技术领域

本发明关于苯酞化合物（phthalide) 的应用， 尤其关于使用苯酞化合物于 治疗及 /或延缓浦肯野细胞 （Purknye cells) 退化的应用， 特别是关于治疗脊 髓性小脑萎缩症、 阿兹海默症、 帕金森氏症的至少一者及 /或延缓其发病的 应用。

背景技术

神经元（neuron)也可称为神经细胞， 是生物体神经系统的结构与功能单 位之一， 可借助化学信号及电信号与其它细胞进行信息 传递， 具有各种不同 的形状和尺寸， 直径为约 4微米至约 100微米， 结构上大致可分为细胞本体、 树突 （dendrite) 及轴突 （axon) 三部分， 其中树突可将信息带入细胞本体， 而轴突则可将信息自细胞本体传出。

浦肯野细胞为存在小脑中负责传送神经冲动功 能的神经元， 属于 γ-氨基 丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA)神经元的一种， 其形态比普通神经细胞大 且具有较多的树突， 主要功能为神经信息传递及调控纳-钾离子通� �。 浦肯野 细胞与生物体的运动协调功能有关， 已知浦肯野细胞的退化 （例如， 浦肯野 细胞死亡、 细胞数量减少或损伤、 或因细胞树突数量减少而使其信息传递功 能下降） 会影响其信息传递的功能， 故与阿兹海默症、 帕金森氏症、 及脊髓 性小脑萎缩症等神经疾病有关，且为该等神经 疾病的进程指标（参见 Schilling, K.等人， 1991， Electrical activity in cerebellar cultures determines Purkinje cell dendritic growth patterns. Neuron 7， 891-902， 该文献全文并于此处以供参考）。 因此， 若能抑制浦肯野细胞退化， 则可提供治疗如阿兹海默症、 帕金森氏症、 及脊髓性小脑萎缩症等神经性疾病的功效。

脊髓性小脑萎缩症 （spinocerebellar atrophy) 是最常见的共济失调疾病之 一， 其主要症状为小脑共济失调 （cerebellar ataxia) , 从而导致协调运动障碍、 肌肉张力减低、 眼球运动障碍、 及言语障碍等。 脊髓性小脑萎缩症的致病原 因主要为遗传或基因突变， 使患者体内的特定染色体位置上的 Atxm-3 (ATXN3 )基因的外显子出现异常的 CAG序列重复， 使所表现的蛋白质中产 生长链的麸胺酸 （glutamine), 导致细胞凋亡。 ATXN3 为一种去泛素蛋白酶 (deubiquitinating enzyme, DUB ), 在泛素-蛋白酶路径中， ATXN3具有防止 异常蛋白聚集的功能。 根据 CAG序列重复在患者染色体中所出现的位置， 脊 髓性小脑萎缩症主要可分为第一型（ SCA1 )、第二型（ SCA2 )、第三型（ SCA3 )、 第六型（SCA6 )、 第七型（SCA7 )和 DRPLA型等亚型。 其中， SCA3又称为 马卡多 -约瑟夫氏病（Machado- Joseph disease, MJD), 为脊髓性小脑萎缩症中 最常见的亚型， 其特征为染色体 14q32.1位置上的外显子 10 (exonlO) 发生 了异常的 CAG序列重复。

目前临床上对于浦肯野细胞退化所引起的相关 疾病仍无有效的治疗方 法， 至多仅能通过物理治疗及呼吸系统照护以减少 并发症的发生机率， 减缓 病情恶化的速度。 因此， 仍极需可有效治疗及 /或延缓浦肯野细胞退化相关 的神经性疾病的药物。

本发明人研究后发现， 苯酞化合物（phthalide)可治疗及 /或延缓浦肯野 细胞退化， 故可用于治疗脊髓性小脑萎缩症、 阿兹海默症、 帕金森氏症的至 少一者及 /或延缓其发病。

发明内容

本发明的一个目的， 在于提供一种使用一苯酞化合物于制备药剂的 用途， 其中该药剂用于治疗及 /或延缓浦肯野细胞退化， 且其中该苯酞化合物是选 自以下群组： 亚丁基苯酞（n-butylidenephthalide)、 亚丁基苯酞的代谢前驱物、 亚丁基苯酞的代谢前驱物的医药可接受盐、 亚丁基苯酞的代谢前驱物的医药 可接受酯、 以及前述的组合。

本发明的又一目的， 在于提供一种于一个体中治疗及 /或延缓浦肯野细 胞退化的方法， 包含投予该个体有效量的一苯酞化合物， 其中该苯酞化合物 选自以下群组： 亚丁基苯酞、 亚丁基苯酞的代谢前驱物、 亚丁基苯酞的代谢 前驱物的医药可接受盐、 亚丁基苯酞的代谢前驱物的医药可接受酯、 以及前 述的组合。

本发明的详细技术内容及部分实施态样， 将描述于以下内容中， 以供本 发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的 特征。

附图说明

图 1所示为经 pEGFP-Cl、pEGFP-Cl-Ataxin3Q28、pEGFP-Cl-Ataxin3Q84 转染的细胞经不同条件处理后的荧光显微镜照 片；

图 2所示为经不同条件处理后斑马鱼的存活率的� �条图；

图 3所示为经不同条件处理后斑马鱼的行为测试� �果的长条图； 图 4所示为经不同条件处理后斑马鱼的神经元的� �轭焦显微镜照片； 图 5A、 图 5B、 图 5C为经不同条件处理后的 SCA3小鼠进行 Local motor 测试的结果的曲线图；

图 6为经不同条件处理后的 SCA3小鼠进行转棒测试的结果的曲线图； 图 7为经不同条件处理后的 SCA3小鼠的小脑切片的免疫化学组织染色 图；

图 8为经不同条件处理后的 SCA3小鼠的小脑组织的钙结合蛋白的西方 墨点图；

图 9为经不同条件处理后的 SCA3小鼠的小脑组织的经泛素化蛋白的西 方墨点图。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施态样； 但是， 在不背离本发明精 神下， 本发明尚可以多种不同形式的态样来实践， 不应将本发明保护范围解 释为限于说明书所陈述者。 此外， 除非文中有另外说明， 于本申请文件中所 使用的 「一」、 「该」 及类似用语应理解为包含单数及复数形式； 所谓 「有效 量」 或 「治疗有效量」， 是指投予至个体时， 可有效至少部分改善怀疑个体的 病情的化合物数量； 所谓 「个体」 是指哺乳动物， 哺乳动物可为人类或非人 动物； 所谓 「治疗」 是包括预防特定疾病或症状、 减轻特定的疾病或症状、 及 /或防止或消除该病症； 所谓 「延缓浦肯野细胞退化」 乙语是指延缓浦肯 野细胞的细胞死亡、 损伤、 及 /或信息传递功能下降； 单位「毫克 /公斤体重」 是指每公斤体重个体所须的投药量。

本发明人发现， 特定苯酞化合物（phthalide)可治疗及 /或延缓浦肯野细 胞退化。 因此， 本发明提供一种使用一苯酞化合物于制备用以 治疗及 /或延 缓浦肯野细胞退化的药剂的用途， 其中该苯酞化合物选自以下群组： 亚丁基 苯酞、 亚丁基苯酞的代谢前驱物、 亚丁基苯酞的代谢前驱物的医药可接受盐、 亚丁基苯酞的代谢前驱物的医药可接受酯、 以及前述的组合。

于根据本发明一具体实施态样中 ， 是使用亚丁基苯酞

(butylidenephthalide; BP ) 以制备用以治疗及 /或延缓浦肯野细胞退化的药 剂。 亚丁基苯酞即下式 （I) 化合物， 在自然状态下同时包含 （Z) -亚丁基苯 酞 （（Z)-butylidenephthalide， 顺式亚丁基苯酞） 及 （E ) -亚丁基苯酞

( (E)-butylidenephthalide, 反式亚丁基苯酞） 二种异构物形式。 较佳地， 是于 本发明使用 Z-亚丁基苯酞含量为 90%或更高的亚丁基苯酞。

于本文中， 所谓 「亚丁基苯酞的代谢前驱物」 是指一经生物体代谢后会 产生亚丁基苯酞的化合物。 举例言之， 但不以此为限， 已知具如下式 (II)结构 的 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞 （3-butylidene-4,5-dihydrophthalide)， 又称 "藁本内 酯"（ligustilide ) , 其于生物体代谢后会产生亚丁基苯酞， 属亚丁基苯酞的代 谢前驱物。

所谓 "医药可接受的盐"， 是包括所述含有酸官能基的苯酞化合物与有机 或无机碱所形成的医药可接受的盐。 其中， 与无机碱所形成的盐的例子包括， 但不限于， 碱金属盐 （如钠盐、 钾盐）、 碱土金属盐 （如钙盐、 镁盐）、 过渡 金属盐 （如铁盐、 锌盐、 铜盐、 锰盐及铝盐）、 以及铵盐； 与有机碱所产生的 盐的例子包括与甲基胺、 二甲基胺、 三甲基胺、 乙基胺、 二乙基胺、 三乙基 胺、 异丙基胺、 三丙基胺、 三丁基胺、 乙醇胺、 二乙醇胺、 2-二甲基胺乙醇、 2-二乙基胺乙醇、 二环己基胺、 离胺酸盐、 精胺酸盐、 组胺酸盐、 咖啡碱、 海 巴胺 （hydrab _a mme)、 胆碱、 甜菜碱、 乙烯二胺、 葡萄糖胺、 甲基葡萄糖胺、 可可碱、 嘌呤、 哌啶、 N-乙基哌啶、 四甲基铵化合物、 四乙基铵化合物、 吡 啶、 Ν,Ν-二甲基苯胺、 Ν-甲基哌啶、 Ν-甲基吗啉、 二环己基胺、 二苯甲基胺、 Ν,Ν-二苯甲基苯乙基胺、 1-伊芬胺（l-ephenamine)、 Ν,Ν-二苯甲基乙烯二胺、 聚胺树脂及其类似物等所形成的盐。

所谓 "医药可接受的酯"， 是指包括所述含有如 -ΟΗ官能基的苯酞化合物 与酸反应所得的酯。 该酸可为无机酸例如盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 磺胺酸、 硝 酸、 及磷酸的无机酸， 和有机酸例如醋酸、 三氟醋酸、 己二酸、 抗坏血酸、 天门冬胺酸、 苯磺酸、 苯甲酸、 丁酸、 樟脑酸 （camphoric acid) , 樟脑磺酸 ( camphorsulfonic acid), 肉桂酸、 柠檬酸、 二葡萄糖酸、 乙垸磺酸、 麸胺酸、 甘醇酸、 甘油磷酸、 半硫酸 (hemisulfic acid), 己酸 (hexanoic acid), 甲酸、 2-羟基乙磺酸 （isethionic acid), 乳酸、 羟基马来酸、 苹果酸、 丙二酸、 扁桃 酸、 三甲基苯磺酸 （ mesitylenesulfonic acid )、 甲磺酸、 萘磺酸 (naphthalenesulfonic acid), 烟碱酸、 2-萘磺酸、 草酸、 扑酸 (pamoic acid), 果胶酯酸、 苯基醋酸、 3-苯丙酸、 特戊酸、 丙酸、 丙酮酸、 水杨酸、 硬脂酸、 琥珀酸、 磺胺酸、 酒石酸、 对 -甲苯磺酸、 十一垸酸等。 可通过任何合合宜方式提供用于本发明的苯酞 化合物。 举例言之， 但不 以此为限， 可自当归、 川芎、 藁本萃取纯化而提供 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞。 此外， 可自例如当归经萃取纯化而提供或自商业上购 买而获得亚丁基苯酞。 另夕卜，可先将自市面上购得（例如购自 Alfa Aesar公司 )的亚丁基苯酞（为（Z) -及 （E) -亚丁基苯酞的混合物） 以适量的硅胶包埋 （重量比为亚丁基苯酞： 硅胶 =1:3 ) ， 随后进行硅胶管柱层析， 以正己垸作为移动相冲提， 依不同时间 点收集冲提出的 （Z) -亚丁基苯酞及（E) -亚丁基苯酞， 分别提供（Z) -亚丁 基苯酞及 （E) -亚丁基苯酞。

如上所述， 于本发明中， 所提供的药剂是具有治疗及 /或延缓浦肯野细 胞退化的功效， 尤其可延缓或避免浦肯野细胞死亡， 且可增加浦肯野细胞中 蛋白质的泛素化作用， 故可用于治疗脊髓性小脑萎缩症、 阿兹海默症、 及帕 金森氏症的至少一者及 /或延缓其发病。 于本发明的部分实施态样中， 该药 剂是用于治疗第三型脊髓性小脑萎缩症 （SCA3 ) 及 /或延缓其发病。 如本说 明书实施例所示， 本发明所提供的药剂可有效延缓或避免患有第 三型脊髓性 小脑萎缩症的患者小脑中的浦肯野细胞死亡， 且可有效改善患者的运动行为。

可以任何合宜的用量施用本发明所提供的药剂 ， 端视投予个体的需求而 异。 举例言之， 当使用于人体以治疗及 /或延缓浦肯野细胞退化时， 药剂的 用量，以亚丁基苯酞计，为每天约 30毫克 /公斤体重至约 2,000毫克 /公斤体重， 较佳为每天约 100毫克 /公斤体重至约 1,000毫克 /公斤体重。 但， 对于急性患 者而言， 其用量可视实际需要而酌增， 例如增加至数倍或数十倍。 此外， 所 投予的药剂的总量可视需要于单次投药程序中 全部给予， 或于多次投药程序 中分别给药。

于本发明中， 所提供的药剂可呈任何形式， 并以任何合宜的方式施用。 举例言之， 但不以此为限， 可经由口服、 鼻腔给药、 脑内注射、 静脉注射、 腹腔注射、 皮下注射、 及 /或皮下或组织间缓释剂型等方式施用至一需� �的 个体。 其中， 由于口服投药剂型便于病人按时自行服用， 故于本发明的一较 佳实施态样中， 是以口服剂型提供该药剂， 例如： 锭剂、 胶囊剂、 颗粒剂、 散剂、 流浸膏剂、 溶液剂、 糖浆剂、 悬液剂、 乳剂、 及酊剂等。 视使用形式 及用途而定， 该药剂可更包含一医药可接受的载剂。 于本发明的部分实施态 样中， 是以橄榄油作为载剂。

以制备适于口服投药的剂型为例， 该药剂中可含有任何不会不利影响所 含活性成分 （即， 亚丁基苯酞、 其代谢前驱物、 及 /或前述之医药可接受盐 及 /或酯） 的活性的医药可接受载剂， 例如： 油性溶剂、 稀释剂、 安定剂、 吸收延迟剂、 崩散剂、 乳化剂、 抗氧化剂、 粘合剂、 润滑剂、 吸湿剂等。 可 利用任何合宜的方法， 将该组合物制成适于口服投药的剂型。

至于制备适于静脉注射或皮下注射的剂型， 该药剂可例如包含一或多种 等张溶液、 盐类缓冲液 （如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液）、 助溶剂

( solubilizer), 乳化剂、 以及其他载剂等成分， 以制成一静脉输注液、 乳剂静 脉输注液、 干粉注射剂、 悬液注射剂、 或干粉悬液注射剂等。

除了上述佐剂外， 该药剂可视需要另含有调味剂、 调色剂、 着色剂等添 加剂， 以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受； 另可添加合宜用量的保 存剂、 防腐剂、 抗菌剂、 抗真菌剂等， 以改善药剂的储存性。 此外， 视需要 地， 可于本发明所提供的药剂中并含一或多种其他 活性成分， 例如抗氧化剂 (如维他命 E)、 神经滋养因子 （neurotrophic factor) 等， 以进一歩加强本发 明药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与 调配度， 只要该其他活性成分 对药剂内所含的苯酞化合物的所欲功效没有不 利的影响即可。

此外， 可以一日一次、 一日多次、 或数日一次等不同投药频率施用本发 明所提供的药剂， 端视投予个体的需求而异。

本发明亦提供一种于一个体中治疗及 /或延缓小脑浦肯野细胞退化的方 法， 其是包含对该个体施用一有效量的一苯酞化合 物， 其中该苯酞化合物选 自以下群组： 亚丁基苯酞、 亚丁基苯酞的代谢前驱物、 亚丁基苯酞的代谢前 驱物的医药可接受盐、 亚丁基苯酞的代谢前驱物的医药可接受酯、 以及前述 的组合。 其中， 有关该活性成分的选用以及其性质、 施用型态与剂量， 均如 上述的说明。

在此下列实施例进一歩例示说明本发明。 其中该等实施例仅提供作为说 明， 而非用以限制本发明的保护范围。

[实施例]

[实施例 1]体外细胞试验

细胞转染

本实验测试亚丁基苯酞以及 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞对 SCA3蛋白质表现 程度的影响。 首先， 将含有绿色荧光蛋白的 pEGFP-Cl-Ataxm3Q84 (即， 具 异常 CAG重复数目 （84Q) 的 Ataxin基因的质体） 或 pEGFP-Cl-Ataxin3Q28 质体（ ，具正常 CAG重复数目（ 28Q )的 Ataxin基因的质体） （购自 Addgene 公司， 美国）， 通过转染试剂 （Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent, Invitrogen™)转染至人类胚胎肾脏细胞（Human embryonic kidney, HEK) 293T ( (Bioresource Collection and Research Center, 台湾） 或神经干细胞 (Neural stem cell, NSC) 中。 将细胞培养于含有 10%胎牛血清（Gibco) 的 DMEM培 养基 (Dulbecco's modified Eagle's medium , Thermo ) , 于 5% C0 ₂ 的 37°C培 养箱中。 之后， 以浓度 5微克 /毫升的亚丁基苯酞 （A10353 , 购自 AlfaAesar, 美国； 纯度 95%) 或 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞 （5393-015M1 , 购自 pharmaron, 中国） 处理细胞 24小时后， 使用荧光显微镜观察各组细胞中 GFP-ATXN3蛋 白质聚集的情形。 实验以野生型 （wild type) 细胞及经绿色荧光蛋白 （GFP) 转染的细胞作为对照组。 实验结果显示于图 1。

如图 1所示（右下角的比例尺为 100微米），未经 GFP转染的细胞不会发 出荧光， 而经质体转染的细胞则可明显观察到荧光表现 ， 显示实验所使用的 细胞可成功表现 GFP及 ATXN3。此外， 经亚丁基苯酞或 3-亚丁基 -4,5-二氢苯 酞处理的细胞的荧光表现 Ataxm3Q84的程度明显降低， 相较于未经药物处理 的组别，显示亚丁基苯酞及 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞可减少 ATXN3蛋白质的数 [实施例 2]斑马鱼活体内试验

( 1 ) 测试安全剂量

本实验使用斑马鱼做为动物模式， 实验组使用的斑马鱼品系为 Tg(HuC:GFP), 此品系特征为初级感觉神经元 （Rohon-Beard cells) 会产生荧 光， 故方便进行观察， 控制组则使用野生型品系， 全部鱼种皆由 TZCAS (中 研院台湾斑马鱼中心 （Taiwan Zebrafish Core Facility at Academia Sinica), 台 湾）及 TZCF (台湾斑马鱼中心（Taiwan Zebrafish Core Facility), 台湾）提供。 首先， 测试亚丁基苯酞对于斑马鱼的毒性， 注射不同剂量的亚丁基苯酞至斑 马鱼， 于 28.5°C进行培养， 并于 48小时后观察其存活率。

结果如图 2所示，野生型斑马鱼的存活率为 100%,而经 500毫克 /公斤亚 丁基苯酞注射的斑马鱼的存活率约 50%， 经 250毫克 /公斤及 50毫克 /公斤亚 丁基苯酞注射的斑马鱼的存活率都大于 75%,但在经 ATXN3 MO或 H ₂ 0注射 后， 斑马鱼的存活率有些微下降， 推测可能是因注射时感染或鱼卵品质不佳。 由此实验结果可知， 浓度 250毫克 /公斤以下的亚丁基苯酞对斑马鱼为安全剂

(2 ) 斑马鱼行为测试

本实验使用 ATXN3基因的吗啉基 DNA片段 （morpholinos, Gene Tools, 美国； 以下称为 ATXN3 MO) 以消除斑马鱼的内源性 ATXN3的表现， 以引 起神经损伤效果。 MO为 DNA结构进行修饰而成， 具有阻断 mRNA转译蛋 白功能， 可使生物不表现特定目标蛋白。 实验所用的 ATXN3 MO 的序列为 5'-TCCTCCTCGTCCAGCTGCTGTGCTA-3' ( SEQ ID NO.： 1 )， 所使用的标准 品控制组的序列为 5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3' ( SEQ ID NO.: 2 ) (以下称为 Ct MO)。 注射前， 将 MO溶解于 ddH ₂ 0， 储存于 -20°C备用。 在斑马鱼的鱼卵出生约 1小时内，进行微注射，并于注射完 24至 48小时（hour post fertilization, hpf)后， 以 300奈莫耳浓度 /微升的 ATXN3 MO、 或 ATXN3 MO合并 250毫克 /公斤亚丁基苯酞、 125毫克 /公斤亚丁基苯酞、 或 62.5毫克 /公斤亚丁基苯酞微注射处理鱼卵， 48小时后， 以滴管尖（tip) 剌激鱼尾， 并 测量剌激致鱼尾移动所需的次数。

实验结果如图 3所示，相较于野生型（简称 Wt)、Ct MO、及控制组 (Mock), 注射 ATXN3 MO的组别的斑马鱼的剌激鱼尾致移动的次数明� ��较高， 而在经 亚丁基苯酞注射后则有回复的现象， 由此可知亚丁基苯酞具有恢复疾病斑马 鱼的行为能力的效果， 且其中又以浓度 250毫克 /公斤的效果最明显。

(3 ) 共轭焦显微镜试验

以 300奈莫耳浓度 /微升 ATXN3 MO、250毫克 /公斤亚丁基苯酞、或 ATXN3 MO合并 250毫克 /公斤亚丁基苯酞、 125毫克 /公斤亚丁基苯酞、 或 62.5毫克 /公斤亚丁基苯酞微注射处理鱼卵， 48小时后， 将鱼体封入玻片中， 以共轭焦 显微镜进行活体荧光运动神经元拍摄。

实验结果显示， 野生型的斑马鱼中没有特殊的神经损伤， 且只注射亚丁 基苯酞及 Ct MO也未出现明显的神经损伤； 但在注射 Ataxin-3 MO后， 会导 致斑马鱼的神经信号明显减弱， 由此证明 Ataxin-3 MO具有神经损伤效果且 具有专一性。此外，如图 4所示，以 250毫克 /公斤亚丁基苯酞治疗 ATXN3 MO 斑马鱼， 具有维持运动神经元数量的效果。 其中， 图 4所示数据为存活数 /总 只数 *100%所得。

[实施例 3] 小鼠活体内试验

本实验使用 MJD84.2基因转殖小鼠（ gp， 经人类 84 CAG重复 ATXN3基 因转殖的小鼠， 简称 SCA3小鼠） 进行实验。 MJD84.2基因转殖小鼠为研究 脊髓性小脑萎缩症的动物模型， 这类小鼠会在出生后 4周内出现歩态异常的 情况， 之后会开始陆续出现轻度震颤、 中度活动能力减退、 前 /后肢不正常收 缩 （约 24周龄）、 及有无力趴地的情况。

( 1 ) MJD84.2基因转殖小鼠的治疗

将二周龄的 MJD84.2基因转殖小鼠随机分为 5个组别， 每组 6只， 分别 以如下列条件进行处理 2周： （1 ) 未处理； （2 ) 喂食橄榄油 （即， 仅喂食佐 剂）； （3 )喂食亚丁基苯酞 100毫克 /公斤 /每天分两次喂食（bid); (4 )喂食亚 丁基苯酞 500毫克 /公斤 /每天分两次喂食 （bid); ( 5 ) 喂食 3-亚丁基 -4,5-二氢 苯酞 100毫克 /公斤 /每天分两次喂食（bid); 另以野生型小鼠（WT )作为控制 组。 2周后， 开始进行， Local motor及转棒测试。

(2 ) Local motor测试

进行 Local motor测试， 以测试小鼠的运动能力。

使 10周龄的小鼠于转棒 （rotarod) 上进行了测试， 每 3周测试一次。 接 着， 将小鼠放置在一个透明的压克力盒 2 小时， 使它自由移动， 利用机器 VersaMax 420 ( Accuscanlnstmmentslnc , USA)进行 1小时的行为测试后， 进 行数据分析统计。

实验结果如图 5A、 5B、 及 5C所示， 相较于未处理及经橄榄油喂食组， 经亚丁基苯酞或 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞喂食组的小鼠的总移动距离 （图 5A)、 移动次数 （图 5B )、 及移动时间 （图 5C) 都较长， 显示其运动能力较佳。 本 实验结果显示亚丁基苯酞及 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞可改善 MJD84.2基因转殖 小鼠的运动行为。

(3 ) 转棒 （rotarod) 测试

进行转棒测试， 以测试小鼠的平衡能力及抓握能力。 测试之前， 先使小 鼠练习二星期后，再进行第一次行为测试，此 实验为利用 IITC 转棒（IITC Life Science Inc, 美国） 进行测试。 使 10周龄的小鼠于转棒 （rotarod) 上进行了 测试， 每 3周测试一次， 条件为在 300秒内从 4至 40转进行线性加速， 记录 小鼠自转棒掉落 （latency to fall) 的时间 （秒）。 每次试验持续最多 5分钟， 在每次测验之间使小鼠至少休息 15分钟， 以避免疲劳。 转棒试验后， 记录小 鼠的体重。 小鼠去每天进行 3 次试验， 连续四天， 以每天平均自转棒掉落下 降的时间进行统计分析。

实验结果如图 6所示， 相较于未处理及经橄榄油喂食组， 在经亚丁基苯 酞或 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞喂食的组别中， 小鼠的平衡能力及抓握能力较佳， 显示亚丁基苯酞及 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞可改善 MJD84.2基因转殖小鼠的运 动行为。

[实施例 4]组织化学染色试验

将八周龄的 MJD84.2基因转殖小鼠（即， 具有经修饰的 ATXN3 gene)随 机分为 5个组别， 每组 6只， 并以下列条件进行处理： （1 ) 未处理； （2 ) 喂 食橄榄油； （3 ) 喂食亚丁基苯酞 100毫克 /公斤 /每天分两次喂食 （bid); (4 ) 喂食亚丁基苯酞 500毫克 /公斤 /每天分两次喂食 (bid); ( 5 )喂食 3-亚丁基 -4,5- 二氢苯酞 100毫克 /公斤 /每天分两次喂食 （bid)。 之后， 分别在第 20周及 24 周时牺牲小鼠并进行小脑切片染色及组织蛋白 萃取（参见实施例 5 )， 以 3.7% 福尔马林隔夜固定小鼠全脑组织后， 将样品包埋入石蜡中。 使用 Quanto套组 ( Thermo, 美国） 将样品进行切片 （4微米） 并安装在显微镜幻灯片上。

图 7所示为 SCA3小鼠免疫化学组织染色小脑的切片染色结� �， 其中， 未治疗组及经橄榄油喂食组显示明显的浦肯野 细胞缺失， 但经亚丁基苯酞或 ₃ _亚丁基 _ ₄ , ₅ _二氢苯酞治疗的组别的小鼠，其浦肯野� �胞数量显著多于未治疗 组别及橄榄油组， 此实验结果显示亚丁基苯酞及 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞治疗 可可延缓或避免浦肯野细胞死亡。

[实施例 5]西方墨点法

取于实施例 4牺牲的 SCA3小鼠的全脑组织， 进一歩分离出小脑组织， 并进行蛋白质萃取。 将所得纯化蛋白质分别使用抗 -泛素 （ubKimtm ) 抗体以 及抗 -钙结合蛋白（calbmdm)抗体进行西方墨点法分析 ，以测定各组别的 SCA3 小鼠的小脑组织的泛素及钙结合蛋白的蛋白质 含量变化。 实验以 β-肌动蛋白 作为内控制组。

如图 8所示， 相较于未治疗组及经橄榄油喂食组， 经亚丁基苯酞或 3-亚 丁基 -4,5-二氢苯酞治疗的组别的小鼠其钙结合蛋白� ��蛋白质表现量明显较 高。 已知钙结合蛋白为浦肯野细胞的标记物 （marker) , 此实验结果与切片结 果皆显示浦肯野细胞的数量增加， 证实亚丁基苯酞及 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞 可减缓 SCA3疾病进程。

此外， 如图 9所示， 相较于未治疗组及经橄榄油喂食组， 经亚丁基苯酞 治疗的组别的小鼠其经泛素进行泛素化 （ubiquitin ubiquitination) 的蛋白质的 含量明显较高， 显示亚丁基苯酞具有增加泛素进行泛素化的能 力， 亦即， 可 增加小脑神经细胞中蛋白质的泛素化作用， 故可增加错误蛋白通过蛋白酶体 (proteasome) 代谢的效率， 减缓 SCA3的疾病进程。

以上实施例的结果显示， 使用本发明所涉特定苯酞化合物可治疗及 /或 延缓浦肯野细胞退化， 故可治疗脊髓性小脑萎缩症、 阿兹海默症、 帕金森氏 症及 /或延缓其发病。

上述实施例仅是用以例示说明本发明的原理及 功效， 而非用于限制本发 明。 任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明 的技术原理及精神的情况 下， 对上述实施例进行修改及变化， 都应当包含在本发明的保护范围内。