TITRE : Utilisation de ligands multifonctionnels pour traiter les syndromes de détresse respiratoire et le choc cytokinique liés aux infections virales à coronavirus .

Domaine technique de l'invention

La présente invention se rapporte à l'utilisation de ligands multifonctionnels à base de substances chimiques les énantiomères lévogyres et dextrogyres de la (AMINO-7 TRIETHOXY-4,5,6 OXO-1 DIHYDRO-1,3 IS0BENZ0FURANNYL-3)- 1METH0XY-8 METHYL-2METHYLENEDI0XY- 6,7TETRAHYDR0-,2,3,4

IS0QUIN0LEINE et ses dérivés deutériés pour traiter le choc cytokinique et les complications pulmonaires liées aux infections aux coronavirus.

Les ligands multifonctionnels sont des molécules thérapeutiques ayant une affinité sur plusieurs cibles pharmacologiques à des doses thérapeutiques de 10 nanomolaires à la micromole. Ces cibles pharmacologiques doivent être synergiques pour parler de ligands multifonctionnels. Cette synergie permet une activité très importante, sans ou avec peu d'effet secondaire. Les inventeurs ont démontré que la AMINO-7 TRIETHOXY-4,5,60X0-1 DIHYDRO-1,3 IS0BENZ0FURANNYL-3 )-1METH0XY-8 METHYL-

2METHYLENEDIOXY-6,7TETRAHYDR0-,2, 3,4 IS0QUIN0LEINE était une nouvelle classe de ligands multifonctionnels.

La nouvelle pneumonie à coronavirus de 2019 (COVID-19) a initialement éclaté à Wuhan, en Chine, début décembre 2019 et s'est propagée à l'ensemble du pays en deux mois. En Chine, l'épidémie de COVID-19 est en train de refluer, mais en dehors de la Chine, elle prend une dynamique exponentielle. Les pays européens (Italie, Espagne, Allemagne, France), les États- Unis, l'Iran et la Corée du Sud sont confrontés à d'énormes défis pour faire face au COVID-19, qui a été officiellement déclaré pandémie par l'Organisation mondiale de la santé le 11 mars 2020.

La maladie à coronavirus 2019 ou Covid-19, acronyme anglais de coronavirus infectious disease 2019 (maladie initialement dénommée 2019-nCoV) est une maladie infectieuse émergente de type zoonose virale causée par la souche de coronavirus SARS- CoV-2.

Les symptômes les plus fréquents en sont la fièvre, la toux et la gêne respiratoire et, plus rarement, un syndrome de détresse respiratoire aiguë pouvant entraîner la mort, notamment chez les personnes rendues fragiles par l'âge ou des comorbidités. Une autre complication mortelle est une réponse exacerbée du système immunitaire inné (choc cytokinique).

Il existe un taux important de formes asymptomatiques.

La transmission interhumaine se fait surtout via des gouttelettes respiratoires, postillons comme la grippe saisonnière, surtout lors de toux et éternuements ou par contact manuel avec une surface contaminée suivi d'un toucher de la main sur le visage (bouche, nez, yeux, pas la peau). La période d'incubation dure généralement deux à quatorze jours, voire 20 jours (cinq jours en moyenne).

Une proportion importante des personnes infectées, entre autres les enfants, ne présentent souvent aucun symptôme mais peuvent transmettre la maladie augmentant sa contagiosité. Une étude française publiée le 27 mars 2020 décrit trois types de malades :

Patients présentant peu de signes cliniques mais avec une charge virale nasale élevée et étant très contagieux ;

Patients ayant des symptômes légers au départ mais subissant une aggravation vers le dixième jour avec apparition d'un syndrome respiratoire aigu sévère malgré une charge virale qui diminue. La réaction immunitaire au niveau pulmonaire ne serait plus régulée ;

Patients avec une aggravation rapide vers un syndrome respiratoire aigu avec persistance d'une charge virale élevée dans le nez et dans la gorge et apparition d'une virémie sanguine à SARS-Cov-2 provoquant une défaillance multi- viscérale conduisant au décès. Ce troisième type de malade concerne surtout les personnes âgées.

Les principales complications des patients hospitalisés sont une détresse respiratoire aiguë dans 30 % des cas, une libération importante de cytokines responsables d'une lymphohistiocytose hémophagocytaire secondaire qui est une forme particulière de choc cytokinique dans 50% des cas.

Une surinfection bactérienne pulmonaire dans 10 % des cas. Une myocardite dans 10 % des cas.

Il est très important de comprendre que c'est au moment où la charge virale a diminué et devient plus faible, que le risque d'orage cytokinique devient le plus élevé.

Ceci prouve que cet orage n'est pas lié à la multiplication du virus mais à une réaction du système immunitaire suite à 1'infection.

L'orage cytokinique se présente comme le choc anaphylactique dans l'allergie : une très faible charge virale suffit à entraîner une réaction mortelle dont la dégranulation locale des basophiles au niveau des poumons en est la cause principale. En effet il a été démontré que les cas mortels d'asthme sont dû aux basophiles. (Kepley 2001 Immunohistochemical détection of human basophils in postmortem cases of fatal asthma). D'autre part il a été démontré que de l'ARN double brin, équivalent de l'infection à coronavirus, activait la dégranulation du basophile. (Ramadan 2013 Activation of basophils by the double-stranded RNA poly(A:U) exacerbâtes allergie inflammation). Si le choc cytokinique est une cause de mortalité importante dans l'infection à coronavirus, il ne faut pas négliger les complications pulmonaires tel les fibroses aigues ou chronique. De nombreux survivants de l'épidémie de syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) de 2003 ont développé une fibrose pulmonaire résiduelle avec une gravité accrue observée chez les patients plus âgés. Les autopsies de patients décédés du SRAS ont également montré une fibrose à des degrés divers. La fibrose pulmonaire peut parfois être considérée comme une conséquence de plusieurs infections virales respiratoires, mais elle est beaucoup plus fréquente après une infection par le coronavirus du SRAS (SRAS-CoV). Ainsi il apparait que les coronavirus sont fréquemment impliqués dans la survenue de fibrose pulmonaire.

Aujourd'hui il n'existe pas de traitement pour traiter le choc cytokinique, ni pour prévenir la fibrose pulmonaire. Aucun médicament actuellement enregistré n'a fait la preuve de son efficacité.

Des essais cliniques sont en cours, mais aucun résultat probant n'est disponible. Par ailleurs, il existe peu de chance d'aboutir à un vaccin aux vues du nombre de mutations du virus.

La recherche clinique sur le nouveau coronavirus (COVID-19) continue à s'intensifier en France. Le 10 avril 2020, l'Agence nationale de santé des médicaments (ANSM) indiquait avoir autorisé 35 essais cliniques dans l'Hexagone portant sur la prise en charge de patients atteints de COVID-19, dont 78% sont menés par des promoteurs académiques.

Par ailleurs, la France est impliquée dans 7 des 10 principaux essais internationaux actuellement en cours. L'ensemble des interventions thérapeutiques ou non thérapeutiques autorisées ou en cours d'instruction est listé par le Ministère de la Santé. Le registre international de l'OMS compte actuellement plus de 1100 essais cliniques, dont 654 sont des essais interventionnels et 261 des études randomisées. Soit près de 500 nouvelles études enregistrées en quelques trois semaines. Si la recherche n'a jamais été aussi intense et rapide, les données solides restent encore rares et rendent les perspectives thérapeutiques encore floues. Dans sa récente synthèse des connaissances, la coordination opérationnelle risque épidémique et biologique (COREB) évoquait le manque de données actuelles concernant les traitements dont une efficacité est attendue dans la prise en charge des patients atteints de Covid-19 (avis HCSP), et qui doivent par conséquent rester réservés à une évaluation dans le cadre d'essais cliniques.

Les premières données issues d'une étude clinique randomisée ouverte sur le lopinavir®-ritonavir®, publiées dans le courant du mois de mars, se sont avérées négatives. Cependant, d'autres études cliniques - dont DISCOVERY chez les patients sévères ou COVIDAXIS en prophylaxie chez les soignants, en France - se poursuivent.

Les seules données relatives au REMDESIVIR® restent celles d'une petite cohorte observationnelle menée chez des cas graves admis en réanimation et ayant décrit une amélioration des besoins en oxygène. Ces données restent sujettes à caution, étant donné l'absence de groupe contrôle.

L'OSELTAMIVIR® est apparu inefficace in vitro comme en clinique dans la prise en charge du COVID-19. L'UMIFENOVIR® (ou Arbidol), actuellement enregistré en Russie et en Chine dans le traitement de la grippe, continue, lui, d'être étudié avec un rationnel plus étoffé (interaction avec le virus lors de sa fixation sur le récepteur ACE2). Les données existantes restent pour l'heure issues d'une étude observationnelle dont les conclusions doivent être confortées par des données comparatives, dont les plus récentes (cf au-dessus) sont négatives. La voie du traitement antivirale semble peu prometteuse. La voie vaccinale pourrait aboutir à un vaccin mais sans doute avec une faible efficacité préventive. De plus il faudrait une couverture vaccinale supérieure à 80% pour limiter la diffusion du coronavirus. Ceci semble peu probable. La voie de l'anti-IL6, ne couvre qu'une partie du choc cytokinique. Pour les séquelles du coronavirus, c'est- à-dire les fibroses induites, il existe des traitements mais avec beaucoup d'effets secondaires. Deux médicaments sont actuellement commercialisés, mais destinés à la fibrose pulmonaire idiopathique. Il s'agit de la Pirfénidone et du Nintedanib .

Selon la HAS (Haute Autorité de Santé, l'efficacité de la Pirfénidone a été appréciée selon un critère intermédiaire évaluant la fonction pulmonaire et marqueur de la progression de la maladie. La différence observée sur ce critère est en faveur de la Pirfénidone par rapport au placebo mais cette différence est faible, de signification clinique mal connue et hétérogène d'une étude à l'autre.

L'effet observé avec ESBRIET® sur le déclin de la fonction pulmonaire chez les patients avec des critères fonctionnels précis (CVF³50% et DLCo³35%) est faible. Le bénéfice clinique apporté aux patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique est difficile à apprécier, car les critères cliniquement pertinents (qualité de vie, survie globale...) ont fait l'objet d'analyses exploratoires et non robustes Cependant, des études de regroupement des patients ont permis de mettre en évidence sur certains profils patients une amélioration notable de la survie.

Les principaux effets indésirables de la Pirfénidone observés ont été des troubles gastro-intestinaux (nausée, diarrhée, dyspepsie), des troubles cutanés (photosensibilisation et rash) et des troubles du métabolisme et de la nutrition (anorexie et perte d'appétit). Au vu des effets secondaires il apparaît peu probable que ce produit soit utilisé pour la fibrose induite par le COVID 19.

D'autre part, le Nintedanib connu sous le nom commercial d'OFEV® a été approuvé aux USA et en Europe pour le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique. Le mode d'action du Nintedanib est celui d'un inhibiteur de tyrosine kinase. Ce produit est utilisé à la dose de 200 à 400 mg/jour. De nombreux effets secondaires ont été observés, notamment gastro intestinaux .

Selon la HAS « Le service médical rendu » par OFEV® est modéré.

Compte tenu de l'efficacité du Nintedanib, appréciée selon un critère intermédiaire, avec une quantité d'effets modérée par rapport au placebo, et des limites méthodologiques de l'analyse comparative de la mortalité, OFEV® apporte, comme ESBRIET®, une amélioration du service médical rendu mineure (ASMR IV), chez les patients présentant une fibrose pulmonaire idiopathique confirmée sur des paramètres cliniques, radiologiques et/ou histopathologiques dont les critères fonctionnels respiratoires sont les suivants : CVFp>50% et DLco³30%. Les effets secondaires de l'OFEV® sont encore plus nombreux que ceux de l'ESBRIEST®. La HAS relève près de 92% d'effets secondaires. Pour ces raisons, le traitement de la fibrose post COVID 19 par ces deux médicaments apparaît peu probable aux doses thérapeutiques utilisées aujourd'hui.

De nombreux produits sont en cours d'étude pour le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique :

Le PLN-74809, de PLIANT therapeutics est un inhibiteur sélectif double des intégrines anbb et anbΐ développé pour le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) et de la cholangite sclérosante primitive (PSC). Il a été démontré que le PLN-74809 inhibe l'activation du TGF-b jusqu'à 70% dans les macrophages alvéolaires prélevés sur des volontaires sains, d'une manière dépendante de la dose et de l'exposition. Il s'agit d'un produit par voie orale. Il n'y a pas de résultat d'efficacité chez l'homme pour ce produit. Une phase II est en cours mais sans aucuns résultats publiés.

Le BBT-877 de BRIDGEBIO THERAPEUTICS un puissant inhibiteur de 1'autotaxine en développement clinique pour traiter la fibrose pulmonaire idiopathique a fourni des résultats de l'analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de l'innocuité de l'étude clinique de phase I randomisée, en double aveugle et contrôlée par placebo. Bien que le produit soit en phase II, il n'existe pas de données d'efficacité de ce produit. Seuls des résultats précliniques chez l'animal sont disponibles.

Le principal candidat de Galecto est le TD139, un inhibiteur sélectif de la galectine-3. Lorsqu'il est inhalé par des patients IPF, le TD139 est conçu pour bloquer la galectine-3 et ainsi empêcher la lectine de liaison aux galactosides de déclencher une voie qui active les macrophages et les myofibroblastes .

Le MN-001 (Tipelukast®) de MEDICINOVA est un antagoniste des récepteurs des leucotriènes (LT) et inhibiteur des phosphodiestérases (PDE) (principalement 3 et 4) et inhibiteur de la 5-lipoxygénase (5-LO). Le médicament est actuellement en phase II, mais les résultats sont semble-t- il d'une efficacité médiocre sans amélioration de la fibrose. Le GLPG1690, de GALAPAGOS est un inhibiteur de 1'autotaxine orale, une fois par jour, actuellement en phase 3. Les résultats mettent en évidence un arrêt de la progression de la maladie, mais aucune amélioration de la fibrose pulmonaire. Le VAY736 de Novartis est un anticorps monoclonal IgGl entièrement humain anti-récepteur du facteur d'activation des cellules B (BAFF), conçu pour une déplétion directe des cellules B médiée par l'ADCC, offrant ainsi un double mode d'action. Actuellement en phase II. Le produit a été abandonné pour manque d'efficacité.

Le KD025 (également appelé SLX-2119) est un inhibiteur de kinase 2 qui est testé pour le traitement de la fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) par la société biopharmaceutique Kadmon. Actuellement ce produit est arrêté en phase clinique de phase II.

En conclusion, il n'existe pas de produit pour traiter la fibrose actuellement malgré de nombreux essais cliniques en cours et encore moins de produit pour prévenir la survenue de fibrose chez les patients présentant une infection à coronavirus .

La tritoqualine est une substance chimique connue depuis de très nombreuses années, et utilisée comme antihistaminique. Sa fabrication est décrite dans le brevet français FR 1.295.309.

La tritoqualine est la 7-Amino-4,5,6-triethoxy-3-(5,6,7,8- tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l, 3-dioxolo[4,5-g]isoquinolin- 5-yl) phthalide. Dans sa forme pharmaceutique commercialisée, elle se présente sous la forme d'un mélange d'énantiomères. La tritoqualine est connue pour son activité antiallergique par son action inhibitrice sur l'histidine décarboxylase. Cette activité est cependant très faible et n'explique pas les nombreuses propriétés qu'elle présente sur des symptômes cliniques variés, rhinite, urticaire, eczéma, mastocytose. L'activité de la tritoqualine a été démontrée dans la mucoviscidose (EP2854947, EP2844253). Bien que l'on parle de fibroses, il s'agit en fait d'une maladie génétique, dont la physiopathologie est due au déficit du transport des électrolytiques via un CFTR anormal. Il n'y a pas de fibrose à proprement parler, mais un épaississement des sécrétions des muqueuses du fait du déficit du transport d'eau. L'activité de la tritoqualine a également été décrite dans la fibrose idiopathique pulmonaire brevet(EP3429587).

Il existe également une description de l'action de la tritoqualine sur le foie et la sécrétion de collagène (suppressive effect of tritoqualine on cell growth and collagen sécrétion in fibroblast. Omezu. 1986).

Les basophiles sont les granulocytes les moins abondants, représentant moins de 1% des leucocytes du sang périphérique. Pour cette raison, ainsi que leurs caractéristiques phénotypiques et morphologiques médiocres et de l'absence de modèles animaux, leur spécificité physiologique pendant la réponse immunitaire ont été ignorées jusqu'à récemment. Même si les mastocytes et les basophiles sont tous deux à l'origine des cellules effectrices primaires de l'asthme bronchique, il existe des preuves immunologiques, biochimiques et pharmacologiques qu'ils exercent des fonctions distinctes au début et lors de l'évolution de l'asthme (karasumaya 2011). Les basophiles sont en effet les premiers grands producteurs d'IL-4 et d'IL-13, qui sont essentiels pour déclencher et maintenir une réponse d'allergie (Casolaro 1990). De plus, en accord avec leur effecteur putatif ils sont clairement associés à l'asthme fatal (Kepley 2001 et Koshino 1993) ; les basophiles sont détectés dans le liquide de lavage nasal après test de provocation chez des patients atteints de rhinite allergique (Iliopoulos 1992). Cette notion est soutenue par la corrélation entre les mutations de gain de fonction de l'IL-4R et l'exacerbation de la maladie allergique.

Des études récentes ont montré que l'activation des basophiles n'est pas seulement favorisée par la réticulation des IgE spécifiques au gène, mais peut être également par des individus non sensibilisés par des antigènes parasites, des lectines et des virus superantigènes, soit par réticulation directe du FcSRI, soit par la liaison à des anticorps IgE non spécifiques (Falcone 2006).

Les infections respiratoires virales, en particulier celles induites par le rhinovirus et le virus respiratoire syncytial, sont les plus courants et cause importante d'une exacerbation aiguë de l'asthme chez les adultes et enfants et représentent un fardeau sanitaire mondial (Jackson 2010, Stensballe 2009). Un nombre croissant de preuves étaye l'hypothèse que ces infections provoquent plus de morbidité chez les asthmatiques que chez les des individus en bonne santé.

Il est probable que les coronavirus ont une action plus toxique sur la fonction respiratoire et que l'asthme n'est pas le facteur le plus important. Une étude anglaise a démontré que l'âge était le facteur principal de risque de décès (160 fois plus de risque de décès au-delà de 80 ans). Comprendre les mécanismes responsables pour l'inflammation des voies respiratoires induite par les virus permettra de trouver des réponses thérapeutiques adaptées.

Les inventeurs ont postulé que les coronavirus stimulaient la voie des TLR4, TLR3 et TLR7 pour entraîner un choc cytokinique via les basophiles. Les basophiles activés vont ensuite stimuler les éosinophiles et les macrophages pour amplifier la réponse immune et aboutir à la détresse respiratoire et au décès du patient infecté par le virus. Ce sont sans doute les protéines virales qui stimulent le TLR4. Ensuite la cascade passant par MyD88 va aboutir à la sécrétion de cytokines TH2, IL6, IL4 et IL13.

Présentation de l'invention

La présente invention concerne également la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide pour utilisation dans le traitement du choc cytokinique lié aux infections à coronavirus .

La présente invention concerne également la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide pour utilisation dans la prévention du choc cytokinique lié aux infections à coronavirus .

La présente invention concerne également la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide et ses dérivés deutériés pour utilisation dans le traitement des détresses respiratoires liées aux infections à coronavirus.

La présente invention concerne également la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide et ses dérivés deutériés pour utilisation dans la prévention des détresses respiratoires liées aux infections à coronavirus Selon un mode préféré de l'invention, la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide pour utilisation dans le traitement du choc cytokinique est remarquable en ce qu'elle est utilisée à la dose de 0,1 mg/kg/jour à 10 mg/Kg/jour .

Selon un mode préféré de l'invention, la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide destiné à être utilisé pour utilisation dans la prévention du choc cytokinique est remarquable en ce qu'elle est utilisée à la dose de 0,1 mg/kg/jour à 10 mg/Kg/jour.

Selon un mode préféré de l'invention, la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide pour utilisation dans le traitement du choc cytokinique est remarquable en ce qu'elle est utilisée à la dose de 5 à 700 mg/jour.

Selon un mode préféré de l'invention, la 7-Amino-4,5,6- triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy-6-methyl-l,3- dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide pour utilisation dans le traitement du choc cytokinique est remarquable en ce qu'elle est conditionnée sous forme de gélules, comprimés, capsules, sirop ou de gel.

Brève description des figures

[Fig. 1] illustre la présence des carbones asymétriques, qui sont notés A et B.

[Fig. 2] illustre la forme de l'isomère RR.

[Fig. 3] illustre la forme de l'isomère SS.

[Fig.4] illustre les méthyls pouvant être deutériés sur la tritoqualine

[Fig.5] illustre la variation des résistances chez la souris traitée et non traitée

[Fig.6] illustre la variation des résistances à 2 minute entre les 3 groupes de souris

[Fig.7] illustre la variation des résistances à 6 minutes entre les 3 groupes de souris [Fig.8] basophiles non dégranulés [Fig. 9] basophiles dégranulés

[Fig.10] effet de la tritoqualine sur l'inhibition de la dégranulation du basophile.

Exemples

Pour faire la démonstration que la tritoqualine inhibe bien le syndrome de détresse respiratoire via le basophile, nous avons utilisé un modèle décrit dans la publication de Ramadan 2013.

Les inventeurs ont utilisé un modèle de souris C57/B16J, dite plus loin comme BL6. Le protocole simulant une infection virale de type ARN double brin a été effectué avec 2 groupes de 15 souris ; il s'agit de souris femelles de 8 semaines d'âge. Un groupe témoin uniquement traité par du sérum physiologique a servi de témoin négatif.

Les souris BL6 sont traitées selon le protocole ci-dessous. Les souris BL6 ont été sensibilisées par des injections intrapéritonéales de 100 mg d'OVA (ovalbumine) aux jours 0,

2 et 4. Par la suite, du jour 10 au jour 15, les souris ont reçu un traitement quotidien avec de l'OVA en aérosol à la concentration de 20 mg/ml ou du sérum physiologique pendant 20 min, en utilisant un nébuliseur à ultrason (Ultra-Neb99). Une heure plus tard, les souris ont reçu 50 mg de poly (A:U) ou du sérum physiologique par voie intranasale.

3 groupes ont été étudiés :

Le groupe 1 témoin négatif qui ne reçoit que du sérum physiologique .

Le groupe 2 qui est sensibilisé à l'OVA et reçoit également de l'ARN double brin (Poly U/Poly A) selon le protocole décrit plus haut/

Le groupe 3 qui est sensibilisé à l'OVA et reçoit également de l'ARN double brin (Poly U/Poly A) selon le protocole décrit plus haut mais également de la tritoqualine à raison de 10mg/kg.

Chaque groupe est analysé par pléthysmographie globale et les mesures sont exprimées en PenH. Une mesure est effectuée toutes les minutes, jusqu'à 10 minutes après l'introduction de l'ARN double brin. Le traitement par la tritoqualine est donné 1 heure avant l'introduction du Poly U/Poly A (ARN double brin).

Dans le groupe 1, qui est le groupe témoin négatif nous avons les résultats suivant au temps 1 minute à 10 minute, exprimé en unité PenH et en moyenne pour 15 souris : [Table 1]

Dans le groupe 2, qui est le groupe témoin positif (souris présentant une infection virale après sensibilisation à l'ovalbumine) nous avons les résultats suivant au temps 1 minute à 10 minutes (Tl à T10), exprimées en unité PenH et en moyenne pour 15 souris :

[Table 2]

Dans le groupe 3, qui est le groupe traité par la tritoqualine à la dose de 10 mg/kg (souris présentant une infection virale après sensibilisation à l'ovalbumine également) nous avons les résultats suivant au temps 1 minute à 10 minutes, exprimées en unité PenH et en moyenne pour 15 souris :

[Table 3]

Si nous comparons les différents groupes, le groupe traité par la tritoqualine présente une augmentation de ses résistances bronchiques, mais de manière modérée par rapport au groupe non traité. Cette différence est maximale à T 6 minutes entre le groupe tritoqualine et le groupe non traité. La différence reste encore très importante à T 10 minutes. L'analyse statistique montre que la différence entre ces 2 groupes est hautement significative (p<0,001).

La conclusion est que dans le modèle d'inflammation respiratoire par l'ovalbumine surinfectée par l'équivalent d'une infection virale à ARN double brin, la tritoqualine montre une efficacité étonnante. Il a été démontré dans ce modèle que c'est le basophile qui est l'élément moteur de l'inflammation respiratoire. (Ramadan 2013)

La tritoqualine est donc capable de traiter les détresses respiratoires liées aux infections à coronavirus.

Les inventeurs ont également testé la tritoqualine directement sur le basophile. Pour ce faire, les inventeurs ont utilisé un test commercial, dit Flow Cast de chez Bülhmann.

Ce test utilise le marqueur CD63. Le marqueur CD63 est considéré comme un marqueur de l'activation des basophiles et des mastocytes. Les basophiles au repos n'expriment que très peu l'antigène CD63 car il est lié aux granules intracytoplasmiques .

L'activation des basophiles et des mastocytes entraîne la fusion des granules avec la membrane plasmique et donc l'expression du CD63 à la surface des cellules.

Le CD63 apparaît donc en surface des basophiles ou des mastocytes uniquement lorsque le CD63 est activé. L'activation du basophile ou du mastocyte peut se faire soit par un allergène, soit par un anti-IgE (anti-FcsRI, qui est l'anti-récepteur des IgE).

L'activation du basophile signifie que le basophile dégranule et libère de nombreuses cytokines toxiques pour le poumon. C'est en effet dans le poumon que l'effet toxique du basophile est le plus important. Il est donc impératif de bloquer la dégranulation du basophile pour éviter le choc toxique. Dans le cadre des infections à coronavirus, ce choc toxique peut aboutir au décès du patient.

Les mastocytes et les polynucléaires basophiles humains sont des éléments d'aspect morphologique relativement similaire, dérivant d'une cellule souche hématopoiétique CD34+. Leur différenciation se fait sous l'influence de cytokines différentes dont la principale est, pour les mastocytes, le Stem Cell Factor et, pour les basophiles, 1'Interleukine-3. Tandis que les mastocytes sont des éléments résidant dans les tissus, le basophile est une cellule circulante. Il est à noter que les mastocytes représentent une population hétérogène en fonction de leur localisation tissulaire, ce qui n'est pas le cas du basophile.

Ces deux cellules interviennent dans la réaction allergique IgE-dépendante car elles expriment le récepteur de haute affinité des IgE. Néanmoins, les médiateurs libérés par ces cellules au cours de cette activation sont pour certains différents. Par ailleurs, basophiles et surtout mastocytes interviennent dans l'immunité innée. C'est dans le cadre de l'immunité innée qu'intervient le basophile dans le cadre de l'infection à coronavirus. En effet le choc cytokinique apparait dans les 6 à 10 jours après le début de l'infection à coronavirus. Ce délai est trop court pour qu'intervienne l'immunité acquise.

Les basophiles et les mastocytes sont impliqués dans de nombreuses pathologies via la sécrétion de nombreuses interleukines .

Les mastocytes et les basophiles sécrètent des cytokines communes comme l'IL 2, IL 3, IL 4, IL 5, IL 6, IL 9, IL 13, IL 15. Ces interleukines sont impliquées pour certaines dans l'allergie comme l'IL-4, d'autres dans la fibrose pulmonaire comme l'IL-13, d'autres dans le choc cytokinique comme l'IL6. Les basophiles sont également responsables de réactions inflammatoires lorsqu'ils sont activés. Ils se dégranulent pour libérer de l'histamine, des protéoglycanes telles que l'héparine et la chondroïtine, et des protéases telles que l'élastase et la lysophospholipase. Ils secrétent également des médiateurs lipidiques tels que les leucotriènes et diverses cytokines.

Les inventeurs ont mis en évidence le rôle étonnant de la tritoqualine sur la modulation du CD63 et donc de la dégranulation du basophile. Les inventeurs ont mis en évidence les propriétés étonnantes et surprenantes de la tritoqualine dans un modèle cellulaire humain de modulation du CD63.

Pour étudier cette action de modulation du CD63 par la tritoqualine, les inventeurs ont utilisé le basophile et un test commercial modifié, le kit Flow CAST® de BULHMANN Laboratories AG (Suisse) qui est un test d ^' activation des basophiles (TAB) pouvant être utilisé pour la détection in vitro de la dégranulation des basophiles ainsi que pour l'étude des réactions allergiques de type immédiates et les hypersensibilités .

Ce test est conçu pour le diagnostic in vitro de l'expression du marqueur CD63 comme marqueur de surface des basophiles activés. Le test est réalisé sur sang total ; la cytométrie en flux permet de quantifier l'expression du CD63 à la surface des basophiles activés.

L'activation (ou dégranulation) des basophiles par ce test peut se faire de trois façons différentes :

Par un allergène, ou

- Par un « anti IgE » (anti-FcsRI, qui est l'anti-récepteur des IgE) ou

- Par un antigène lipopolysaccharidique bactérien, appelé le fMLP.

Il est prévu pour le diagnostic in vitro de l ^' expression du CD63, le tout sur sang complet par cytométrie en flux après stimulation allergénique.

Les basophiles au repos n'expriment que très peu l'antigène CD63 car il est lié aux granules intracytoplasmiques. L'activation des basophiles (par exemple par une IgE (activation immunologique) ou le fMLP (activation non immunologique)) entraîne la fusion des granules avec la membrane plasmique et donc l'expression du CD63 à la surface des cellules.

Pour évaluer la dégranulation via l'expression du CD63, le kit Flow CAST® a été utilisé partiellement. Ce test comprend un anti IgE du récepteur à l'IgE. Les inventeurs n'ont utilisé que ce dernier activateur.

D'autre part, le test Flow Cast utilise un deuxième marqueur de membrane, le CCR3. La protéine codée par ce gène est un récepteur pour les chimiokines de type C-C. Il appartient à la famille 1 des récepteurs couplés à la protéine G.

Il est fortement exprimé dans les éosinophiles, dans les basophiles et est également détecté dans les cellules TH1 et TH2, ainsi que dans les cellules épithéliales des voies aériennes. Ce récepteur peut contribuer à l'accumulation et à l'activation des éosinophiles, des basophiles et d'autres cellules inflammatoires dans les voies respiratoires allergiques. Ce récepteur couplé à la taille de la cellule permet de caractériser spécifiquement le basophile. L'analyse de ces 2 récepteurs permet de caractériser le basophile et sa dégranulation de manière hautement spécifique par cytométrie de flux.

La cytométrie de flux permet de caractériser les différentes cellules sanguines.

Les faisceaux lasers permettent l'évaluation et la mesure de différents paramètres cellulaires :

- La mesure frontale de la lumière diffractée du faisceau laser permet d'évaluer la taille de la cellule : c'est le Forward SCatter (FSC). - La mesure de la lumière diffractée perpendiculairement permet d'évaluer la granularité de la cellule : c'est le Side SCatter (SSC).

Cette granularité peut être due à des irrégularités à l'intérieur ou à la surface des cellules ou bien, à la densité des organites qui la composent.

Des marqueurs de fluorescence permettent ensuite de mieux caractériser les différentes sous populations cellulaires (ces marqueurs sont couplés avec les clusters de différentiations) .

L'appareil qui a été utilisé tout au long de ces expériences est un cytométre de flux BD FACS Canto avec 2 Lasers :

Un bleu avec la possibilité de 3 fréquences : 564-606 nm,

515-545 nm, 750-810 nm.

Un rouge avec la possibilité de 2 fréquences : 750-810 nm et 650-670 nm.

Plusieurs fluorochromes sont utilisés : APC Cy 7 (APC-Cy ™ 7 est un fluorochrome qui combine APC et un colorant cyanine) et FITC (1'isothiocyanate de fluorescéine) ainsi que le PE (phycoérythrine) .

Ces différents couplages permettent de caractériser les cellules séparément et plus particulièrement les basophiles. Ces différents couplages permettent de caractériser les cellules séparément et plus particulièrement les basophiles. On distinguera 4 zones de fenêtrage selon que l'on observe ou non un marquage CD63 et que l'on observe un marquage CCR3 ou non :

- CD63+ et CCR3- qui caractérisent des cellules non basophiles dégranulés.

- CD63+ et CCR3+ qui caractérisent les basophiles dégranulés.

- CD63- et CCR3- qui caractérisent des cellules non basophiles non dégranulés. CD63- et CCR3+ qui caractérisent des basophiles non dégranulés .

Ainsi avec cette analyse, il est possible d'analyser séparément les basophiles dégranulés des basophiles non dégranulés. Il est ainsi possible en faisant interagir une molécule d'intérêt thérapeutique, de connaître sa capacité ou non d'agir sur la dégranulation.

Le protocole de dégranulation a été effectué à partir du Flow CAST.

Le Kit-Flow CAST est composé de :

Un tampon neutre stimulation Buffer avec IL-3. Un tampon de stimulation avec l'Anticorps anti-FceRI contrôle positif (Stimulation Control).

- Un tampon de stimulation avec fMLP contrôle positif (fMLP).

Non utilisé dans ce protocole.

Un réactif de coloration (Staining Reagent). un tampon de lavage (Wash Buffer).

- Un réactif de lyse (Lysing Reagent).

Rappel : Lors de l'activation des basophiles les marqueurs CD63 liés aux granules intra- cytoplasmiques vont fusionner avec la membrane plasmique. Ils sont alors exprimés à la surface de la cellule : les basophiles activés deviennent de ce fait CD63+. Outre le CD63, un autre marqueur spécifique des basophiles permet de mieux les cibler : il s'agit du CCR3 (récepteur de chimiokines 3).

- Les basophiles activés et dégranulés sont CD63+ et CCR3+ ;

- les basophiles non-dégranulés sont CD63- et CCR3+.

Trois tests ont été réalisés afin de définir et préciser le protocole final. Tout d'abord, un échantillon « témoin négatif », c'est-à-dire contenant uniquement le tampon neutre, a été analysé afin d'observer les résultats attendus lors de l'absence de stimulation et donc de dégranulation. Nous pouvons constater, sur la [Fig. 8] qui présente 4 zones, que seule la zone CD63- CCR3+ contient un nuage de points correspondant aux basophiles non dégranulés. En l'absence de stimulation, les cellules ne sont donc pas activées et ne dégranulent pas.

Le deuxième test comprend un échantillon « témoin positif » avec l'anticorps FcsRI. Sur les 4 zones fenêtrées en cytométrie de flux, une fenêtre Échantillon témoin positif avec l'Anticorps anti-FceRI permet d'observer les nuages de points dans la zone CD63+ CCR3+. Il s'agit de la zone en haut à droite sur la [Fig. 9]. Cela indique que l'anticorps anti- FceRI entraîne bien la dégranulation des basophiles. Cependant, tous les basophiles ne sont pas dégranulés, car la fenêtre CCR3+ et CD63- contient quelques points correspondant aux basophiles non dégranulés.

Enfin, le troisième test comprend l'utilisation de l'anticorps anti-FceRI dans le but de faire dégranuler le basophile avec une incubation préalable de la tritoqualine à différentes concentrations. C'est avec cette dernière analyse que les inventeurs ont pu démontrer l'activité de la tritoqualine sur la modulation du CD63.

Enfin, les basophiles étant une population très faible dans la formule sanguine, souvent moins de 1%. Avec un objectif d'obtenir au moins 500 basophiles à analyser, il a fallu trier plus de 50 000 globules blancs à chaque passage devant le cytométre de flux.

Ensuite, la tritoqualine est mise dans chaque échantillon avec l'anticorps anti-FcsRI. Si la tritoqualine est capable d'inhiber la dégranulation, alors le nombre de basophiles non dégranulés devraient augmenter.

Les concentrations utilisées de la tritoqualine vont de ImM à 10mM correspondant à des doses thérapeutiques de 100 mg à 1 gramme par jour chez un homme d'un poids moyen de 70 kg. Les expériences ont été les suivantes :

Dans un premier temps, un patient a été prélevé et 5 tubes ont été préparés. Un tube témoin négatif : sans incubation avec la tritoqualine et sans l'anticorps anti FcsRI (le produit de dégranulation). Quatre tubes « témoin positif » : sans incubation avec de la tritoqualine et avec le dégranulant des basophiles (anticorps anti FcsRI).

Le but de ces expériences étant de démontrer la pertinence du test pour différentier les basophiles dégranulés des basophiles non dégranulés.

L'expérience confirme que l'anticorps anti-FcsRI fait dégranuler les basophiles car dans la série avec l'anticorps anti FcsRI (témoin positif), près de 85% des basophiles ont dégranulé. Dans l'échantillon « témoin négatif », il n'y a quasiment pas de cellules dégranulées (moins de 17%). L'analyse statistique a été réalisée par l'intermédiaire de GraphPad Prism 7.0.

Le test de student du témoin négatif versus témoin positif montre également que le p est inférieur à 0.0001. Cela signifie que les basophiles dégranulés et non dégranulés sont hautement différentiables en cytométrie de flux.

Ainsi, la phase d'étude a été réalisée avec 4 patients à des doses étagées de 2,5 pmoles à 10 pmoles. A type d'exemple, la [Fig. 10] montre l'effet dose de la tritoqualine de 1 pmole à 10 pmoles sur l'inhibition de la dégranulation du basophile et donc de la modulation de l'expression du CD63.

A 5 pmoles, le CD63 est encore exprimé sur environ 40% des cellules alors qu'à 10 pmoles, cette expression est réduite à moins de 2%. L'analyse statistique met en évidence un P supérieur à 0,001 des doses de 2,5 micromoles à 10 micromoles. La tritoqualine module bien l'expression du CD63 sur le basophile de manière surprenante et progressive. Cette modulation du CD63 permet d'envisager des traitements à base de tritoqualine pour le traitement du syndrome de détresse respiratoire et le choc cytokinique liés aux infections à coronavirus. Cette puissante action d'inhibition de dégranulation permet d'envisager également de prévenir le choc cytokinique ainsi que les détresses respiratoires liées aux infections à coronavirus.

Le traitement de ces pathologies pouvant se faire à des doses thérapeutiques entre 5 mg/jour et 700 mg/jour.

La tritoqualine peut être utilisée sous différentes formes, en dehors de sa forme « comprimée » sans modifier son efficacité, par exemple sous forme de gélule, sirop, ou gel. la 7-Amino-4,5,6-triethoxy-3- (5,6,7,8-tetrahydro-4-methoxy- 6-methyl-l,3-dioxolo [4,5-g]isoquinolin-5-yl) phthalide peut également être utilisée en association avec des médicaments agissant en complément, comme le Nintedanib et la Pirfénidone. Ces médicaments agissant selon des modes d'action différents permettent de diminuer les doses et ainsi les effets secondaires et toxiques. Le Nintedanib peut être utilisé à la dose de de 10 mg à 50 mg/jour.

La Pirfénidone peut être également utilisée à des doses plus faibles comme 100 à 200 mg/jour.

La tritoqualine commerciale se présente sous la forme d'une poudre blanche, très sensible à la lumière qui la dégrade en Cotarnine et acide phtalique.

La tritoqualine présente deux carbones asymétriques, mais l'analyse de l'ancienne forme commerciale montre que la tritoqualine est un mélange racémique de 2 énantiomères (R-R et S-S) et non un mélange de 4diastéréoisomères.

La tritoqualine est une benzylisoquinoléine dont le poids moléculaire est de 500. Ce composé peut être modifié ou substitué par des composés comprenant soit du carbone 14 ou des composés deutériés. Les composés et les sels marqués par un isotope peuvent être utilisés de différentes manières. Ils peuvent convenir à des médicaments et/ou à différents types de tests, tels que des tests de distribution de tissu sur substrat. Par exemple, les composés marqués au tritium et/ou au carbone 14 sont particulièrement utiles pour divers types de tests, tels que les tests de distribution tissulaire sur substrat, en raison de leur préparation relativement simple et de leur excellente détectabilité. Par exemple, les produits marqués au deutérium sont utiles sur le plan thérapeutique et présentent des avantages thérapeutiques potentiels par rapport aux composés non marqués par le deutérium. En général, les composés et les sels marqués au deutérium peuvent avoir une stabilité métabolique supérieure à ceux qui ne sont pas marqués par des isotopes en raison de l'effet cinétique isotopique. Une stabilité métabolique plus élevée se traduit directement par une demi-vie accrue in vivo ou par des doses plus faibles, ce qui pourrait être souhaité. Les composés et les sels marqués par un isotope peuvent généralement être préparés en suivant les procédures décrites dans les schémas de synthèse connues comme par exemple dans le brevet EP3352757 déposé par concert pharmaceuticals . Il est ainsi aisé de remplacer des méthyls non-deutériés par des méthyls deutériés. Ainsi 5 substitutions de méthyls deutériés pourrait être fait sur la tritoqualine . Deux sur le cycle cotarnine et 3 sur le cycle nitrophtalide .

Ainsi il est possible d'utiliser ces composés deutériés pour améliorer la biodisponibilité de la tritoqualine et son efficacité dans le choc cytokinique et le traitement de la détresse respiratoire lié aux infections à coronavirus.