GASTROINTESTINAL

DESCRIPCION

Sector de la técnica

La presente invención se encuentra dentro de la biología y la medicina pudiendo aplicarse a la industria alimentaria y farmacéutica. La invención se refiere al uso de péptidos y/o hidrolizados enzimáticos de proteínas lácteas para mejorar la protección del tracto intestinal mediante la estimulación de la secreción de mucinas, y a las composiciones que contienen dichos péptidos. Además, la presente invención también recoge nuevas secuencias peptídicas con actividad opioide .

Estado de la técnica

Durante los últimos años, muchas de las investigaciones sobre la fracción proteica de los alimentos se han enfocado al estudio de los péptidos biológicamente activos presentes en la secuencia de las mismas . Estos péptidos se encuentran en estado inactivo cuando forman parte de la proteína precursora pero pueden liberarse mediante hidrólisis enzimática, bien durante la digestión gastrointestinal o durante el procesado de los alimentos. Una vez liberados, los péptidos pueden actuar como compuestos biológicamente activos en el organismo. Así, por ejemplo, se ha demostrado que pueden ejercer actividad opiode, antihipertensiva o antimicrobiana; y cada vez existe más evidencia de que pueden tener actividad en el sistema inmune o mejorar la biodisponibilidad de minerales .

El intestino es el órgano responsable de la absorción de nutrientes, ejerce funciones de barrera, de reconocimiento de señales y de síntesis de compuestos bioactivos. Estas funciones están reguladas por hormonas y citoquinas, pero se sabe que ciertos componentes de la dieta también pueden jugar un papel fundamental en la modulación de dichas funciones. Las células epiteliales intestinales, que se encuentran formando una monocapa que cubre toda la superficie del tracto gastrointestinal, son especialmente importantes en esta modulación porque interaccionan directamente con el contenido intestinal, incluyendo alimentos, sus digeridos y la flora bacteriana. Por lo tanto, el alimento, además de una fuente de nutrientes, puede actuar como un "modulador" de distintas funciones fisiológicas. El órgano donde este concepto puede aplicarse directamente es el tracto gastrointestinal porque está en contacto con una gran cantidad de sustancias que ingerimos. La modulación de las funciones intestinales mediante la dieta ha sido recientemente calificada como esencial para mejorar la salud humana (Shimizu and Son, 2007 Curr. Pharm. Design 13: 885-895) .

Una función clave del epitelio intestinal es actuar como barrera física entre el medio externo y el interno. La superficie intestinal está cubierta por una capa mucosa que juega un importante papel fisiológico que incluye la lubricación de la superficie celular, la defensa frente a la colonización por bacterias patógenas y la protección frente a las proteasas intestinales. Los principales componentes estructurales del mucus son las mucinas, glicoproteínas de alto peso molecular producidas por las células caliciformes de la superficie epitelial. El epitelio del intestino, tanto delgado como grueso, contiene células caliciformes productoras de mucinas. La mucina 2 es la mucina formadora de gel predominante en el intestino sano de humano, rata y ratón. Cualquier situación experimental o patológica que cambie directa o indirectamente la cantidad de mucina, su estructura o el contenido acuoso o iónico va a provocar una alteración de la barrera mucosa. La úlcera gástrica o la colitis ulcerosa son ejemplos de las consecuencias de un fallo en la expresión y/o composición del mucus gástrico o intestinal, respectivamente.

Estudios recientes han demostrado que algunos componentes de la dieta pueden tener una influencia positiva sobre las características del mucus intestinal, produciendo un aumento en la secreción o en la expresión de mucinas o incluso aumentando el número de células caliciformes intestinales, aunque el modo de acción de cada compuesto puede diferir (Barceló et al., 2000 Gut 46:218-224). Por ejemplo, la fibra dietética parece favorecer la capacidad total de secreción de mucinas en el lumen del intestino delgado, aunque el efecto estimulador en la secreción es dependiente tanto de la cantidad como de la calidad de la fibra dietética ingerida (Tanabe et al, 2005 J. Nutr. 135: 2431-2437) y puede deberse a un incremento en el número de células caliciformes

(Ito et al., 2009 J. Nutr. 139: 1640-1647). Respecto a los genes codificadores de las mucinas (MUC) , se ha demostrado que concentraciones bajas de butirato estimulan la expresión de MUC2

(Gaudier et al., 2004 Am. J. Physiol. Gastrointest . Líver Physiol. 278: G1168-G1174) mientras que elevadas concentraciones de este ácido graso de cadena corta reprimen la expresión, lo que puede hacer disminuir la función intestinal de barrera (Burger Van Paasen et al., 2009 Biochem. J. 420: 211-219).

En el campo de las proteínas alimentarias se está investigando el papel de las proteínas y péptidos en la regulación de distintas funciones a nivel intestinal. En particular, Trompette et al., 2003 ( J. Nutr. 133: 3499-3503) han comprobado que algunos péptidos lácteos, concretamente el péptido YPFPGPI, /3-casomorfina 7, que corresponde al fragmento (60-66) de la /3-caseína A2 bovina, induce la producción de mucina en yeyuno de rata, mediante la activación del sistema nervioso entérico y la interacción con receptores opioides. También se comprobó que un hidrolizado de a-lactoalbúmina inducía la liberación de mucinas mientras que ni la caseína ni una mezcla de aminoácidos producían este efecto. Puesto que esta actividad secretora desaparecía en presencia de naloxona, un antagonista opioide, se planteó que la secreción se producía por un mecanismo nervioso implicando la activación de receptores opioides tipo μ (Claustre et al., 2002 Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283: G521-G528; Trompette et al., 2003 J. Nutr. 133: 3499- 3503). La presencia de estos receptores en células intestinales sugiere la posibilidad de que las /3-casomorfinas , que se producen en el lumen intestinal durante la digestión, pueden controlar la producción de mucinas mediante la acción directa sobre las células caliciformes intestinales. Posteriormente, se ha demostrado que el péptido YPFPGPI, /3-casomorfina 7, induce la secreción de la mucina 5AC en células caliciformes humanas de colon (HT29-MTX) (Zoghbi et al., 2006 Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290: G1105- G1113; Plaisancié et al. 2010 Int Patent Appl. WO2010/130956) . Sin embargo, no todos los péptidos opioides tienen actividad sobre la producción de mucinas intestinales . La administración luminal en yeyuno de rata de los péptidos /3-casomorfina-6 bovina (YPFPGP) , β- casomorfina 4 (YPFP) y /3-casomorfina 4-NH ₂ (YPFF-NH ₂ ), aunque poseen afinidad por receptores opioides (Teschemacher et al., 1997 Biopolymers 43:99-117; Meisel and FitzGerald 2000 Br. J. Nutr. 84:S27-S31), no inducen la secreción de mucinas (Trompette et al., 2003 J. Nutr. 133: 3499-3503).

Por otro lado, con el fin de establecer una asociación entre la producción de mucinas y su biosintesis, se han realizado estudios de expresión de los genes que codifican para mucinas. En células intestinales de rata (DHE) se ha demostrado que la exposición al péptido YPFPGPI, /3-casomorfina 7, provoca un aumento en la expresión de los principales genes implicados en la producción de mucinas de rata (rMuc) , rMuc2 y rMuc3. En células humanas HT29-MTX, este péptido también da lugar a un aumento en la expresión del gen codificador de la principal mucina secretada, MUC5AC (Zoghbi et al., 2006 Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290: G1105- G1113) . En un estudio in vivo, se ha observado un aumento en la expresión de los genes rMuc3 y rMuc4 en ratas a las que se les administró una dieta rica en caseínas hidrolizadas comparándola con una dieta rica en aminoácidos y una dieta exenta de proteínas (Han et al., 2008 J. Agrie. Food Chem. 56: 5572-5576).

Sin embargo, aunque se conoce que los hidrolizados que contienen β- casomorfina 7 tienen actividad secretora de mucinas, no se han identificado otras secuencias peptídicas que estén presentes en hidrolizados de caseínas lácteas y que sean también responsables de inducir secreción de mucinas. Por tanto, la presente invención proporciona nuevas secuencias peptídicas con actividad estimulante de la secreción de mucinas intestinales en células intestinales humanas . Esta actividad biológica no habría sido previamente descrita para estos péptidos, por lo que supone un nuevo uso de los mismos. Además, se describe la producción de las mismas mediante hidrólisis enzimática de proteínas alimentarias de bajo costo (proteínas suero, caseinatos, etc.), dando lugar a hidrolizados que contienen los nuevos péptidos en concentraciones relevantes y por tanto con actividad protectora a nivel intestinal.

Descripción de la Invención

La presente invención proporciona hidrolizados de proteínas de suero y caseína que contienen una serie de péptidos que afectan positivamente a la actividad secretora de mucinas, estimulando la formación de la mucosa intestinal y que afectan a la expresión del gen MUC5AC en células epiteliales intestinales secretoras de mucinas (HT29-MTX). También se describen nuevos péptidos derivados de las caseínas capaces de inducir la secreción de mucinas y que presentan actividad opioide en íleon de cobayo.

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de al menos un péptido bioactivo aislado que: a) posee actividad estimulante de secreción de mucinas y/o actividad opioide; b) está presente en un hidrolizado enzimático de al menos una proteína de la leche seleccionado entre un hidrolizado de proteínas de suero (preferentemente un hidrolizado de proteínas de suero con tripsina) o un hidrolizado de caseína de la leche (preferentemente un hidrolizado de caseína de la leche con pepsina) ; c) su estructura comprende una secuencia con al menos dos aminoácidos aromáticos, donde el primer aminoácido aromático es una tirosina situada en primera o segunda posición respecto al extremo N-terminal de dicha secuencia y el segundo aminoácido aromático es una fenilalanina o una tirosina situada en tercera o cuarta posición con respecto a la primera tirosina (lo que quiere decir que entre el primer residuo de tirosina y el segundo aminoácido aromático hay uno o dos aminoácidos de separación) ; y donde dicha estructura se selecciona entre SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 y SEQ ID No: 12; para la fabricación de una composición farmacéutica o un ingrediente funcional para estimular la formación de la mucosa intestinal. La formación de dicha mucosa intestinal se debe a una mayor secreción de mucinas que se induce por los péptidos aislados anteriores. De hecho, se ha comprobado que la formación de mucinas se debe al incremento de la expresión del gen MUC5AC en células caliciformes humanas secretoras (HT29-MTX), cuando se exponen a al menos uno de los péptidos bioactivos aislados . Esta estimulación de la formación de la mucosa intestinal por parte de los péptidos bioactivos anteriores, resulta de utilidad para favorecer la protección gastrointestinal.

En la Tabla 1 se muestra la lista de las secuencias de los péptidos bioactivos SEQ ID No: 1 a SEQ ID No: 12 contemplados en el ámbito de la presente invención.

Tabla 1 .

YLLF SEQ ID No: 1 Secuencia de aminoácidos del fragmento 102-105 de la /3-lactoglobulina bovina

YLLF-NH ₂ SEQ ID No: 2 Secuencia de aminoácidos del fragmento 102-105 amidado de la /3-lactoglobulina bovina

YPSF-NH ₂ SEQ ID No: 3 Secuencia de aminoácidos del fragmento 41-44 amidado de la /3-caseina humana

YPFV-NH ₂ SEQ ID No: 4 Secuencia de aminoácidos del fragmento 51-54 amidado de la /3-caseina humana

YPFVE SEQ ID No: 5 Secuencia de aminoácidos del fragmento 51-55 de la /3-caseina humana

RYLGY SEQ ID No: 6 Secuencia de aminoácidos del fragmento 90-94 de la Q _sl -caseína bovina YLGY SEQ ID No: 7 Secuencia de aminoácidos del fragmento 91-94 de la Q _sl -caseína bovina

AYFYPEL SEQ ID No: 8 Secuencia de aminoácidos del fragmento 143-149 de la Q _sl -caseína bovina

YFYPEL SEQ ID No: 9 Secuencia de aminoácidos del fragmento 144-149 de la Q _sl -caseína bovina

YFYPE SEQ ID No: 10 Secuencia de aminoácidos del fragmento 144-148 de la Q _s i-caseína bovina

YFYP SEQ ID No: 11 Secuencia de aminoácidos del fragmento 144-147 de la Q _sl -caseína bovina

YFY SEQ ID No: 12 Secuencia de aminoácidos del fragmento 144-146 de la Q _sl -caseína bovina

En el ámbito de la presente invención, hidrolizado enzimático se refiere a la combinación de un sustrato proteico que sirve de material de partida y enzimas proteoliticas en una relación adecuada y en condiciones especificas de pH y tiempo de hidrólisis que da lugar a péptidos con la secuencia deseada.

El material de partida de la presente invención seria cualquier sustrato apropiado que comprendiese una o más proteínas o péptidos, de origen animal, vegetal, o procedentes de microorganismos, que contengan la secuencia de aminoácidos de los péptidos bioactivos de interés (SEQ ID No 1, SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5, SEQ ID No 6, SEQ ID No 7, SEQ ID No 8, SEQ ID No 9, SEQ ID No 10, SEQ ID No 11 y SEQ. ID. N° 12, tabla 1), preferiblemente leche, caseína o concentrados de proteínas de suero. Dado que todos ellos son secuencias lácteas, resulta obvio que podría usarse cualquier preparado que contenga las proteínas de partida: β-lactoglobulina, β-caseína, o ¾i-caseína de diferentes especies, o péptidos o fragmentos de las mismas de cualquier tamaño, solos o mezclados con otras proteínas. Por ejemplo: caseína entera, caseinatos y leche en sus diferentes formas de presentación, productos lácteos fermentados, hidrolizados de proteínas lácteas, subproductos lácteos, derivados lácteos para alimentación animal, etc. Dicho material de partida se disuelve o dispersa, a una concentración apropiada, en agua o en una disolución tampón, a un pH adecuado para la actuación de la enzima proteolitica . Puede emplearse cualquier enzima proteolitica capaz de romper la proteina presente en el material de partida y proporcionar los péptidos de interés, pero preferiblemente pepsina a pH 2,0-3,0 o tripsina a pH 7,5-8,5. También podrían emplearse microorganismos proteolíticos que llevasen a cabo una fermentación del sustrato y la hidrólisis de la proteína.

Las condiciones de hidrólisis: pH, temperatura, relación enzima- sustrato, interrupción de la reacción etc., se optimizan con el fin de seleccionar los hidrolizados más activos. En una realización particular, se obtienen los péptidos bioactivos empleando caseína hidrolizada con pepsina a pH 2,5, en una relación enzima/sustrato 4/100 (p/p) y realizando la hidrólisis a 37°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 minutos y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 6 horas. En otra realización particular, los péptidos se obtienen hidrolizando un concentrado de proteínas de suero con tripsina a pH 8,0, en una relación enzima/sustrato 5/100 (p/p) y realizando la hidrólisis a 37°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 minutos y 24 horas, pero, preferiblemente durante un tiempo inferior a 4 horas .

En el ámbito de la presente invención, la composición farmacéutica se refiere a la mezcla de un principio activo, o mezcla de principios activos, con los excipientes adecuados (lactosa, maltodextrina, etc.) para dar formas orales de administración, preferentemente comprimidos o cápsulas . Se entiende por principio activo los péptidos individuales, la mezcla de los mismos o los hidrolizados enzimáticos que los contienen. Las dosis de los péptidos de interés pueden estar comprendidas entre 1 a 10 mg/día, pero preferiblemente se administrarán a dosis de 5 a 7 mg/día.

En el ámbito de la presente invención, ingrediente funcional se refiere a un ingrediente alimentario que además de ejercer un efecto beneficioso en el individuo que lo consume por su valor nutritivo, demuestra satisfactoriamente mejorar una o más funciones en el organismo. La función en el organismo del ingrediente funcional viene referida tanto a la mejora de una función fisiológica, como a la disminución del riesgo a padecer una enfermedad. El ingrediente funcional puede contener los péptidos individuales, la mezcla de los mismos o los hidrolizados enzimáticos que los contienen, además de distintos excipientes con el fin de mejorar sus características organolépticas o tecnológicas (lactosa, fructosa, almidón, maltodextrinas , etc.). Este ingrediente funcional podría incorporarse a distintos alimentos compatibles con una dieta saludable como yogures, zumos, fórmulas infantiles, barritas de cereales, preparados y postres lácteos, preparados alimenticios en polvo, etc.

La composición farmacéutica o el ingrediente funcional anteriores son de utilidad para estimular la formación de la mucosa intestinal .

En una realización preferida, el péptido bioactivo aislado para la fabricación de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional comprende al menos un péptido seleccionado entre al menos uno del grupo que consiste en: SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2 y una combinación de ambos. Dichos péptidos SEQ ID No: 1 y/o SEQ ID No: 2 (Tabla 2) están presentes en hidrolizados de proteínas de suero (preferentemente en hidrolizados de proteínas de suero con tripsina) e incrementan la actividad secretora de mucinas en células epiteliales intestinales productoras de mucinas, y por tanto, estimulan la formación de la mucosa intestinal. Debe entenderse que el uso de un hidrolizado enzimático de proteínas de suero, que comprenda al menos uno de los péptidos individuales SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, o una combinación de los mismos, es igualmente válido para la elaboración de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional.

Tabla 2. Secuencias de péptidos lácteos con actividad secretora de mucinas derivados de proteínas de suero . YLLF SEQ ID No: 1

YLLF-NH ₂ SEQ ID No: 2

La tecnología disponible permite que los péptidos bioactivos identificados en la Tabla 2 (SEQ ID No: 1 y SEQ ID No: 2), al conocerse su secuencia, puedan obtenerse por síntesis química y/o enzimática, hidrólisis de proteínas de diferentes especies (vaca, oveja, cabra, etc.), hidrólisis de proteínas humanas recombinantes o por métodos recombinantes de producción heterologa.

En otra realización preferida, el péptido bioactivo aislado para la fabricación de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional comprende al menos un péptido seleccionado entre al menos uno del grupo que consiste en: SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12 y cualquier combinación de los mismos. Los péptidos SEQ ID No : 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No : 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 y/o SEQ ID No: 12 (Tabla 3) están presentes en hidrolizados de caseínas (preferentemente en hidrolizados de caseína de la leche con pepsina) e incrementan la actividad secretora de mucinas en células epiteliales intestinales productoras de mucinas, estimulando por tanto la formación de la mucosa intestinal.

Tabla 3. Secuencias de los péptidos lácteos con actividad secretora de mucinas derivados de caseínas .

YPSF-NH2 SEQ ID No: 3

YPFV-NH2 SEQ ID No: 4

YPFVE SEQ ID No: 5

RYLGY SEQ ID No: 6

YLGY SEQ ID No: 7

AYFYPEL SEQ ID No: 8

YFYPEL SEQ ID No: 9

YFYPE SEQ ID No: 10

YFYP SEQ ID No: 11 YFY SEQ ID No: 12

La tecnología disponible permite que los péptidos bioactivos identificados en la Tabla 3 (SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12), al conocerse su secuencia, puedan obtenerse por síntesis química y/o enzimática, hidrólisis de proteínas de diferentes especies (vaca, oveja, cabra, etc.) , hidrólisis de proteínas humanas recombinantes o por métodos recombinantes de producción heterologa.

En otra realización preferida, el péptido bioactivo aislado para la fabricación de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional comprende al menos un péptido seleccionado entre al menos uno del grupo que consiste en: SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5 y cualquier combinación de los mismos. Los péptidos SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 y/o SEQ ID No: 5 están presentes en un hidrolizado de la fracción de /3-caseína de la leche (preferentemente en hidrolizados de /3-caseína de la leche con pepsina) . Por lo tanto, para la elaboración de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional, según se entiende la invención, es posible utilizar al menos uno de los péptidos definidos por SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, o una combinación cualquiera de dichos péptidos, o un hidrolizado enzimático de la fracción de /3-caseína de la leche que comprenda al menos uno de dichos péptidos.

En otra realización preferida, el péptido bioactivo aislado para la fabricación de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional comprende al menos un péptido seleccionado entre al menos uno del grupo que consiste en: SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12 y cualquier combinación de los mismos. Los péptidos SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 y/o SEQ ID No: 12 están presentes en hidrolizados de la fracción de ¾i-caseína de la leche (preferentemente en hidrolizados de _sl - caseína de la leche con pepsina) , y como se mencionó anteriormente incrementan la actividad secretora de mucinas en células epiteliales intestinales productoras de mucinas. Además, cualquiera de los péptidos SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12 o una combinación de los mismos, además de actividad estimulante de la secreción de mucinas, presentan actividad opioide en preparaciones de íleon de cobayo (Tabla 4) . En consecuencia y al igual que en los casos anteriores, para la elaboración de la composición farmacéutica o del ingrediente funcional según la invención, es posible utilizar al menos uno de los péptidos individuales definidos por SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12, o cualquier combinación de dichos péptidos, o un hidrolizado enzimático de la fracción de ¾i-caseína de la leche que comprenda al menos uno de dichos péptidos . Al poseer estas secuencias actividad opioide podrían ejercer distintas funciones fisiológicas relacionadas con la interacción con receptores opioides a nivel intestinal como el retardo del tránsito intestinal, actividades relacionadas con el sistema inmune, etc.

Tabla 4. Secuencias de los péptidos lácteos derivados de caseínas con actividad opioide .

Debe entenderse que con el uso de al menos uno de los péptidos bioactivos aislados anteriores, para la fabricación de una composición farmacéutica o un ingrediente funcional para estimular la formación de la mucosa intestinal (y en consecuencia mejorar la protección gastrointestinal), como se describió anteriormente, la presente invención también contempla la protección de un péptido bioactivo aislado que: a) posee actividad estimulante de secreción de mucinas y/o actividad opioide; b) está presente en un hidrolizado enzimático de al menos una proteina de la leche seleccionado entre un hidrolizado de proteínas de suero (preferentemente un hidrolizado de proteínas de suero con tripsina) o un hidrolizado de caseína de la leche (preferentemente un hidrolizado de caseína de la leche con pepsina) ; c) su estructura comprende una secuencia con al menos dos aminoácidos aromáticos, donde el primer aminoácido aromático es una tirosina situada en primera o segunda posición respecto al extremo N-terminal de dicha secuencia y el segundo aminoácido aromático es una fenilalanina o una tirosina situada en tercera o cuarta posición con respecto a la primera tirosina; y donde dicha estructura se selecciona entre SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 y SEQ ID No: 12; para estimular la formación de la mucosa intestinal y/o favorecer la protección gastrointestinal, y por tanto para su uso como estimulante de la formación de la mucosa intestinal y/o como protector gastrointestinal. No obstante, es posible que para su aplicación, preferentemente dicho péptido se encuentre formando parte como un componente de una composición farmacéutica o de un ingrediente funcional, como los definidos anteriormente.

Del mismo modo, el uso del primer aspecto de la invención puede ser igualmente protegido como un método de tratamiento para estimular la formación de la mucosa intestinal y/o favorecer la protección gastrointestinal caracterizado porque comprende administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido bioactivo aislado que: a) posee actividad estimulante de secreción de mucinas y/o actividad opioide; b) está presente en un hidrolizado enzimático de al menos una proteína de la leche seleccionado entre un hidrolizado de proteínas de suero (preferentemente un hidrolizado de proteínas de suero con tripsina) o un hidrolizado de caseína de la leche (preferentemente un hidrolizado de caseína de la leche con pepsina) ; c) su estructura comprende una secuencia con al menos dos aminoácidos aromáticos, donde el primer aminoácido aromático es una tirosina situada en primera o segunda posición respecto al extremo N-terminal de dicha secuencia y el segundo aminoácido aromático es una fenilalanina o una tirosina situada en tercera o cuarta posición con respecto a la primera tirosina; y donde dicha estructura se selecciona entre SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 y SEQ ID No:

Según la presente invención, el término cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de los péptidos de la invención calculada para producir el efecto deseado. Concretamente, viene referido a la cantidad de péptido, o mezcla de péptidos, o de los hidrolizados que contienen los péptidos, que es capaz de inducir la secreción de mucinas a nivel gastrointestinal y así contribuir a la protección del mismo. Las dosis de los péptidos de interés pueden estar comprendidos entre 1 a 10 mg/día, pero preferiblemente se administrarán a dosis de 5 a 7 mg/día. Las dosis de los hidrolizados que los contienen pueden estar comprendidos entre 0.5- 5 g/día, pero preferiblemente se administrarán a dosis de 1-2 g/día .

Explicación detallada de las figuras

Figura 1. Efecto de los péptidos SEQ ID No: 5 (A), SEQ ID No : 6 (B) , SEQ ID No: 8 (C) en una concentración de 0,1 mM sobre la secreción de mucinas en células HT29-MTX determinado mediante ensayo de lectina conjugado a enzimas (ELLA) . Los datos están expresados como porcentaje de secreción de mucinas frente a control (células sin tratar) . Cada punto representa la media + error estándar de la media de tres réplicas biológicas por triplicado. Diferencias significativas obtenidas mediante ANOVA de dos vías aplicando el test de Bonferroni . ***P<0,001; *P<0,05. Figura 2. Efecto de los hidrolizados obtenidos de proteínas de suero (A), y de caseínas (B) en concentraciones de 0,1 y 1,0 % sobre el nivel de RNAm de MUC5AC determinado mediante PCR cuantitativa (RT-qPCR) entre 2 y 24 horas de exposición. Los datos están expresados como nivel de expresión relativa de MUC5AC frente al control (células sin tratar) , empleando ciclofilina como gen de referencia. Cada punto representa la media + el error estándar de la media de tres réplicas biológicas por triplicado. Diferencias significativas obtenidas mediante ANOVA de dos vías aplicando el test de Bonferroni . *P<0,05.

Figura 3. Efecto de los péptidos SEQ ID No: 2 (A), SEQ ID No: 6 (B) y SEQ ID No : 8 (C) en concentraciones de 0,5, 0,1 y 0,05 mM sobre el nivel de RNAm de MUC5AC determinado mediante PCR cuantitativa (RT-qPCR) entre 2 y 24 horas de exposición. Los datos están expresados como nivel de expresión relativa de MUC5AC frente al control (células sin tratar), empleando ciclofilina como gen de referencia. Cada punto representa la media + el error estándar de la media de tres réplicas biológicas por triplicado. Diferencias significativas obtenidas mediante ANOVA de dos vías aplicando el test de Bonferroni. **P<0,01; *P<0,05.

Figura 4. Efecto de los péptidos SEQ ID No: 9 (A) y SEQ ID No: 10

(B) en la preparación fibra longitudinal-plexo mientérico (FL-PM) de íleon de cobayo. Cada punto representa la media del porcentaje de inhibición de la respuesta contráctil inducida eléctricamente de 3-4 réplicas + error estándar de la media en al menos 3 animales diferentes por la administración acumulativa de los péptidos .

Ejemplos de realización de la invención

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad de los hidrolizados de de las proteínas de suero y caseínas y de los péptidos que contienen sobre la secreción de mucinas y la expresión del gen MUC5AC en células HT29- MTX. Además, se ilustra la actividad opioide de algunos de ellos en ensayos realizados en preparaciones de íleon de cobayo. a) MATERIALES Y MÉTODOS a.l) Péptidos e hidrolizados

La β-casomorfina 7 bovina f (60-66) de la β-caseina A2 de secuencia YPFPGPI se adquirió de Bachem (Bubendorf, Suiza) y se utilizó como control positivo. Los péptidos SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 11 y SEQ ID No: 12, y los péptidos oí-lactorfina humana y bovina f (50-53) de la OÍ- lactoalbúmina de secuencia YGLF-NH ₂ , la forma desaminada de la OÍ - lactorfina bovina f (50-53) de la α-lactoalbúmina de secuencia YGLF, la morficeptina bovina, f (60-63) de la β-caseina A2 de secuencia YPFP-NH ₂ , la neocasomorfina bovina f (114-119) de la β-caseina de secuencia YPVEPF y la exorfina de α-caseína bovina, f (91-96) de secuencia YLGYLE, se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida (FMOC) en un sintetizador 433A (Applied Biosystems, Warrington, UK) . La pureza de todos estos péptidos sintéticos fue superior al 90% verificándose mediante cromatografía líquida en fase inversa acoplada a espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS) .

En la preparación del hidrolizado de proteínas de suero, un concentrado de proteínas de suero (Friesland Foods Domo, Zwolle, Holanda) se disolvió en agua al 5% p/v y se calentó a 90°C durante 10 minutos. La hidrólisis se desarrolló aplicando tripsina porcina de grado alimentario (Biocatalysts , Nantgarw, Wales, UK) con una relación enzima-sustrato del 5% p/p, durante 3 horas a 37 °C y pH 8,0. La reacción finalizó mediante inactivación de la enzima por tratamiento térmico a 95 °C durante 15 minutos.

El hidrolizado de caseínas se obtuvo a partir de caseína comercial (Promilk 85, Arras Cedex, Francia) al 6% p/v en agua con un pH final de 2,5. La hidrólisis se llevó a cabo con pepsina de grado alimentario (Biocatalysts) en una relación enzima-sustrato del 2% p/p, añadiéndose dos veces (momento inicial y tres horas de hidrólisis) . Se incubó a 40 °C durante 6 horas con inactivación final de la enzima por calentamiento a 80-85°C durante 15 minutos. La identificación de los péptidos contenidos en los hidrolizados se realizó mediante HPLC-MS/MS. a.2) Análisis mediante RP-HPLC acoplado on-line a espectrometría de masas en tándem (RP-HPLC-MS/MS )

Se empleó un equipo Esquire-LC (Bruker Daltonik GMBH, Bremen, Alemania) . El equipo de HPLC (serie 1100) estaba formado por una bomba cuaternaria, un inyector automático, un sistema de desgasificación de eluyentes y un detector ultravioleta de longitud de onda variable (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) acoplado en línea a un espectrómetro de masas de trampa iónica Esquire 3000 (Bruker Daltonik) . La columna fue una columna Hi-Pore C18 (250 x 4,6 mm d.i., 5 \im de tamaño de partícula) (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) . El disolvente A fue una mezcla de agua y ácido trifluoroacético (1000:0,37) y el disolvente B una mezcla de acetonitrilo y ácido trifluoroacético (1000:0,27) . Se inyectaron 50 μΐ de muestra preparada a una concentración de 4,5 mg/ml. Se empleó un flujo de 0,8 ml/min, con un gradiente lineal del 0% al 50% de disolvente B en 60 minutos. El eluyente se monitorizó a 214 nm y el flujo de la muestra hacia el nebulizador del espectrómetro de masas fue de 275 μΐ/min. La ionización por electrospray (ESI) utilizó N2 como agente nebulizador (8 L/min) , presión de nebulización 60 psi, temperatura de secado 350 °C y un voltaje del capilar de 4 KV. Los espectros de masa se adquirieron en el rango de 100-2500 m/ z y se empleó un rampa de fragmentación comprendida entre 0,3 y 2 V. Como sistema de adquisición de datos se utilizó el programa Esquire ControlTM 5.0 (Bruker Daltonik) y para identificar la secuencia de los diferentes péptidos se utilizaron los programas informáticos Data AnalysisTM 3.0, Sequence EditorTM 2.1 y BiotoolsTM 2.1 todos ellos de Bruker Daltonik. a.3) Cultivos celulares

Se utilizó la línea celular HT29-MTX derivada de adenocarcinoma de colon humano, con capacidad de secreción de mucinas donada por la Dra. Thécla Lesuffleur (INSERM UMR S 938, París, Francia) . Las células se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado y 10 mL/L de penicilina-estreptomicina a 37 °C, en atmósfera humidificada con 5% de C0 ₂ . Los pases semanales se realizaron empleando tripsina/EDTA 0,05% (todos los reactivos eran de Gibco, Paisley, UK) . Las células se sembraron en placas de 12 pocilios con una densidad de 5><10 ⁵ células por pocilio (Nunc, Roskilde, Dinamarca) . La linea celular se utilizó entre los pases 12 y 22. Los experimentos se realizaron 21 días después de confluencia. Desde 24 horas antes del ensayo se trabajó con medio de cultivo sin suero ni antibiótico para eliminar la interferencia de proteínas u hormonas. El día del ensayo, se retiró el medio, se lavó dos veces la monocapa celular con buffer fosfato salino (PBS) y se adicionó el medio con los péptidos en concentración 0,05, 0,1 y 0,5 mM, incubándose a 37 °C durante tiempos comprendidos entre 30 minutos y 24 horas. En los pocilios control se añadió únicamente el medio de cultivo. A los tiempos seleccionados, se recogieron los sobrenadantes que se mantuvieron congelados a -70 °C hasta su análisis. La extracción y posterior purificación del ARN celular se llevó a cabo con el kit Nucleospin® RNA II (Macherey-Nagel , Düren, Alemania) . a.4) Ensayo de Lectina Conjugada a Enzima (Enzyme-Linked Lectin Assay; ELLA) .

La determinación cuantitativa de mucinas totales se realizó mediante un ensayo ELLA basado en el empleo de aglutinina de germen de trigo, que ha mostrado una fuerte reactividad frente a azúcares específicos presentes en las mucinas secretadas por las células caliciformes. El contenido total de glicoproteínas en las muestras estudiadas se obtuvo mediante interpolación en una curva estándar construida a partir de mucina gástrica porcina comercial (Sigma, St Louis, CA, USA) . El tapizado de la placa de poliestireno de 96 pocilios se realizó con las muestras de la recta de calibrado y con las muestras a ensayar disueltas en buffer carbonato sódico (0,5 M, pH 9,6), dejando en incubación toda la noche a 4 °C. Se realizó el bloqueo con seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma) al 2% durante 1 hora a 37 °C. Se añadió aglutinina de germen de trigo biotinilada (Vector Laboratories, Peterborough, UK) en PBS-Tween-BSA (1:1000), y las muestras se incubaron 1 hora a 37 °C. Posteriormente, para amplificar la señal se añadió el complejo avidina-peroxidasa (Vector laboratories ) en PBS-Tween-BSA (1:50000) . La determinación colorimétrica se llevó a cabo mediante lectura de la absorbancia a 492 nm en un lector de placas Multiskan Ascent (Labsystems, Barcelona, España) utilizando una disolución de o-fenilendiamina dihidrocloruro (OPD) (Dako, Glostrup, Dinamarca) . Los datos de cada muestra ensayada se expresaron como porcentaje de secreción de glicoproteina frente a su muestra control en el mismo tiempo y ensayo celular. a.5) Ensayo de PCR cuantitativa

La determinación del número de copias de ARN se llevó a cabo mediante PCR cuantitativa con medida de la fluorescencia en tiempo real, empleando SYBR Green como fluoróforo en el equipo Lightcycler 480 (Roche, Mannhein, Alemania) con placas de 384 pocilios. Se obtuvo el ADNc a partir de 375 ng de ARN mediante el uso de High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para MUC5AC (código de acceso NCBI AJ001402), gen diana, se utilizaron los oligos 2870- 2889/3109-3091, mientras que para el gen de referencia ciclofilina (código de acceso NCBI Y00052) se utilizaron los oligos 280- 340/445-421 (Zoghbi et al., 2006 Am. J. Physiol. Gastrointest. Líver Physiol . 290: 1105-1113) . Se estudió cada muestra de ADNc por triplicado. Cada tubo de reacción contenia 5 μΐ de 2 ^χ SYBR Green real-time PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,25 μΐ a 10 μΜ de cada uno de los oligos específicos, 0,27 μΐ de ADNc y 4,23 de H ₂ 0. La amplificación se inició a 95 °C durante 5 minutos y 45 ciclos a 95 °C durante 10 segundos, 60 °C durante 10 segundos y 72 °C durante 10 segundos. Se utilizaron controles para confirmar la ausencia de dímeros de oligos y para verificar que no había contaminación por ADN. Mediante el análisis de las curvas de fusión y electroforesis en gel de agarosa al 2% se comprobó que todos los ensayos amplificaron un único producto. Para calcular la eficiencia (E=10-l/pendiente) se determinó una curva con los números de ciclos (Ct) obtenidos de la amplificación de cantidades conocidas de ADNc. Los valores de expresión relativa se calcularon utilizando el método del umbral critico (Δ ACt) . Todos los experimentos se realizaron por triplicado partiendo de tres réplicas biológicas. a.6) Análisis estadístico

Los datos se analizaron mediante ANOVA de dos vías, utilizando el software GraphPad Prism, seguido del test de Bonferroni para las comparaciones individuales . Las diferencias entre medias y controles se consideraron significativas con valores de P<0,05(*), P<0,01(**) o P<0, 001 (***) . a.7) Valoración in vitro de la actividad opioide de los péptidos en la preparación fibra longitudinal-plexo mientérico (FL-PM) de íleon de cobayo

Se ha estudiado la posible naturaleza opioide de los péptidos mediante la valoración de su capacidad para inhibir las contracciones inducidas eléctricamente de la preparación fibra longitudinal-plexo mientérico de íleon de cobayo (FL-PM) . Para este estudio se han utilizado cobayos albino hembra procedentes de Harían Ibérica (Castelar, España) , con un peso comprendido entre 250 - 300 g. La preparación FL-PM se obtuvo a partir de dichos segmentos intestinales, según la modificación de la técnica descrita por Ambache (1954 J. Physiol. Lond. 125: 53-55) para aislar fibras longitudinales de íleon de conejo. Se utilizó la técnica in vitro de baño de órganos, en la que el equipo utilizado está formado por copas de vidrio con capacidad para 10 mi que se llenaron con 5 mi de solución Krebs (NaCl 118, KC1 4.75; CaCl ₂ 2.54; KH ₂ P0 ₄ 1.19; MgS0 ₄ 1.2; NaHC0 ₃ 25; glucosa 11 mM) , que se burbujea continuamente con gas carbógeno (95% 0 ₂ y 5% C0 ₂ ) y se mantiene a la temperatura de 37 °C. A continuación se le confiere a la preparación una tensión basal de 1 g, se dejan transcurrir 15 min de reposo para su estabilización y se estimulan eléctricamente de forma continuada. Las condiciones de estimulación fueron constantes: pulsos simples cuadrados de 0,3 Hz de frecuencia, 2 ms de duración y voltaje supramaximal . La actividad contráctil de las preparaciones se registró mediante un sistema de registro de datos y análisis acoplado a un transductor de fuerza isométrica.

Una vez que, tras el comienzo de la estimulación eléctrica, las preparaciones presentaron una respuesta contráctil estable, se realizaron curvas concentración-respuesta, por adición al baño de órganos de dosis crecientes acumulativas de los péptidos, espaciadas en 10 min (considerado como el intervalo de tiempo requerido para que los péptidos ejerzan su efecto) . Las concentraciones evaluadas fueron: 6, 1 x 1CT ⁸ , 1,8 x 1CT ⁷ , 5,5 x 1CT ⁷ , 1,6 x 1CT ⁶ y 5 x 1CT ⁶ M. Tras la administración de la última dosis y tras los 10 min de espera, se añadió una única dosis del antagonista opioide naloxona (10 ^~6 M) para comprobar si tenia lugar la reversión del efecto de los mismos y corroborar que el efecto inhibitorio estaba mediado por la interacción selectiva con receptores opioides. Con el fin de comparar el efecto de los nuevos péptidos con el de un agonista opioide conocido y con un péptido alimentario con actividad opioide descrita, de forma paralela a la evaluación de los nuevos péptidos, también se realizaron curvas de morfina y de β-casomorfina 7 siguiendo el mismo protocolo y se han utilizado como curvas patrón de referencia.

Los resultados se expresan como % de inhibición de la contracción, considerando como 100% la amplitud media de las 5 últimas contracciones antes de la adición de la primera dosis de la curva. Cada preparación se utilizó para llevar a cabo una única curva concentración-respuesta .

Ejemplo 1. Efecto de diferentes péptidos sintéticos alimentarios en la actividad secretora de mucinas en células HT29-MTX.

La Tabla 5 presenta los valores de máxima secreción de mucina en las células HT29-MTX tras la adición de los péptidos de SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8 a la concentración de 0,1 mM. Además, la Tabla 5 muestra estos valores para otros seis péptidos previamente descritos como opioides. Once de los 14 péptidos alimentarios ensayados dieron lugar a un incremento significativo (P<0,001) de la actividad secretora de mucinas en las células HT29- MTX. Los valores máximos de secreción oscilaron entre 191 y 587% respecto al control (células sin tratar) . Cabe destacar que la SEQ ID No: 2 y la SEQ ID No: 5 produjeron mayores aumentos en la secreción de mucinas que la β-casomorfina 7.

Tabla 5. Secreción máxima de mucina respecto al control (células HT29-MTX no tratadas) por efecto de la adición de diferentes péptidos sintéticos alimentarios en concentración 0,1 mM. Datos obtenidos de tres replicados biológicos por triplicado. Diferencias significati as entre valores medios y controles (células no tratadas) mediante ANOVA de dos vías (Test de Bonferroni) .

Mucina

Péptido

secretada

Proteina o

o

Secuencia Denominación P alimentaria Control

SEQ ID Des-NH ₂ -/3-lactorfina /3 _B -lactoglobulina

163 <0, , 05 No: 1 bovina f (102-105)

SEQ ID /3 _B -lactoglobulina

/3-lactorfina bovina 452 <o, 001 No: 2 f (102-105)

SEQ ID /3 _H -caseina f (41-

/3-casorfina humana 215 <o, 001 No: 3 44)

SEQ ID /3 _H -caseina f (51-

Valmuceptina 259 <o, 001 No: 4 54)

SEQ ID /3-casomorfina 5 /3 _H -caseina f (51-

339 <o, 001 No: 5 humana 55)

SEQ ID ¾j ,-) -caseína

- 191 <o, 001 No: 6 f (90-94)

SEQ ID ¾j ,-) -caseína

- 226 <o, 001 No: 7 f (91-94)

SEQ ID a _s iB ^_ caseína

- 220 <o, 001 No: 8 f (143-149)

/3-casomorfina 7 /3 _B -caseína A2

YPFPGPI 282 <o, 001 bovina f (60-66)

α-lactorfina humana a _H/B -lactalbúmina

YGLF '-NH ₂ 587 <o, 001 y bovina f (50-53) Des-NH ₂ - Q-lactorfina a _H/B -lactalbúmina

YGLF 209 <0,001 humana y bovina f (50-53)

/3 _B -caseína A2

YPFP-NH? MMoorrffiicceeppttiinnaa bboovviinnaa 130 ns f (60-63)

Neocasomorfina /3 _B -caseína f (114-

YPVEPF 120 ns bovina 119)

α-caseína exorfina o¾-caseína f (91-

YLGYLE 104 ns

2-7 bovina 96)

La Figura 1 muestra el efecto durante el tiempo de exposición de los péptidos de SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6 y SEQ ID No: 8. a una concentración 0,1 mM sobre la secrección de mucinas en células HT29-MTX. La SEQ ID No: 5 mostró valores incrementados de secreción de mucinas a los 30 minutos y 2 horas seguido de un incremento significativo a las 4 horas y a las 8 horas (Fig 1A) . Las SEQ ID No: 6 y SEQ ID No: 8 mostraron niveles absolutos inferiores a los que habían presentado los péptidos anteriormente descritos pero significativos a las 2 y 4 horas, respectivamente (Fig IB y 1C) .

Estos resultados muestran que no todas la secuencias opioides inducen la secreción de mucinas. Así, por ejemplo, los péptidos morficeptina bovina, neocasomorfina bovina y α-caseína exorfina 2-7 bovina, que se habían descrito previamente como péptidos agonistas opioides (Teschemacher 2003 Curr. Pharm. Design 9: 1331-1344), no estimularon la producción de mucinas en células epiteliales intestinales. Las secuencias YGLF-NH2 e YGLF, son capaces de favorecer la secreción de mucinas. Por otra parte, se describe por primera vez que los péptidos SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 4 y SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 6, SEQ ID No: 7 y SEQ ID No: 8 son capaces de favorecer la secreción de mucinas promoviendo de esta forma una actividad protectora a nivel intestinal.

Ejemplo 2. Efecto de diferentes hidrolizados de proteínas lácteas derivados de las proteínas de suero y de las caseínas en la expresión del gen MUC5AC de las células HT29-MTX.

Con el objetivo de evaluar si los hidrolizados de las proteínas de suero y de las caseínas afectaban a la expresión del gen MUC5AC se realizaron ensayos de estimulación de las células HT29-MTX después de 2, 4, 8 y 24 horas de incubación con concentraciones de los hidrolizados de 0,1% y 1%. Se observó que el hidrolizado de proteínas de suero daba lugar a un incremento de copias de MUC5AC entre las 4 y las 8 horas. La expresión basal cuando se añadió la concentración de 1% a las 4 horas fue 1,53 veces el valor basal (Figura 2A) . El hidrolizado de caseínas dio lugar a un incremento de copias de MUC5AC a entre las 4 y las 8 horas. La expresión basal cuando se añadió la concentración de 1% a las 4 horas fue 1,86 veces el valor basal (P<0,5) (Figura 2B) .

Estos resultados indican que tanto los hidrolizados de proteínas de suero como los hidrolizados de caseínas ensayados producen en las células caliciformes humanas secretoras de mucinas una sobreexpresión del gen MUC5AC .

Ejemplo 3. Efecto de diferentes péptidos lácteos derivados de las proteínas de suero y de las caseínas en la expresión del gen MUC5AC de células HT29-MTX.

Concentraciones comprendidas entre 0,05 y 0,5 mM de los péptidos de SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 6 y SEQ ID No: 8 se añadieron al medio de incubación de las células para tiempos comprendidos entre 2 y 24 horas .

La Figura 3 muestra los resultados de PCR cuantitativa en a unas concentraciones de 0,05 mM, 0,1 mM y 0,5 mM. El tratamiento de las células con la SEQ ID No : 2 provocó un aumento significativo

(P<0,05) del número de copias del gen MUC5AC a las 4 horas de exposición a la concentración de 0,5 mM (2,1 veces la expresión basal) (Fig. 3A) . El tratamiento de las células con SEQ ID No: 6 dio lugar a un aumento del número de copias de mRNA a las 4 horas

(entre 1,5 y 1,7 veces la expresión basal), aunque debido a la variabilidad encontrada, este incremento no fue estadísticamente significativo (Fig. 3B) . El tratamiento de las células con la SEQ ID No: 8 provocó un aumento significativo (P<0,05) (1,9 veces la expresión basal) del número de copias del gen MUC5AC a las 4 horas de exposición a la concentración de 0,1 mM (Fig. 3C) . Los tiempos en los que se detecta sobreexpresion coinciden con el tiempo al que las células tratadas con este péptido habían mostrado una mayor secreción de mucinas .

Ejemplo 4. Actividad opioide de péptidos alimentarios mediante ensayo en íleon de cobayo .

La Figura 4 presenta la actividad agonista opioide de los péptidos SEQ ID No: 9 y SEQ ID No: 10 determinada in vítro mediante ensayo en la preparación FL-PM de íleon de cobayo. Los péptidos indujeron una inhibición de las contracciones inducidas eléctricamente que osciló entre 20 y 30% en el caso de la SEQ ID No: 9 (Fig 4A) y entre 25 y 35% en el caso de la SEQ ID No: 10 (Fig. 4B) , en la concentración 5,5 10 ^~7 M. El efecto de todos los péptidos revirtió con la administración de naloxona (10 ^~6 M) . En curvas similares la morfina dio lugar a una inhibición máxima de un 75% mientras que la /3-casomorfina 7 produjo una inhibición máxima de un 20%.

Estos resultados indican que las secuencias ensayadas, cuya actividad opioide no había sido previamente descrita, producen una inhibición de la contracción en la preparación FL-PM de íleon de cobayo mediada por receptores opioides superior a la de la β- casomorfina 7.