible.
Afin de déterminer les gènes cibles potentiellement régulés par ces miARN d'intérêt, les Inventeurs ont procédé à l'établissement d'un profilage des ARNm par puce d'expression (Affymetrix, human HuGene 1.0 ST microarrays). Les échantillons analysés sont les mêmes que ceux qui ont servi pour la mesure des miARN au cours de la différenciation. Une approche complémentaire a consisté à évaluer le transcriptome de cellules épithéliales respiratoires après manipulation du niveau d'expression des miARN sélectionnés par transfection. Une sélection de gènes-cibles en relation avec la régénération et la différenciation de l'épithélium a été réalisée à l'aide de supports bioinformatiques (Mediante, Ingenuity Pathway™). Les Inventeurs ont ainsi pu établir un lien fonctionnel entre les miARN précédemment identifiés et un certain nombre de transcrits impliqués dans la régénération et la différenciation de l'épithélium respiratoire humain. Les résultats obtenus montrent que 500-1000 transcrits sont associés à la différentiation (voir la Figure 9).
Seule l'expression de quelques gènes varie entre ALI-FC and ALI-WD, indiquant une stabilité de l'expression des ARN une fois la ciliogénèse enclenchée.
111-3. Identification in silico des gènes cibles putatifs communs des brins 5p des miARN mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b et mir-34c
Les gènes cibles prédits ont été récupérés pour chacun des brins 5p des 5 miARN sélectionnés mir-449a, mir-449b et mir-34a, mir-34b-5p (mir-34b*) et mir- 34c-5p qui partagent une homologie de séquence au niveau de leur séquence de reconnaissance, à l'aide d'outils bioinformatiques prédictifs (Le. TargetScan, mirbase target, picTar and Microcible 2to8) accessibles à travers l'interface réseau Mediante (www.microarray.fr). Les Inventeurs ont tout d'abord sélectionné les gènes cibles prédits communs aux 5 miARN d'intérêts, qui ont été validés à l'aide de la méthodologie détaillée ci-dessus. Sur près de 3500 cibles prédites pour chacun des miARN pris séparément, 1229 cibles sont communes aux 5 miARN sélectionnés. Les 1229 cibles prédites ont ensuite été comparées avec celles significativement réprimées (environ 1000, P<0.05) au cours de la différenciation plus particulièrement entre la condition pleinement différenciée et la première étape de prolifération non-différenciée (ALI-WD versus ALI-DO (n=3 donneurs)). Ainsi, les résultats montrent 62 gènes communs aux 5 miARN sélectionnés susceptibles de jouer un rôle clé dans la régénération de l'épithélium respiratoire (voir le Tableau VIII). Parmi ces gènes, est retrouvée notamment la cavéoline-1. Les résultats montrent que la cavéoline-1 est fortement inhibée tout au long de la différenciation (voir la Figure 8).
Tableau VIII. Listes des gènes cibles putatifs des microARN sélectionnés retrouvés inhibés au cours de la différenciation de l'épithélium respiratoire.
A cette liste de gènes cibles d'intérêt, peuvent être ajoutés les gènes Rfx2, Rfx3, FoxJ1 et STATH qui sont les cibles prédites par bioinformatique de miR-31 et/ou miR-130a.
IV- Validation de la Cavéoline-1 comme cible des miARN sélectionnés
La cavéoline-1 (Cav-1) est une protéine membranaire de 22-kDa essentielle à la formation de petites invaginations de la membrane plasmique appelées caveolae. Le gène Cav-1 est exprimé dans les cellules adhérentes (endothéliales, épithéliales, fibroblastes, cellules musculaires lisses).
Plus particulièrement, il a été montré que les cavéolines sont présentes à la surface membranaire des cellules épithéliales basales et ciliées, indiquant un rôle crucial dans ces types cellulaires (Krasteva, G. et al. (2006) Respir Res 7, 108). Une perte d'expression de cavéoline-1 peut conduire à une prolifération et une différenciation épithéliales défectueuses (Yang, G. et al. (2008) Exp Mol Pathol 84, 131-140).
En outre, les cavéolines ont été incriminées dans diverses susceptibilités aux pathologies respiratoires. Par exemple, les caveolae contiennent une variété de récepteurs, et la Cav-1 a été impliquée dans la réduction du nombre de récepteurs du transforming growth factor (TGF)-beta présents à la surface cellulaire. Des travaux antérieurs ont souligné la contribution probable d'un défaut de cavéoline-1 dans plusieurs pathologies respiratoires en conséquence d'une perturbation de la voie du TGF-beta Le Saux, CJ. et al. (2008) J Biol Chem 283, 5760-5768).
Par ailleurs, il a été montré que plusieurs micro-organismes utilisaient sélectivement les caveolae pour infecter les cellules (Norkin, L.C. et al. (2001) Exp CeII Res 266, 229-238). Comme ces caveolae sont localisés sur la surface basolatérale des cellules ciliées de l'épithélium respiratoire, ils pourraient notamment être impliqués dans l'endocytose d'agents infectieux lors d'une lésion épithéliale (Krasteva, G. et al., 2006). En effet, les adénovirus nécessitent une perte d'intégrité de l'épithélium ou des jonctions serrées pour accéder à la membrane basolatérale des cellules ciliées pour exercer leur pouvoir pathogène (Walters, R.W. et al. (1999) J Biol Chem 274, 10219-10226). Enfin, les cellules basales seraient plus vulnérables aux infections (Pickles, R. J. et al. (1996) Hum Gène Ther 7, 921-931 (1996). En accord avec cela, il a été montré que le nombre des caveolae est plus important au niveau des cellules basales que des cellules ciliées (Krasteva, G. et al., 2006). IV-1. Principe des essais
L'algorithme MicroCible a été utilisé ; il identifie 7 sites de fixation différents pour miR-34b-5p dans le transcrit de Cav-1 , contre 3 sites de fixation différents pour mir-34a/34c-5p, mir-449a/b. Les Inventeurs ont construit un vecteur d'expression d'un gène rapporteur dans lequel la partie 3'-UTR entière de la Cav-1 a été insérée en aval de la séquence codante de la luciférase. Ensuite, les cellules HEK293T ont été co- transfectées avec ce vecteur et chacun des 5 miARN sélectionnés (mir34a/b-5p/c- 5p/449a/b), indépendamment en comparaison avec un miARN contrôle négatif.
IV-2. Matériels et méthodes
Vecteurs d'expression 3'-UTR et mesure d'activité luciférase.
La séquence complète de la partie non codante (3'-UTR) de la cavéoline (SEQ ID N°178) est amplifiée par PCR puis clonée au niveau des sites Xhol and Notl du vecteur psiCheck2 (Promega).
Les microARN synthétiques d'intérêts (miR-34a, miR-34b * , miR-34c-5p et le miR contrôle négatif (miR-Neg1)) ont été synthétisés par la société Ambion (Applied Biosystems). Une transfection inverse a été réalisée sur les cellules HEK293T (20000 cellules par puits) dans une plaque 96-puits blanche avec 100ng de vecteur plasmidique psiCheck2 et 5 nmoles de miARN synthétique en utilisant comme agent de transfection la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 48 heures après la transfection, les activités des luciférases renilla et firefly ont été évaluées avec le kit Dual GIo Luciférase Assay System (Promega) et mesurées à l'aide d'un luminomètre (Luminoskan Ascent, Thermolab System).
Identification de voies de signalisation
Le software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, USA) a été utilisé pour identifier des réseaux d'interaction entre gènes d'intérêts et d'autres groupes fonctionnels. Les gènes ayant un ratio supérieur à 1 ont été sélectionnés. Ainsi, il est possible d'associer des fonctions biologiques et des maladies à nos résultats expérimentaux.
IV-3. Résultats
Les Inventeurs ont montré que mir-34b-5p inhibait significativement
(P<0.01) l'expression du gène de la luciférase lorsque celle-ci est fusionnée à la partie 3' non-codante de la cavéoline-1. Ces résultats additionnés au fait que les inventeurs retrouvent la cavéoline-1 fortement inhibée au cours de la différenciation indiquent que la Cav-1 est une cible spécifique de mir-34b * (mir-34b-5p) impliquée dans le processus de différenciation de l'épithélium respiratoire (Figure 11). II apparaît vraisemblable que les miARN, mir-449a, mir-449b, mir-34a et mir-34b*, ne réprimant pas la cavéoline-1 , agissent sur la régulation d'un ou plusieurs autres gènes.
Selon le même principe, l'essai réalisé avec la cavéoline a été reproduit avec d'autres gènes cibles d'intérêt ; la séquence 3'-UTR des gènes suivants a été clonée AREG (SEQ ID N°179), AURKA (SEQ ID N°180), CAPN13 (SEQ ID N°181), CCNB1 (SEQ ID N°182), CCNE2 (SEQ ID N°183), CDC6 (SEQ ID N°184), CDC25A (SEQ ID N°185), CENPK (SEQ ID N°186), CEP55 (SEQ ID N°187), CDC20B (SEQ ID N°188), E2F7 (SEQ ID N°189), FOXM1 (SEQ ID N°190), STATH (SEQ ID N°191) et TOP2A (SEQ ID N 0 192).
Tableau IX - liste des gènes cibles validé par au moins un des miARN sélectionné
Une cible est validée dès lors que son expression est inhibée par un miARN.
V- Identification par puces ADN (Affymetrix®) des cibles des miARN d'intérêts : mir-449a, mir-449b. mir-34a, mir-34b*. mir-34c-5p
Afin de déterminer les gènes modulés spécifiquement par l'expression d'un miARN d'intérêt, chaque miARN, mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b * et mir-34c- 5p, est transfecté dans des cultures primaires de cellules épithéliales respiratoires non- différenciées (HAECs) et étudié par puces transcriptome (Affymetrix®), 48h après la transfection, les gènes différentiellement modulés. Etant donné que mir-449a, mir-449b, mir-34a, mir-34b * , mir-34c-5p partagent le même « seed » (séquence 2-7), ils sont susceptibles d'interagir avec des cibles communes. De ce fait, 95 gènes communs ont été obtenus comme significativement modulés par ces miARN.
Classiquement il est admis qu'un miARN va directement agir sur ses
ARNm cibles en vue de réprimer leur expression. La Figure 12 montre l'enrichissement de gènes cibles contenant de la région complémentaire de la séquence de reconnaissance de ces miARN d'intérêt en réponse à 48h de transfection de chacun de ces miARN. Nous avons observé sur les 95 gènes modulés que 41 gènes sont significativement réprimés (voir le Tableau X).
Sur ces 41 gènes réprimés, 18 gènes sont des cibles prédites (par analyse in silico) communes aux 5 miARN sélctionnés (voir le Tableau Xl) et dont la régulation par lesdits miARN pourraient jouer un rôle clé dans la différenciation de l'épithélium respiratoire et dans la mise en place d'une stratégie thérapeutique de maladies respiratoires (mucoviscidose, asthme, bronchopneumopathies obstructives chronique, dyskinésie ciliaire primaire...).
Tableau IX : 41 gènes réprimés communs aux miARN mιr-34a, mιr-34b*, mιr-34c-5p, mιr-449a et mιr-449b après transfection dans des HAECs de chacun des miARN d'intérêt
VO
Tableau XI. Cibles prédites réprimées et communes à mιr-449a, mιr-449b, mιr-34a, mιr-34b * et mιr-34c-5p et réprimées après transfection dans des HAECs de chacun des miARN sélectionné
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O
Une analyse bioinformatique à l'aide du software Ingenuity Pathway Analysis software (IPA) (Ingenuity Systems, Mountain View, USA) a permis d'identifier des réseaux d'interaction entre ces gènes et d'associer des fonctions biologiques et des maladies aux résultats expérimentaux (voir la Figure 13).
Les voies régulées par l'expression des miARN sélectionnés sont des voies majeures de régulation du cycle cellulaire.
Vl- Etude de l'impact fonctionel de la suppression de l'expression des miR-449 sur la ciliogénèse
L'impact de l'extinction de l'expression des miR-449 sur la ciliogénèse a ensuite été étudié.
Vl-A. Matériels et méthodes
Cellules HAECs
Six cultures indépendantes de cellules HAEC ont été transfectées avec un oligonucléotide dirigé contre les miR-449 et conjugué à une molécule de cholestérol ; la ciliogénèse a été évaluée au cours du temps de régénération.
Ces essais utilisent un oligonucléotide antisens du miR-449a
(antagomir) lié en 3' par une liaison 2'-O-méthyl à une molécule de cholestérol et a pour séquence : 5'-a s C s C s agcuaacaauacacugc s C s a-Chol-3' (SEQ. ID. N°207) (les liaisons phosphorothioate sont indiquées par l'indice s ) (obtenu après de Eurogentec (Seraing, Belgique).
Cet antagomir cible le miR-449a d'Homo sapiens (correspondance complète) et le miR-449b avec un mésappariement.
Le contrôle négatif utilisé est le Clear-miR(tm) de séquence : 5'- c s a s uscgucgaucguagcg s c s a-Chol-3' (SEQ. ID. N°208) de Eurogentec.
L'antagomir (100 μM) a été pré-incubé dans du sérum de veau foetal
(SVF) pendant 30 min RT. Ensuite, le mélange antagomir-SVF dans un milieu de différenciation (20 μM d'antagomir) est ajouté sur la face apicale des cellules HAECs primaires. Après 2h à 37°C, le mélange est retiré pour restaurer l'interface air-liquide.
La transfection est renouvelée tous les 5 jours avec un antagomir fraîchement préparé jusqu'à ce que les cellules de contrôles aient atteint une différenciation complète (généralement après 21 jours).
Xenopus laevis.
Les oligonucléotides morpholino (MO) dirigés contre les miR-449 (GeneTools, LLC, Philomath, Oregon, USA) ont pour séquence :
- MO-449a : 5'-ACCAGCTAACATTACACTGCCT-3' (SEQ. ID. N°209)
- MO-449b : δ'-GCCAGCTAAAACTACACTGCCT- 3' (SEQ. ID. N°210)
- MO-449C : δ'-ACAGCCAGCTAGCAAGTGCACTGCC-S' (SEQ. ID. N°211) - et le MO de contrôle : 5'-TGCACGTTTCAATACAGACCGT-3' (SEQ. ID. N°212)
Le MO anti-DLL1 utilisé est celui décrit par Morichika. et al. (Dev Growth Differ 52 (2), 235 (2010).)
Vl-B. Résultats et discussions
Le miR-449 invalidé par son antagomir conduit à une réduction significative du nombre de cellules HAECs ciliées au stade ALI-D21 (moyenne de l'inhibition de la ciliogenèse: 2,3 ± 0,3, n = 6, P <0,001) (voir la Figure 14), parallèlement à une réduction du même ordre de l'expression de miR-449 (Figure 14, cliché b).
MiR-449 a également été invalidé dans les cellules d'embryons de
Xenope par injection épidermique d'un mélange d'oligonucléotides morpholino ciblant le miR-449 mature. L'invalidation de miR-449 empêche la multiciliogénèse, tel que révélé par coloration à la tubuline acétylée au stade de développement embryonnaire du bourgeon caudal et chez les têtards (n = 112) (voir la Figure 14, clichés c à i).
La multiciliogénèse exige: (i) une sortie définitive du cycle cellulaire, suivie de (ii) d'une centriologénèse caractérisée par la multiplication de centaines de corps basaux, dérivés de centrioles nouvellement synthétisés ; (iii) la migration des corps basaux jusqu'à la membrane apicale où ils agissent en tant que centres d'organisation des microtubules et permettent l'assemblage des axonèmes mobiles.
Dans les deux modèles étudiés, le ratio de cellules tubuline-positives
(coloration des cils) et de cellules centrine-2-positives (coloration des corps basaux) n'est pas affecté par la suppression de l'expression de miR-449, ce qui suggère que miR-449 agit avant la formation des centrioles.
Il est intéressant de noter que, alors que l'invalidation de miR-449 dans l'épiderme de Xenope supprime la multiciliogénèse, elle n'a pas supprimé l'expression des ARNm des marqueurs des cellules ciliées incluant l'α-tubuline, Tex15 et le facteur de transcription Foxji (voir la Figure 15). Ces données indiquent que miR- 449 est nécessaire à la différenciation terminale, mais pas à la spécification des cellules multiciliées, confirmant ainsi le rôle de miR-449 comme régulateur principal de la ciliogenèse chez les vertébrés.
VII- Effet d'une transfection de miR-449 sur les cibles de miR-449
Afin d'évaluer l'impact de miR-449 sur la ciliogenèse, il est apparu souhaitable de vérifier que les cibles de miR-449 étaient inhibées au cours de la différenciation terminale et après transfection de miR-449. VII-A. Matériels et méthodes
Analyse du cycle cellulaire par cvtométrie de flux
Les cycles cellulaires de cellules A549 d'adénocarcinome du poumon sont synchronisées par une culture d'une nuit par carence en sérum puis transfectées avec les microARN ; les cellules sont ensuite cultivées en DMEM supplémenté avec L- glutamine et FCS à 10% jusqu'à 30% de confluence. Les cellules sont collectées 48h plus tard, fixées avec de l'éthanol 80% et colorées avec 0,1 ml d'une solution d'iodure de propidium (37°C, 30 minutes) contenant une RNAse A (50 μg/ml).
Les données sont lues sur un cytomètre en flux FACScalibur (Becton- Dickinson). Les pourcentages de cellule en phase G1 , S et G2+M ont été calculés avec le logiciel Pro Cellquest.
Construction des plasmides et mesures de l'activité luciférase
Des séquences complètes ou partielles de la région 3' non traduite de Areg, Ccnbi , Ccne2, Cdc25a, DIH et Notchi ont été amplifiées et clonées dans le vecteur psiCheck2 (Promega).
Les constructions de vecteurs psiCheck ainsi obtenues ont été cotransfectées avec des microARN synthétiques ou un contrôle négatif (Ambion, Applied System) dans des cellules HEK293T. L'activité luciférase est mesurée tel que décrit par Pottier et al. (PLoS One 4 (8), e6718 (2009)).
VII-B. Résultats
Les cibles de miR-449 ont été définies par l'analyse des profils d'expression suivants : (i) à quatre stades de régénération de cellules HAECs (ALI-DO, ALI-D7, ALI-D14, ALI-D21), (ii) avec cellules HAECs en multiplication transfectées avec miR-449. L'annotation fonctionnelle des ARNm différentiellement exprimés par Gène Set Enrichment Analysis (GSEA) (Edgar et al. Nucleic Acids Res 30 (1 ), 207 (2002)) révèle une augmentation significative des gènes associés au stade G2/M et à la ciliogénèse (voir la Figure 16).
Les transcrits modulés par miR-449 sont analysés avec des outils de prédictions de cibles des microARN (http://www.microarray.fr: 8080/merqe/index) conduisant à l'identification de plusieurs cibles potentielles de ce microARN, qui ont été validés avec un test luciférase (Figure 17, clichés a, c).
Un premier groupe de cibles validées de miR-449a/b comprend l'amphiregulin (Areg), la cycline B1 (Ccnbi), la cycline E2 (Ccne2), et la cell division cycle 25 homolog A (Cdc25A), qui codent pour des protéines impliquées dans régulation du cycle cellulaire. En effet, la transfection de miR-449 conduit à l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 (Figure 17b), tel que rapporté par Feng, M. et al. (CeII Cycle 9 (2), 213 (2010)), Lize et al. (CeII Death Differ (2009), Noonan et al. (Oncogene 28 (14), 1714 (2009)) et Yang, X. et al. (Gènes Dev 23 (20), 2388 (2009)), et est une étape cruciale avant le démarrage de la centriogénèse.
Un deuxième groupe de cibles validées de miR-449 se compose de Notchi et du ligand de Notch, DLL1 (Figure 17c). De façon intéressante, le blocage de la voie de signalisation Notch avec un antagoniste sécrétase gamma (DCT, 10 uM) pendant la régénération des cellules HAEC potentialise significativement la ciliogénèse (Figure 17d) ce qui est en accord avec la revue de Tsao et al. (Development 136 (13), 2297 (2009)).
Ces résultats sont cohérents avec l'observation que les précurseurs des cellules ciliées de l'épiderme de Xénope expriment transitoirement le ligand DIH de
Notch au moment de leur spécialisation et que l'expression de DIH diminue rapidement avec le temps parallèlement avec l'accumulation miR-449 dans ces progéniteurs
(Figure 17e).
Comme cela pouvait être prévu à partir de cette observation, l'expression endogène de DIM est restée élevée dans les précurseurs des cellules ciliées des embryons modifiés avec le MO miR-449 (Figure 17 e et f) suggérant que miR-449 réprime l'expression de DIH .
VIII- Effet de l'activité soutenue de DIM sur la cilioqénèse.
Les conséquences d'une activité soutenue de DIM sur la ciliogénèse a ensuite été évaluée.
L'injection d'un ARN synthétique de DIH dépourvue de site de liaison à miR-449 a pour conséquence (1) une spécialisation excessive des cellules ciliées, (2) une ciliogénèse déficiente dans \a grande majorité de ces cellules, phénotype identique à celui observé chez les embryons dépiétés en miR-449 (Figure 17g).
L'inhibition latérale par la signalisation Notch est connue pour supprimer l'identité de la cellule multiciliée. L'augmentation de la spécification des cellules ciliées observée après une surexpression de DIH est probablement causée par l'inhibition de l'activité de Notch, tel que rapporté par Deblandre et al. (Development 126 (21), 4715 (1999)).
Paralèllement, la suppression de l'expression de DIH endogène par des oligonucléotides morpholinos a conduit à une spécification excessive des cellules ciliées (Figure 17g). Ainsi, miR-449 peut déclencher la multiciliogénèse en réprimant l'expression de DIH . À l'appui de ce modèle, une multiciliogénèse déficiente causée par l'extinction de l'expression de miR-449 est efficacement restaurée l'inhibition de la cible de miR-449, DIM (Figure 17g).
Ainsi ces résultats montrent que la répression de l'expresion de DIH est au centre du mécanisme d'action de miR-449.