CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de nanopartículas con elevada intensidad de absorbancia SPR, en un estrecho rango de longitud de onda, como agentes citotóxicos para la inducción de muerte celular. Así la presente invención puede aplicarse en biomedicina, en métodos de fototerapia para el tratamiento de enfermedades mediante la inducción de muerte celular. Más concretamente la presente invención puede aplicarse en tratamientos de enfermedades infecciosas mediante la inducción de la muerte de microorganismos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La fabricación y estudio de nanomateriales ha tenido un desarrollo creciente durante la pasada década. Los materiales con dimensiones nanométricas representan un cambio significativo en sus propiedades físico-químicas y en algunos casos son origen de nuevos fenómenos. Sin embargo, los estudios relacionados con la actividad biológica de estos nanomateriales aún son muy incipientes. Algunas investigaciones recientes muestran resultados importantes relacionados con la actividad de diferentes medicamentos y con la función antimicrobiana. Entre los nanomateriales utilizados se encuentra la plata (Ag), conocida por sus propiedades como desinfectante desde hace alrededor de 1200 años. Preparaciones de este metal han sido utilizadas durante siglos con varios usos médicos, como son: profilaxis ocular de recién nacidos, uso tópico en heridas por quemaduras, tratamiento de infecciones ortopédicas y otras dolencias. La plata también sirve como un potente bactericida, actuando contra un amplio espectro de microorganismos. Se cree que cationes de este metal reaccionan con las proteínas, provocando su inactivación, mediante la formación de enlaces de coordinación con grupos -SH de residuos de Cys. Cuando este material es preparado en forma de nanopartículas es de esperar una mayor actividad antimicrobiana debido al aumento de la superficie específica de interacción. Análisis mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) e investigaciones proteómicas sugieren que las nanopartículas de plata interactúan con los componentes de la membrana bacteriana, causando cambios estructurales que terminan por provocar la disipación de la fuerza protón- motriz y consecuentemente inducen la muerte de la célula. Se cree también que la inactivación general de proteínas celulares a causa del tratamiento con iones Ag ⁺ tiene otras consecuencias graves, como la pérdida de la capacidad de replicación del ADN. Adicionalmente, se encontró que la unión de iones Ag ⁺ con grupos funcionales de las proteínas puede dar lugar a su desnaturalización. Las nanopartículas de Ag también pueden utilizarse como agentes antimicrobianos efectivos al ser aplicadas como recubrimiento de superficies que requieren una función bactericida, por ejemplo, en los casos de material médico y filtros para tratamiento de agua.

Otra aplicación interesante de las nanopartículas metálicas en el campo de la biología es la detección de concentraciones muy bajas de moléculas mediante el efecto denominado "Surface-enhanced Raman Scattering" (SERS), descubierto a finales de la década del 1970. Este fenómeno está relacionado con un incremento gigantesco de la dispersión Raman (10 ¹⁰ - 10 ¹⁵ ) en el entorno de nanopartículas metálicas. En una de sus interpretaciones, el fenómeno se relaciona con la resonancia electromagnética en las nano estructuras de metales nobles, lo cual ha servido de base para la teoría electromagnética del SERS. Actualmente, esta resonancia electromagnética es denominada "Surface Plasmon Resonante" (SPR), e incluye fenómenos y aplicaciones muy diversas, tales como "SPR biosensing", terapia fotodinámica usando el plasmon de las nanocorazas o nanocortezas de Au y líneas de transmisión óptica basadas en nanopartículas. Todas estas aplicaciones están basadas en los intensos campos electromagnéticos que se producen en la vecindad de las nanopartículas metálicas a causa de la polarización de un campo electromagnético externo. La intensidad e incremento de este campo electromagnético local vienen determinadas por la forma, tamaño, configuración y composición de las nanopartículas.

El incremento de la intensidad del campo electromagnético en la superficie de una nanopartícula aislada y excitada resonantemente es alrededor de 30 veces. Sin embargo, en puntos intermedios entre nanopartículas acopladas, la intensidad del campo puede intensificarse unas 5000 veces. Por tanto, en la proximidad de un sistema de nanopartículas, la intensidad de luz de excitación se amplifica por un factor que varía entre 10 ³ y 10 ⁷ . Es de destacar también que la intensidad de estos campos electromagnéticos decae rápidamente con la distancia a la superficie de la nanopartícula metálica.

Otro aspecto importante es el cambio en la actividad química de las nanopartículas bajo los efectos de una radiación luminosa (láser o lámpara fluorescente). La radiación láser de las nanopartículas metálicas (de Ag) diluidas en solución acuosa provoca la fragmentación o fusión del coloide. Se ha demostrado que la radiación láser origina la foto-eyección de electrones, provocando la ionización-oxidación superficial de las nanopartículas y la consecuente segregación de iones (Ag ⁺ ). Este fenómeno se intensifica en presencia de iones Cl ^" , debido a un ataque oxidativo O ₂ /C1 ^" ("oxidative etching"), que en el caso de las nanopartículas de Ag con morfología de planos gemelos puede dar lugar a su disolución completa. El efecto de ataque oxidativo ha sido utilizado para la foto-conversión de nano-esferas en otras nanopartículas de distinta morfología.

Recientemente se han explorado las posibles aplicaciones foto-terapéuticas de nanopartículas metálicas, proponiéndose tratamientos anticancerígenos basados en las propiedades foto-térmicas de las nanopartículas de Au (1-3). En estos casos la actividad de la nanopartícula se basa en el calentamiento local producido en zonas irradiadas debido a su proximidad con los nanoelementos. El papel de las nanopartículas es asegurar una absorción efectiva de la radiación a través del fenómeno SPR y transferir el exceso de energía en forma calor al tejido adyacente. Utilizando un láser continuo con una longitud de onda de 820 nm y una potencia de 4 W/cm ² , Hirsch y sus colaboradores (1) han observado incrementos en la temperatura de aproximadamente 37 ⁰ C por encima de las condiciones fisiológicas en áreas irradiadas en presencia de los nanoelementos. Sin embargo, la aplicación de las nanopartículas utilizadas en la presente invención no se basa en el aumento de la temperatura. Los efectos conseguidos están más bien relacionados con el plasmon inducido sobre la superficie de las nanopartículas. Es decir, el efecto conseguido en la presente invención se debe a una propiedad óptica específica de las nanopartículas utilizadas, y no a una propiedad térmica. Así mismo, los efectos foto-térmicos quedan descartados como causa de la muerte de las células, ya que la radiación electromagnética utilizada en la presente invención es de baja potencia media, 0,018 W/cm ² , es decir, 220 veces menor que la utilizada en tratamientos fototérmicos reportados por otros autores (1).

Por lo tanto, la muerte celular conseguida mediante la presente invención se debe en parte a las características ópticas especiales de las nanopartículas utilizadas. Dichas nanopartículas presentan una serie de peculiaridades importantes, entre las cuales están: una intensidad de absorbancia SPR elevada (entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 1 cm) en un rango estrecho de longitudes de onda entre 350 y 500 nm. Cuando la zona de aplicación de las nanopartículas se irradia con luz de una longitud de onda cercana al máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas (preferentemente entre 400 y 410 nm), se originan campos electromagnéticos elevados en el entorno de las nanopartículas que pueden dar lugar a diversos fenómenos que afectarían a la viabilidad de las células, tales como electroporación: de la membrana celular, ataque fotooxidativo o formación de especies reactivas de oxígeno, los cuales serían responsables en última instancia de la muerte de las células. Ninguno de los documentos localizados en el estado de la técnica comprende el uso de las nanopartículas utilizadas en la presente invención para inducir muerte celular. La utilización de estas nanopartículas aprovechando su propiedad física SPR anteriormente mencionada hace posible que en la presente invención, a diferencia de otros casos descritos en el estado de la técnica, se emplee radiación electromagnética de baja potencia para inducir campos electromagnéticos elevados en el entorno de las nanopartículas, los cuales actúan eficazmente induciendo muerte celular.

El efecto fue ensayado en células procariotas, particularmente en cepas de laboratorio de la bacteria Escherichia coli. Esta aplicación de las nanopartículas de la invención aún no ha sido prevista en los documentos del estado de la técnica analizados.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención

La presente invención se refiere al uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR (entre 0,4 y 1,2) a un rango de longitudes de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm, como agente citotóxico para inducir muerte celular. La estimulación del campo electromagnético en el entorno de las nanopartículas adheridas a la superficie celular conlleva la inhibición del crecimiento de dichas células y, eventualmente, su muerte. Debido a que la radiación electromagnética utilizada en la presente invención es de baja potencia se descartan los efectos foto-térmicos como la causa de la muerte de las células. Por el contrario, la presente invención propone como causas de la muerte celular la electroporación de la membrana celular, el ataque foto-oxidativo ("photooxidative etching") del núcleo de Ag de las nanopartículas, produciendo iones de Ag ⁺ tóxicos, o la fotoinducción de la formación de especies reactivas de oxígeno en el medio celular próximo a las nanopartículas. Todos estos efectos tienen su origen en los altos campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas específicamente utilizadas en la presente invención al ser sometidas a radiación electromagnética de baja potencia.

Las nanopartículas utilizadas en la presente invención presentan la característica física de poseer una elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango estrecho de longitudes de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm. Se trata además de nanopartículas que comprenden un núcleo interno, preferentemente de plata (Ag) o de aleaciones que comprendan plata. Además las nanopartículas están recubiertas por un material inerte semiconductor, cerámico y/o dieléctrico, siendo preferentemente un óxido metálico semiconductor, cerámico y dieléctrico del grupo: SiO ₂ , GeO ₂ , ZrO ₂ , TiO ₂ , ZnO ₂ . De manera particular, en la presente invención se utilizan nanopartículas de Ag recubiertas por una capa externa de SiO ₂ , denominadas nanopartículas Ag-sílice.

Las nanopartículas usadas en la presente invención, una vez unidas a la superficie celular e irradiadas con una longitud de onda dentro del rango entre 350 nm - 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm, inducen la muerte de células procariotas, aunque por sus características este efecto también es extensible a células eucariotas.

En la presente invención se entiende por enfermedad infecciosa a la manifestación clínica provocada por la acción de microorganismos u otros agentes infectivos, como por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, virus, protozoos, etc. A efectos de la presente invención el término elevada intensidad de absorbancia SPR se define entre los valores 0,4 y 1,2 (para un paso óptico de 10 mm). Asimismo, el término rango estrecho de longitud de onda se define entre 350 y 500nm.

En la presente invención se define como agente citotóxico a todo aquel que causa toxicidad en las células suprimiendo sus funciones y/o provocando su muerte. Se refiere a cualquier tipo de célula, procariota o eucariota, preferentemente células bacterianas. Además, en la presente invención, la inducción de citotoxicidad en una muestra comprende la esterilización, desinfección o conservación de la misma; así como cualquier otro efecto procedente de la inducción de la citotoxicidad en las células presentes en la muestra.

La muestra comprende células vivas cuya citotoxicidad, y eventualmente muerte, se desea inducir, y ésta puede ser de cualquier tipo, tanto sólida como líquida, y de cualquier origen. Así, por ejemplo, la muestra puede ser tanto material o instrumental quirúrgico o de laboratorio, como agua u otro líquido, como un medio de cultivo o un tejido biológico.

Por otro lado, mencionar que la dosis efectiva de nanopartículas para provocar la muerte celular en la presente invención corresponde a una concentración de al menos 0,15xl0 ¹⁴ nanopartículas por litro.

Descripción de las figuras

Figura 1. Caracterización física de la nanopartícula Ag-sílice.

A. Espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag-sílice que muestra la banda del Plasmon centrada en 400 nm. El eje X muestra la longitud de onda (nm) y el eje Y la absorbancia (a.u).

La gráfica interior muestra la distribución de tamaños medidos mediante TEM. El eje X muestra el diámetro de las nanopartículas siendo su valor medio 1 lnm.

B. Imagen HRTEM (Microscopía Electrónica de Transmisión de Alta Resolución) de una nanopartícula de Ag-sílice mostrando el recubrimiento de sílice amorfo (flechas negras). La fotografía además muestra los planos cristalinos gemelos ("twin planes"), flechas blancas, y las 5 caras o pliegues gemelos que conforman el tipo de morfología o de crecimiento de nanopartículas con forma de decaedro. En este tipo de morfología de nanopartículas se potencia el fenómeno de ataque oxidativo ("oxidative etching") debido a distorsiones significativas de la red cristalina, a la relajación superficial y en general a la presencia de defectos.

Figura 2. Efecto de las nanopartículas de Ag-sílice en cultivos de bacterias E.coli.

A. Imagen de TEM de una suspensión de células de Escherichia coli en presencia de nanopartículas de Ag-sílice añadidas en una concentración de 0.15x10 ¹⁴ nanopartículas/L. Se muestra la adherencia de las nanopartículas de la invención a la superficie celular. Esta unión es imprescindible para conseguir que los altos campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas, debido al fenómeno SPR, alcancen e interactúen con las células.

B. Curvas de crecimiento de las bacterias medidas a través de OD ⁶⁰⁰ (Densidad Óptica del medio de cultivo líquido a 600nm), eje Y, versus el tiempo de crecimiento en minutos, eje X. Cuadrados, sin nanopartículas, estrellas, con una concentración de 0.15 xlO ¹⁴ nanopartículas/L, triángulos, con 1,5x10 ¹⁴ nanopartículas/L y círculos, con 15x10 ¹⁴ nanopartículas/L.

Figura 3. Efecto bactericida en medio líquido.

Estas gráficas muestran las curvas de crecimiento bacteriano mediante las medidas de OD ⁶⁰⁰ (eje Y) frente al tiempo de crecimiento en minutos (eje X) y bajo diferentes tratamientos. Para estos experimentos se utilizó una concentración intermedia correspondiente a 1.5x10 ¹⁴ nanopartículas/L, para la cual no se manifiesta toxicidad intrínseca de forma previa a la aplicación de la radiación. De esta forma cualquier efecto foto -bactericida conseguido cuando se aplica la radiación puede ser discriminado con respecto al efecto de toxicidad intrínseca de la nanopartícula. Los círculos corresponden a muestras irradiadas y los cuadrados corresponden a las muestras control (sin irradiación). A. Muestra con nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 405nm (láser azul) sobre un 5% del volumen. Se evidencia una disminución en la OD ⁶⁰⁰ entre el 30% y el 40%, incluso siendo irradiado solamente un 5% del volumen total del cultivo.

B. Muestra sin nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 405nm (láser azul) sobre un 15% del volumen. En este caso se observó una ligera disminución en la OD ⁶⁰⁰ .

C. Muestra con nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 633nm (láser rojo). No muestran cambios significativos en el crecimiento celular.

D. Muestra sin nanopartículas de Ag-sílice irradiadas a 633nm (láser rojo). No muestran cambios significativos en el crecimiento celular.

Figura 4. Efecto bactericida en medio sólido.

A. Cultivo de bacterias Escherichia coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con aplicación de dos tipos de radiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. Se observa un área libre de células (superficie gris), claramente distinguible de la zona ocupada por colonias bacterianas (superficie brillante, blanca) en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). En cambio, dicha zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es más efectiva porque es cercana al máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas.

B. Cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de células. Es decir, el tratamiento no es efectivo, a pesar de la radiación, debido a la ausencia de nanopartículas. C. Cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con radiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas. Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B).

D. Cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas después de 48 horas sin irradiación, habiendo sido antes irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B).

Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz de 405nm es efectivo y, además, irreversible.

Figura 5. Esquema representativo de los mecanismos responsables de la muerte celular después del tratamiento con las nanopartículas de la invención e irradiación con una longitud de onda entre 350 y 500nm.

A. Ataque directo a la superficie celular a través de perturbaciones eléctricas en la pared celular y en la membrana causando el mal funcionamiento de la células y eventualmente su muerte.

B. Fenómeno de ataque fotooxidativo ("foto-oxidative etching"): liberación de iones Ag ⁺ de las nanopartículas Ag-sílice, en presencia de anión Cl ^" (presente en el medio de cultivo), que son inyectados justo en la membrana celular.

C. Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). La excitación de cromóforos endógenos bacterianos foto-sensibles provoca la reducción de moléculas de oxígeno cercanas, produciendo ROS muy reactivas capaces de matar a las células.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la inducción de muerte celular por parte de nanopartículas citotóxicas con características ópticas especiales, adheridas a la superficie celular e irradiadas con una frecuencia entre 350 y 500 nm.

La capa de sílice de las nanopartículas Ag-sílice (preferentemente utilizadas en la presente invención) disminuye la segregación intrínseca de iones Ag ⁺ y por ende sus efectos, como la coordinación con grupos SH proteicos, disminuyendo también su toxicidad intrínseca. Sin embargo, el hecho de que el recubrimiento de sílice sea muy fino (1-2 nm) posibilita que el campo electromagnético sobre la superficie aislante sea intenso. Además, la capa o recubrimiento de sílice no es compacta, es decir, presenta poros, los cuales permiten reacciones químicas inducidas o intensificadas por la radiación luminosa. Si el medio celular es rico en sales con presencia abundante de iones Cl ^" la radiación luminosa provoca la foto-oxidación de la superficie de las nanopartículas de Ag y la segregación o inyección de iones de plata. De esta forma, mediante la irradiación con luz de la longitud de onda adecuada en zonas seleccionadas se puede controlar la toxicidad de las nanopartículas.

Tal y como se ha mencionado en el estado de la técnica, las nanopartículas de Ag son conocidas por su actividad antibiótica intrínseca. Sin embargo, en la presente invención la capa de sílice aisla y estabiliza la Ag que forma el núcleo interno de la nanopartícula atenuando o inhibiendo su efecto bactericida intrínseco. En la presente invención se testó este fenómeno mediante el estudio del crecimiento de la bacteria E. coli en la presencia de nanopartículas Ag-sílice. Las nanopartículas fueron añadidas al cultivo de bacterias, justo antes del comienzo del su crecimiento exponencial, a concentraciones entre 0,15.10 ¹⁴ y 15.10 ¹⁴ nanopartículas/L. Las curvas de crecimiento bajo estas condiciones, medidas en base al OD ⁶⁰⁰ , se representan en la Figura 2B. Sólo se observó un débil efecto tóxico con la mayor de las concentraciones de nanopartículas utilizadas (15.10 ¹⁴ nanopartículas/L), lo que dio lugar a una pequeña reducción del crecimiento de las bacterias. Estudios similares llevados a cabo con nanopartículas de Ag no recubiertas a concentraciones comparables con las anteriores mostraron un efecto bactericida mucho mayor (disminución del crecimiento en un 90%). Por lo tanto, se concluye que las nanopartículas utilizadas en la invención (particularmente las nanopartículas Ag-sílice) poseen un efecto inhibidor intrínseco (previo a la aplicación de radiación) del crecimiento de los cultivos bacterianos muy pequeño. Dicha atenuación de la toxicidad intrínseca de las nanopartículas es debida a su recubrimiento inerte, el cual, a su vez, debilita su efecto inductor de la muerte celular permitiendo además su activación posterior mediante la aplicación de la radiación requerida. Es decir, permite controlar temporal y espacialmente la toxicidad de la nanopartícula, ya que ésta ocurrirá solo en el momento y en el lugar en que sea aplicada la radiación luminosa de la longitud de onda adecuada. Debido a que las nanopartículas utilizadas en la presente invención se unen eficazmente a la superficie celular (ver la Figura 2A), puede concluirse que la reducción de toxicidad intrínseca de la Ag no es debida a la falta de proximidad a las células.

Las nanopartículas utilizadas en la invención han sido caracterizadas por varias técnicas físicas. La Figura IA muestra el espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag, observándose una elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango estrecho de longitudes de onda en torno a 400nm. En la Figura IB se muestran imágenes HRTEM donde se observan partículas de Ag esféricas con un diámetro de l lnm (ver la Figura IA interna), cada una de ellas cubierta con una capa amorfa de sílice de un espesor entre 1 y 2 nm (flechas negras, Figura IB). En las imágenes TEM se distinguen además los planos gemelos, evidenciados por las flechas blancas de la Figura IB, junto con los cinco vértices contenidos en cada cara, dando lugar a una morfología de decaedro. Este tipo de estructura está formada por cinco mono cristales tetraédricos orientados radialmente a través de una abscisa central, de tal forma que todos los tetraedros tiene una esquina en común y cada uno de ellos tiene dos caras en contacto con sus vecinos. Con este tipo de morfología el fenómeno "oxidative etching" es amplificado debido a distorsiones en el entramado del cristal.

El análisis los datos obtenidos por XRD (Difracción de Rayos X) indica que la Ag de las nanopartículas está formada por cristales con un diámetro de 11 nm. Además, los picos característicos de sílice no están presentes en el espectro XRD, lo que sugiere que este último material es amorfo. Las medidas realizadas en las nanopartículas Ag- sílice por EDX (Fluorescencia de Rayos X) muestran una ratio Si/O de ¹ A lo cual coincide con la presencia de sílice amorfo en la superficie de las nanopartículas.

Un requisito indispensable para observar el efecto de los fenómenos causados por la absorbancia SPR es que la estructura diana (en este caso la superficie celular) se encuentre próxima a la superficie de la nanopartícula, donde el plasmón debe originarse. Tal y como se ha demostrado en la presente invención mediante TEM, las nanopartículas utilizadas se adhieren eficazmente a la membrana de las células, acumulándose en su superficie (ver Figura 2A). Para estudiar el efecto de los altos campos electromagnéticos inducidos mediante la excitación de las nanopartículas utilizadas en la invención mediante SPR, se usaron dos láseres, llamados azul y rojo. La longitud de onda del láser azul (405nm) es muy próxima a la absorción máxima del espectro de las nanopartículas utilizadas en la invención (Figura IA). El láser rojo tiene una longitud de onda de 633 nm, y fue elegido como control negativo debido a que su absorción por las nanopartículas es muy pequeña.

Un grupo de experimentos fueron llevados a cabo en medios de cultivo líquidos, donde las bacterias fueron irradiadas con un láser introducido en una caja termostática a 37 ⁰ C. Este hecho permitió una fácil medición del OD ⁶⁰⁰ en pequeños volúmenes de cultivo, los cuales son requeridos para conseguir una irradiación significativa con láseres cuyo foco de irradiación es de 1,4 mm ² aproximadamente. Por lo tanto, para un medio de 3 mm, correspondiente al grosor de la cubeta o vial del cultivo, el volumen irradiado es 4,2 μl, lo cual corresponde aproximadamente al 9,3% del total de los 45 μl de cultivo original. La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento medidas bajo estas condiciones. En los cultivos donde se añadieron nanopartículas (concretamente nanopartículas de Ag-sílice) se utilizó una concentración de 1,5.10 ⁴ nanopartículas/L, que es la concentración que causa una toxicidad intrínseca de las nanopartículas de Ag medible (Figura 2B), lo que permite la observación del efecto sobre el crecimiento celular debido exclusivamente a la irradiación láser. Las muestras que contenían nanopartículas Ag-sílice y fueron irradiadas con un láser azul mostraron un crecimiento atenuado con un descenso en el OD ⁶⁰⁰ en la parte superior de la curva de entre el 30 y el 40%, comparado con los experimentos control donde se usaron las mismas muestras sin irradiación, o muestras sin nanopartículas irradiadas con el mismo láser (ver Figura 3A). Por otro lado, experimentos control realizados mediante la irradiación con el láser rojo, ya fuera añadiendo o sin añadir nanopartículas, no mostraron cambios significativos en el crecimiento celular (Figuras 3 C y D). Estos resultados indican claramente que las nanopartículas utilizadas en la presente invención (particularmente las nanopartículas Ag-sílice) deben estar presentes para que la irradiación afecte negativamente al crecimiento celular. Además se demuestra que el efecto observado se relaciona específicamente con la aplicación de una longitud de onda (entre 350 y 500 nm preferentemente entre 400 y 410 nm) que se corresponde con la mayor intensidad de absorbancia SPR conseguida por las nanopartículas.

Los experimentos en medios de cultivo líquidos no informan sobre la viabilidad de las células debido a que no permiten distinguir entre la reducción de la velocidad de división celular y la reducción del número de células viables. Adicionalmente, debido a que únicamente se puede incidir con el láser sobre una fracción del volumen total, y teniendo en cuenta que la población de células cambia con el tiempo debido al movimiento de las bacterias en la muestra, no se controla de manera exhaustiva la dosis de radiación efectiva. Por lo tanto, en la presente invención se utilizó también la irradiación de cultivos sólidos como sistema de estudio y validación del método, ya que en este tipo de cultivos la difusión de las bacterias es limitada y puede asumirse que la radiación aplicada sobre la muestra es constante. Se utilizaron como medio sólido placas de agar (medio LB), en las cuales las bacterias fueron sembradas y crecidas hasta la formación de colonias que, idealmente, cubrían toda la superficie de la placa. Las nanopartículas Ag-sílice fueron introducidas en el medio a una concentración de 1,5.10 ¹⁴ nanopartículas /L, tanto en el inoculo utilizado para sembrar las placas como en el medio LB-agar correspondiente a éstas, y la irradiación con los láseres azul y rojo fue mantenida durante el crecimiento celular completo y llevada a cabo sobre pequeñas áreas seleccionadas y no superpuestas. La Figura 4 muestra el efecto bactericida en medio sólido. La Figura 4 A muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con aplicación de dos tipos de radiación: láser azul (B), de 405 nm, y láser rojo (R), de 633 nm. Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B) y, en cambio, dicha zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es efectiva porque tiene una longitud de onda similar a la del máximo de absorbancia SPR de las nanopartículas. La Figura 4B muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de células en ningún caso. Es decir, en ausencia de nanopartículas el tratamiento bactericida no es efectivo. La Figura 4C muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con irradiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas, periodo necesario para el crecimiento de las colonias bacterianas en condiciones normales, observándose un área libre de células en la zona irradiada (punto B). La Figura 4D muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas, irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas, y mantenidas después sin irradiación a temperatura óptima de crecimiento durante 48 horas más. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz a 405 nm es efectivo y, además, irreversible.

Por lo tanto, se pueden extraer dos conclusiones importantes: « La presencia de nanopartículas en la superficie celular y la irradiación de la zona con la longitud de onda a la cual las nanopartículas muestran su máxima absorbancia SPR (longitud de onda entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm) es fundamental para el éxito del efecto citotóxico. • En la zona donde se aplican las condiciones explicadas en el punto anterior no se observa una reactivación del crecimiento celular aunque se deje de aplicar la radiación. En presencia de las nanopartículas la irradiación a una frecuencia correspondiente al espectro de absorbancia SPR de las nanopartículas esteriliza la zona. Una de las causas de la muerte celular provocada por las nanopartículas utilizadas en la invención debe ser un ataque directo a la superficie celular a través de perturbaciones eléctricas en la pared y/o la membrana de las células, causando su mal funcionamiento y eventualmente se muerte (Figura 5 A). De hecho, los pulsos del láser a escala de nanosegundos, e incluso menores, son capaces de perturbar temporalmente la integridad de la membrana y este efecto ha sido usado para la transformación celular con ADN exógeno.

Alternativamente, otros mecanismos indirectos están implicados en la muerte celular. Es sabido que el fenómeno de ataque fotooxidativo ("foto-oxidative etching") libera cationes Ag ⁺ de las nanopartículas Ag-sílice en presencia de aniones Cl ^" en la disolución, lo cual da lugar a una inyección de los iones Ag ⁺ justo en la membrana celular. La capa o recubrimiento de las nanopartículas no es compacta, es decir, presentan poros que permiten reacciones químicas, que pueden a su vez ser inducidas o intensificadas por la radiación luminosa. Si el medio celular es rico en sales con abundante presencia de iones Cl ^" la radiación luminosa provoca la foto-oxidación de la superficie de las nanopartículas de Ag y la segregación o inyección de iones Ag ⁺ . De esta forma, mediante la irradiación con luz de la longitud de onda adecuada en zonas seleccionadas se puede controlar la toxicidad de las nanopartículas. En el caso de células eucariotas las nanopartículas pueden ser incluso fagocitadas, por lo que la inyección de Ag ⁺ ocurriría también directamente en su interior (Figura 5 B).

Por otro lado, la muerte celular puede producirse debido a la producción de especies reactivas de oxígeno. Este efecto ocurre debido a la absorción de luz violeta-azul por cromóforos endógenos bacterianos foto-sensibles, los cuales, una vez excitados, son capaces de transferir la energía a moléculas de oxígeno cercanas, produciendo especies reactivas de oxígeno (ROS), especialmente oxígeno singlete ( ¹ O ₂ ), peróxido de hidrógeno (H ₂ O ₂ ) y radicales hidroxilo (OH). La presencia de las nanopartículas en su superficie celular posibilita la amplificación de la intensidad de luz efectiva, que a su vez incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno. Esta combinación de luz, moléculas fotosensibles y especies reactivas de oxígeno se conoce en el campo de la oncología como terapia foto-dinámica. Las consecuencias tóxicas del incremento de ROS en las células son conocidas e incluyen mutaciones del genoma, peroxidación de lípidos, inhibición de la glucólisis y de la síntesis de ADN.

Otro mecanismo sería el que sinérgicamente integra varios, o todos, los arriba mencionados. De hecho, los poros formados en la membrana debido a las perturbaciones eléctricas facilitan la entrada de iones Ag ⁺ o de especies reactivas de oxígeno al interior de las células donde ejercen su efecto tóxico. Alternativamente, los iones Ag ⁺ pueden incluso inducir directamente la generación de especies reactivas de oxígeno mediante reacciones bien conocidas.

En conclusión la presente invención evidencia dos claros fenómenos relacionados con el uso concreto de las nanopartículas de la invención para la inducción de la muerte celular: • El recubrimiento inerte de las nanopartículas (particularmente sílice) reduce la toxicidad intrínseca de su núcleo de plata, en lugares o momentos donde tal efecto tóxico intrínseco no es requerido o es perjudicial. El momento y lugar en el cual se activa la toxicidad de las nanopartículas pueden controlarse mediante la aplicación selectiva de la radiación adecuada. • La excitación de dichas nanopartículas con una radiación de una longitud de onda dentro de la banda (alrededor de 400 nm) de su absorbancia SPR (350-5 OOnm, preferentemente 400-4 lOnm), produce la activación del efecto tóxico que actúa induciendo la muerte celular a través de mecanismos bioactivos como la electroporación de la membrana, el ataque fotooxidativo o la foto inducción de radicales libres.

Así, el método evidenciado en la presente invención tiene una aplicación directa relacionada con la inducción de manera selectiva y controlada de muerte celular tanto en células procariotas como eucariotas. La reducida toxicidad intrínseca de las nanopartículas y los elevados campos eléctricos generados vía SPR ofrecen multitud de aplicaciones en medicina y biología.

El primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de nanopartículas con una elevada intensidad de absorbancia SPR, que comprenden externamente un recubrimiento inerte (preferentemente un óxido metálico semiconductor seleccionado entre: SiO ₂ , GeO ₂ , ZrO ₂ , TiO ₂ , ZnO ₂ o un metal inerte) e internamente un núcleo metálico (preferentemente Ag), como agentes citotóxicos. En una realización preferida de la invención las nanopartículas presentan una intensidad de absorbancia SPR entre 0,4 y 1,2, para un paso óptico de 10 mm, a una longitud de onda de 400 nm. El segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de las nanopartículas arriba definidas para la elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de enfermedades infecciosas.

El tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método para la inducción de citotoxicidad en una muestra que comprende poner ésta en contacto con dichas nanopartículas y la irradiación de las nanopartículas adheridas a la superficie celular con luz de una longitud de onda entre 350 y 500 nm. La muestra puede ser de cualquier tipo, tanto sólida como líquida, que comprenda células vivas. Por ejemplo la muestra puede ser material o instrumental quirúrgico o de laboratorio. Otro tipo de muestra puede ser agua, u otros líquidos, contaminados con bacterias. Los ejemplos que se exponen a continuación tienen el objetivo de ilustrar la invención sin limitar el alcance de la misma.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Caracterización física de la nanopartícula Ag-sílice.

Tal y como puede verse en la Figura 1 A en la presente invención se elucidaron las propiedades ópticas especiales de las nanopartículas empleadas. Así, la Figura 1 A muestra el espectro de absorción de una suspensión de nanopartículas de Ag con elevada intensidad de absorbancia SPR en un rango de longitudes de onda alrededor de 400nm. Además, en la Figura IB se muestran imágenes HRTEM donde se observan partículas de Ag esféricas con un diámetro de 1 1 nm (ver la Figura IA interna), cada una de ellas cubierta con una capa amorfa de sílice de un espesor entre 1 y 2 nm (flechas negras, Figura IB). Se distinguen los planos gemelos en las imágenes TEM, los cuales son evidenciados por las flechas blancas de la Figura IB, junto con los cinco vértices contenidos en cada cara, dando lugar a una morfología de decaedro. Este tipo de estructura está formada por cinco mono cristales tetraédricos radialmente orientados a través de una abscisa central de tal forma que todo el tetraedro tiene una esquina en común y cada una de ellas tiene dos caras en contacto con sus vecinas. Con este tipo de morfología el fenómeno de ataque oxidativo ("oxidative etching") es amplificado, debido a distorsiones en las interfases entre los cristales tetrahédricos que conforman las nanopartículas. Por otro lado, el análisis los datos obtenidos por XRD (Difracción de Rayos X) indica que la Ag de las nanopartículas se encuentra en forma de cristales con un diámetro de 1 lnm. Además, los picos característicos de sílice no están presentes en el espectro XRD, lo que sugiere que dicho material es amorfo. Las medidas realizadas en las nanopartículas Ag-sílice por EDX (Fluorescencia de Rayos X) muestran un ratio Si/O de Vi, lo cual coincide con la presencia de sílice amorfo en la superficie de la nanopartícula. Ejemplo 2. Adhesión de las nanopartículas a la superficie celular.

La adhesión exitosa de las nanopartículas a la superficie celular se evidenció mediante imágenes TEM (Figura 2 A) de una suspensión de células de E. coli en presencia de nanopartículas de Ag-sílice añadidas en una concentración de 0.15x10 ¹⁴ nanopartículas/L. Esta unión es imprescindible para conseguir que los altos campos electromagnéticos inducidos en el entorno de las nanopartículas debido al fenómeno SPR alcancen las células e interactúen con ellas.

Ejemplo 3. Estimación del efecto citotóxico de las nanopartículas en un medio líquido.

Se llevó a cabo un grupo de experimentos en medios de cultivo líquidos, donde las bacterias fueron crecidas e irradiadas con un láser en el interior de una caja termostática a 37 ⁰ C. Este hecho permitió una fácil medición del OD ⁶⁰⁰ en pequeños volúmenes de cultivo, los cuales son requeridos para conseguir una irradiación significativa con láseres cuya superficie de irradiación es de 1,4 mm ² aproximadamente. Por lo tanto, para un espesor de la muestra de 3 mm, correspondiente a la anchura de los viales empleados, el volumen irradiado es de 4,2μl, lo cual corresponde aproximadamente al 9% del total de los 45 μl del cultivo original. La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento medidas bajo estas condiciones. En los cultivos donde se añadieron nanopartículas (concretamente, nanopartículas de Ag-sílice) se utilizó una concentración de 1,5.10 ⁴ nanopartículas/L, que es la concentración que causa una toxicidad intrínseca de las nanopartículas de Ag medible (Figura 2B), lo que permite la observación de efectos en el crecimiento celular debidos exclusivamente a la irradiación láser. Las muestras que contenían nanopartículas Ag-sílice y fueron irradiadas con un láser azul mostraron un crecimiento atenuado, con un descenso en el OD ⁶⁰⁰ en la parte superior de la curva de entre el 30 y el 40%, comparado con los experimentos control donde se usaron las mismas muestras sin irradiación, o muestras sin nanopartículas irradiadas con el mismo láser (ver Figura 3A). Por otro lado, experimentos control realizados mediante la irradiación con el láser rojo, añadiendo o sin añadir nanopartículas, no mostraron cambios significativos en el crecimiento celular (Figuras 3 C y D). Estos resultados indican claramente que las nanopartículas utilizadas en la presente invención (particularmente las nanopartículas Ag-sílice) deben estar presentes para que la irradiación afecte negativamente al crecimiento celular. Además se demuestra que el efecto observado se relaciona específicamente con la aplicación de una longitud de onda correspondiente a la banda de absorbancia SPR de las nanopartículas, que se encuentra en torno a -400 nm (entre 350 y 500 nm, preferentemente entre 400 y 410 nm).

Sin embargo, los experimentos en medios de cultivo líquidos no informan sobre la viabilidad de las células debido a que no permiten distinguir entre la reducción de la velocidad de división celular y la reducción del número de células viables.

Adicionalmente, debido a que únicamente se puede incidir con el láser sobre una fracción del volumen total, donde además la población de células cambia con el tiempo debido al movimiento de la bacteria en la muestra, en medios líquidos no puede llevarse a cabo un control exhaustivo de la radiación efectiva. Por ello se llevaron a cabo también experimentos en medios de cultivo sólidos (ver ejemplo 4).

Ejemplo 4. Estimación del efecto citotóxico de las nanopartículas en medio sólido.

En la presente invención se utilizó la radiación de cultivos sólidos como sistema de estudio y validación del método ya que en este tipo de cultivos la difusión de las bacterias es limitada y puede asumirse que la radiación aplicada sobre la muestra es constante. Se utilizaron como medio sólido placas demedio LB en agar, en las cuales las bacterias fueron sembradas y crecidas hasta la formación de colonias que, idealmente, cubrían toda la superficie de la placa. Las nanopartículas Ag-sílice se encontraban presentes a una concentración de 1,5.10 ¹⁴ nanopartículas/L, tanto en el inoculo utilizado para sembrar las placas como en el propio medio de cultivo de las placas. La irradiación con los láseres azul y rojo fue mantenida durante todo el crecimiento celular y llevada a cabo sobre pequeñas áreas seleccionadas no superpuestas. La Figura 4 muestra el efecto bactericida en medio sólido. La Figura 4 A muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B) y, en cambio, dicha zona libre de células no aparece cuando la placa es irradiada con el láser rojo de 633 nm (punto R). Es decir, la luz azul es más efectiva porque tiene una longitud de onda similar a la cual las nanopartículas presentan su máxima absorbancia SPR. La Figura 4B muestra un cultivo de bacterias E.coli sembradas sobre placas Petri de agar en ausencia de nanopartículas y con dos tipos de irradiación: láser azul (B) de 405 nm y láser rojo (R) de 633 nm. No se observa ningún área libre de células. Es decir, en ausencia de nanopartículas el tratamiento no es efectivo. La Figura 4C muestra un cultivo de bacterias E. coli sembradas sobre placas Petri de agar en presencia de nanopartículas y con irradiación de luz azul (B) de 405 nm durante 16 horas (periodo de crecimiento de las colonias celulares). Se observa un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). La Figura 4D muestra un cultivo de bacterias E. coli similar al anterior, donde las bacterias sembradas sobre placas Petri en presencia de nanopartículas, una vez irradiadas con luz azul de 405 nm durante 16 horas, son después mantenidas en crecimiento durante 48 horas adicionales, pero sin irradiación. Después de 48 horas sin irradiación sigue observándose un área libre de células en la zona irradiada con el láser azul de 405nm (punto B). Es decir, el tratamiento con las nanopartículas de la invención y luz a 405nm es efectivo y, además, irreversible.

REFERENCIAS

1. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A VoLlOO (23), 13549-13554 (2003).

2. Cáncer Letter 209, 171-176 (2004).

3. Nano Letters VoI. 7 (12), 3759-3765 (2007).