La présente invention concerne des peptides insecticides et leurs utilisations, notamment en tant qu’ agents phytosanitaires. ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L’INVENTION

L’impact économique des pertes de récoltes dues aux insectes nuisibles est extrêmement important et se chiffre en milliards de dollars chaque année.

À ce jour, la protection des cultures repose quasi exclusivement sur des traitements chimiques de plus en plus utilisés mais largement critiqués du fait de leur rémanence dans l’environnement et de leur toxicité vis-à-vis d’organismes non cibles tels que les amphibiens, la faune aquatique, les insectes auxiliaires ou encore les agriculteurs utilisateurs de ces produits. Ainsi, les insecticides les plus utilisés à ce jour contre les pucerons, à savoir les néonicotinoïdes, seront très prochainement interdits dans l’union européenne en raison de leur dangerosité avérée à l’encontre des pollinisateurs.

Outre ces préoccupations sociétales et sanitaires, il est également à noter que ces dernières décennies ont vu l’émergence d’insectes ravageurs capables de résister aux traitements classiques.

Le développement de nouvelles molécules insecticides efficaces, d’origine naturelle, non toxiques pour l’homme et plus respectueuses de l’environnement apparaît indispensable afin de limiter l’utilisation des insecticides conventionnels issus de la chimie de synthèse.

RÉSUMÉ DE L’INVENTION

L’objectif de la présente invention est de fournir de nouveaux agents insecticides efficaces notamment contre les pucerons, pouvant être utilisés en tant qu’ agents phytosanitaires et donc aptes à remplacer les traitements actuels utilisant des néonicotinoïdes.

La présente invention concerne ainsi G utilisation en tant qu’ agent pesticide, de préférence en tant qu’ agent insecticide, d’un peptide comprenant la séquence de formule

(I) (I)

dans laquelle

Xi représente une séquence de 1 à 9 acides aminés,

X ₂ représente une séquence de 2 acides aminés,

X ₃ représente une séquence de 3 acides aminés,

X ₄ représente une séquence de 3 acides aminés,

X5 représente une séquence de 3 à 5 acides aminés,

X ₆ représente une séquence de 4 et 6 acides aminés,

X ₇ représente un acide aminé,

C _d représente une séquence de 9 acides aminés,

X9 représente une séquence de 2 acides aminés,

X10 représente une séquence de 2 à 16 acides aminés,

ou d’un sel dudit peptide acceptable sur le plan phytosanitaire.

De préférence,

Xi représente la séquence (Z) _m -[G/S], de préférence la séquence (Z) _m -G, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des m occurrences et m est 0 ou un nombre entier entre 1 et 8 ; et/ou

X ₂ représente la séquence [F/Y] -Z, de préférence la séquence F-Z, où Z est un acide aminé ; et/ou

X ₄ représente la séquence [S/D/N] -Z-Z, de préférence [S/D] -Z-Z, et de manière plus particulièrement préférée la séquence S -Z-Z, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou

X5 représente la séquence (Z) _n -[L/V], de préférence la séquence (Z) _n -V, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des n occurrences et n est un nombre entier entre 2 et 4, et/ou

Xe représente la séquence [G/N]-(Z) _P , de préférence N-(Z) _P , où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des p occurrences et p est un nombre entier entre 3 et 5 ; et/ou

X ₈ représente la séquence Z-[E/Q]-Z-Z-Z-Z-Z-[D/G]-Z (SEQ ID NO : 7), de préférence la séquence Z-E-Z-Z-Z-Z-Z-D-Z (SEQ ID NO : 8), où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou X ₉ représente la séquence [P/A] -[Y/H], de préférence la séquence P-Y.

En particulier

Xi peut représenter la séquence Z ₁ -Z ₂ -Z ₃ -Z ₄ -Z ₅ -Z ₆ -Z ₇ -Z ₈ -Z ₉ où

Zi est absent ou est D, de préférence est D,

Z ₂ est absent ou est F ou I, de préférence est F,

Z ₃ est absent ou est D, de préférence est D,

Z ₄ est absent ou est P ou Y, de préférence est P,

Z ₅ est absent ou est T, N ou H, de préférence est T,

Z ₆ est absent ou est E, T ou Y, de préférence est E,

Z ₇ est absent ou est F, L ou I, de préférence est F,

Z ₈ est absent ou est K, R ou E, de préférence est K, et

Z ₉ est G ou S, de préférence G ; et/ou

X ₂ peut représenter la séquence [F/Y]-[P/E/Q/F], de préférence F-P ; et/ou X ₃ peut représenter la séquence [FK/R]-[E/Y/F]-[I/N/G/F], de préférence I-E-I ; et/ou

X ₄ peut représenter la séquence [S/D/N]-[K/T/N/R]-[Y/H/V/I], de préférence S-

K-Y ; et/ou

X5 peut représenter la séquence Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 où

Z ₁₀ est absent ou est E, de préférence est absent,

Zi ₁ est absent ou est Y, de préférence est absent,

Z ₁₂ est A, N, Y ou H, de préférence est A,

Z ₁₃ est V ou K, de préférence V,

Z ₁₄ est V ou F, de préférence V ; et/ou

X ₆ peut représenter la séquence Z15-Z16-Z17-Z18-Z1 ₉ -Z20 où

Z15 est N ou G, de préférence N,

Zi ₆ est absent ou est Y, de préférence est Y,

Z ₁₇ est absent ou est T, A, K ou D, de préférence T,

Zi ₈ est S, I, R ou E, de préférence est S,

Z ₁₉ est R, F, D, V, A ou F, de préférence R, et

Z ₂₀ est P, H, A ou V, de préférence P ; et/ou

X ₇ peut représenter Y, I, S ou A, de préférence Y. X8 peut représenter la séquence [ V/I/S |-[ E/Q|-[ A/Y/D |-[ A/H/D/R/K |-[ K/S/ A/R |- [E/M/ Q/L] - [R/E/L/N/K] - [D/ G] -[Q/L/H/M] (SEQ ID NO: 9), de préférence V-E-A-A-K- E-R-D-Q (SEQ ID NO: 10) ; et/ou

X9 peut représenter la séquence [P/A] -[Y/H], de préférence la séquence P-Y ; et/ou

X10 peut représenter la séquence Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32- Z33-Z34-Z35-Z36 où

Z21 est Y, R, A, Q ou P, de préférence Y,

Z22 est D, T, E ou N, de préférence D,

Z23 est absent ou est G, de préférence est absent,

Z24 est absent ou est G, S, H, Q ou K, de préférence est absent,

Z25 est absent ou est P ou A, de préférence est absent,

Z26 est absent ou est A, E ou S, de préférence est absent,

Z27 est absent ou est M, Q, E ou V, de préférence est absent,

Z28 est absent ou est L, M, E ou V, de préférence est absent,

Z29 est absent ou est M ou L, de préférence est absent,

Z30 est absent ou est H, de préférence est absent,

Z31 est absent ou est N, Q ou D, de préférence est absent,

Z32 est absent ou est F, de préférence est absent,

Z33 est absent ou est L, de préférence est absent,

Z34 est absent ou est T ou S, de préférence est absent,

Z35 est absent ou est S ou N, de préférence est absent,

Z36 est absent ou est P, de préférence est absent.

De manière plus préférée, le peptide est choisi dans le groupe constitué

- d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’ acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, et

- d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence de formule (I) présentant au moins 50%, de préférence au moins 80%, au moins 85%, au moins 90%, au moins 95%, au moins 98% ou au moins 99%, d’identité de séquence avec l’une des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, et présentant une activité pesticide, de préférence une activité insecticide.

De manière tout particulièrement préférée, le peptide comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, de préférence comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4, et de manière tout particulièrement préférée comprend, ou consiste en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1.

Le peptide a de préférence une taille comprise entre 40 et 100 acides aminés, de préférence comprise entre 40 et 70 acides aminés.

Le peptide peut être utilisé comme agent insecticide à l’encontre d’hémiptères, lépidoptères, coléoptères et/ou diptères, de préférence à l’encontre d’hémiptères et plus particulièrement de pucerons, notamment Acyrthosiphon pisum.

La présente invention concerne également une cellule hôte non-humaine comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel qu’utilisé selon l’invention, ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans ladite cellule.

La cellule peut être une cellule de plante, de préférence une cellule de plante légumineuse ou de plante céréalière, et de manière plus particulièrement préférée une cellule de plante légumineuse choisie dans le groupe constitué du soja, haricot, pois, pois chiche, arachide, lentille, luzerne, fève et caroubier ou une cellule de plante céréalière choisie dans le groupe constitué du blé et du maïs.

La cellule peut également être un microorganisme entomopathogène, de préférence une bactérie ou un champignon entomopathogène.

La présente invention concerne en outre un virus entomopathogène comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel qu’utilisé selon l’invention, ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans l’insecte infecté par le virus.

La présente invention concerne également une plante transgénique ou structure végétale multicellulaire comprenant au moins une cellule selon l’invention, ainsi qu’un procédé de production d’une telle plante transgénique comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel qu’utilisé selon l’invention, et la reconstitution dudit organisme à partir de ladite cellule.

La présente invention concerne par ailleurs une composition phytosanitaire comprenant au moins un peptide tel qu’utilisé selon l’invention ou l’un de ses sels acceptables sur le plan phytosanitaire, une cellule hôte et/ou un virus selon l’invention, et un support et/ou excipient acceptable sur le plan phytosanitaire. La composition peut comprendre en outre un ou plusieurs agents phytosanitaires additionnels, de préférence choisis parmi les insecticides, les bactéricides, les fongiques, les virucides, les régulateurs de croissance ou les stimulateurs des défenses naturelles de la plante.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS Figure 1 : Séquence du peptide BCR4 avec représentation des ponts disulfure Cl-

C5, C2-C4 et C3-C6.

Figure 2: Spectre ESI-HRMS (A) et chromatogramme HPLC (B) du peptide BCR4 (Temps de rétention 22,5 min).

Figure 3 : Alignement multiple des membres de la famille BCR1-2-4-5. DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Les inventeurs ont identifié une nouvelle famille de peptides insecticides naturels pouvant être utilisés comme alternative aux pesticides chimiques conventionnels.

Ces peptides appartiennent à une nouvelle classe de protéines riches en cystéine appelées « Bactériocyte Cysteine Rich » (BCRs) et récemment identifiée chez le puceron de pois Acyrthosiphon pisum (Shigenobu et al. 2013). Dans cet organisme, les BCRs contiennent de 67 à 108 résidus, avec six ou huit résidus de cystéines et sont au nombre de sept. Elles sont codées par des gènes orphelins et exprimées exclusivement dans les bactériocytes des pucerons. Ces cellules de l'hôte abritent Buchnera aphidicola, la bactérie symbiotique primaire des pucerons. Les séquences de BCRs ne montrent aucune similarité significative avec d'autres protéines d’organismes séquencés et une analyse comparative a confirmé que ces peptides sont limités à la lignée des pucerons.

Dans la présente demande, les inventeurs ont démontré que le peptide BCR4, appartenant à la sous-famille BCR1 -2-4-5, présente une activité insecticide exceptionnelle contre le puceron du pois avec une plage d'activité (5-80 mM) semblable à celle du peptide AG41, un peptide entomotoxique prometteur d’origine végétale (WO2015087238A1). Les peptides de cette famille constituent donc une alternative efficace à l’utilisation de pesticides issus de la chimie de synthèse Selon un premier aspect, la présente invention concerne l’utilisation en tant qu’ agent pesticide, et plus particulièrement en tant qu’ agent insecticide, d’un peptide comprenant, ou consistant en, la séquence de formule (I)

dans laquelle

Xi représente une séquence de 1 à 9 acides aminés,

X2 représente une séquence de 2 acides aminés,

X3 représente une séquence de 3 acides aminés,

X ₄ représente une séquence de 3 acides aminés,

X5 représente une séquence de 3 à 5 acides aminés,

X ₆ représente une séquence de 4 à 6 acides aminés,

X ₇ représente un acide aminé,

Xs représente une séquence de 9 acides aminés,

X9 représente une séquence de 2 acides aminés,

X10 représente une séquence de 2 à 16 acides aminés,

ou d’un sel dudit peptide acceptable sur le plan phytosanitaire.

Dans la formule (I), les traits de liaison entre les différents résidus cystéine représentent les ponts disulfures.

Dans le présent document, les termes « peptide », « oligopeptide », « polypeptide » et « protéine » sont utilisés indifféremment et se réfèrent à une chaîne d’acides aminés reliés par des liaisons peptidiques, quel que soit le nombre de résidus d’ acide aminé constituant cette chaîne.

Tel qu’utilisé ici, le terme « acide aminé » se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T), aux résidus d'acides aminés naturels rares (par exemple l'hydroxyproline, l'hydroxylysine, l'allohydroxylysine, la 6-N-méthylysine, la N-éthylglycine, la N-méthylglycine, la N- éthylasparagine, l'allo-isoleucine, la N-méthylisoleucine, la N-méthylvaline, la pyroglutamine ou l'acide aminobutyrique) et aux acides aminés non naturels (par exemple norleucine, norvaline et cyclohexyl-alanine). De préférence, ce terme se réfère aux 20 résidus d'acides aminés standard naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T).

Les acides aminés sont ici représentés par leur code à une lettre ou à trois lettres selon la nomenclature suivante: A: alanine (Ala); C: cystéine (Cys); D: acide aspartique (Asp); E: acide glutamique (Glu); F: phénylalanine (Phe); G: glycine (Gly); H: histidine (His); I: isoleucine (Ile); K: lysine (Lys); L: leucine (Leu); M: méthionine (Met); N: asparagine (Asn); P: proline (Pro); Q: glutamine (Gln); R: arginine (Arg); S: sérine (Ser); T: thréonine (Thr); V: valine (Val); W: tryptophane (Trp) et Y: tyrosine (Tyr).

Les acides aminés constituant le peptide utilisé selon l'invention peuvent être de configuration L ou D, de préférence de configuration L.

Selon un mode de réalisation,

Xi représente la séquence (Z) _m -[G/S], de préférence la séquence (Z) _m -G, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des m occurrences et m est 0 ou un nombre entier entre 1 et 8 ; et/ou

X ₂ représente la séquence [F/Y] -Z, de préférence la séquence F-Z, où Z est un acide aminé ; et/ou

X ₄ représente la séquence [S/D/N] -Z-Z, de préférence [S/D] -Z-Z, et de manière plus particulièrement préférée la séquence S -Z-Z, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou

X5 représente la séquence (Z) _n -[L/V], de préférence la séquence (Z) _n -V, où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des n occurrences et n est un nombre entier entre 2 et 4, et/ou

X ₆ représente la séquence [G/N]-(Z) _P , de préférence N-(Z) _P , où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chacune des p occurrences et p est un nombre entier entre 3 et 5 ; et/ou

X ₈ représente la séquence Z-[E/Q]-Z-Z-Z-Z-Z-[D/G]-Z (SEQ ID NO : 7), de préférence la séquence Z-E-Z-Z-Z-Z-Z-D-Z (SEQ ID NO : 8), où Z est un acide aminé indépendamment choisi pour chaque occurrence ; et/ou

X ₉ représente la séquence [P/A] -[Y/H], de préférence la séquence P-Y. Selon un mode de réalisation particulier, Xi représente la séquence Z ₁ -Z ₂ -Z ₃ -Z ₄ - Z ₅ -Z ₆ -Z ₇ -Z ₈ -Z ₉ où

Zi est absent ou est D, de préférence est D,

Z ₂ est absent ou est F ou I, de préférence est F,

Z ₃ est absent ou est D, de préférence est D,

Z ₄ est absent ou est P ou Y, de préférence est P,

Z ₅ est absent ou est T, N ou H, de préférence est T,

Z ₆ est absent ou est E, T ou Y, de préférence est E,

Z ₇ est absent ou est F, L ou I, de préférence est F,

Zs est absent ou est K, R ou E, de préférence est K, et

Z ₉ est G ou S, de préférence G ; et/ou

X ₂ représente la séquence [F/Y]-[P/E/Q/L], de préférence F-P ; et/ou

X ₃ représente la séquence [I/K/R]-[E/Y/F]-[I/N/G/L], de préférence I-E-I ; et/ou X ₄ représente la séquence [S/D/N] -[K/T/N/R]-[Y/H/V/I], de préférence S-K-Y ; et/ou

X5 représente la séquence Z10-Z11-Z12-Z13-Z14 où

Z ₁₀ est absent ou est E, de préférence est absent,

Zi ₁ est absent ou est Y, de préférence est absent,

Z ₁₂ est A, N, Y ou H, de préférence est A,

Z ₁₃ est V ou K, de préférence V,

Z ₁₄ est V ou L, de préférence V ; et/ou

X ₆ représente la séquence Z15-Z16-Z17-Z18-Z19-Z20 où

Z ₁₅ est N ou G, de préférence N,

Zi ₆ est absent ou est Y, de préférence est Y,

Z ₁₇ est absent ou est T, A, K ou D, de préférence T,

Zi ₈ est S, I, R ou E, de préférence est S,

Z ₁₉ est R, L, D, V, A ou F, de préférence R, et

Z ₂₀ est P, H, A ou V, de préférence P ; et/ou

X ₇ représente Y, I, S ou A, de préférence Y ; et/ou

X ₈ représente la séquence [V/FS]-[E/Q]-[A/Y/D]-[A/H/D/R/K]-[K/S/A/R]- [E/M/ Q/L] - [R/E/L/N/K] - [D/ G] -[Q/L/H/M] (SEQ ID NO: 9), de préférence V-E-A-A-K- E-R-D-Q (SEQ ID NO: 10) ; et/ou

X ₉ représente la séquence [P/A]-[Y/H], de préférence la séquence P- Y ; et/ou Xio représente la séquence Z21-Z22-Z23-Z24-Z25-Z26-Z27-Z28-Z29-Z30-Z31-Z32-Z33- Z34-Z35-Z36 où

Z21 est Y, R, A, Q ou P, de préférence Y,

Z22 est D, T, E ou N, de préférence D,

Z23 est absent ou est G, de préférence est absent,

Z24 est absent ou est G, S, H, Q ou K, de préférence est absent,

Z25 est absent ou est P ou A, de préférence est absent,

Z26 est absent ou est A, E ou S, de préférence est absent,

Z27 est absent ou est M, Q, E ou V, de préférence est absent,

Z28 est absent ou est L, M, E ou V, de préférence est absent,

Z29 est absent ou est M ou L, de préférence est absent,

Z30 est absent ou est H, de préférence est absent,

Z31 est absent ou est N, Q ou D, de préférence est absent,

Z32 est absent ou est F, de préférence est absent,

Z33 est absent ou est L, de préférence est absent,

Z34 est absent ou est T ou S, de préférence est absent,

Z35 est absent ou est S ou N, de préférence est absent,

Z36 est absent ou est P, de préférence est absent.

Selon un autre mode de réalisation particulier,

Xi est choisi dans le groupe constitué des séquences G, S, YHYIES (SEQ ID NO : 11), YFES (SEQ ID NO : 12), DFDPTEFKG (SEQ ID NO : 13), DIDPNTLRG (SEQ ID NO : 14) ; et/ou

X2 est choisi dans le groupe constitué des séquences FL, FQ, FE, FP et YP ; et/ou

X ₃ est choisi dans le groupe constitué des séquences KYL, RYN, RFG, KYN, IEI et KEI ; et/ou

X ₄ est choisi dans le groupe constitué des séquences DRV, NNI, DNV, DTH, SKY ; et/ou

X5 est choisi dans le groupe constitué des séquences HKL, YKL, NKL, AVV et EYNVV (SEQ ID NO : 15) ; et/ou

Xe est choisi dans le groupe constitué des séquences GDEFV (SEQ ID NO : 16), GSAA (SEQ ID NO : 17), GKRVP (SEQ ID NO : 18), GKIDH (SEQ ID NO : 19), NYTSRP (SEQ ID NO : 20) et GASLP (SEQ ID NO : 21) ; et/ou X ₇ représente Y, I, S ou A ; et/ou

X ₈ est choisi dans le groupe constitué des séquences IQYKSLKGL (SEQ ID NO : 22), SQYRSLKGM (SEQ ID NO : 23), VQYDAMNGL (SEQ ID NO : 24), IQYHSMEGL (SEQ ID NO : 25), VEAAKERDQ (SEQ ID NO : 26) et VQDARQLDH (SEQ ID NO : 27) ; et/ou

X ₉ est choisi dans le groupe constitué des séquences PH, PY et AY ; et/ou

X ₁₀ est choisi dans le groupe constitué des séquences PTGKASVVLHNFLTSP (SEQ ID NO : 28), ANGQAAQVLHNFLSN (SEQ ID NO : 29), QEGHAAEELHQF (SEQ ID NO : 30), RTGSAAQMLHDFLSNP (SEQ ID NO : 31), YD et YDGGPEMLM (SEQ ID NO : 32).

Selon un mode de réalisation préféré, le peptide est choisi dans le groupe constitué d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences

DFDPTEFKGPFPTIEICSKY C A VV CNYTSRPC Y C VEAAKERDQWFP YC Y

D (SEQ ID NO : 1),

GPFLTKYLCDRVCHKLCGDEFVCSCIQYKSLKGLWFPHCPTGKASVVLH NFLTSP (SEQ ID NO : 2),

YFESPFETKYNCDTHCNKLCGKIDHCSCIQYHSMEGLWFPHCRTGSAAQ MLHDFLSNP (SEQ ID NO : 3),

DIDPNTLRGPYPTKEICSKYCEYNVVCGASLPCICVQDARQLDHWFAYC YDGGPEMLM (SEQ ID NO : 4),

SPFQTRYNCNNICHKLCGSAACACSQYRSLKGMWFPHCANGQAAQVLH NFLSN (SEQ ID NO : 5), et

YHYIESPFETRFGCDNVCYKLCGKRVPCSCVQYDAMNGLWFPHCQEGH

AAEELHQFL (SEQ ID NO : 6),

et des variants fonctionnels de celui-ci.

De préférence, le peptide est choisi dans le groupe constitué d’un peptide comprenant, ou consistant en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4, et des variants fonctionnels de celui-ci.

De manière plus particulièrement préférée, le peptide est choisi dans le groupe constitué d’un peptide comprenant, ou consistant en, la séquence d’acides aminés SEQ ID NO : 1, et des variants fonctionnels de celui-ci. Le terme « variant fonctionnel » se réfère à un peptide de formule (I) et dont la séquence diffère de la protéine parente par au moins une substitution, insertion ou délétion mais qui conserve une activité pesticide, de préférence une activité insecticide.

De préférence, les variants fonctionnels présentent au moins 50% d’identité de séquence avec la séquence parente, de manière plus particulièrement préférée au moins 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% d’identité de séquence avec la séquence parente, et de manière tout particulièrement préférée au moins 90%, 95%, 98% ou 99% d’identité de séquence avec la séquence parente.

Tel qu'utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" se réfère au nombre (%) d'appariements (résidus d'acides aminés identiques) aux positions provenant d'un alignement de deux séquences polypeptidiques. L'identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. En particulier, l'identité de séquence peut être déterminée en utilisant l'un quelconque des nombreux algorithmes d'alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d'alignement global (e.g. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d'alignement local, par exemple l'algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l'algorithme d'Altschul (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L'alignement dans le but de déterminer le pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l’homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov / ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. T /homme de l'art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l'alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d'identité de séquence d'acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme « Protein BLAST » (ou Blastp) dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut (Expect threshold : 10, Word size : 6, Matrix = BLOSUM62, Gap Costs : Existence = 11, Extension = 1 , Conditional compositional score matrix adjustment). Selon certains modes de réalisation, les variants fonctionnels peuvent différer de la séquence parente par 1 à 10, i.e. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 à 10, substitutions, insertions et/ou délétions d’acides aminés, de préférence par 1 à 5, i.e. 1, 2, 3, 4 ou 5, substitutions, insertions et/ou délétions d’ acides aminés.

Le terme « substitution », tel qu'utilisé ici désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standard naturels, les résidus d'acides aminés naturels rares et d'acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d'acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu’utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d’un résidu d’acide aminé par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives se font parmi (i) les acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine), (ii) les acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), (iii) les acides aminés polaires (glutamine et asparagine ou sérine, thréonine et tyrosine ), (iv) les acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine et valine), (v) les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane) et (vi) les petits acides aminés (glycine, alanine). De préférence, la ou les substitutions sont des substitutions conservatives.

Selon un mode de réalisation particulier, le peptide comprend, ou consiste en, une séquence d’acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 6, de préférence comprend, ou consiste en, une séquence d’ acides aminés choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à 4, et de manière plus particulièrement préférée comprend, ou consiste en, la séquence d’ acides aminés SEQ ID NO : 1.

Le peptide utilisé selon l’invention a de préférence une taille comprise entre 40 et 100 acides aminés, de manière plus particulièrement préférée comprise entre 40 et 80 acides aminés, et de manière encore plus particulièrement préférée comprise entre 40 et 70 acides aminés. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide utilisé selon l’invention a une taille de 50 à 60 acides aminés. Le peptide utilisé selon l’invention peut comprendre la séquence de formule (I) fusionnée à un autre domaine protéique. Ce domaine protéique peut par exemple être une séquence signal ou un tag (ou étiquette).

En particulier, le peptide peut être un précurseur qui subit des modifications post- traductionnelles permettant d’obtenir la forme mature et active du peptide. Il peut ainsi comprendre une séquence signal de translocation et des sites de reconnaissance et/ou de clivage lui permettant de subir ces modifications post-traductionnelles.

Selon un mode de réalisation particulier, le peptide est un précurseur d’un peptide pesticide ou insecticide mature, ledit précurseur comprenant une séquence signal de translocation en N-terminal. La séquence signal peut notamment être la séquence M- [R/K] -L-L- [ Y/H] -G-F-L-I-I-M-L-T- [M/I] - [ Y/H] -LS - [ V/I] -Q (SEQ ID NO : 33).

Le peptide peut également comprendre, en N-terminal ou C-terminal, un tag (ou étiquette) utile pour la purification ou l’immobilisation du peptide. De tels tags sont bien connus de l’homme du métier et incluent par exemple les tags histidine (His ₆ ), FLAG, HA (épitope dérivé de l’hémagglutinine du virus de la grippe), MYC (épitope dérivé de la proto-oncoprotéine humaine MYC) ou GST (glutathion-S-transférase). Optionnellement, le peptide peut comprendre un site de clivage par une protéase ou un agent chimique permettant de supprimer ce tag.

Le peptide utilisé selon l’invention peut présenter une ou plusieurs modifications post-traductionnelles et/ou modifications chimiques en particulier une glycosylation, une amidation, une acylation, une acétylation et/ou une méthylation.

Afin d’augmenter la résistance du peptide aux peptidases, des groupements protecteurs peuvent être ajoutés aux extrémités C- et/ou N-terminale. Par exemple, le groupement protecteur à l’extrémité N-terminale peut être une acylation ou une acétylation et le groupement protecteur à l’extrémité C -terminale peut être une amidation ou une estérification. L’action des protéases peut également être contrecarrée, par exemple, par G utilisation d’acides aminés de configuration D ou de liaisons pseudo peptidiques remplaçant les liaisons peptidiques « classiques » CONH, telles que CHOH- CH2, NHCO, CH2-0, CH2CH2, CO-CH2, N-N, CH=CH, CH2NH, et CH2-S.

L’invention couvre également G utilisation de sels dudit peptide, de préférence de sels acceptables sur le plan phytosanitaire. Un sel acceptable sur le plan phytosanitaire est un sel qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé, vis-à-vis de la plante, de l’environnement ou de l’homme. Les sels peuvent être, par exemple, les sels avec des acides minéraux acceptables tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique et l'acide phosphorique ; les sels avec des acides organiques acceptables tels que l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide succinique, l'acide ascorbique et l'acide tartrique ; les sels avec des bases minérales acceptables tels que les sels de sodium, de potassium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ; ou les sels avec des bases organiques qui ont un azote salifiable. Selon certains modes de réalisation préférés, le sel est un sulfate d’ammonium. Ces sels sont couramment utilisés et leurs méthodes de préparation sont bien connues de l’homme du métier.

L’invention concerne l’utilisation du peptide tel que décrit ci-dessus en tant qu’ agent pesticide, et plus particulièrement en tant qu’ agent insecticide, de préférence pour des applications phytosanitaires.

Tel qu’utilisé ici, le terme « pesticide » se réfère à un composé destiné à lutter contre des organismes considérés comme nuisibles. Lorsque ces organismes sont des insectes, on parle d’ « insecticide ».

Tel qu’utilisé ici, le terme « application phytosanitaire» se réfère à une action destinée à protéger les végétaux et les produits de culture contre des organismes nuisibles, en particulier des insectes, et/ou à assurer la conservation des produits de culture. On entend par « produits de culture » les produits cueillis ou récoltés, notamment les légumes, les fruits, les fleurs, ou les graines, et les produits transformés qui en sont dérivés, notamment les farines.

De préférence, le peptide est utilisé en tant qu’ agent insecticide dans un traitement phytosanitaire.

L’activité insecticide du peptide peut être aisément testée par l’homme du métier, notamment en observant la survie de larves d’insecte, par exemple de larves de puceron du pois, sur un milieu liquide contenant le peptide à tester. Cette technique de routine est illustrée dans la partie expérimentale de la présente demande. De préférence, un peptide est considéré comme ayant une activité insecticide lorsqu’il présente une TL50 (temps létal où 50% des individus meurent) de moins de 5 jours sur des larves d’insecte, de préférence des larves de puceron du pois, à une concentration de 100 mM, préférence à une concentration de 50mM.

L’activité insecticide du peptide de formule (I) est de préférence à l’encontre d’insectes nuisibles sélectionnés dans le groupe constitué des hémiptères, lépidoptères, coléoptères et diptères.

Des exemples d’hémiptères incluent, sans y être limités, des espèces de pucerons telles qa’Acyrtho siphon pisum, Aphis gossypii, Aulacorthum solani, Macrosiphum euphorbiae, Myzus persicae et Rhopalosiphum padi, des espèces de cochenilles telles que Planococcus citri , des espèces d’aleurodes telles que Trialeurodes vaporariorum et Bemisia tabaci, ou des espèces de punaises telles que Lygocoris pabulinus, Liocoris tripustulatus, Lygus rugulipennis et Corythucha ciliata.

Des exemples de lépidoptères incluent, sans y être limités, des espèces de chenilles de plusieurs papillons telles que Chrysodeixis chalcites, Mamestra brassicae, Spodoptera exigua, Clepsis speclrana, Cacoecimorpha pronuhana, Duponchelia fovealis, Tuta absoluta, Cydia pomonella, Lobesia botrana et Eupoecillia ambiguella.

Des exemples de coléoptères incluent, sans y être limités, des espèces de charançons telles que Sitophilus spp. et des espèces de taupins telles que Agriotes spp.

Des exemples de diptères incluent, sans y être limités, des espèces de mouches telles que Sciarkhe spp., Musca domestica, Stomoxys calcitrans et Liriomyza spp.

Selon certains modes de réalisation préférés, le peptide est utilisé en tant qu’ agent insecticide à l’encontre d’un ou plusieurs hémiptères, et plus particulièrement d’un ou plusieurs pucerons, notamment Acyrthosiphon pisum.

Le peptide décrit ci-dessus peut être utilisé seul ou en combinaison avec un ou plusieurs autres agents actifs. Le ou les agents actifs additionnels peuvent notamment être choisis parmi les autres peptides décrits ci-dessus et de formule (I) et d’autres agents pesticides, insecticides ou phytosanitaires, de préférence avec un ou plusieurs autres agents insecticides.

De préférence, le peptide est utilisé en combinaison avec un ou plusieurs autres peptides insecticides. Selon un mode de réalisation particulier, le peptide est utilisé en combinaison avec le peptide insecticide AG41 (WO2015087238, tableau II). La présente invention concerne également une cassette d’expression comprenant un acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), lié de manière opérationnelle à un promoteur transcriptionnel hétérologue.

Le terme « cassette d'expression » désigne une construction d'acide nucléique comprenant une région codante et une région régulatrice, liées de manière opérationnelle. L'expression "lié de manière opérationnelle" indique que les éléments sont combinés de manière à ce que l'expression de la séquence codante soit sous le contrôle du promoteur transcriptionnel. Typiquement, la séquence du promoteur est placée en amont du gène d'intérêt, à une distance de celui-ci compatible avec le contrôle de l'expression.

La cassette peut en outre comprendre d’autres éléments régulateurs tels qu’un terminateur de transcription, la séquence d’un peptide de transit et/ou une séquence activatrice dite « enhancer ».

Tel qu’utilisé ici, le terme « promoteur transcriptionnel hétérologue » se réfère à un promoteur qui, dans la nature, n’est pas associé à l’acide nucléique codant pour le peptide. La cassette selon l’invention est donc une cassette recombinante.

Le promoteur transcriptionnel peut être aisément choisi par l’homme du métier selon la nature de la cellule hôte dans laquelle l’expression est envisagée. Ce promoteur peut notamment être un promoteur inductible ou constitutif, procaryote ou eucaryote, systémique ou tissu-spécifique.

De préférence, le promoteur transcriptionnel est un promoteur permettant l’expression du peptide dans une cellule hôte de plante ou d’un microorganisme entomopathogène.

De manière alternative, la cassette est destinée à être insérée dans un vecteur viral et le promoteur transcriptionnel est un promoteur permettant l’expression du peptide dans une cellule hôte infectée par ledit vecteur, de préférence une cellule d’un insecte nuisible.

Les cassettes d’expression selon l'invention peuvent être construites par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.

La présente invention concerne en outre un vecteur d’expression comprenant une cassette d’expression selon l’invention. Ce vecteur d’expression peut être utilisé pour transformer une cellule hôte et permettre l’expression de l’acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) dans ladite cellule. Le vecteur peut être un ADN ou un ARN, circulaire ou non, simple- ou double- brin. Il est avantageusement choisi parmi un plasmide, un phage, un phagemide, un virus, un cosmide et un chromosome artificiel.

L’homme du métier peut aisément choisir le vecteur le plus approprié notamment au regard de la cellule hôte ciblée, du niveau d’expression et de la stabilité recherchés, du mode choisi pour introduire le vecteur dans la cellule hôte, etc.

Le vecteur peut comporter en outre des éléments permettant sa sélection dans la cellule hôte comme, par exemple, un gène de résistance à un antibiotique ou à un herbicide, ou un gène de sélection assurant la complémentation du gène respectif délété dans le génome de la cellule hôte. De tels éléments sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.

Les vecteurs selon l'invention peuvent comprendre, en outre, une origine de réplication et/ou une séquence permettant une insertion ciblée dans le génome de la cellule hôte.

Les vecteurs selon l'invention peuvent être construits par des techniques classiques de biologie moléculaire, bien connues de l'homme du métier.

Selon un mode de réalisation particulier, le vecteur est un vecteur viral, de préférence un virus entomopathogène. Ainsi, la présente invention concerne un virus entomopathogène comprenant un acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), ledit acide nucléique étant placé sous le contrôle d’une promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans la cellule hôte infecté par le virus, la cellule hôte étant de préférence une cellule d’insecte.

Le virus entomopathogène peut être choisi parmi les Baculoviridae, les Reoviridae, les Poxviridae, les Iridoviridae, les Parvoviridae, les Picomoviridae, et les Rhabdoviridae.

De préférence, le virus entomopathogène appartient à la famille des Baculoviridae.

Le promoteur transcriptionnel peut être aisément choisi par l’homme du métier selon la cellule cible.

La présente invention concerne également G utilisation d’une cassette d’expression ou d’un vecteur d’expression selon l’invention pour transformer ou transfecter une cellule. La cellule hôte peut être transformée/transfectée de manière transitoire ou stable et la cassette ou le vecteur peut être contenu dans la cellule sous forme d’épisome ou sous forme chromosomique.

La présente invention concerne une cellule hôte non-humaine comprenant une cassette ou un vecteur d’expression selon l’invention.

Elle concerne également une cellule hôte comprenant un acide nucléique hétérologue (qui n’est pas naturellement présent dans la cellule) codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I). Ledit acide nucléique est de préférence placé sous le contrôle d’un promoteur transcriptionnel permettant l’expression dudit acide nucléique dans la cellule. Ce promoteur peut être un promoteur endogène (naturellement présent dans la cellule) ou un promoteur hétérologue (qui n’est pas naturellement présent dans la cellule).

La cellule hôte peut être choisie notamment pour agir en tant que vecteur de propagation du peptide de formule (I) ou à des fins de production du peptide.

La cellule hôte peut être une cellule procaryote ou eucaryote. La cellule hôte peut notamment être une cellule de plante, une cellule animale, une cellule fongique ou une bactérie.

Selon un mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule animale. La cellule animale pour être notamment choisie parmi les cellules de mammifères telles que les cellules COS ou CHO, les cellules d’insectes telles que les cellules Sf9, Sf2l ou Hi5, les cellules de protozoaires ou de nématodes.

Les cellules de protozoaires et de nématodes sont préférentiellement choisies parmi les familles entomopathogènes, en particulier les familles utilisées en lutte biologique telles que par exemple les familles de protozoaires Amoebidae et Nosematidae ou les espèces de nématodes Steinermatidae et Heterorhabditidae.

Selon un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule de microorganisme, de préférence une cellule de microorganisme entomopathogène et de manière plus particulièrement préférée une cellule bactérie ou de champignon entomopathogène.

De nombreuses bactéries ont été décrites comme entomopathogènes. En particulier, la bactérie peut être choisie parmi les bactéries des familles Bacillaceae, Enterobacteriaceae et Pseudomonaceae. De préférence, la bactérie est choisie parmi Bacillus thurengiensis et Bacillus sphaericus.

De même, de nombreux champignons ont été décrits comme entomopathogènes. En particulier, le champignon peut être choisi parmi les champignons des genres Beauveria, par exemple Beauvaria bassiana, Metharizium, par exemple Metharizium anisopliae, Verticillium, Erynia, Hirsutella, Entomophtora et Entomophaga.

Selon encore un autre mode de réalisation, la cellule hôte est une cellule de plante, de préférence une cellule de plante légumineuse ou de plante céréalière.

La cellule de plante peut être une cellule de plante légumineuse choisie dans le groupe constitué du soja, haricot, pois, pois chiche, arachide, lentille, luzerne, fève et caroubier.

La cellule de plante peut également être une cellule de plante céréalière choisie dans le groupe constitué du blé et du maïs.

La cellule de plante peut également être une Nicotianée, par exemple Nicotiana sylvestris ou Nicotiana tabacum.

Les techniques pour introduire une acide nucléique hétérologue dans ces différents types de cellules (cellule de plante, cellule animale, cellule fongique ou bactérie) sont bien connues de l’homme du métier.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne également un organisme multicellulaire transgénique comprenant une cellule hôte selon l’invention, c’est-à-dire une cellule comprenant un acide nucléique hétérologue codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), en particulier comprenant une cassette ou un vecteur d’expression selon l’invention.

Selon un mode de réalisation, l’organisme est un protozoaire ou un nématode.

Selon un mode de réalisation préféré, l’organisme est une plante transgénique ou une structure végétale multicellulaire

Tel qu’utilisé ici, le terme « structure végétale multicellulaire» se réfère à des parties de plante telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules, du bois, ou des structures multicellulaires telles que des cals, des organes de plante ou des embryons immatures (e.g. explants utilisés pour la trans genèse). La reconstitution d’une plante transgénique ou d’une structure végétale multicellulaire telle que définie ci-dessus à partir d’une cellule de plante transfectée ou transformée fait appel à des techniques de routine bien connues de l’homme du métier.

Le peptide peut être exprimé de manière ubiquitaire (dans tous les tissus de la plante) ou seulement dans certains tissus ou organes, en particulier les tissus ou organes qui sont les cibles de l’organisme nuisible.

Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.

La présente invention concerne également un procédé de production d’une plante transgénique ou d’une structure végétale multicellulaire comprenant une cellule hôte selon l’invention, ledit procédé comprenant l'introduction dans une cellule de plante d’un acide nucléique codant pour un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), d'une cassette d'expression ou d’un vecteur selon l’invention, et la reconstitution de ladite plante ou structure à partir de ladite cellule.

Optionnellement, le procédé peut également comprendre une étape de sélection des plantes ou structures contenant l’acide nucléique, la cassette ou le vecteur. Cette sélection peut être réalisée par toute méthode connue de l’homme du métier, notamment par des méthodes d’amplification de l’ADN.

Tous les modes de réalisation concernant les autres aspects de l’invention sont également envisagés dans cet aspect.

La présente invention concerne également une méthode de production d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) comprenant la transformation ou transfection d’une cellule par un acide nucléique codant ledit peptide ou une cassette ou vecteur d’expression selon l’invention ; la mise en culture de la cellule transfectée/transformée ; et la récolte du peptide produit par ladite cellule. Les méthodes de production de peptides recombinants sont bien connues de l’homme du métier.

La cellule utilisée pour la production du peptide peut être une cellule procaryote ou eucaryote.

Selon un mode de réalisation particulier, la cellule est une bactérie, en particulier E. coli. De préférence, la bactérie utilisée est capable d’effectuer le repliement oxydatif du peptide, telle que par exemple une souche d’E. coli SHuffle (Lobstein et al. Microbial Cell Factories. 20l2;l l :56).

La présente invention concerne également une méthode de production d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) comprenant l’obtention d’une plante transgénique selon l’invention et exprimant le peptide, la culture de cette plante et la récolte du peptide produit par ladite plante.

De préférence, la plante transgénique est une Nicotianée, par exemple Nicotiana sylvestris ou Nicotiana tabacum.

Les méthodes de production de peptides recombinants à partir de plantes transgéniques sont bien connues de l’homme du métier.

La présente invention concerne également une méthode de production d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) comprenant l’insertion d’un acide nucléique codant ledit peptide, d’une cassette ou d’un vecteur d’expression selon l’invention dans un système d’expression in vitro également appelé acellulaire et la récolte du peptide produit par ledit système. De nombreux systèmes d’expression in vitro ou acellulaires sont disponibles dans le commerce et G utilisation de ces systèmes est bien connue de l’homme du métier.

La présente invention concerne également une composition phytosanitaire comprenant au moins un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), une cellule hôte ou un organisme transgénique selon l’invention et/ou un virus selon l’invention, et un excipient acceptable sur le plan phytosanitaire. L’invention concerne en outre G utilisation d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I), une cellule hôte ou un organisme transgénique selon l’invention et/ou un virus selon l’invention, pour la préparation d’une composition phytosanitaire.

La composition phytosanitaire peut être de tout type. Il peut s’agir d’une solution aqueuse ou hydro-alcoolique, d’une pâte, d’un gel en particulier un gel aqueux (ou hydrogel), d’une glue, d’une mousse, d’une émulsion eau-dans huile ou huile-dans-l’eau, d’une émulsion multiple, d’une micro- ou nano-émulsion, d’une solution micellaire, d’une suspension, ou d’un colloïde. La composition phytosanitaire peut aussi être solide, par exemple sous forme d’une poudre ou de granulés directement applicables par « poudrage » ou devant être dissous ou dispersés dans un solvant adapté avant application.

On entend par « excipient acceptable sur le plan phytosanitaire » un excipient qui ne présente pas de toxicité notable, à la dose où il est utilisé, vis-à-vis de la plante, de l’environnement et de l’homme. Les excipients utilisables dans les compositions phytosanitaires sont bien connus de l’homme du métier et regroupent, entre autres, les diluants et les charges, les agents mouillants, les tensio-actifs, par exemple les tensio- actifs ioniques, amphotères ou non-ioniques, les agents dispersants, les agents épaississants, les agents gélifiants, des agents permettant une libération contrôlée de l’actifs, par exemple des agents d’encapsulation ou micellaires tels que les phospholipides, les adjuvants thixotropes, les colorants, les agents antioxydants, les agents conservateurs, les agents stabilisants, des agents filmogènes, les véhicules en particulier les solvants comme l’eau et les alcools inférieurs, les huiles d’origine minérale, végétale ou animale, les résines, les cires, le colophane, les latex, les gommes telles que la gomme arabique, les agents anti-mousses, et les agents adhésifs.

La composition phytosanitaire selon l’invention peut comprendre, en outre, un ou plusieurs agents phytosanitaires additionnels. Le ou les agents phytosanitaires additionnels peuvent être choisis par exemple parmi les insecticides, les bactéricides, les fongiques, les virucides, les régulateurs de croissance ou les stimulateurs des défenses naturelles de la plante tels que les éliciteurs.

La forme galénique et les excipients de la composition phytosanitaire selon la présente invention peuvent être aisément choisis par l’homme du métier et dépendent essentiellement de l’infestation à traiter et/ou du mode d’administration.

La présente invention concerne également l’utilisation d’un peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) ou d’une composition phytosanitaire selon l’invention pour traiter ou prévenir l’infestation d’une plante et/ou d’un produit de culture par des organismes nuisibles, de préférence par des insectes, le procédé comprenant la mise en contact du peptide tel que décrit ci-dessus et de formule (I) avec ladite plante, produit de culture ou organisme nuisible

Toutes les références citées dans cette description sont incorporées par référence dans la présente demande. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.

EXEMPLES

Matériel et méthodes Synthèse et purification du peptide BCR4

Dix milligrammes de peptide brut réduit BCR4 (DFDPTEFKGPFPTIEICSKY C A VV CNYTSRPC Y C VEAAKERDQWFPY C YD ;

SEQ ID NO : 1) non fonctionnel ont été obtenus auprès de la société Proteogenix (Strasbourg, France). Le repliement oxydatif du peptide in vitro a été réalisé en suivant le protocole précédemment décrit (cf. Da Silva et al, 2009). Brièvement, le repliement oxydatif a été effectué en incubant le peptide réduit (10 mg) dans un tampon désoxygéné contenant 0,1 mM de glutathion oxydé (10 équiv.), 1 mM de glutathion (100 équiv.), 1 mM d'EDTA, TRIS 100 mM, pH 8,5, à 20°C, pendant 48 h sous atmosphère d'argon (concentration finale du peptide 30 mM). La réaction a été acidifiée en ajoutant du TFA (200 mΐ) et le mélange brut a été purifié par HPLC semi-préparative pour donner du BCR4 pur (2,2 mg soit 22% de rendement). La pureté du peptide BCR4 a été évaluée par RP- HPLC, sa masse a été obtenue par spectrométrie de masse haute résolution (ESI-HRMS). La concentration du peptide a été déterminée en mesurant sa surface de pic RP-HPLC à 214 nm. Tests insecticides

Les expérimentations ont été réalisées sur des pucerons provenant du clone parthénogénétique du puceron du pois LL01 qui contient uniquement le symbiote primaire B. aphidicola. Les pucerons sont élevés et maintenus sur des plants de fèves (Vicia faba L., variété Aquadulce) sous conditions climatiques contrôlées (température de 21 +/- l°C, humidité relative de 70%, photopériode de l6h), afin d’obtenir des pucerons se reproduisant uniquement par parthénogénèse vivipare. Pour réduire la variabilité liée à T utilisation d’individus à différents stades de développement, les pucerons sont issus d’un élevage synchronisé. Pour cela, des pucerons adultes et prêts à pondre sont déposés sur des plants de fèves. Après 24 heures, les jeunes larves sont récupérées et déposées sur du milieu artificiel contenant ou non le peptide d’intérêt. La manipulation s’effectue avec un témoin négatif composé seulement de milieu artificiel et un témoin positif représentant une des concentrations de la gamme étudiée avec des pucerons. La gamme étudiée comprend différents milieux contenant le peptide BCR4 étudié à plusieurs concentrations variant de 5 à 80 mM. Les expériences ont été réalisées sur trente larves par condition répartis en trois groupes distincts de dix individus.

Analyses statistiques

Toutes les données sur la mortalité des pucerons ont été analysées statistiquement par un traitement de survie standard. Toutes les concentrations de BCR4 ont été analysées séparément dans une analyse de survie paramétrique avec un ajustement logarithmique normal.

Analyses de séquences

Les séquences orthologues des protéines BCR ont été récupérées en utilisant une combinaison de TBLASTN et BLASTP (Johnson et al, 2008) contre les génomes des pucerons disponibles dans la base de données AphidBase (Legeai et al, 2010) et les bases de données entières de protéines, nucléotides et EST non redondantes du NCBI. Les protéines BCR ont été soumises à de multiples alignements de séquences en utilisant le programme MUSCLE (Edgar et al, 2004).

Résultats

Synthèse et purification du peptide BCR4

2,2 mg de peptide pur de BCR4 ont été obtenu par une synthèse chimique en phase solide suivie d’un repliement oxydatif permettant de mettre en place les ponts disulfures C1-C5, C2-C4 et C3-C6 (Figure 1).

La pureté du peptide BCR4 a été évaluée par RP-HPLC et sa masse a été obtenue par spectrométrie de masse haute résolution (ESI-HRMS) : la masse théorique calculée de BCR4 est de 5891.5400 g.mol-l, masse expérimentale obtenue est de 5891.5437 g.mol-l (Figure 2A). La concentration du peptide a été déterminée en mesurant sa surface de pic RP-HPLC à 214 nm (Figure 2B).

Tests insecticides

La mesure de l’activité insecticide de BCR4 a été réalisée en incorporant des doses croissantes de peptides dans le milieu nutritif des pucerons et le suivi de leur mortalité a été effectué sur 7 jours. Un effet très significatif de dose réponse sur le temps de survie des pucerons a été observée (TL50 : Temps létal où 50 % des individus meurent) (Tableau 1). Tableau 1 : Toxicité du peptide BCR4 sur le puceron du pois Acyrthosiphon visum. TL50 en jours, avec des intervalles de confiance, obtenus par analyse de survie avec un ajustement logarithmique normal.

Concentration (mM)

TL50 1.16 1.76 1 .94: 3.24 3.48 1 J .3 > 20

(joui·*) (0.98 - 1.37) [1 27 - 2 42] [1 .47 - 2.57] [2 22 - 4.72] [2.28 - 5.31 (4 16 - 30.81

L’effet dose réponse commence très tôt, dès le premier jour après ingestion, avec une mortalité élevée. Cette plage d'activité (5-80 mM) est semblable à celle du peptide AG41, un peptide entomotoxique prometteur d’origine végétale (cf. WO2015087238).

Analyses de séquences

Grâce à une recherche exhaustive des bases de données nucléotidiques et protéiques du NCBI couplée à une inspection spécifique des espèces de pucerons séquencées disponibles dans AphidBase (Legeai et al, 2010), les inventeurs ont récupéré un total de 32 séquences de BCR. Toutes ces séquences ont été identifiées chez des espèces de pucerons. Les 32 séquences de BCR ont été utilisées pour l'alignement des séquences d'acides aminés et, d’après les motifs consensus obtenus à la suite de ces alignements, il apparaît que les séquences BCR peuvent être regroupées en quatre sous- familles comprenant les séquences (i) BCR1-2-4-5, (ii) BCR3, (iii) BCR6 et (iv) BCR8 (Tableau 2). Tableau 2 : Caractéristiques des quatre sous-familles de BCR.

Orthoiogucs identifies che*

Nombre tk*

Motif consensus“ les pucerons dont le génome résidus cystéine

est séi uence

BCR1-2-4-5 6 C (3) C (3-5) C (4-6) C ( I ) C (13) C Apis (4), Dnox ( 1 )

Agly (1 ), Apis ( 1 ), Dnox (2),

BCR3 6 C (3) C (6) C (21 -25) C (6) C (4) C

Mcer ( I ). Mper ( 1 ), Rpad ( ! ) Apis ( 1), Dnox (2 ), Mcer (1 ),

BCR6 8 C ( 15) C (3) C (3) C (10) C (10) C ( l) CC

Mper (1 )

Agly ( 1 ), Apis ( 1 ), Dnox ( 1 ),

BCR8 6 C (3-4) C (10) C ( 1 7) C ( f ) CC

Mcer (1), Mper ( 1). Rp3d il) a : Le nombre de résidus entre les cystéines sont notés entre parenthèses

b : Abréviations: Agly, Aphis glycines, Apis, Acyrthosiphon pisum, Dnox, Diuraphis noxia, Mcer, Myzus cerasi, Mper, Myzus persicae, Rpad, Rhopalosiphum padi.

Les peptides BCR1 (SEQ ID NO : 2), BCR2 (SEQ ID NO : 3), BCR4 (SEQ ID NO : 1) et BCR5 (SEQ ID NO : 4) à’ Acyrthosiphon pisum, ainsi que deux peptides <X Acyrtho siphon kondoi (SEQ ID NO : 6) et de Diuraphis noxia (SEQ ID NO : 5), appartiennent à la sous-famille BCR1-2-4-5 qui présente un motif consensus strictement conservé (Figure 3).

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Da Silva P et al, 2009. Biopolymers 92(5): 436-444.

Edgar R C et al, 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32, 1792-1797.

Johnson M et al, 2008. NCBI BLAST: a better web interface. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Res. 2008 Jul l ;36(Web Server issue):W5-9.

Legeai F et al, 2010. AphidBase: a centralized bioinformatic resource for annotation of the pea aphid genome. Insect Mol. Biol. 19, 5-12.

Shigenobu and Stern. Proc. R. Soc. B. 2013 280, 20121952.