La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende N- acetilcisteína (NAC) para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a Microcistinas (MCs). También se refiere al uso de

Ia citada composición en Ia recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de Ia lista que comprende hígado, riñon, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición se utiliza para Ia fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La NAC, derivado acetilado del aminoácido L-cisteína, es un conocido antioxidante que contiene grupos tiol.

Las aplicaciones de Ia NAC se basan en que puede actuar frente al estrés oxidativo por diferentes caminos. Es un precursor de Ia síntesis de GSH actuando como proveedor de cisteína y estimulando Ia actividad de las enzimas citosólicas involucradas en el ciclo del GSH, tales como Glutatión reductasa (GR), que aumenta Ia tasa de regeneración de GSH. Por otro lado, in vivo e in vitro actúa directamente, a través de su grupo tiol, sobre diferentes especies reactivas de oxígeno (ROS) tales como ácido hipocloroso, radical hidroxilo y peróxido de hidrógeno (Aruoma O.l. et al. (1989) Free Rad. Biol. Med. 6:593-597).

Se ha descrito que Ia inyección de NAC mejora el estado redox de GSH en el hígado de anguilas (A. anguilla) intoxicadas con organofosforados (diclorvos), incrementando su tolerancia al estrés oxidativo y Ia necrosis provocadas por ingesta de pesticidas, particularmente en el caso de organofosforados o piretroides. Su uso queda restringido a esa aplicación y además sólo se hace referencia a las funciones de NAC frente al estrés oxidativo (ES2249167 A1).

Por otro lado, las MCs son toxinas producidas por cianobacterias tóxicas presentes en aguas superficiales, que pueden bioacumularse en pescados de consumo público a niveles muy próximos e incluso superiores a Ia Ingesta Diaria Tolerable (IDT) provisional establecida, afectando a Ia calidad y seguridad de este tipo de alimentos y suponiendo un riesgo potencial para el consumidor. Las MCs han ocasionado episodios de muerte masiva en peces, siendo responsables de Ia enfermedad denominada "NetPen Liver Disease" (NPLD) en salmones procedentes del Atlántico criados en cautividad. En comparación con los mamíferos, los peces son menos sensibles a los efectos tóxicos, Io que podría permitir una mayor acumulación, existiendo variabilidad en función de Ia especie y destacando su mayor distribución pues afectan no sólo al hígado sino también al riñon, corazón, branquias, piel, médula y/o sangre, alterando además su comportamiento y desarrollo. Las cianobacterias constituyen parte de Ia dieta de diversos ciprínidos y cíclidos, como es el caso, por ejemplo, de las Tilapias (Orechromis, sp.). La Tilapia (Oreochromis sp.) es uno de los pescados que más rápidamente se ha introducido en acuicultura, por Ia facilidad que presenta su manejo, gran capacidad de adaptación a condiciones adversas y fácil reproducción; sus distintas variedades son filtradoras y consumidoras de cianobactehas y en Europa se está despertando un gran interés por su cultivo.

Como mecanismo de acción tóxica más aceptado, las MCs a nivel subcelular son inhibidores específicos de las fosfatasas de proteínas tipo 1 (PP1) y 2A (PP2A), desencadenando un proceso de apoptosis y consecuente daño celular. Por otro lado, el estrés oxidativo juega un papel muy significativo en Ia patogenicidad de estas toxinas, detectándose un aumento en Ia producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como cambios en Ia actividad de diversas enzimas antioxidantes en roedores y peces.

Actualmente no existe un tratamiento antidótico específico en casos de intoxicación por MCs procedentes de cianobacterias. Varios estudios han demostrado los efectos protectores de ciertos antioxidantes frente a su acción tóxica en roedores, cuando se administran previamente a Ia exposición a las toxinas, como es Ia suplementación con Ia vitamina E, Ia vitamina C, licopenos, ciertos polifenoles del té, flavonoides o melatonina. Hasta Ia fecha no se conoce ningún tratamiento capaz de recuperar a los peces intoxicados con MCs. Teniendo en cuenta Ia ubicuidad de estas toxinas se hace necesario recuperar peces que presenten alteraciones histopatológicas con diferentes niveles de afección que pueden impedir el ciclo de vida normal de los peces afectados.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende NAC para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs.

En tilapias (Oreochromis sp.) expuestas a dosis únicas y repetidas de MCs se inducen estrés oxidativo y alteraciones patológicas. En concreto, se han comprobado variaciones dosis-dependiente en Ia actividad de diversas enzimas antioxidantes, disminución de los niveles de Glutatión (GSH), aumento de los niveles de lipoperoxidación (LPO) y de oxidación de proteínas, en diferentes órganos (hígado, riñon, branquias, etc.), y múltiples alteraciones histopatológicas en órganos diversos como hígado, riñon, branquias o corazón.

La NAC administrada en esta invención se muestra efectiva manteniendo el estado de salud del pez, previniendo daños causados por las toxinas y/o mejorando los efectos tóxicos inducidos por MCs en diversos órganos de tilapias intoxicadas.

Además, el uso de NAC como aditivo alimentario no sólo mejora los niveles de GSH hepáticos, sino que por su propia actividad antioxidante es capaz de disminuir Ia lipoperoxidación (LPO) (hígado, riñon), aumentar el contenido proteico en hígado y recuperar las lesiones histopatológicas inducidas en múltiples órganos como hígado, riñon, corazón, tracto gastrointestinal y branquias.

En este sentido, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de una composición que comprende NAC para Ia elaboración de un medicamento útil en el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs.

NAC es el derivado N-acetil del aminoácido L-cisteína. La NAC es el precursor del glutatión. El glutatión tiene un grupo tiol (sulfidrilo) que Ie confiere efectos antioxidantes por medio de Ia reducción de radicales libres.

La composición de Ia presente invención comprende, al menos, NAC. El medicamento está compuesto, al menos, por Ia composición anterior. La NAC, sus sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento de los efectos tóxicos en peces expuestos a MCs.

Por un "derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) NAC.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc.

El término "tratamiento" tal como se entiende en Ia presente invención supone combatir los efectos tóxicos para estabilizar el estado de toxicidad de los individuos. El medicamento se emplea también para Ia prevención de los efectos tóxicos ocasionados a los peces expuestos a MCs. El término "prevención" tal como se entiende en Ia presente invención consiste en evitar Ia aparición de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs. En este caso, previamente a Ia intoxicación por MCs, los peces están protegidos por un aumento de las defensas antioxidantes producido por Ia acción de Ia NAC. El medicamento también se emplea para Ia recuperación de los efectos tóxicos ocasionados en peces expuestos a MC.

El término "efectos tóxicos" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a Ia consecuencia derivada de Ia exposición del pez a las MCs, es decir, la aparición de diversos efectos adversos como por ejemplo un daño celular que ocasiona un daño en los tejidos biológicos Io que a su vez puede provocar un cambio en las funciones fisiológicas y en el metabolismo celular.

Las MCs son toxinas de estructura heptapeptídica producida tanto por cianobacterias filamentosas (Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) como coloniales (Microcystis). Una vez que se ingieren, las MCs se transportan hasta el hígado donde Ia mayoría quedan almacenadas y el resto permanecen en Ia sangre y pueden contaminar otros tejidos. Las MCs se unen covalentemente a fosfatases de proteínas bloqueando así numerosos procesos de control celular. La MC de Ia presente invención se selecciona de Ia lista que comprende microcistina LA, microcistina LR, microcistina YR, microcistina RR, microcistina YM, microcistina YA, microcistina LY, microcistina FR, microcistina Laba, microcistina HtyR, microcistina AR, microcistina M(O)R, microcistina WR, 3-desmetilmicrocistina LR, 7-desmetilmicrocistina LR, 3,7-didesmetilmicrocistina LR, 3-desmetilmicrocistina YR, 7-desmetilmicrocistina YR, 3- desmetilmicrocistina RR, 7-desmetilmicrocistina RR, 3,7-didesmetilmicrocistina RR, 3-desmetilmicrocistina HtyR, 7-desmetilmicrocistina HtyR, 3,7- didesmetilmicrocistina HtyR, 7-desmetilmicrocistina HphR, (Mser7)microcistina LR, (Ser7)microcistina LR, (Ser7)microcistina RR, (Ser7)microcistina HtyR, (Ser7)3-desmethytmicrocistina XR, (DMAdda) microcistina LR, (ADMAdda) microcistina LR, (ADMAdda)3-desmetilmicrocistina LR, (ADMAdda) microcistina Lhar, (ADMAdda, Mser7) microcistina LR, D-Glu(CH30)estermicrocistina LR, D- Glu(CH ₃ O)ester 3-desmetilmicrocistina LR, D-Glu(C ₃ H ₇ θ ₂ )ester microcistina LR o (D-Ser1.ADMAdda) microcistina LR. La lista anterior no se limita a las MCs mencionadas. Preferiblemente Ia MC es microcistina LR (MC-LR).

Un segundo aspecto de Ia presente invención es el uso de una composición que comprende N-acetilcisteína para Ia elaboración de un medicamento útil en Ia recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs. El término "recuperación" hace referencia a Ia desaparición de los efectos tóxicos causados por Ia intoxicación con MC. Esta recuperación supone Ia reversión total de los daños causados en los tejidos del pez, recuperando de esta forma las funciones normales de los órganos afectados.

En una realización preferida de Ia presente invención, los efectos tóxicos son decir, la aparición de diversos efectos adversos como por ejemplo un daño celular que ocasiona un daño en los tejidos biológicos Io que a su vez puede provocar un cambio en las funciones fisiológicas y en el metabolismo celular.

Las MCs son toxinas de estructura heptapeptídica producida tanto por cianobacterias filamentosas (Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) como coloniales (Microcystis). Una vez que se ingieren, las MCs se transportan hasta el hígado donde Ia mayoría quedan almacenadas y el resto permanecen en Ia sangre y pueden contaminar otros tejidos. Las MCs se unen covalentemente a fosfatasas de proteínas bloqueando así numerosos procesos de control celular. La MC de Ia presente invención se selecciona de Ia lista que comprende microcistina LA, microcistina LR, microcistina YR, microcistina RR, microcistina YM, microcistina YA, microcistina LY, microcistina FR, microcistina Laba, microcistina HtyR, microcistina AR, microcistina M(O)R, microcistina WR, 3-desmetilmicrocistina LR, 7-desmetilmicrocistina LR, 3,7-didesmetilmicrocistina LR, 3-desmetilmicrocistina YR, 7-desmetilmicrocistina YR, 3- desmetilmicrocistina RR, 7-desmetilmicrocistina RR, 3,7-didesmetilmicrocistina RR, 3-desmetilmicrocistina HtyR, 7-desmetilmicrocistina HtyR, 3,7- didesmetilmicrocistina HtyR, 7-desmetilmicrocistina HphR, (Mser7)microcistina LR, (Ser7)microcistina LR, (Ser7)microcistina RR, (Ser7)microcistina HtyR, (Ser7)3-desmethytmicrocistina XR, (DMAdda) microcistina LR, (ADMAdda) microcistina LR, (ADMAdda)3-desmetilmicrocistina LR, (ADMAdda) microcistina Lhar, (ADMAdda, Mser7) microcistina LR, D-Glu(CH30)estermicrocistina LR, D- Glu(CH ₃ O)ester 3-desmetilmicrocistina LR, D-Glu(C ₃ H ₇ θ ₂ )ester microcistina LR o (D-Ser1.ADMAdda) microcistina LR. La lista anterior no se limita a las MCs mencionadas. Preferiblemente Ia MC es microcistina LR (MC-LR).

Un segundo aspecto de Ia presente invención es el uso de una composición que comprende N-acetilcisteína para Ia elaboración de un medicamento útil en Ia recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs. El término "recuperación" hace referencia a Ia desaparición de los efectos tóxicos causados por Ia intoxicación con MC. Esta recuperación supone Ia reversión total de los daños causados en los tejidos del pez, recuperando de esta forma las funciones normales de los órganos afectados.

En una realización preferida de Ia presente invención, los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas. El término "alteraciones histopatológicas" tal como se entiende en Ia presente invención son daños producidos en los tejidos biológicos del pez. Estos daños son detectados por medio de análisis a nivel microscópico de las estructuras patológicas de las diferentes muestras obtenidas, sin excluir otras técnicas de detección.

Una realización aún más preferida de Ia invención, es el uso donde las alteraciones histopatológicas son producidas en al menos uno de los tejidos de Ia lista que comprende hígado, riñon, corazón, branquias o tracto gastrointestinal. Tal como se ha mencionado anteriormente las MCs pueden acumularse en el tejido hepático y también pueden llegar a otros órganos utilizando Ia sangre como medio de dispersión, de esta forma, las MCs pueden causar efectos tóxicos y/o alteraciones histopatológicas en los citados órganos. La recuperación de los tejidos afectados por las alteraciones histopatológicas es un aspecto destacable de Ia presente invención ya que puede suponer Ia curación de los peces cultivados, peces seleccionados por diversas características para Ia cría, peces de especies en peligro de extinción o cualquier otro tipo de pez que presente alteraciones histopatológicas en un grado reversible.

En otra realización más preferida de Ia presente invención, Ia NAC se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg por Kg de peso del pez. Esta administración se lleva a cabo durante al menos una semana. Preferiblemente Ia cantidad diaria incorporada a los peces es de entre 600 y 880 mg por Kg de peso. Tal como los inventores han determinado, Ia administración de cantidades diarias superiores a 800 mg por Kg de peso de pez, pueden ocasionar alteraciones hepáticas en los peces (esteatosis), renales (atrofia, degeneración), cardiacas (miofibrolisis) e intestinales (pérdida de microvellosidades).

Esta composición, se puede administrar de distintas formas, entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, intramuscularmente o de forma subcutánea. Más preferiblemente se administra de forma oral o intraperitoneal. En otra realización más preferida Ia composición se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral o intraperitoneal. Los peces intoxicados están expuestos a más de 60 μg de MC por pez y por día durante 21 días (intoxicación subcrónica). Preferiblemente los peces están expuestos a más de 120 μg de MC por pez en exposición única.

Otra realización preferida de Ia presente invención, comprende el uso de Ia composición anteriormente descrita que además incluye excipientes farmacológicamente aceptables.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a Ia absorción de Ia sustancia activa (en Ia presente invención, NAC), estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a Ia preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que Io hagan más agradable.

Así pues, los excipientes podrían tener Ia función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o Ia humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar Ia disolución de los componentes y su absorción en el intestino sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término "excipiente farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

En una realización más preferida de Ia invención, Ia composición comprende además otra sustancia activa.

En cada caso Ia composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición de Ia presente invención se puede presentar bajo Ia forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Otras realizaciones preferidas son el uso para Ia fabricación de un alimento funcional, el uso para Ia fabricación de un complemento vitamínico y otra más es el uso para Ia fabricación de un complemento nutricional.

La NAC puede formar parte de un alimento funcional, complemento vitamínico, complemento nutricional o cualquiera de sus combinaciones. Tal como se entiende en Ia presente invención, un alimento funcional cumple una función específica como puede ser Ia de mejorar Ia salud de los peces. Para ello al alimento funcional se Ie puede agregar un complemento vitamínico y/o complemento nutricional. El alimento funcional, los complementos descritos o cualquiera de sus combinaciones pueden administrarse junto con un pienso, formar parte de Ia composición del pienso o pueden administrarse de forma independiente.

En una realización preferida, de Ia presente invención, los peces son cultivados.

Se entiende por "peces cultivados" aquellos peces criados en piscifactorías, charcas o cualquier contenedor de agua de cualquier tamaño que permita Ia cría de peces y/o el engorde. Los peces cultivados pueden ser, sin limitar, peces destinados a Ia alimentación o a Ia cría de peces ornamentales.

En otra realización preferida, de Ia presente invención, los peces pertenecen al género Oreochromis sp.

Los peces pertenecientes a este género se conocen como Tilapias. Las Tilapias crecen en aguas cálidas dulces o saladas y tienen pocas exigencias respiratorias, rápido crecimiento y facilidad para Ia puesta. Los peces se pueden seleccionar, sin limitarse, a Ia lista que comprende O. amphimelas, O. andersonü,,O. angolensis, O. aureus, O. chungruruensis , O. esculentus, O. hunterí, O. ismailiaensis, O. jipe, O. karomo, O. karongae, O. korogwe, O. lepidurus, O. leucostictus, O. lidole, O. macrochir, O. malagarasi, O. mortimeri, O. mossambicus, O. mweruensis, O. niloticus (NiIe tilapia), O. Pantani, O. pangani girigan, O. pangani pantani, O. placidus, O. placidus placidus, O. placidus ruvumae, O. rukwaensis, O. saka, O. salinicola, O. schwebischi, O. shiranus, O. shiranus chilwae, O. shiranus shiranus, O. spilurus, O. spilurus niger, O. spilurus percivali, O. spilurus spilurus, O. squamipinnis, O. tangán ¡cae, O. upembae, O. urolepis, O. urolepis hornorum, O. urolepis urolepis u O. variabais. Más preferiblemente los peces pertenecen a Ia especie O. niloticus (NiIe tilapia).

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra el efecto protector de diferentes concentraciones de NAC sobre Ia LPO en hígado y riñon de tilapias expuestas a 120 μg MC/pez.

FIG. 1A.- Medidas de LPO en hígado. FIG. 1 B - Medidas de LPO en riñon. Donde: el eje Y representa los valores de LPO (peroxidación lipídica) cuantificados como sustancias de degradación de Ia peroxidación de los lípidos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (Thiobarbituric Acid Reactive Substances, TBARS) expresados en nmol TBARS/g de tejido ± error estándar (n=8). Los niveles de significación, es decir, que al comparar entre los grupos seleccionados Ia diferencia entre ellos sea estadísticamente significativa para Io cual el parámetro p debe ser menor de 0.05 (p<0.05), son los siguientes: (a) en comparación con el grupo control (grupo 1), (b) en comparación con el grupo 2, sólo MC; (c) comparación del grupo tratado con MC y NAC con el grupo tratado sólo con NAC, y (f) comparación del grupo de peces tratado con MC y una dosis de NAC de 1936 mg NAC/Kg pez/día con un grupo de peces tratados con MC y una dosis de NAC 880 mg NAC/Kg pez/día.

FIG. 2. Muestra los cambios histopatológicos en hígado de tilapias expuestas a MCs y su recuperación por NAC.

A, C, E, G, I ₁ K, M, O: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden 5, 100, 50, 50, 50, 50, 50 y 50 μm, respectivamente. B, D, F, H, J, L, N, P: 10

Observaciones ultraestructurales. Las barras miden 20, 10, 20, 20, 10, 5, 20 y 20 μm, respectivamente.

FIG. 3. Cambios histopatológicos en riñon de tilapias expuestas a MCs y su recuperación por NAC.

A, C, E, G, I, K, M, O: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden 200, 100, 100, 50, 50, 50, 50 y 150 μm, respectivamente. B, D, F, H, J, L, N, O: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden 10, 50, 10, 10, 50, 50, 50 y 50 μm, respectivamente.

FIG. 4. Cambios histopatológicos en corazón de tilapias expuestas a MCs y su recuperación por NAC

A, C, E, G, I, K, M, O: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden, 50 μm. B, D, F, H ₁ J, L, N, P: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden, 10, 10, 30, 10, 10 y 10 μm, respectivamente.

FIG. 5. Cambios histopatológicos en intestino de tilapias expuestas a MC y su recuperación por NAC

A, C, E, G, I, K, M, O: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden, 50 μm. B, D, F, H, J, L. N, P: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden, 10, 10, 10, 5, 10, 10, 5 y 10 μm, respectivamente.

FIG. 6: Cambios histopatológicos en branquias de tilapias expuestas a MC y su recuperación por NAC.

A, C, E, G, I, K, M, O: Tinción con Hematoxilina-eosina. Las barras miden, 100 μm. B, D, F, H, J, L, N, P: Observaciones ultraestructurales. Las barras miden 500, 1000, 500, 500, 500, 500, 500 y 500 μm, respectivamente.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el uso de NAC para tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs. 11

EJEMPLO 1

La invención se llevó a cabo empleando un total de 64 peces macho de Oreochromis niloticus (NiIe tilapia), de peso medio 50±7 g, y longitud de 12±2 cm, obtenidos en una piscifactoría, y transferidos en acuarios (96 L) con sistema de filtración de agua y aireación adecuados, y ciclos de 12/12 h luz/oscuridad. Los peces fueron alimentados con comida comercial (Dibaq, Segovia, España), en una cantidad de 0,3 g/día. Los peces se aclimataron durante 15 días antes del experimento. Se llevó a cabo Ia extracción de las MCs a partir de un liofilizado de células de cianobacterias procedentes de una floración natural que contenía 2885 μg/g de MC-LR, según el método de Moreno et al (2004, Biol Res 37:405-417). Se utilizaron 8 grupos experimentales con 8 animales en cada uno. Cada grupo fue introducido en un acuario independiente:

Acuario 1 : Peces control, alimentados sólo con pienso normal durante 7 días.

Acuario 2: Peces alimentados con pienso durante 7 días, intoxicados con MCs en Ia dieta (dosis única de 120 μg/pez).

Acuarios 3, 5 y 7: Peces alimentados con pienso + NAC durante 7 días.

Acuarios 4,6 y 8: Peces con pienso + NAC (400, 880 y 1936 mg de NAC/Kg pez, respectivamente) durante 7 días. Los peces se intoxicaron con una dosis única de 120 μg MC/pez.

Al final del experimento los peces fueron sacrificados, anestesiándolos con hielo. Se procedió a Ia extracción de los órganos, y se prepararon sus extractos para las determinaciones de biomarcadores enzimáticos, según Prieto et al. (2006, Aquat. Toxicol 77:314-321), concretamente Ia medida de Ia lipoperoxidación lipídica (LPO) se realizó midiendo los TBARS o sustancias de degradación de Ia peroxidación de los lípidos que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico. Los estudios histológicos por microscopía óptica y electrónica en los distintos órganos se llevaron a cabo según Atencio et al (2008, Toxicol Pathol 36:449- 458).

Para los estudios de significación estadística entre grupos, se empleó el análisis de Ia varianza (ANOVA) y posteriormente el ensayo de Tukey, con una significación estadística p<0,05. 12

Los resultados más significativos fueron los siguientes:

1) En Ia FIG 1 se observa como las MCs incrementan Ia lipoperoxidación (LPO) en hígado (1 ,9 veces), y en riñon (1 ,4 veces) frente al control, y los efectos protectores de NAC se demuestran con todas las dosis ensayadas. 2) Las MCs disminuyen los cocientes GSH/GSSG en hígado de los peces intoxicados, y Ia aplicación de NAC mejoró este parámetro. 3) Las alteraciones de Ia actividad catalasa (CAT), superoxido dismutasa (SOD), Glutatión peroxidasa (GPx), Glutatión reductasa (GR) y Glutatión transferasa (GST) fueron mejoradas por NAC, recuperando los valores del grupo control.

EJEMPLO 2. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en hígado.

El estudio histopatológico del hígado de los peces pertenecientes al lote tratado con MC-LR puso de evidencia un proceso degenerativo que consistió en Ia presencia de cordones hepáticos formando células en cebolla característica de una degeneración glucogénica (FIG.2 C), frente a una ausencia de lesiones del grupo control (FIG.2 A, B). Al microscopio electrónico las células muestran núcleos redondeados, escaso citoplasma y Ia mayor parte de éste ocupado por glucógeno granular (FID. 2 D).

En los tres lotes de peces tratados exclusivamente con NAC se observó que, mientras que con las dosis más bajas (400 y 880 mg/kg) no existían lesiones hepáticas (FIG. 2 E, F ₁ G, H), los peces tratados con Ia dosis más alta (1936 mg/kg) desarrollaron un proceso de esteatosis observándose al microscopio óptico vacuolas de grasas en el citoplasma y al microscopio electrónico hepatocitos muy claros con presencia de vacuolas de grasa (FIG. 2 I, J).

Estas lesiones se mantuvieron en el lote de peces a los que junto a Ia MC-LR se les administró 400 mg/kg de NAC, sin embargo es un proceso mucho más leve, y se intercalaron células acidófilas normales junto a células en cebolla (FIG. 1 K). Al microscopio electrónico se observó Ia presencia de escaso glucógeno en el citoplasma (FIG. 2 L).

El estudio estructural de los peces del lote a los que junto con Ia MC se les administró una dosis de 880 mg/kg de NAC, mostró una recuperación de las 13

lesiones provocadas por Ia MC, ya que éstas no aparecieron en estos peces (FIG. 2 M, N), sin embargo a los que se les administró junto con Ia MC una dosis de 1936 mg/Kg de NAC presentaron un proceso de esteatosis similar al lote de peces tratados únicamente con esta misma dosis de NAC, observándose hepatocitos con citoplasma claro y zonas muy vacuolizadas debido a Ia presencia de grasa (Fig.2 O). Al microscopio electrónico se confirman estas lesiones presentándose en el último lote abundantes vacuolas de grasas muy pleomórficas (Fig.2 P)

A, B: Hígado de los peces control. A. Cordones hepáticos normales, morfología poliédrica con núcleo central y citoplasma claro. B. Detalle de hepatocito aparentemente normal, con organoides citoplasmáticos, retículos

(círculo), mitocondrias (flecha).

C, D: Tilapias expuestas sólo a Microcistinas (120 μgMC/pez.) C. Parénquima hepático desorganizado, cordones de hepatocitos a modo de células en cebolla (círculo). D. El hepatocito presenta un núcleo denso normal (N) rodeado de un escaso citoplasma (flecha) repleto de glucógeno granular (círculo).

E, F: Tilapias expuestas solo a NAC (dosis baja, 400 mg/kg). E. Parénquima hepático con cordones hepatocitos aparentemente normal (círculo). F. El hepatocito con un citoplasma con mitocondrias aparentemente normal

(flecha), lisosomas (círculo) y escaso glucógeno granular (estrella).

G, H: Hígado de tilapias tratadas solo con NAC (dosis media, 880 mg/kg). G.

Parénquima con hepatocitos aparentemente normales dispuestos en cordones (flecha) H. Hepatocitos normales con un desarrollo normal de los organoides citoplasmáticos, mitocondrias (flecha), y escaso glucógeno

(estrella).

I, J: Hígado de tilapias tratadas con dosis alta de NAC (1936 mg/kg). I.

Hepatocitos en cordones con vacuolas de grasa en el citoplasma (flecha). J. Hepatocito con citoplasma muy claro y presencia de vacuolas grasas

(estrella).

K, L: Hígado de peces tratados con MC-LR+ NAC (400 mg/kg). K.

Hepatocitos en cordones con morfología aparentemente normal (círculo). L.

Hepatocito con citoplasma claro (flecha) rodeando al núcleo (N) y presencia de glucógeno (círculos) 14

M, N: Hígado de peces tratados con MC-LR+NAC (880 mg/kg). M. Parénquima con hepatocitos en cordones y con citoplasma aparentemente normal (círculo). N. Hepatocitos con abundantes mitocondrias (flecha) asociadas al Retículo endoplásmico rugoso (RER) (estrella). O, P: Hígado de peces tratados con MC-LR+NAC (1936 mg/kg). O. Parénquima hepático con hepatocitos con citoplasma claro y con numerosas vacuolas de grasa (círculo). P. Hepatocito alterado con presencia de vacuolas de grasas muy pleomórficas (círculo).

EJEMPLO 3. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en riñon.

Morfológicamente los ríñones de los peces del lote tratados con MC-LR mostraron una degeneración glomerular caracterizada por una atrofia del glomérulo, dilatación de Ia capsula de Bowman, hiperemia y hemorragia en el parénquima renal (FIG. 3 C), y al microscopio electrónico, por Ia presencia de membranas básales irregulares y con zonas de hialinización podocitaria (FIG. 3 D). Los ríñones de los peces del lote control presentaron una estructura aparentemente normal (FIG. 3 A, B).

El estudio de los peces de los lotes tratados solamente con las dosis más bajas de NAC (400 y 880 mg/kg, respectivamente) no mostraron ninguna lesión renal (FIG. 3 E, F, G, H). Sin embargo, con Ia dosis más alta (1936 mg/kg) los ríñones presentaron un proceso de degeneración atrófica glomerular, observándose al microscopio electrónico un engrasamiento e irregularidad de las membranas básales de los capilares (FIG. 3 I, J).

En los peces a los que se les administró MC junto con 400 mg/ kg de NAC se observaron al microscopio óptico ciertas lesiones consistentes en ligeras hiperemias y microhemorragias (FIG. 3 K), y al microscopio electrónico, una ligera tumefacción de Ia pared endotelial (FIG. 3 L). En el lote de peces tratados con MC y 880 mg/kg de NAC se observó estructuralmente y ultraestructuralmente una morfología del parénquima renal totalmente normal (FIG. 3 M, N). Sin embargo, aquellos a los que se Ie suministró MC y 1936 mg/kg de NAC mostraron un proceso de atrofia y degeneración membranosa 15

glomerular junto con ciertos procesos de hiperemia y microhemorragias (FIG. 3 O ₁ P).

A, B: Riñon de los peces control. C, D: Histología de peces tratados con MC-LR. C. Detalle de parénquima renal con glomérulos atrofíeos, hialinizados e hiperémicos con dilatación de Ia capsula de Bowman (flecha). Hiperemia (círculo) y hemorragias (estrella) en el parénquima renal. D. Glomérulo renal con engrosamiento e irregularidad de las membranas básales (flecha) con zonas de hialinización podocitaria (círculo).

E, F: Tilapias expuestas sólo a NAC (dosis baja, 400 mg/kg). E. Parénquima renal con glomérulo renal (círculo) aparentemente normal y ligeras hemorragias (flecha). F. Detalle del glomérulo renal normal con ligera tumefacción de Ia pared endotelial (círculo). G, H: Tilapias expuestas sólo a NAC (dosis media, 880 mg/kg). G. Glomérulo de tamaño y morfología normal (círculo). H. Glomérulo renal aparentemente normal con las membranas básales distribuidas correctamente (círculo). I, J: Histología del riñon de tilapias tratadas con dosis alta de NAC (1936 mg/kg). I. Atrofia de glomérulos (círculo), hialinizados e hiperámicos (flecha). J. Engrosamiento e irregularidades de las membranas básales del glomérulo renal (círculo).

K, L: Histología del riñon de peces tratados con MC-LR+ NAC (400 mg/kg). K. Detalle del parénquima renal prácticamente normal, con hiperemia (flecha) y ligeras hemorragias (estrella). L. Glomérulo renal con tumefacción de las células endoteliales (círculo).

M, N: Histología del riñon de peces tratados con MC-LR+NAC (880 mg/kg). M. Detalle del parénquima renal prácticamente normal. N. Glomérulo renal sin modificación de las membranas básales (círculo). O, P: Histología del riñon de peces tratados con MC-LR+NAC (1936 mg/kg). O. Parénquima renal con glomérulos hialinizados e hiperémicos (círculo), y dilatación de Ia capsula de Bowman (flecha). Hemorragias (estrella). P. Degeneración membranosa con grumos irregulares (flecha) e hialinización podocitaria muy marcada (círculo).

EJEMPLO 4. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en corazón. 16

El estudio histopatológico realizado sobre peces tratados con MC-LR mostraron estructuralmente a nivel de corazón un proceso de miofibrolisis, tumefacción y cierta presencia de grasa. Ultraestructuralmente se apreció claramente esta miofibrolisis de Ia fibra cardiaca, caracterizada por una pérdida de gran parte del material contráctil (FIG. 4 C, D).

Los peces tratados con las dosis más bajas de NAC (400 y 880 mg/kg) presentan una morfología de las fibras cardiacas similares a las del grupo control (FIG. 4 E, F, G, H) mientras que las del lote del grupo a los que se les administró Ia dosis más alta de NAC (1936 mg/kg ), presentaron al microscopio óptico tumefacción y miofibrolisis de las fibras cardiacas junto con procesos de microhemorragias (FIG. 4 I). Al microscopio electrónico se apreció en este último lote una desintegración parcial de las miofibrillas (FIG. 4 J).

Los procesos degenerativos en corazón que se observaron en los peces tratados con MC-LR fueron mucho más leves en aquellos peces tratados con suplemento de NAC a Ia dosis más baja (400 mg/kg) (FIG. 4 K, L) y no se observaron lesiones en los tratados con Ia dosis intermedia (880 mg/kg) (FIG. 3 M, N), sin embargo, en aquéllos a los que se les suministró además de Ia MC Ia dosis más alta de NAC (1936 mg/kg) mostraron un proceso de miofibrolisis con deflecación de las miofibrillas y cierta grasa intersticial observado al microscopio óptico (FIG. 3 O), y ultraestructuralmente se apreciaron las fibras cardiacas con degeneración y desintegración de las miofibrillas (FIG. 3 P).

A, B: Corazón de peces control.

C, D: Histología del corazón de peces tratados con MC-LR. C. Tumefacción de miofibrilla (círculo) con deflecación de las mismas (flecha) y zona de almacenamiento graso (estrella). D. Pérdida y desintegración de las miofibrillas (círculo).

E, F: Corazón de peces tratados con NAC (dosis baja, 400 mg/kg). E. Detalle de corazón con fibras aparentemente normal (círculo). F. Estructura de las miofibrillas prácticamente normal (círculo). G, H: Corazón de tilapias expuestas solo a NAC (dosis media, 880 mg/kg). G. Fibras musculares aparentemente normales. H. Miofibrillas aparentemente normales (círculo). 17

I, J: Histología del corazón de tilapias tratadas con dosis alta de NAC (1936 mg/kg). I. Tumefacción de las fibras (círculo) con deflecaciones de las mismas (estrella) y microhemorragias (flechas). J. Fibras con desintegración parcial de las miofibrillas (círculos). K ₁ L: Histología del corazón de peces tratados con MC-LR+NAC (400 mg/kg). K. Detalle de miocardio con zonas de fibrillas musculares deflecadas (círculo) y microhemorragias escasas (flecha). L. Desorganización fibrilar (flechas) y concentraciones de mitocondrias (círculo). M, N: Histología del corazón de peces tratados con MC-LR+NAC (880 mg/kg). M. Detalle de corazón con fibras musculares aparentemente normal. N. Fibra cardiaca con miofibrillas normales (flecha) y concentraciones de mitocondrias muy activas (círculo).

O ₁ P: Histología del corazón de peces tratados con MC-LR+NAC (1936 mg/kg). O. Deflecación de miofibrillas (círculo) y cierta grasa intersticial (flechas). P. Degeneración y desintegración de las miofibrillas (círculo).

EJEMPLO 5. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en intestino.

A nivel de intestino en los peces tratados con MC-LR se observaron lesiones, frente al lote control (FIG. 5 A, B), caracterizadas por un proceso de enteritis necrótica con Ia presencia, al microscopio óptico, de enterocitos necrosados y descamación parcial de las vellosidades (FIG. 5 C), y al microscopio electrónico, una pérdida de microvellosidades (FIG. 5 D).

Tras Ia administración de las diferentes dosis de NAC (400, 880 y 1936 mg/kg) solo se observaron ciertas lesiones en Ia dosis más alta (1936 mg/kg), que consistieron en un proceso de necrosis y degeneración del enterocito, con células en necrosis y zonas de las vellosidades descamadas (FIG. 5 E, F, G, H, I ₁ J).

Los peces a los que se les administró NAC junto con Ia MC-LR mostraron una protección (400 y 880 mg/kg) con una estructura aparentemente normal cuando fueron observadas tanto al microscopio óptico como electrónico (FIG. 4 K, L, M, N). Sin embargo, con Ia suplementación con Ia dosis más alta de NAC (1936 mg/kg) se observaron procesos de necrosis y degeneración del hepatocito, 18

detectándose al microscopio óptico vellosidades intestinales con necrosis y descamación (FIG. 5 O) y al microscopio electrónico, pérdida de microvellosidades (FIG. 5 P).

A, B: Intestino de peces control. A. Vellosidades aparentemente normales con enterocitos aparentemente normales. B. Enterocitos con abundantes microvellosidades (círculo) aparentemente normales.

C, D: Histología de intestino de tilapias tratadas con MC-LR. C. Detalle de vellosidades intestinales con enterocitos necrosados (flecha) y descamación parcial (círculo). D. Alteración de los enterocitos con pérdida parcial (círculo) y total (flecha) de las microvellosidades.

E, F: Intestino de peces tratados con NAC (dosis baja, 400 mg/kg). E.

Vellosidades aparentemente normales (círculo). F. Células intestinales aparentemente normales (círculo). G, H: Intestino de Tilapias expuestas solo a NAC (dosis media, 880 mg/kg). G.

Vellosidades aparentemente normales (círculo). H. Recuperación del epitelio con abundantes microvellosidades (círculo).

I, J: Intestino de tilapias tratadas con dosis alta de NAC (1936 mg/kg). I. Detalle de vellosidades intestinales con Ia zona apical necrosada (flecha) y descamada parcialmente (círculo). J. Zonas de descamación de Ia microvellosidades

(círculo).

K, L: Histología del intestino de peces tratados con MC-LR+NAC (400 mg/kg). K.

Detalle de vellosidades intestinales con pequeñas zonas de enterocitos necrosados (flechas). L. Zona apical del enterocito con alteración de las microvillosidades (círculo).

M, N: Intestino de peces tratados con MC-LR+NAC (880 mg/kg). M.

Vellosidades intestinales normales (círculo). N. Zonas de enterocitos aparentemente normales con microvellosidades recuperadas (círculo).

O, P: Intestino de peces tratados con MC-LR+NAC (1936 mg/kg). O. Vellosidades intestinales con necrosis (flecha) y descamación de las células intestinales (círculo). P. Enterocitos alterados con pérdida de Ia microvellosidades intestinales (círculo).

EJEMPLO 6. NAC mejoró las alteraciones histopatológicas inducidas en branquias. 19

Al microscopio óptico las branquias de los peces tratados con MC presentaron, a nivel de las laminillas primarias y secundarias, procesos de hiperemia y hemorragias, y al microscopio electrónico de barrido se observó una alteración de Ia morfología con pérdida de continuidad del arco branquial, descamación y presencia de componentes sanguíneos extravasados (FIG. 6 B, C). Estas lesiones no fueron observadas en el lote control, que presentó una morfología aparentemente normal (FIG. 5 A, B).

En los tres lotes de peces tratados exclusivamente con NAC no se observaron lesiones en las branquias con las dosis más bajas (400 y 880 mg/kg) (FIG. 6 E,

F, G, H), pero los peces tratados con Ia dosis más alta (1936 mg/kg) mostraron alteraciones tales como zonas de hemorragias e hiperemia tanto en las laminillas primarias como secundarias (FIG. 6 I). En este último lote, las branquias observadas mediante microscopio electrónico de barrido presentaron zonas de descamación en las laminillas primarias y deflecaciones en las laminillas secundarias, además de presencia de elementos formes sanguíneos extravasados (FIG. 6 J).

Los peces tratados con MC y 400 mg/kg de NAC, mostraron recuperación de las lesiones provocadas por Ia MC, ya que presentaron ligeras hiperemias y ciertas descamaciones en las laminillas (FIG. 6 K, L), aunque Ia protección es máxima en aquellos peces a los que se les administró 880 mg/kg de NAC ya que no se observaron lesiones en estos peces (FIG. 6 M, N). Sin embargo, a los peces que se les administró MC y 1936 mg/Kg de NAC presentaron procesos de hiperemia y hemorragias en el arco bronquial observados mediante el microscopio óptico

(FIG. 6 O), y al microscopio electrónico de barrido se apreció una descamación de las láminas primarias y tumefacción de las laminillas secundarias (FIG. 5 P).

A, B: Branquias de peces control. C, D: Branquias de peces tratados con MC-LR. C. Detalle de filamento branquial con presencia de hiperemia (círculo) y hemorragias (flecha) en laminillas primarias y secundarias. D. Arco branquial con pérdida de continuidad y presencia de componentes sanguíneos extravasados (círculo). E, F: Histología de branquias de peces tratados con NAC (dosis baja, 400 mg/kg). E. Filamentos branquiales aparentemente normales. F. Detalle de laminillas primarias y secundarias aparentemente normales. 20

G, H: Branquias de peces tratados con NAC (dosis media, 880 mg/kg). G.

Filamentos branquiales aparentemente normales. H. Detalle de laminillas primarias y secundarias aparentemente normales.

I ₁ J: Histología de branquias de peces con dosis alta de NAC (1936 mg/kg). I. Laminillas primarias con zonas de hemorragias (flecha) e hiperemia (estrella). J.

Laminillas primarias con zonas de descamación y presencia de elementos sanguíneos extravasados (círculo). Deflecación de las laminillas secundarias

(flecha).

K, L: Histología de branquias de peces tratados con MC-LR+ NAC (400 mg/kg). K. Laminillas primarias y secundarias con ligera hiperemia (flecha) y hemorragias (estrella). L. Laminas primarias con ligera descamación (círculo) y láminas secundarias aparentemente normales (flecha).

M, N: Branquias de peces tratados con MC-LR+NAC (880 mg/kg). M.

Filamentos branquiales aparentemente normales. N. Laminillas primarias y secundarias aparentemente normales.

O, P: Branquias de peces tratados con MC-LR+NAC (1936 mg/kg). O. Procesos hemorrágicos en el arco branquial (círculo), y presencia de hiperemia en lámina primaria y secundaria (flecha). P. Descamación, hemorragia y tumefacción de las láminas primarias (flecha).