UTILISATION DE DERIVES DE TREHALOSE POUR STIMULER LES DEFENSES

NATURELLES DE PLANTES

La présente invention concerne le domaine agricole et, plus particulièrement, l’utilisation de dérivés de tréhalose ou un procédé mettant en œuvre ces dérivés, pour stimuler les défenses naturelles des plantes.

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE 1TNVENTION

De nos jours, l’augmentation du rendement dans la culture des plantes est devenue primordiale pour satisfaire les besoins de notre société. De manière générale, ce rendement dépend de la bonne santé et de l’intégrité de la plante, permettant ainsi de lui assurer un bon développement et une bonne croissance. Pendant leur croissance, les plantes sont soumises aux agressions d’agents pathogènes, tels que les champignons. Pour lutter contre ces agressions, l’utilisation massive des produits phytosanitaires ou pesticides est conventionnellement utilisée malgré les impacts importants qu’ils présentent sur l’environnement et la santé. Ainsi, dans le cadre du développement d’une agriculture durable et plus respectueuse de l’environnement, l’utilisation des pesticides, tels que les fongicides, doit être diminuée. Toutefois, toute diminution de l’utilisation de pesticides doit s’accompagner de la mise en place de nouvelles stratégies de lutte contre les agents pathogènes, de façon à maintenir une production de qualité en quantité suffisante pour répondre aux besoins alimentaires croissants.

L’une des stratégies développées consiste à stimuler les défenses des plantes pour qu’elles se défendent par elles-mêmes plus efficacement, permettant ainsi une réduction des quantités de pesticides appliquées sur les cultures. Dans ce contexte, diverses molécules ont été développées pour leur effet stimulateur des défenses des plantes (SDP). Toutefois très peu de produits ou principes actifs sont aujourd’hui homologués et commercialisés en tant que « SDP ». En ce qui concerne plus particulièrement le blé (première culture céréalière Française), seuls le Iodus 2 ^® Céréales et la Vacciplant ^® , comprenant la laminarine en tant que principe actif, sont homologués en tant que SDP contre la septoriose et l’oïdium. Cependant, l’efficacité au champ de ces SDP, en particulier le Iodus 2 ^® Céréales, reste assez faible et G efficacité obtenue en conditions de culture contrôlée au laboratoire est rarement retrouvée en plein champ. Le développement de nouveaux produits SPD plus efficaces contre la septoriose et l’oïdium, maladies majeures des cultures de blé, est donc nécessaire.

Dans ce contexte, Renard-Merlier et al. (Phytochemistry, 2007, 68, 1156-1164) et Randoux et al. (Phytopathology, 2010, 100, 1352-1363) ont testé le potentiel effet SDP du tréhalose, à l’état expérimental en conditions contrôlées, pour améliorer la lutte contre le champignon responsable de l’oïdium, Blumeria graminis f sp. tritici. Un pourcentage de protection efficace d’environ 38 % du tréhalose a été obtenu grâce à l’induction des mécanismes de défense du blé vis-à-vis de l’oïdium (Tayeh et al., Phytopathology, 2014, 104, 293-305). Toutefois, cette protection est très variable selon le mode d’application du tréhalose et une infiltration de tréhalose dans les feuilles de blé s’est montrée être plus efficace qu’une pulvérisation foliaire. En outre, la dose utilisée de 15 g/L pour obtenir ce pourcentage de protection le plus efficace est trop élevée pour envisager une application en champs.

Ainsi, il existe aujourd’hui un réel besoin de développer de nouvelles molécules efficaces pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, en particulier contre un agent pathogène, tels que les champignons responsables de l’oïdium et de la septoriose chez le blé.

RESUME DE L’INVENTION

Devant cette problématique, les inventeurs ont synthétisé des dérivés de tréhalose difonctionnalisés en 6,6’. En outre, ils ont démontré, de manière surprenante, que ces dérivés particuliers de tréhalose permettaient de protéger plus efficacement une plante, en particulier le blé, contre des agents pathogènes en stimulant ses défenses naturelles.

La présente invention concerne donc sur une utilisation d’un composé de formule (I) :

dans laquelle Ri représente un groupe choisi parmi :

un groupe -OR ₃ , avec R ₃ étant un groupe choisi parmi :

• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un phényle ou un groupe carboxyle, ou

• un groupe acétyle ou tosyle,

un azoture ou un groupe -NR4R5, avec R ₄ et R5 étant indépendamment un hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C ₆ ,

un halogène,

r un hydrogène, ou

un groupe -O-CO-Rr, ou -NH-CO-Re, avec R ₆ étant un phényle optionnellement substitué par un hydroxyle ou un groupe alkyle en Ci- C ₆ ;

ou un de ses sels pour stimuler les défenses naturelles d’une plante.

Selon un mode préféré de l’invention, Ri représente un groupe choisi parmi :

un groupe -OR ₃ , avec R ₃ étant un groupe choisi parmi :

• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou

un azoture ou un groupe -NH-CO-Re, avec R ₆ étant un groupe alkyle en

Ci-C ₆ .

Selon un mode plus préféré, le composé de formule (I) ou un de ses sels utilisé dans la présente invention est choisi parmi :

- 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; - 6,6’-di-0-octyl-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;

- 6,6’-di-0-carboxymethyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-toluene-p-sulfonyl-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6 ^, -di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-diiodo-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;

- 6,6’-dichloro-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-dibromo-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-difluoro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;

- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; et

- 6,6 ^, -di-(2-hydroxybenzoylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhal ose.

Un autre objet de l’invention concerne un procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que défini ci-dessus, sur ladite plante.

Selon un mode particulier, la composition est une composition aqueuse ou hydro- alcoolique. Selon un autre mode particulier, la composition est appliquée par pulvérisation foliaire, par enrobage des graines, ou par arrosage et infiltration du sol. De préférence, la plante est une céréale et, plus particulièrement du blé.

Un autre objet particulier de l’invention est un procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, tel que défini ci-dessus, contre un agent pathogène fongique, de préférence Zymoseptoria tritici, et Blumeria graminis.

Selon un mode préféré de l’invention, la composition mise en œuvre dans le procédé tel que défini ci-dessus est appliquée à une dose comprise entre 1 et 60 kg par hectare de champs, de préférence entre 1 et 50, entre 1 et 20, entre 1 et 10 kg et entre 1,5 et 6 kg par hectare de champs, et de manière encore plus préférée à une dose d’environ 1,75, 3,5, ou 5,25 kg par hectare de champs.

Un autre objet de l’invention concerne aussi un composé ou un de ses sels choisi parmi :

- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-trehalose ;

- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-trehalose ;

- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose;

- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;et

- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-trehalose.

LEGENDE DES FIGURES

Figure 1 : Mesure de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/L ou sans traitement (ELO):

A : Activité peroxydase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2 après traitement.

B : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon B. graminis (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).

C : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon B. graminis (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).

Figure 2 : Activité lipoxygénase mesurée dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/L ou sans traitement (ELO) :

A : Activité lipoxygénase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2) après traitement.

B : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon B. graminis (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).

C: Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon B. graminis (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).

Figure 3 : Répartition des différents évènements de germination des spores du champignon B. graminis observés par catégorie (spores non germées, spores avec un petit tube germinatif appressorial (TGA), spores avec un long TGA, spores avec plusieurs TGA, spores avec des TGA avortés) 24 heures après traitement avec les composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L ou sans traitement (H ₂ 0).

Figure 4 : Observation des surfaces nécrosées (taches brunes) dues à la septoriose chez les plantules de blé traitées avec différents composés.

A : Représentation graphique du pourcentage de surfaces nécrosées selon différents traitements avec ICB5, ICB8, ICB11, ou ICB21 en comparaison avec le Vacciplant et le tréhalose natif

B : Photographies de feuilles de plantules de blé traitées avec ICB5, ICB8, ICB11, ou ICB21 à 1,5 g/L, et sans traitement (Contrôle).

Figure 5 : Comparaison du pourcentage de pycnides chez des plantules de blé (cultivar Alixan) traitées avec du Vacciplant (Laminarine à 37 g/L), par rapport au traitement avec du tréhalose natif, ou ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 à 1,5 g/L, et sans traitement (Contrôle).

Figure 6 : Evaluation du pourcentage de pycnides chez des plantules de blé (cultivar Pakito) traitées avec ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 à 1,5 g/L, et sans traitement (Contrôle).

Figure 7 : Photographies d’observations microscopiques des pycnides après décoloration des feuilles de blé (A : Feuille de blé inoculée avec Z. tritici ; B : Feuille de blé traitée par ICB11 à 1,5 g/F et inoculée avec Z. tritici ; C : Feuille de blé traitée par ICB21 à 1,5 g/F et inoculée avec Z. tritici ).

Figure 8 : Evaluation du pourcentage de pycnides chez des feuilles de blé (cultivar Alixan) inoculées avec Z. tritici et traitées avec ICB11, et ICB21 à 1,5 g/F, et sans traitement (Contrôle).

Figure 9 : Evaluation de l’accumulation de callose sur des feuilles de blé traitées avec ICB11, et ICB21 à 1,5 g/F et sans traitement (FLO) (48h après traitement (J2)), inoculées ou non avec Z. tritici (à 2, 9 et 11 jours après inoculation).

Figure 10 : Mesure de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/F ou sans traitement (FLO):

A : Activité peroxydase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2 après traitement. B : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).

C : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).

D : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 9 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+9Î) ou sans inoculation (J2+9ni).

E : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 11 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1 li) ou sans inoculation (J2+1 lni).

F : Activité peroxydase mesurée 48h après traitement, 13 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+13Î) ou sans inoculation (J2+l3ni).

Figure 11 : Mesure de l’activité lipoxygénase dans les feuilles de blé après traitement par les composés ICB11 et ICB21 à l,5g/L ou sans traitement (H ₂ 0):

A : Activité lipoxygénase mesurée 24 heures (Jl) et 48 heures (J2 après traitement.

B : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement (J2), 1 jour après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1Î) ou sans inoculation (J2+lni).

C : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 2 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+2Î) ou sans inoculation (J2+2ni).

D : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 9 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+9Î) ou sans inoculation (J2+9ni).

E : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 11 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+1 li) ou sans inoculation (J2+1 lni).

F : Activité lipoxygénase mesurée 48h après traitement, 13 jours après inoculation par le champignon Z. tritici (J2+13Î) ou sans inoculation (J2+l3ni).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Les composés de formule (I), et leurs sels décrits dans la présente demande permettent de stimuler les défenses naturelles d’une plante, notamment le blé, lui assurant ainsi une protection efficace contre des agents pathogènes, tels que les champignons, en réduisant la surface de nécroses, le développement des pustules et des pycnides. Plus particulièrement, les inventeurs ont démontré que les composés de l’invention présentaient toutes les caractéristiques des produits SDP en induisant notamment l’expression d’enzymes et de gènes caractéristiques des défenses des plantes, ainsi que l’accumulation d’un dépôt de callose. Composés de formule (I)

Le tréhalose est un sucre, et plus précisément, un disaccharide composé deux molécules de glucose liées par une liaison l,l-a-glycosidique. Il est d’origine naturelle et peut se trouver dans certaines plantes et champignons. Le tréhalose serait impliqué dans la capacité qu’auraient certaines plantes à résister à des périodes prolongées de dessiccation. En outre, le tréhalose présente également, à forte concentration, un effet SDP chez le blé tel qu’illustré par les travaux de Tayeh et al. (Phytopathology, 2014, 104, 293-305). Les composés de formule (I) et leurs sels tels que définis dans la présente demande et utilisés pour stimuler les défenses naturelles des plantes sont des dérivés de tréhalose fonctionnalisés sur le groupement Ri (positions 6 et 6’ du tréhalose natif).

Plus spécifiquement, les composés et leurs sels répondent à la formule générale (I) suivante :

dans laquelle Ri représente un groupe choisi parmi :

un groupe -OR ₃ , avec R3 étant un groupe choisi parmi :

• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un phényle ou un groupe carboxyle, ou

• un groupe acétyle ou tosyle, un azoture ou un groupe -NR4R5, avec R ₄ et R5 étant indépendamment un hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C ₆ ,

un halogène,

un hydrogène, ou

un groupe -O-CO-Rr, ou -NH-CO-Re, avec Rr, étant un phényle optionnellement substitué par un hydroxyle ou un groupe alkyle en Ci-

C ₆ .

Dans le cadre de la présente invention, les termes ci-dessous ont les définitions suivantes :

Le terme « alkyle » désigne un radical hydrocarboné saturé ou instauré, linéaire ou ramifié, ayant plus particulièrement de 1 à 10, de préférence 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 atomes de carbones. On peut citer, par exemple, les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, tert-butyle, pentyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle, décyle.

Le terme « halogène » correspond à un atome de fluor, de chlore, de brome, ou d’iode, et est de préférence un atome de chlore ou d’iode.

Le terme « azoture » correspond à un groupe N3.

Le terme « carboxyle » correspond à un groupe COOH.

L’expression « substitué par au moins » signifie que le radical est substitué par un ou plusieurs groupes de la liste.

Le terme « sel » désigne tous les sels du composé d’intérêt de formule (I). Ils comprennent des sels de groupes acides ou basiques présents dans le composé spécifié. Les sels d'addition acide comprennent, mais ne sont pas limités, à des sels de chlorhydrate, bromhydrate, iodhydrate, nitrate, sulfate, bisulfate, phosphate, phosphate acide, isonicotinate, acétate, lactate, salicylate, citrate, tartrate, pantothénate, bitartrate, ascorbate, succinate, maléate, gentisinate, fumarate, gluconate, glucaronate, saccharate, formate, benzoate, glutamate, méthanesulfonate, éthanesulfonate, benzènesulfonate, ptoluènesulfonate et le pamoate (c'est-à-dire, 1,1'- méthylène-bis-(2-hydroxy-3- naphtoate)). De préférence, un sel acide est le chlorhydrate ou le bromhydrate. Des sels de base adaptés comprennent, mais ne sont pas limités, à des sels d'aluminium, calcium, lithium, magnésium, potassium, sodium, zinc, et diéthano lamine. De préférence, un sel basique est le sodium.

Selon un mode particulier de l’invention, Ri représente un groupe choisi parmi :

un groupe -OR ₃ , avec R3 étant un groupe choisi parmi :

• un groupe alkyle en C1-C10, optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou

un azoture ou un groupe -NH-CO-Re, avec R ₆ étant un groupe alkyle en

Ci-C ₆ .

De préférence, Ri représente un groupe choisi parmi :

un groupe -OR ₃ , avec R ₃ étant un groupe choisi parmi :

• un groupe alkyle en C ₁ -C ₇ , optionnellement substitué par au moins un groupe carboxyle, ou

un groupe -NH-CO-Re, avec Rr, étant un groupe alkyle en Ci -CY,, de préférence un méthyle .

Un composé de formule (I) ou un de ses sels préféré, utilisé dans la présente invention, est un composé choisi parmi :

- 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-octyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxymethyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-toluene-p-sulfonyl-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-diiodo-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; - 6,6’-dichloro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;

- 6,6’-dibromo-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;

- 6,6’-difluoro-6,6’-didcoxy-a,a-tréhalosc ;

- 6,6 ^, -di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ; et

- 6,6 ^, -di-(2-hydroxybenzoylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhal ose ;

de préférence, choisi parmi :

- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-octyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ; et

- 6,6 ^, -di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

et de manière encore plus préférée, choisi parmi :

- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ; et

- 6,6 ^, -di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose. Un objet de l’invention concerne aussi un composé ou un de ses sels choisi parmi :

- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypropyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose ;

- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose ; et

- 6,6’-di-0-(2-hydroxybenzoyl)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose .

Application

L’invention concerne l’utilisation d’un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que décrits ci-dessus pour stimuler les défenses naturelles d’une plante. L’invention concerne également un procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que décrits ci-dessus, sur ladite plante. Dans le cas d’une plante ayant eu un premier contact avec un agent pathogène, la stimulation des défenses naturelles se traduit par un ensemble de modifications biologiques qui confèrent à cette plante une présensibilisation (« résistance systémique acquise »). L’agent pathogène provoque en réaction chez la plante la production de molécules élicitrices (couramment appelées « éliciteurs ») qui induisent et stimulent les défenses naturelles. La plante devient ainsi capable de réagir plus efficacement face à une nouvelle attaque. La stimulation des défenses naturelles des plantes peut également être induite de manière externe, c’est-à-dire sans que la plante ait été en contact avec un agent pathogène mais sur laquelle un éliciteur a été appliqué. Ainsi, dans le cadre de la présente invention, les composés de formules (I) sont des produits présentant des propriétés élicitrices, stimulant ainsi les défenses naturelles des plantes.

Par « agent pathogène », on entend ici tout organisme capable de causer une maladie chez les plantes. Par exemple, un agent pathogène peut être une bactérie, un parasite, un virus, ou un champignon. Dans le cadre de la présente invention, un agent pathogène est de préférence un champignon.

Par « stimuler les défenses naturelles d’une plante », on entend ici l’induction ou l’augmentation d’au moins une des modifications biologiques suivantes : une production de molécule(s) antibiotique(s) et/ou antifongique(s), un renforcement de la paroi cellulaire illustré par un dépôt de callose, une expression accrue d’un ou plusieurs gènes de défense tels que Pall, LOX1, PR1, POX2, CHI4, NPR1, et OXO, et une augmentation des activités enzymatiques, telles que la peroxydase et la lipoxygénase. Cette stimulation des défenses naturelles permet ainsi de protéger efficacement la plante de toute maladie telle que la septoriose en réduisant la surface de nécroses et/ou le développement des pycnides, et l’oïdium en réduisant le développement des pustules.

L’invention concerne aussi un procédé ou une méthode pour renforcer la paroi cellulaire et/ou exprimer un ou plusieurs gènes de défense d’une plante et/ou augmenter l’activité enzymatique, en particulier la peroxydase et/ou la lipoxygénase, chez une plante, comprenant l’application d’une composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels tels que décrits ci-dessus, sur ladite plante. Selon un mode particulier de l’invention, la plante est une céréale, par exemple l’orge, l’avoine, le millet, le maïs, le riz, le seigle, le blé, etc. De préférence la plante est du blé. Dans le contexte de l’invention, le blé comprend toutes les variétés de blé connues de l’homme du métier et notamment les cultivars de blé Alixan et Pakito.

Au cours de sa croissance et de son développement, le blé peut développer un nombre considérable de maladies. On peut citer par exemple l’oïdium, la fusariose, la septoriose, le piétin-verse, et la rouille brune, couronnée, jaune, et noire. Les maladies les plus communes sont notamment l’oïdium et la septoriose.

Les symptômes de l’oïdium peuvent être observés sur les feuilles, les tiges et les épis, mais ce sont les feuilles qui sont les plus souvent attaquées. Généralement, des pustules blanches se développent, et produisent une masse de spores ayant une apparence poudreuse. Au fur et à mesure de leur croissance, les pustules d’oïdium foncent et prennent une couleur grise ou brune. À terme, des organes contenant des spores noires (les cleistothèces) sont retrouvés incorporés dans les pustules de l’oïdium. Des champignons responsables de l’apparition de l’oïdium chez le blé sont notamment des champignons appartenant à la famille des Erysiphaccac, tels que Blumeria graminis forma specialis tritici (Blumeria graminis f. sp. tritici).

Les symptômes de la septoriose peuvent être observés dès les premières phases de croissance. Dans les jeunes parcelles de blé à semis automnal, des plaques aqueuses, qui prennent rapidement une apparence brune et nécro tique, sont déjà observables début décembre, ainsi que tout au long de l’hiver sur les étages foliaires inférieurs. Celles-ci contiennent des pycnides noires apparentes qui caractérisent la présence du champignon Mycosphaerella graminicola (anamorphe Zymoseptoria tritici), responsable de la septoriose du blé.

Ainsi, un objet préféré de l’invention est un procédé ou une méthode tel que décrit ci- dessus pour stimuler les défenses naturelles d’une plante contre un agent pathogène fongique, de préférence Zymoseptoria tritici, et Blumeria graminis. La composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels et mise en œuvre dans la méthode ou le procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante peut être formulée sous une forme connue de l’homme du métier pour être appliquée sur une plante.

De préférence, la composition se présente sous forme de poudre ou de solution, et est avantageusement une solution. Selon un mode préféré de l’invention, la composition est une solution aqueuse ou hydro-alcoolique. Lorsque la composition est une solution aqueuse, le composé de formule (I) ou un de ses sels est dissous dans de l’eau à une concentration donnée. Lorsque la composition est une solution hydro-alcoolique, le composé de formule (I) ou un de ses sels est dissous dans un mélange comprenant de l’eau et un solvant alcoolique, telle que le méthanol, l’éthanol, le propylène glycol, le propanol, le butanol, etc.

La concentration ou la dose en composé de formule (I) ou un de ses sels dans la composition mise en œuvre dans la méthode ou le procédé de l’invention dépendent bien entendu de l’espèce de plante à traiter et de son stade de développement. De préférence, la composition est appliquée à une dose comprise entre 1 et 60 kg par hectare de champs, de préférence entre 1 et 50, entre 1 et 20, entre 1 et 10 kg et entre 1,5 et 6 kg par hectare de champs, et de manière encore plus préférée à une dose d’environ 1,75, 3,5, ou 5,25 kg par hectare de champs.

Les doses décrites ci-dessus et appliquées pour un traitement en champs, peuvent être extrapolées des tests réalisés en laboratoire. En effet, les inventeurs ont démontré dans les exemples ci-après qu’une concentration minimale de 0,5 g/L d’un composé de l’invention était suffisante pour assurer un pourcentage de protection satisfaisant chez le blé. En conditions de laboratoire, il est généralement appliqué un volume de 15 mL d’une solution comprenant un composé de l’invention sur une surface d’application au sol de 0,0429 m ² . Dans le cas où le composé à une concentration de 0,5 g/L, il est donc appliqué 7,5 mg (0,5 g x 15 mL) sur 0 ,0429 m ² , ce qui correspond à 1,748 kg pour 100 m ² , c’est-à-dire environ 1,75 kg par hectare de champs. De manière similaire, une concentration de 1 g/L d’un composé de l’invention correspond à une dose d’environ 3,5 kg par hectare de champs. Une concentration de 1,5 g/L d’un composé de l’invention correspond à une dose d’environ 5,25 kg par hectare de champs et une concentration de 15 g/L d’un composé de l’invention correspond à une dose d’environ 52,5 kg par hectare de champs. Bien entendu, l’homme du métier tiendra compte des normes applicables pour une application en champs et veillera à ne pas utiliser des doses supérieures aux normes établies par hectare de champs.

La composition comprenant un composé de formule (I) ou un de ses sels et mise en œuvre dans la méthode ou le procédé pour stimuler les défenses naturelles d’une plante peut être appliquée par tout moyen connus de l’homme du métier. Par exemple, la composition peut être appliquée directement sur la plante par pulvérisation foliaire ou sur la semence de la plante par enrobage des graines. Une pulvérisation foliaire consiste à vaporiser une solution sous forme de gouttelettes sur les feuilles de plante. L’enrobage des graines consiste à recouvrir la graine d’un film comprenant la composition. La composition peut aussi être appliquée directement sur le sol sur lequel pousse la plante, par arrosage et infiltration. Dans un mode de réalisation particulier, la composition est appliquée par pulvérisation foliaire, par enrobage des graines, ou par arrosage et infiltration du sol.

D’autres aspects et avantages de l’invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

EXEMPLES

Exemple 1 : Synthèse des composés ICB

Les composés synthétisés selon les méthodes décrites ci-dessous ont été analysés par RMN et/ou spectrométrie de masse.

Les spectres de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont été enregistrés sur un spectromètre Brucker Avance II 400 opérant à 400 MHz pour le proton et à 100 MHz pour le carbone.

Les spectres de masse haute résolution ont été enregistrés sur un Spectromètre Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC-MS en mode introduction directe équipé d’une source électrospray en mode positif ou négatif avec une valeur variable suivant les molécules.

Les spectres de masse ont été enregistrés sur un Spectromètre Maldi-TOF/TOF Brucker Daltonics Ultraflex II en mode réflectron positif avec pour matrice le 2.5 DHB.

- 6,6’-di-0-trityl-a,q-tréhalose (ICB1)

20 g de tréhalose anhydre et 45,56 g de chlorure de trityle ont été dissous dans 400 mL de pyridine. Le mélange réactionnel a été agité pendant 1 nuit à température ambiante. Le solvant a été évaporé. Le tréhalose n’ayant pas réagi, a été éliminé par un lavage à l’eau. Le solide obtenu a été agité avec du toluène pendant une nuit et filtré sous vide. Cette opération a été répétée une fois puis le produit a été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 95% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 7,42-7,22 (m, H arom. du trityle, 30H), 5,12 (d, J=3,6Hz, 2H), 4,89 (d, J=4,9Hz, 2H), 4,83 (d, J=5,3Hz, 2H), 4,77 (d, J=6,4Hz, 2H), 4,03-4,01 (m, 2H), 3,61-3,59 (m, 2H), 3,37-3,35 (m, 2H), 3,19 (app d, J=8,2Hz, 2H), 3,16-3,14 (m, 2H).

¹³ C-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 144,5 ; 128,8 ; 128,3 ; 127,3 (C sur cycle de trityle), 93,6 (Cl) ; 73,8 ; 72,1 ; 71,6 ; 71,0 (C2-C5) ; 7,0 (C6).

- 6,6’-di-0-éthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB5)

a) synthèse du l^^l’^’^’-hexa-O-acétyl-ô^’-di-O-trityl-o^a-tréha lose

20 g de 6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 200 mL de pyridine anhydre et 200 mL d’anhydride acétique. Le mélange réactionnel a été laissé sous agitation pendant une nuit à température ambiante. Celui-ci a ensuite été versé dans de l’eau froide et placé au froid pendant une nuit. Le solide a été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 91% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, CDCL) d (ppm): 7,43-7,25 (m, H arom. du trityle, 30H), 5,48 (t, J=9,8Hz, 2H), 5,46 (d, J=3,6Hz, 2H), 5,22-5,17 (t, dd, J=l0,8Hz, J=4,4Hz, 4H), 4,16- 4,12 (m, 2H), 3,13 (d, J=3,0Hz, 4H), 2,01 (s, 6H, Ac), 1,92 (s, 6H, Ac), 1,77 (s, 6H, Ac). ¹³ C-RMN (400 MHz, CDCb) d (ppm) : 170,2 ; 169,7 ; 169,2 (C=0 Ac) ; 143,4 ; 128,6 ; 127,9 (C sur cycle de trityle) ; 92,7 (Cl) ; 70,6 ; 69,8 ; 69,7 ; 68,9 (C2-C5) ; 61,8 (C6) ; 20,7 ; 20,6 ; 20,4 (CH ₃ Ac). b) synthèse 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-a,a-tréhalose

1 g de 2,3,4,2 ^, ,3 ^, ,4 ^, -hexa-0-acétyl-6,6’-di-0-trityl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL d’acide acétique à 80% aqueux. Le mélange a été laissé sous agitation à 75°C pendant 20h puis refroidi à température ambiante. Le trityl déprotégé a été précipité par ajout d’eau distillée. La phase aqueuse a ensuite été extraite avec de l’éther diéthylique puis évaporée et séchée sous vide. Une poudre crème avec un rendement de 85% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 5,51 (dd, J=9,4Hz, J=l0,3Hz, 2H), 5,28 (d, J=3,9Hz, 2H), 4,99 (dd, J=9,4Hz, J=lO,4Hz, 2H), 4,96 (dd, J=l0,3Hz, J=4,0Hz, 2H), 3,94-3,92 (m, 2H), 3,63-3,61 (m, 4H), 2,07 (s, 6H, Ac), 2,06 (s, 6H, Ac), 2,02 (s, 6H, Ac).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 162,8 ; 162,4 ; 162,1 (C=0 Ac); 93,1 (Cl); 72,4 ; 72,0 ; 70,9 (C2-C5) ; 60,4 (C6) ; 20,7 ; 20,2 (CH ₃ Ac).

HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci ₆ H ₂₆ NaOi ₃ ⁺ [M+ Na] ⁺ 449,1266, expérimental 449,1262.

c) Synthèse du 6,6’-diéthyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose

1 g de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6’-diéthyl-a,a-tré halose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 96% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,16 (d, J=3,6Hz, 2H), 3,84 (t, J=4,5Hz, 2H), 3,81 (t, J=4,6Hz, 2 H), 3,76 (d, J=6,3Hz, 2H), 3,63-3,62 (m, 2H), 3,44-3,42 (m, 4H), 2,70 (q, J=6,9Hz, 4H, CH ₂ ), 1,17 (t, J=6,8Hz, 6H, CH ₃ ).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,2 ; 71,1 ; 69,7 (C2-C5) ; 60,6 (C6) ; 30,4 (CH ₂ 0) ; 25,4 (CH ₃ ). MALDI-TOF (m/z) : calculé pour CAFLoNaOi i [M+Na] ⁺ 42l,l686 expérimental 421,1636.

- 6,6’-di-0-butyl-6,6’-dideoxy- tréhalose (ICB6)

lg de 2,3,4,2 ^, ,3 ^, ,4 ^, -hexa-0-acétyl-6,6’-dibutyl-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 73% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,14 (d, J=4,9Hz, 2H), 3,86 (t, J=3,7Hz, 2H), 3,81 (t, J=6,2Hz, 2H), 3,73 (d, J=3,9Hz, 2H), 3,66-3,62 (m, 2H), 3,43-3,40 (m, 4H), 3,13 (m, 4H, CH ₂ ), 1,33 (qi, J=7,4Hz, 8H, CH ₂ ), 0,91 (t, J=7,4Hz, 6H, CH ₃ ).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,2 ; 71,1 ; 69,7 (C2-C5) ; 60,6 (C6) ; 36,5 (CH ₂ 0) ; 28,7 ; 26,4 (CH ₂ ) ; 25,5 (CH ₃ ).

MALDI-TOF (m/z) : calculé pour C ₂ oH ₃ sNaOn ⁺ [M-Na] ⁺ 477,2 expérimental 477,1.

- 6,6’-di-0-hexyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB7)

lg de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6’-dihexyl-a,a-tréh alose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 59% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 5,11 (d, J=5Hz, 2H), 3,83-3,30 (m, 14H), 1,48-1,40 (m, 4H, OCH ₂ CH ₂ ), 1,28-1,15 (m, 8H, CH ₂ ), 0,90 (t, J=6,7Hz, 6H, CH ₃ ).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,3 ; 71,2 ; 69,8 (C2-C5) ; 60,7 (C6) ; 40,2 (CH ₂ 0) ; 37,1 ; 34,8 ; 31,1 ; 29,2 ; 28,4 ; 25,4 (CH ₂ ) ; 25,5 (CH ₃ ).

MALDI-TOF (m/z): calculé pour C ₂₄ H ₄₆ NaOn ⁺ [M-Na] ⁺ 5l0,3 expérimental 533,1. - 6,6’-di-Q-octyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB8)

lg de 2,3,4,2’,3’,4’-hcxa-0-acétyl-6,6’-dioctyl-a,a-tréh alosc ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé sous vide et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 74% a été obtenue.

‘H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,00 (dd, J=2,8Hz, J=3,6Hz, 2H), 3,85-3,35 (m, 14H, H2, H3, H4, H5, H6, OCH ₂ ), 1,49-1,44 (m, 4H, OCH ₂ CH ₂ ), 1,32-1,14 (m, 10H, CH ₂ ), 0,80 (t, J=6,8Hz, 6H, CH ₃ ).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 93,3 (Cl) ; 72,6 ; 72,3 ; 71,2 ; 69,8 (C2-C5) ; 60,7 (C6) ; 40,2 (CH ₂ 0) ; 37,1 ; 34,8 ; 31,1 ; 29,2 ; 28,4 ; 27,1 ; 25,4 (CH ₂ ) ; 25,5 (CH ₃ ).

MALDI-TOF (m/z) : calculé pour CUFUNaOi i [M+Na] ⁺ 589,3564 expérimental 589,3433. - 6,6’-di-Q-carboxyméthyl-a-a-tréhalose (ICB9 et ICB10)

5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30 mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-2-chloroacétique ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec 15 mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 66% a été obtenue.

‘H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 5,11 (s, 2H), 3,97 (s, 4H), 3,79-3,70 (m, 8H), 3,57 (d, J=7,2Hz, 2H), 3,37 (t, J=8,8Hz, 2H).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): d 174,9 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,5 ; 72,1 ; 71,0 ; 69,6 (C2- C5) ; 60,5 (C6) ; 43,8 (CH ₂ C=0).

MALDI-TOF (m/z): calculé pour C ir,H ₂₄ Na ₂ 0i ₃ [M] ⁺ 502,l expérimental 502,9.

La même synthèse a été réalisée en utilisant de l’acide 2-bromoacétique avec un rendement de 22,5%. - 6,6’-di-0-carboxyéthyl-a-a-tréhalose de sodium (ICBll)

5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-3-bromopropionique ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec l5mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 85% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,21 (t, J=3,5Hz, 2H), 3,90-3,76 (ps. m, 8H), 3,69- 3,63 (ps.m, 6H), 3,47 (t, J=9,2Hz, 2H), 2,80 (t, J=6,4Hz, 4H).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 174,3 (C=0) ; 93,3 (Cl) ; 72,5 ; 72,2 ; 71,1 ; 69,7 (C2-C5) ; 60,6 (C6) ; 40,0 (CH ₂ 0) ; 29,4 (CH ₂ CO).

HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour CisH ₂ xNaOi5 [M+ Na] ⁺ 509,1482, expérimental 509,1462.

- 6,6’-di-Q-carboxypropyl-a-a-tréhalose de sodium (ICB12)

5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-4-bromobutanoïque ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec l5mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 41% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,13 (d, J=3,8Hz, 2H), 3,80-3,69 (m, 8H), 3,59- 3,58 (m, 2H), 3,52 (t, J=6,7Hz, 4H), 3,35 (t, J=9,3Hz, 2H), 2,16 (t, J=7,8Hz, 4H), 1,72 (q, J=7,3Hz, 4H).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 183,1 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,2 ; 72,1 ; 71,1 ; 66,5 (C2-C5) ; 61,5 (C6) ; 48,9 (CH ₂ 0) ; 34,0 (CH ₂ CO) ; 28,4 (C-CTL-C).

MALDI-TOF (m/z): calculé pour C ₂ oH3 ₂ Na ₂ On ⁺ [M-Na] ⁺ 58l,2 expérimental 581,8.

- 6,6’-di-0-carboxybutyl-a-a-tréhalose de sodium (ICB13 et ICB14)

5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30 mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-5-chloropentanoïque ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec 15 mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 45% a été obtenue. La même synthèse a été réalisée en utilisant de l’acide 5-bromopentanoïque, avec un rendement de 12,8%.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,04-5,00 (m, 2H), 3,73-3,45 (m, 16H), 3,50-3,45 (m, 2H), 2,07 (t, J=7,4Hz, 4H), 1,64-1,54 (m, 8H).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm): 183,4 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,5 ; 72,1 ; 71,0 ; 69,6 (C2-C5) ; 60,5 (C6) ; 45,2 (CH ₂ 0) ; 36,7 (CH ₂ CO) ; 31,6 ; 23,2 (C-CTL-C).

MALDI-TOF (m/z): calculé pour C ₂₂ H _½ Na ₂ 0i ₅ [M-Na] ⁺ 609,l expérimental 609,0.

- 6,6’-di-0-carboxypentyl-a-a-tréhalose de sodium (ICB15 et ICB16)

5g de tréhalose sec ont été dissous dans 30 mL de dioxane suivi de l’addition de 4 g de soude en micro-perles. L’agitation à 40°C a été laissée pendant 2h. Puis 4,82 équivalents d’acide-6-chlorohexanoïque ont été ajoutés petit à petit, l’ensemble a été laissé sous agitation pendant 3h. Un lavage avec l5mL de méthanol a été effectué. Le solide a ensuite été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 32% a été obtenue.

La même synthèse a été réalisée en utilisant de l’acide 6-bromohexanoïqueavec un rendement de 8,0%

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,11 (d, J=3,4Hz, 2H), 3,82-3,55 (m, 12H), 3,42- 3,38 (m, 4H), 2,11 (t, J=7,3Hz, 4H), 1,81-1,77 (m, 4H), 1,51-1,46 (m, 4H), 1,39-1,33 (m, 4H).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 183,8 (C=0) ; 93,2 (Cl) ; 72,4 ; 72,2 ; 71,0 ; 69,6 (C2-C5) ; 60,5 (C6) ; 37,4 (CH ₂ 0) ; 35,1 (CH ₂ CO) ; 31,8 ; 27,3 ; 24,9 (C-CTL-C).

MALDI-TOF (m/z) : calculé pour CAFLoNaOi [M-H] ⁺ 477,4 expérimental 478,5.

- 6,6’-di-0-toluene-n-sulfonyl-a,q-tréhalose (ICB18)

lg de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6'-di-0-toluène-/?-su lfonyl-a,a-tréhalose a été dissout dans 20 mL de méthanol. Sous agitation, quelques grammes de sodium ont été ajoutés jusqu’à obtenir un pH de 9. Le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. Ensuite, de l’acide chlorhydrique à 0.1M a été ajouté jusqu’à avoir un pH de 4-5. Le mélange a été évaporé. La poudre obtenue a été mise en contact avec de l’éthanol et le milieu a été laissé reposer 24h. La poudre a été filtrée et séchée. Une poudre blanche avec un rendement de 98% a été obtenue. 'H-RMN (400 MHz, CDCb) : d 7.67 (d, J=7.64Hz, 4H, arom. H ortho de C-SO2), 7.35 (d, J=7.52Hz, 4H, arom. H ortho de C-CH3), 5.50 (s, 2H), 4.41-4.34 (m, 6H), 4.29-4.26 (m,6H), 2.37 (s, 6H, Me de Ts)

¹³ C-RMN (400 MHz, CDCI3) : d 142.61 ; 139.36 ; 129.53 ; 125.40 (C sur cycle de Ts), 95.12 (Cl) ; 75.86 ; 71.08 ; 70.12 ; 69.80 (C2-C5) ; 68.86 (C6) ; 20.58 (Me de Ts)

- 6,6’-diazido-6,6’-dideoxy-a,g-tréhalose (ICB20)

Dans un ballon de 50mL, 1,25 g de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6'-diazido-6,6’- dideoxy-a,a-tréhalose ont été dissous dans 20 mL de méthanol. Du sodium métallique a été ajouté jusqu’à un pH= 9. Le mélange a été laissé sous agitation pendant 48h. La solution a été neutralisée avec des solutions d’acide chlorhydrique à 1N et 0,1 N. Le solvant a été évaporé et le solide obtenu a été séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 97% a été obtenue.

1H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,14 (d, J=3,6Hz, 2H), 3,92-3,90 (m, 2H), 3,77 (t, J=9,4Hz, 2H), 3,61 (dd, J=9,2Hz, J=3,0Hz, 2H), 3,51 (d, J=5,7Hz, 2H), 3,48 (d, J=5,7Hz, 2H), 3,40 (t, J=9,3Hz, 2H).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 93,8 (Cl) ; 72,3 ; 71,0 ; 70,9 ; 70,5 (C2-C5) ; 51,0 (C6).

HRMS (ESI-) (m/z) : calculé pour CUFLoGN _f .Oy [M+ Cl]- 427,0986, expérimental 427,0985.

- 6,6’-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB21)

a) Synthèse du 2,3,4,2’,3 ^, ,4 ^, -hexa-0-acétyl-6,6'-di-0-toluène-p-sulfonyl-a,a- tréhalose

20 g de tréhalose sec ont été dissous dans 300 mL de pyridine. Puis, sous agitation vigoureuse, 50g de chlorure de tosyle ont été ajoutés très lentement. Après 35 min, 300 mL d’anhydride acétique ont été ajoutés et la solution a été laissée sous agitation pendant une nuit. Le milieu réactionnel a été alors placé dans un mélange d’eau et de glace puis mis au froid pendant une nuit. Après précipitation du composé, celui-ci a été filtré. Le précipité blanc a ensuite été filtré puis mis une nuit sous agitation avec du méthanol. Le précipité a ensuite été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 50 % a été obtenue. 'H-RMN (400 MHz, CDCb) d (ppm) : 7,71 (d, J=8,2Hz, 4H, arom. H ortho de C-SO2), 7,36 (d, J=8,0Hz, 4H, arom. H ortho de C-CH3), 5,33 (t, J=4,7Hz, 2H), 4,96-4,80 (m, 6H), 4,13-3,96 (m, 6H), 2,45 (s, 6H, CH ₃ du tosyle), 2,02 (s, 6H, Ac), 2,00 (s, 6H, Ac), 1,99 (s, 6H, Ac).

¹³ C-RMN (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 169,9 ; 169,5 ; 169,5 (C=0 Ac) ; 145,3 ; 132,4 ; 129,8 ; 128,0 (C sur cycle de Ts) ; 92,8 (Cl) ; 69,8 ; 69,2 ; 68,5 ; 68,1 (C2-C5) ; 67,5 (C6) ; 21,6 (CH ₃ du tosyle) ; 20,6 ; 20,5 (CH ₃ Ac).

b) Synthèse du l^^^’^’^’-hexa-O-acét l-ô^'-diazido-ô^’-dideox -a^- tréhalose

2g de 2,3,4,2’,3’,4’-hcxa-0-acétyl-6,6'-di-0-toluènc-/?-su lfonyl-a,a-tréhalosc et 308 mg d’azide de sodium ont été dissous dans 14 mL de DMF. Le mélange a été laissé sous agitation à 90°C pendant l6h. Par la suite, il a été refroidi à température ambiante et précipité dans de l’eau distillée. Après avoir filtré le mélange, une recristallisation dans 20 mL d’éther ou éthanol a été réalisée. Le précipité a ensuite été filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 88% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 5,50 (t, J=5,5Hz, 2H), 5,35 (d, J=3,8Hz, 2H), 5,11 (d, J=4,0Hz, 2H), 5,01 (t, J=5,0Hz, 2H), 4,11-4,09 (m,2H), 3,39 (dd, J=7,3Hz, 2H), 3,20 (dd, J=l2,9Hz, J=2,4Hz, 2H), 2,15 (s, 6H, Ac), 2,09 (s, 6H, Ac), 2,05 (s, 6H, Ac). ¹³ C-RMN (400 MHz, CDCI3) d (ppm): 169,9 ; 169,6 ; 169,6 (C=0, Ac) ; 93,8 (Cl) ; 69,9; 69,8 ; 69,7 ; 69,6 (C2-C5) ; 50,9 (C6) 20,6 (CH ₃ , Ac).

HRMS (ESI+) (m/z): calculé pour C ₂₄ H32N6NaOi5 ⁺ [M+ Na] ⁺ 667,1818, expérimental 667,1817.

c) Synthèse du ô^'-di-ÎN-acétylaminoj-l^l’^’-tétra-O-acétyl-ô^’ -dideoxy- a,a-tréhalose

2 g de 2,3,4,2’,3’,4’-hexa-0-acétyl-6,6'-diazido-6,6’-dide oxy-a,a-tréhalose ont été placés dans 20 mL de dioxane et 4 mL de méthanol. Sous N ₂ , 4,5g de triphénylphosphine ont été ajoutées lentement et le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant lh. Ensuite, 14 mL d’ammoniac (30%) ont été ajoutés et le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant l6h. Le solvant a été évaporé sous vide et le résidu a été trituré avec de l’eau. La suspension résultante a été acidifiée jusqu’à un pH de 4 avec de l’acide chlorhydrique à 1N et 0,1N. PI1 ₃ P et Ph3PO résultants ont été filtrés et lavés avec de l’eau (2x50 mL) et les phases aqueuses combinées ont été lavées avec du dichlorométhane (2x5 OmL). La phase aqueuse a ensuite été évaporée et séchée sous vide. Une poudre crème avec un rendement de 80% a été obtenue après recristallisation dans l’éthanol.

'H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,09 (t, J=4Hz, 2H), 3,84-3,76 (ps. m,4 H), 3,66- 3,54 (ps. m, 4H), 3,41-3,27 (ps. m, 4H), 2,00 (s, 9H, Ac).

¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 177,4 (C=0, Ac) ; 174,4 (C=0, Ac) ; 93,3 (Cl) ; 72,3 ; 71,0; 70,9 ; 70,6 (C2-C5) ; 39,8 (C6) ; 21,7 ; 21,1 (CH ₃ , Ac).

HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour C ₂₄ H36N ₂ NaOi5 ⁺ [M+ Na] ⁺ 592,2116, expérimental 425,1771 (hydrolyse des acétyles).

d) Synthèse du 6,6’-di-(N-acétylamino)-6,6’-dideoxy-a,a -tréhalose (ICB21)

Dans un ballon de 50mL, l,34g de 6,6'-di-(N-acétylamino)-2,3,2’,3’-tétra-0- acétyl-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose a été dissout dans 20mL de méthanol. Sous agitation, quelques milligrammes de sodium ont été ajoutés jusqu’à un pH 9. Le mélange a été laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. La solution a été acidifiée avec des solutions HCl à 1N et 0,lN, filtrée et évaporée. Le produit a été recristallisé dans de l’éthanol, filtré et séché sous vide. Une poudre blanche avec un rendement de 87% a été obtenue.

1H-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 5,22 (d, J=4Hz, 2H), 3,95-3,89 (ps. m,4H), 3,75- 3,66 (ps.m, 4H), 3,54-3,49 (ps.m, 2H), 3,42 (ps.t, J=9,6Hz, 2H), 2,12 (s, 6H, CH ₃ ). ¹³ C-RMN (400 MHz, D ₂ 0) d (ppm) : 174,50 (C=0); 93,4 (Cl); 72,4 ; 71,1 ; 71,0 ; 70,6, (C2-C5) ; 39,8 (C6); 21,8 (CH ₃ ).

HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci ₆ H ₂₈ N ₂ NaOii ⁺ [M+ Na] ⁺ 447,1585, expérimental 447,1590.

- 6,6’-diiodo-6,6’-dideoxy-a,q-tréhalose (ICB24)

8 g de tréhalose anhydre ont été dissous dans 200 mL de DMF. Ensuite, 30.65 g de triphénylphosphine et 23.75 g de diiode ont été ajoutés. Le mélange a été chauffé à 80 °C pendant lh30 puis évaporé jusqu’à obtenir 1/3 du volume d’origine. Enfin, 300 mL de méthanol ont été additionnés. Quelques grammes de sodium solide ont été ajoutés jusqu’à pH 9. L’agitation à température ambiante a été laissée pendant 30 min puis le mélange a été neutralisé sous DOWEX 50W, 8, H+ form. La résine a été éliminée par filtration et lavée avec du méthanol. La solution a ensuite été filtrée à travers du charbon animal et concentrée pour obtenir un résidu. Le résidu a ensuite été trituré avec 250 mL d’eau. PI13P et PI13PO résultants ont été éliminés par filtration. Le solide obtenu a été mis dans 50 mL de xylène et laissé sous agitation pendant plusieurs heures puis filtré. Le solide a été lavé plusieurs fois avec du dichlorométhane et du butanol pour éliminer les traces de diode et de DMF. Une poudre jaune avec un rendement de 61% a été obtenue.

'H-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 4.99 (d, J=3.6Hz, 2H), 4.92 (t, J=3.5Hz, 4H), 3.64 (d, J=5.8Hz, 2H), 3.54-3.42 (m, 8H) 2.70 (s, 4H), 2.53 (m, 6H)

¹³ C-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 93.41 (Cl) ; 73.64 ; 72.03 ; 71.05 ; 70.99 (C2- C5) ; 60.60 (C6)

HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci ₂ H ₂ oLNa0 ₉ ⁺ [M+ Na] ⁺ 584,9089, expérimental 584,9092.

- 6,6’-dichloro-6,6’-dideoxy-a,a-tréhalose (ICB25)

2 g de tréhalose sec ont été dissous dans 10 mL de DMF et 3 mL de chlorure de thionyle. La réaction était exothermique. La solution a été laissée sous agitation pendant 2h à température ambiante et a été évaporée sous vide. 10 mL d’eau distillée ont été additionnés et une série d’extraction avec 10-15 mL de dichlorométhane a été effectuée jusqu’à obtenir une phase organique incolore. La phase aqueuse a été évaporée. Un liquide brun avec un rendement de 10% a été obtenu.

'H-RMN (400 MHz, DMSO) d (ppm) : 4.89 (dd, J=5.8Hz, 4H), 3.70 (m, 2H), 3.65 (m, 2H), 3.61 (m, 2H), 3.59-3.52 (m, 4H), 3.28 (d, J= 3.4Hz, 2H), 3.22 (s, 4H)

¹³ C-RMN (400 MHz, DMSO d (ppm) : d 93.90 (Cl) ; 73.24 ; 71.73 ; 71.30 ; 71.20 (C2- C5) ; 61.13 (C6)

HRMS (ESI+) (m/z) : calculé pour Ci ₂ H ₂ oCl ₂ Na0 ₉ ⁺ [M+ Na] ⁺ 401,0377, expérimental 401,0360. Exemple 2 : Tests contre l’oïdium (Blumeria graminis f. sp. triticï)

1. Tests in planta

1.1. Conditions de culture du blé

Des grains de blé ont été imbibés dans de l’eau pendant 24 heures puis ont été semés en quinconce dans des barquettes en plastique remplies de terreau, à raison de 24 plantules par barquette. La culture a été faite en armoire de croissance, avec 12 heures de jour à 18 °C et 12 heures de nuit à 12 °C. L’humidité relative était de 70%. Lorsqu’elles étaient âgées de 10 jours, les plantules ont été pulvérisées avec 10 mL d’un composé ICB de l’invention à 15 g/L ou 1,5 g/L. Après 48 heures, les plantules ont été inoculées avec une suspension de B. graminis à 250 000 spores/mL de Fluorinert FC43 (heptacosafluorotributylamine, 3M, Cergy-Pontoise, France). La lecture des symptômes (pustules blanchâtres) a été réalisée 12 jours après l’inoculation.

1.2. Résultats de protection du blé

Le taux d’infection a été évalué sur les premières feuilles formées depuis la base des plantes (collet).

Le pourcentage d’infection obtenu après traitement des plants de blé par les différents composés ICB est défini par rapport au témoin (plants de blé pulvérisé avec de l’eau distillée et inoculés) et est calculé selon la formule suivante :

% infection = (nombre de pustules blanchâtres sur la première feuille des plants traités avec le composé ICB X 100) / nombre de pustules blanchâtres sur la première feuille du plant témoin

Le pourcentage de protection est calculé selon la formule suivante :

% de protection = 100 - % d’infection Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 :

Les meilleurs taux de protection contre l’oïdium du blé ont été obtenus avec les composés ICB8, ICB11, et ICB2l.

1.3. Validation de l’effet inducteur de défenses : dosages d’activités enzymatiques Les dosages de l’activité peroxydase et lipoxygénase ont été réalisés sur la première feuille formée à partir de la base des plants de blé âgés de 10 jours :

au moment du traitement par les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L (sans inoculation),

- à 24 heures (Jl) et 48 heures (J2) après traitement, et

- à 1 jour (J2+li ou J2+lni) et 2 jours (J2+2i ou J2+2ni) après inoculation (i) par le champignon B. graminis ou sans inoculation (ni).

Pour les feuilles de blés infectées, l’inoculation par le champignon B. graminis a été effectuée à J2. Les résultats concernant le dosage de l’activité peroxydase sont illustrés par la figure 1. Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité peroxydase, visible dès 24 h à 48 h après traitement, dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 1 A). Après infection (inoculation) par le champignon B. graminis, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation significative de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non- traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non-inoculées (Figures 1B et 1C).

Les résultats concernant le dosage de l’activité lipoxygénase sont illustrés par la figure 2.

Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité lipoxygénase 24 h et 48 h après traitement, dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 2A).

Après infection (inoculation) par le champignon B. graminis, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation de l’activité lipoxygénase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non-traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non-inoculées (Figures 2B et 2C).

2. Effet direct sur la sermination des spores de B. sraminis

L’effet direct des composés ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 sur le pouvoir germinatif des spores de B. graminis a été évalué en saupoudrant un inoculum frais (âgé de 10 jours) au-dessus de boites de Péri contenant un milieu solide constitué d’agar à 12% dans de l’eau distillée stérile et un des produits ICB5, ICB8, ICB11, ou ICB21 à une concentration de 1,5 g/L. Les boites de Pétri ont été mises à incuber à la lumière pendant 24 heures et la germination des spores de B. graminis a été observée au microscope photonique.

Les résultats sont illustrés par la figure 3.

Aucun effet sur le nombre et l’aspect des tubes germinatifs des spores de B. graminis n’a été observé, quel que soit le composé ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 testé. Ceci démontre que la protection observée est due à un effet SDP (stimulateur de défense des plantes) plutôt qu’à un effet antifongique ou fongistatique. Exemple 3 : Tests contre la septoriose ( Zymoseptoria triticï)

1. Tests in planta

1.1. Conditions de culture du blé

Des grains de blé ont été imbibés dans de l’eau pendant 24 heures puis ont été semés en quinconce dans des barquettes en plastique remplies de terreau, à raison de 24 plantules par barquette. La culture a été faite en armoire de croissance, avec 16 heures de jour à 20 °C et 8 heures de nuit à 16 °C. L’humidité relative était de 70%. Lorsqu’elles étaient âgées de 22 jours, les plantules ont été pulvérisées avec 15 mL d’un composé ICB de l’invention à 15 g/L ou 1,5 g/L. Après 48 heures (J2), les plantules ont été inoculées avec une suspension de spores de Z. tritici à 1.10 ⁶ spores/mL d’eau distillée contenant 0,025% de Citowett (B.A.S.F., Levallois-Perret, France). La lecture des symptômes a été réalisée environ 3 semaines après l’inoculation.

1.2. Résultats de protection du blé

1.2.1. Protection obtenue chez le cultivar de blé Alixan inoculé par la souche T02596

La septoriose du blé, due à Mycosphaerella graminicola (anamorphe Zymoseptoria tritici), se manifeste par l’apparition de taches brunâtres sur les feuilles de blé, qui correspondent à des nécroses des tissus et donc à la mort des cellules des feuilles de blé dans la zone infectée.

Le pourcentage de surface foliaire nécrosée est évalué visuellement sur les deuxième (F2) et troisième (F3) feuilles formées depuis la base du plant de blé.

Le pourcentage d’infection obtenu après traitement des plants de blé par les différents composés ICB est défini par rapport au témoin (plants de blé pulvérisé avec de l’eau distillée et inoculés) et est calculé selon la formule suivante : % infection = (% de surface foliaire nécrosée sur les plants traités avec le composé ICB X 100) / % de surface nécrosée chez les plants témoin

Le pourcentage de protection est calculé selon la formule suivante :

% de protection = 100 - % d’infection

Les résultats sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

Tableau 2 :

Les meilleurs taux de protection contre le champignon Zymoseptoria tritici ont été obtenus avec les composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21.

Des tests de protection ont également été réalisés en réduisant la dose des composés ICB. Les résultats sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.

Tableau 3 :

Les résultats du tableau 3 montrent que la réduction de la concentration des composés ICB à 1 et 0,5 g/L permet d’obtenir une protection équivalente à la concentration 1,5 g/L. L’effet des composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21 a été comparé à celui du Vacciplant (laminarine) commercialisé par la société Arysta, utilisé à la dose préconisée au champ : 0,5 L/ha de la solution commerciale à 37 g/L de laminarine.

Les résultats sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4 :

Les résultats montrent un % de protection d’environ 5 fois supérieur pour les composés ICB11 et ICB21, par rapport au % de protection obtenu avec Vacciplant. Une réduction significative du pourcentage de surface nécrosée due à la maladie chez les plantules de blé traitées par les composés ICB 11 et ICB21, est également observée sur les photographies de la figure 4.

L’évaluation de la maladie passe également par l’observation de l’apparition de pycnides, structures de formation des pycnidiospores, qui sont des unités de dissémination du champignon, responsables de la propagation de la maladie.

Les résultats sont présentés dans la figure 5.

Ces résultats montrent une réduction significative du nombre de pycnides formées après traitement des plantules de blé avec ICB8 (environ 40 %), et plus fortement avec ICB11 et ICB21 (environ 50%) à 1,5 g/L, par rapport au contrôle. Cette réduction est également observée par rapport au traitement avec le Vacciplant (0,5 L/ha de la solution commerciale à 37 g/L de laminarine) et le tréhalose natif (1,5 g/L).

1.2.2. Protection obtenue chez le cultivar de blé Pakito inoculé par la souche TOI 192

Le protocole utilisé chez le cultivar de blé Pakito inoculé par la souche T01193 était identique au protocole utilisé chez le cultivar de blé Alixan inoculé par la souche T02596.

Les résultats concernant le pourcentage de protection des composés ICB5, ICB8, ICB11 et ICB21 sont présentés dans le tableau 5 ci-dessous, et les résultats concernant l’observation des pycnides est présentée dans la figure 6. Tableau 5 :

Les résultats montrent un taux de protection similaire chez le cultivar de blé Pakito à celui observé chez le cultivar de blé Alixan (réduction de la surface nécrosée et du nombre de pycnides formées) avec les composés ICB11 et ICB21.

1 3. Analyse microscopique des pycnides sur des feuilles traitées chez le cultivar de blé Alixan et inoculées avec Z. tritici

Les résultats sont présentés dans les figures 7 et 8.

L’analyse microscopique montre et confirme une diminution du nombre des pycnides d’environ 50% après traitement avec les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L (Figure 8). Cette diminution du nombre des pycnides est également observée sur les photographies de la figure 7. En outre, une réduction de la taille des pycnides (surface noire) est également observée. 1.4. Effet des composés de l’invention sur l’induction de la callose

Des plants de blé de 3 semaines ont été traités avec les produits ICB21 et ICB11 et inoculés avec la souche T02596. Les plantes traitées avec de l’eau et inoculées ont été utilisées comme contrôles Les prélèvements suivants ont été effectués : J+lni, J+2ni, J2+ lni, J2+2ni, J2+39ni, J2+l lni, J2+li, J2+2i, J2+9i et J2+11Î. Les feuilles ont été fixées et décolorées pendant 2h avec une solution d’éthanol/acide acétique (3/1, v/v). Les plantes ainsi décolorées ont ensuite été rincées avec de l’éthanol à 70 %, 50 % puis 25 % pendant 2h chacun. Les plantes ont finalement été rincées dans de l’eau distillée une nuit.

Les plantules ont été incubées dans du NaOH 10 % à 37°C pendant lh pour clarifier les tissus, puis incubées avec le bleu d’aniline à 0,01 % K2HP04 150 mM, pH 10 pendant plusieurs heures.

Les dépôts de callose ont été observés au microscope confocal avec une longueur d’onde d’excitation de 405 nm et une longueur d’onde d’émission de 523 nm.

Les résultats sont présentés dans la figure 9.

Les résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L induisent l’accumulation d’un dépôt de callose sur les feuilles de blé inoculées avec Z. tritici (i) 2, 9, et 11 jours après traitement par rapport aux feuilles non inoculées (ni), empêchant ainsi la pénétration du pathogène Z. tritici.

1.5. Dosages d’activités enzymatiques

Les plantes ont été cultivées selon le protocole décrit au point 1.1.

Les dosages de l’activité peroxydase et lipoxygénase ont été réalisés sur la troisième feuille de chaque plante :

au moment du traitement par les composés ICB11 et ICB21 à 1,5 g/L (sans inoculation),

- à 24 heures (Jl) et 48 heures (J2) après traitement, et - à 1 jour (J2+1Î ou J2+lni), 2 jours (J2+2Î ou J2+2ni), 9 jours (J2+9Î ou J2+9ni), 11 jours (J2+1 li ou J2+1 lni), et 13 jours (J2+13Î ou J2+l3ni), après inoculation (i) par le champignon Z. tritici ou sans inoculation (ni).

Pour les feuilles de blés infectées, l’inoculation par le champignon Z. tritici a été effectuée à J2.

Les résultats concernant le dosage de l’activité peroxydase sont illustrés par les figures 10A, 10B, 10C, 10D, 10E, et 10F.

Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité peroxydase 48 h après traitement dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 10A).

Après infection (inoculation) par le champignon Z. tritici, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation significative de l’activité peroxydase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non-traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non- inoculées (Figures 10B-10F), et ce jusqu’à 13 jours après inoculation.

Fes résultats concernant le dosage de l’activité lipoxygénase sont illustrés par les figures 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, et 11F.

Ces résultats montrent que les composés ICB11 et ICB21 induisent une augmentation de l’activité lipoxygénase 48 h après traitement, dans les feuilles de blé traitées, hors contexte infectieux (Figure 11 A).

Après infection (inoculation) par le champignon Z. tritici, les composés ICB11 et ICB21 induisent également une augmentation de l’activité lipoxygénase dans les feuilles de blé traitées et inoculées comparé aux feuilles de blé non-traitées et inoculées et aux feuilles de blé traitées et non- inoculées (Figures 11B-11F), et ce jusqu’à 13 jours après inoculation. 1.6. Analyses de l’expression de gènes de défense des plantes après traitement avec les composés de l’invention et inoculation avec Z tritici.

Protocole :

Les plantules de blé traitées avec les produits ICB11 et ICB21 à 1,5 g/l pendant 48h ont été inoculées avec la souche T02596, afin de suivre l’expression de gènes marqueurs de défense par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). L’ARN total a été extrait à partir des feuilles à 1, 2, 3 et 12 jours après inoculation (JAI) en utilisant le kit RNeasy plant Mini kit (Qiagen). Avant l’étape de qRT-PCR, TARN a été traité avec la RNase- Free DNase I (Qiagen) pour éliminer les l’ADN génomique résiduel. La synthèse d’ADNc s’est faite à partir de lpg d’ARN total en utilisant le kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). La qRT-PCR a été effectuée dans un appareil qRT-PCR ABI PRISM 7300 afin de mesurer l’effet des produits à base de tréhalose sur l’expression des gènes suivants : POX2, PR1, PAL1, LOX1 et CHI4. L’expression relative des gènes a été calculée selon la méthode AACt (Livak et Schmittgen, Methods, 2001, 4, 402-408). Des plantes traitées avec de l’eau ont été utilisées comme contrôle négatif.

Résultats :

Les résultats du tableau 7 montrent que le prétraitement des plantes avec les produits ICB11 et ICB21 suivi d’une inoculation avec le pathogène augmente fortement l’expression des gènes de défense PAL1, POX2, PR1 et CHI4. En effet, le traitement avec les produits potentialise l’expression des gènes de défense, puisque l’induction des gènes augmente 2 fois plus par rapport à celle observée chez des plantes traitées avec de l’eau. L’induction forte du gène PR1, caractéristique de la voie de l’acide salicylique (12 JAI), semble en totale corrélation avec l’expression du gène PAL1, plus précoce (1 et 2 JAI), gène codant pour une enzyme située très en amont de la voie des phénylpropanoïdes, conduisant notamment à la synthèse d’acide salicylique. Le produit d’expression du gène PR1 est une protéine basique possédant des propriétés fongicides. De même, l’expression du gène CHI4 codant pour une chitinase capable de dégrader la paroi de champignons, augmente de 1,5 à 2 fois après traitement avec les produits ICB11 et ICB21 par rapport au traitement avec de l’eau. L’expression du gène POX2 augmente fortement après traitement et inoculation. Une forte induction de ce gène contribue à une forte activité enzymatique de la peroxydase, connue pour son rôle dans rutilisation des peroxydes, toxiques pour la plante. L’induction du gène POX2 peut ainsi indiquer la synthèse d’une peroxydase qui permettrait un renforcement de la paroi cellulaire, par l’accumulation de lignine par exemple, empêchant la pénétration des agents pathogènes. Hors contexte infectieux, le traitement seul avec les produits n’induit pas une forte expression de gènes. En effet, à 3 et 4 jours après traitement, il n’y pas de mobilisation du métabolisme de la plante vers l’expression de gènes de défense. Toutefois, la plante reste en alerte puisque l’inoculation par l’agent pathogène Z. tritici déclenche une expression importante des marqueurs de défense.

Tableau 6 : séquence des amorces utilisées pour les expériences de qPCR.

(F : Forward, R : Reverse)

Tableau 7 : expression des gènes après traitement chez plantes inoculées ou non.

2. Effet direct sur la germination des spores de Z. tritici Les composés ICB5, ICB8, ICB11, et ICB21 ont été incorporées à un milieu gélosé stérile composé d’Agar à 12% dans de l’eau distillée à des concentrations finales variées (0,15 g/L, 0,5 g/L, 1 g/L, 1,5 g/L, 7,5 g/L, et 15 g/L). Une goutte de solution de spores du champignon Z. tritici à 1.10 ⁶ spores/mL d’eau a été déposée à 5 emplacements sur le milieu gélosé. Après 8 et 12 jours d’incubation à l’obscurité, les diamètres des disques correspondant au développement du champignon ont été mesurés.

Les résultats ont montré que quelle que soit la concentration utilisée, les composés testés ne modifient pas la germination et le développement du champignon. Aucun effet fongicide ni fongistatique n’a été observé. Ceci démontre que la protection observée est due à un effet SDP (stimulateur de défense des plantes) plutôt qu’à un effet antifongique ou fongistatique.

En conclusion des exemples 2 et 3, les inventeurs ont démontré de manière surprenante que les composés de l’invention, en particulier ICB11 et ICB21 étaient des composés SDP efficaces en :

- protégeant la plante de blé en réduisant la surface de nécroses responsables de la septoriose, et en réduisant le développement des pustules responsables de l’oïdium ;

- réduisant le développement des pycnides responsables de la propagation de la septoriose ;

- induisant l’expression des activités de la peroxydase et de la lipoxygénase après traitement et inoculation, permettant ainsi à la plante de répondre plus rapidement et plus efficacement, et donc de la rendre plus résistante ou tolérante lorsqu’elle est soumise à un agent pathogène ;

- induisant l’accumulation d’un dépôt de callose sur les feuilles des plantes ;

- induisant l’expression des gènes de défense des plantes ; et en

- ne présentant pas d’effet sur la germination et le développement des champignons responsables de l’oïdium et de la septoriose, démontrant ainsi que la protection des plantes était due à un effet SDP, et non à un effet antifongique ou fongistatique.