L'invention a plus précisément pour objet l'utilisation de substances seules ou en mélange choisies parmi, la Norphenazone (3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one), les sels de la Norphenazone acceptable pour une utilisation pharmaceutique, le Coenzyme QN ou N représente un nombre entier compris entre 6 et 10.

L'invention a plus précisément pour objet le traitement prophylactique des articulations lors d'interventions chirurgicales, par exemple arthroscopie, etc et le traitement thérapeutique de l'arthrose, l'arthrite et l'ostéo-arthrite.

Les articulations mammifères ont une résistance mécanique au mouvement réduite et une élasticité aux charges compressive grâce à la présence de cartilage recouvrant les surfaces osseuses en contact. Le cartilage est un tissu non vascularisé, l'homéostasie y est essentiellement dirigée par la diffusion.

Certaines interventions médicales, certains traumatismes et certaines maladies ont pour conséquence d'endommager le cartilage des articulations. Cela couvre en particulier les arthroscopies et autres modes d'intervention chirurgicaux qui coupent ou râpent la surface du cartilage, les traumatismes ponctuels ou répétitifs de la surface du cartilage par charge mécanique, l'arthrose, une affection chronique, dégénérative et non inflammatoire des articulations, l'arthrite causée par un traumatisme, et l'ostéo-arthrite. Ces conditions sont associées à une altération destructive des cartilages et à des douleurs et craquement des articulations. Ces altérations destructives sont accompagnées de la mort des cellules du cartilage, les Chondrocytes, ainsi que de la diminution du volume et la perte d'élasticité de la matrice polymérique entourant ces Chondrocytes. Cette réduction d'élasticité s'observe en particulier lors de la perte des Glucosaminoglycans, qui sont les principaux constituants du réseau polymérique élastique du cartilage.

Il n'existe actuellement aucune composition pharmaceutique efficace reconnue pour le traitement prophylactique ou thérapeutique des tissus cartilagineux des articulations lié aux conditions décrites précédemment. (Réf. Martindale The Extra Pharmacopeia). Les traitements proposés actuellement se contentent de réduire les douleurs constatées par différents moyens afin de conserver la mobilité de l'articulation touchée, ou de remplacer certaines parties de l'articulation par des prothèses. La présente invention décrit une méthode innovante de préservation du tissu cartilagineux et de sa fonctionnalité dans les articulations mammifères lors des affections décrites précédemment.

L'utilisation de la Norphenazone, ou de ses sels acceptables pour une utilisation pharmaceutique, est connue comme agent antipyrétique (Brevet GB1072262) ou agent anti-inflammatoire (Brevet US 4579844 ; JP63132833) dans des conditions générales de tissus vascularisés. Ces conditions, ainsi que les effets observés ne peuvent s'appliquer au cartilage des articulations. L'application de la Norphenazone dans les traitements ophtalmiques est décrite (EP0633025), elle correspond à des phénomènes oxydatifs et photo oxydatifs très particuliers des constituants de l'oeil et de ses pathologies.

Le Coenzyme Q est connu comme inhibiteur de cytochrome C, il est également connu pour ses propriétés anti-oxydantes dans des milieux hydrophobes ou des tissus fortement vascularisés.

Ces conditions ne s'appliquent pas dans le cas d'un tissu cartilagineux essentiellement aqueux et non vascularisé, dont les cellules vivantes se trouvent à l'intérieur d'une matrice imperméable au produit. Ce produit est également décrit comme adjuvant ophtalmique lors d'intervention chirurgicale (Brevet EP1231909), ce qui par la nature de l'organe considéré ne peut s'appliquer au cartilage des articulations. Des méthodes de dispersion du coenzyme Q sont décrites (Brevet W09835660), mais elles ne peuvent tre appliquées car elles introduisent des acides gras néfastes aux tissus cartilagineux.

Contre toute attente, il a été observé que des préparations pharmaceutiques contenant un ou plusieurs des constituants suivants, la Norphenazone, un sel pharmaceutiquement acceptable de la Norphenazone, le Coenzyme QN (N compris entre 6 et 10) permettaient de réduire la quantité de Chondrocytes morts ainsi que la désagrégation de la matrice de polymère du cartilage articulaire lors de traumatismes ou d'affections décrites précédemment.

La quantité de la Norphenazone ou du sel phannaceutiquement acceptable dans la préparation découverte dans la présente invention est telle que la concentration de la substance active en contact avec la surface du cartilage dans l'articulation se situe entre 1*10-7 et 1*10 2 Molaire. De manière optimale cette concentration se situe entre 1 * 10-5 et 1*10-3 Molaire.

La quantité de Coenzyme QN (N compris entre 6 et 10) dans la préparation découverte dans la présente invention est telle que la concentration de la substance active en contact avec la surface du cartilage dans l'articulation se situe entre 1*10-7 et 1*10 3 Molaire. De manière optimale cette concentration se situe entre 1*10-6 et 1*10-4 Molaire. Le Coenzyme QN, utilisé dans cette invention, est préalablement dissout dans une huile, une graisse ou une substance hydrophobe pharmaceutiquement acceptable, dont les caractéristiques essentielles sont la teneur minimale en acide gras insaturés, et en particulier l'absence d'acide gras tel que l'acide arachidonique, l'acide lonolénique, l'acide linoléique. La quantité de la phase hydrophobe utilisée dans la préparation se situe entre 50 et 0,01% en poids de la préparation, et de manière optimale entre 10 et 0, 1% en poids de la préparation. Les phases aqueuse et hydrophobe sont émulsifiées en utilisant à cet effet tout émulsifiant pharmaceutiquement acceptable dans des proportions correspondant à l'état de la technique. Au besoin des quantités adéquates d'agent ionisant, de régulateur de pH, d'épaississant, ou d'agent de conservation sont incluses dans la préparation.

Un traitement adéquat est appliqué à la préparation afin de pouvoir l'injecter dans l'articulation dont le tissu cartilagineux est concerné par la présente invention. De manière alternative on ajoutera à la préparation tout agent permettant un contrôle de la dissolution après l'injection, comme par exemple par la création d'inclusions a base de cyclodextrine, ou de liposomes. De manière alternative le contrôle de la quantité de préparation en contact avec la surface du cartilage peut tre réglée par l'emploi d'un élément solide implanté à proximité du cartilage.

La préparation pharmaceutique ainsi présentée est utile comme médicament prophylactique ou thérapeutique des différentes lésions du cartilage.

Exemple 1 Un modèle In Vitro est utilisé pour démontrer l'effet de dégradation d'une blessure mécanique sur les Chondrocytes du cartilage. Ce modèle est décrit dans les références suivantes : - Matrix and cell injury due to sub-impact loading of adult bovine articular cartilage explants : effects of strain rate and peak stress ; T. Quinn ; Journal of orthopaedic research 19 (2001) - Cartilage injury by ramp compression near the gel diffusion rate ; V. Morel, EPFL (Suisse) ; Les pièces de cartilage bovin sont obtenues par biopsie cylindrique de la tte humérale de l'animal 48 heures après sa mort. Les éléments testés mesures 4mm de hauteur de la surface externe du cartilage à la face interne de l'os sub-chondrial explanté. La partie osseuse de l'élément est cylindrique de diamètre 4mm, alors que la taille du cartilage attaché est un cylindre de 2,7mm de diamètre.

Les cartilages explants sont placés individuellement dans des puits d'une contenance de lml dans un milieu de culture. Le milieu de culture est renouvelé chaque 24 heures, et les puits contenants les cartilages sont conservés dans un incubateur à 37 degrés Celsius, avec une atmosphère enrichie de 4,8% volume de CO2.

Le milieu de culture a la composition suivante : - 500 ml Dubellco's MEM culture media (Biochrom KG) - 5 ml Non essential amino acids mixture (Biochrom KG) - 50 ml Bovine foetal serum (Cambrex) - 0. 4 mM L-Proline (Sigma) - 5 ml Antibiotics, anti-fungal media (Penicillin G 10'000 U/ml ; Streptomycin sulphate 10'000 ug/ml ; Amphotericin B 25 Uug/ml) Pour l'évaluation de la préparation pharmaceutique décrite dans cette invention, une quantité 6mg de Norphenazone correspondant à une concentration de 6,1 * 10-5 Molaire de la substance dans le milieu de culture est directement dissoute dans celui-ci.

Le programme de culture des cartilages après la mort de l'animal est le suivant : - Jour 2 biopsie des cartilages avec os sub-chondrial.

- Jour 7 compression des cartilages - Jour 7 mise en milieu de culture contenant la préparation pharmaceutique.- - Jour 11 mesure de viabilité des Chondrocytes (Mesure destructive) - Jour 18 mesure de viabilité des Chondrocytes.

La compression est effectuée en utilisant un support plane de l'échantillon dont le déplacement contre un plongeur fixe cylindrique de diamètre largement supérieur à celui de l'échantillon est contrôlé par un moteur. La force exercée lors de la compression est mesurée par un capteur sur le plongeur. Le déplacement est enregistré en mme temps. Le montage utilisé contient les éléments suivants : - Displacement controller (PM500-C from Newport Instruments) - Engine PM500-1A. 100 (Newport Instruments) - Stress recorder (Model 31, Sensotec) Les conditions de contraintes choisies sont une déformation constante de 7% par seconde de l'épaisseur du cartilage jusqu'à l'obtention d'une force maximale de 14 MPa. La contrainte est ensuite immédiatement relâchée.

La mesure de viabilité des Chondrocytes est effectuée par imagerie cellulaire confocal d'une tranche verticale du cylindre de l'élément de biopsie. Les Chondrocytes morts sont différentiés des Chondrocytes vivants par coloration sélective avec deux fluorophores distincts et spécifiques pour l'objet de la mesure. Les images obtenues sont traitées à l'aide d'un programme informatique permettant de déterminer les surfaces relatives ne contenant que des Chondrocytes morts, et celles ne contenant que des Chondrocytes vivants. Ces surfaces sont exprimées en pourcentage de la surface totale du cartilage de biopsie. Les résultats sont traités statistiquement pour leur variance suivant un modèle de régression multiple ANOVA. Les différences sont ensuite testées par pair en utilisant la méthode de Tu Key (Biostatistics, A methodology for the Health sciences, L. D. Fisher). Le matériel suivant est utilisé : Fluorophores : Calcein AM/Ethidium homodimer-1 (Live/Dead Viability/Cytotoxicity kit Molecular Probe Inc.) Microscope confocal : Carl Zeiss LSM410 avec une source d'excitation Laser à Argon Les résultats obtenus sont présentés dans la table 1. Surface de Chondrocytes morts Surface de Chondrocytes vivants Control sans Control avec Norphenazone Control sans Control avec Norphenazone Compression Compression 6, 1 10'5 M Compression Compression 6, 1 10-5 M Jour 11 9, 5% 23, 1% 5, 3% 35, 8% 18, 3% 72,4% Jour 18 9,6% 36, 8% 8, 7% 30,5% 15,0% 65, 3% La différence entre ces résultats a un degré de confiance supérieur à 99% (Tukey test).

Exemple 2 Un modèle In Vitro est utilisé pour démontrer l'effet de dégradation d'une blessure mécanique sur la matrice polymérique du cartilage. Ce modèle est décrit dans les références suivantes : - Matrix and cell injury due to sub-impact loading of adult bovine articular cartilage explants : effects of strain rate and peak stress ; T. Quinn ; Journal of orthopaedic research 19 (2001) - Cartilage injury by ramp compression near the gel diffusion rate ; V. Morel ; Les échantillons sont préparés suivant la mme procédure que dans l'exemple 1. Le milieu de culture, ainsi que les conditions sont les mmes que dans l'exemple 1, de mme pour le programme de l'expérience et les conditions mécaniques du traumatisme appliqué.

Pour l'évaluation de la préparation pharmaceutique décrite dans cette invention, une quantité de 33, 6mg de Coenzyme Q10 correspondant à une concentration de 6,95 * 10-5 Molaire de la substance dans le milieu de culture est d'abord dissoute dans une quantité de 11,2g d'huile de colza correspondant à 2% en poids du milieu de culture final. Une quantité de 2,8g, soit 0,5% poids par rapport au milieu de culture de propylène glycol est ajouté à l'huile avant d'tre émulsifié par action mécanique avec le milieu de culture décrit dans l'exemple 1.

Durant le cours de l'étude, les milieux de cultures sont changés toutes les 24 heures et leurs teneurs en glucosaminoglycans (appelé GAG dans le reste du document) sont analysées.

La méthode d'analyse des GAG se fait par colorimétrie suivant les méthodes décrites dans : - R. W. Farndale, D. J. Buttle, A. J. Barrett, Improved quantification and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylene blue, Biochemica and Biophysica acta, 883,1986, p 173-177.

- R. W. Farndale, C. A. Sayers, A. J. Barrett, A direct spectrophotometric microassay for sulphated glycosaminoglycans in cartilage cultures, Connective Tissue Research, vol.

9,1982, p 247-248.

Le mélange d'une prise de 20 microlitre du milieu de culture et de 200 microlitre d'une solution de bleu de méthylène donne une variation d'absorption du mélange à 530nm en fonction de la teneur en GAG de la prise. Les valeurs enregistrées sont converties en teneur de GAG par comparaison avec une droite d'étalonnage construite en utilisant des concentrations connues, comprises entre 10 et 100 microgrammes par ml, de Sulfate de Chondrocytes (Sigma).

A la fin de la période de culture, le cartilage mesuré est totalement digéré afin de déterminer sa teneur totale en GAG. Cette valeur est utilisée pour exprimer les pertes journalières du cartilage en GAG en pourcentage de celle-ci. Pour la mesure de la teneur totale des cartilages en GAG, ceux-ci sont digérés dans 1 ml de solution de Papaïne à 60 Deg. C pendant 16 heures. La solution de Papaïne a la formulation suivante : - 75 inl de PBS contenant 0,0075 mg de NaN3 - 65 mg de cystéine HC1 - 375 microlitre de suspension de Papaïne à 25 mg/ml (Sigma, P-3125) La solution obtenue après digestion est diluée 50 fois dans le mme milieu de culture que celui utilisé pendant l'étude pour effectuer la mesure colorimétrique. Une prise de 20 microlitre est mélangée à 200 microlitre de solution de bleu de méthylène comme précédemment.

La présentation des résultats obtenus pour la composition pharmaceutique de cette invention est faite sous forme graphique en représentant les valeurs moyennes obtenues et leur écart type.

Graphique 1 Les exemples ci-dessus confirment que la préparation pharmaceutique découverte dans la présente invention, contenant un, ou un mélange des constituants choisis parmi la Norphenazone, les sels pharmaceutiquement acceptable de la Norphenazone et le Coenzyme QN (N compris entre 6 et 10) sont efficaces comme traitement prophylactique et thérapeutique des traumatismes et des affections des cartilages, comme par exemple, lors d'interventions chirurgicales, de contraintes mécaniques uniques ou répétées, de l'arthrose, de l'arthrite ou de l'ostéo-arthrite.