Stand der Technik In der chemischen und biochemischen Synthese werden vermehrt Enzyme als Katalysatoren eingesetzt. So werden in vielen Fällen aufgrund der oft milderen Reaktionsbedingungen be- reits in großtechnischen Verfahren Hydrolasen, speziell Lipasen (EC 3.1. 1.3) zur Fettspaltung eingesetzt.

Geeignete enzymatische Verfahren zur Veresterung oder Umesterung sind beispielsweise be- schrieben in K. Drauz und H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, VCH- Verlag, Weinheim 1975.

Bekannt ist, dass Transesterifikation in wasserfreien oder wasserarmen Medien durch Lipasen katalysiert werden. Ist im Reaktionssystem von Estern, Alkohol und Lipasen auch Wasser vorhanden, so setzt normalerweise eine Abspaltung von gebundenen Säuren zu freien Säuren ein. Da verschiedene Lipasen auch die Bildung von Estern aus freien Fettsäuren und Alkoho- len katalysieren, werden im Endeffekt in den überwiegenden Fällen eine Transesterifikations- reaktion mit einer Säurezwischenstufe neben einer direkten Transesterifikation durchgeführt.

Für viele technische Prozesse ist allerdings von großem Nachteil, dass freie Säuren im System gebildet werden. Teilweise verhindert der Wassergehalt eine technisch und kommerziell ak- zeptable Umsetzung (Ausbildung eines unvorteilhaften thermodynamischen Gleichgewichts).

Aufwendige technische Anlagen (Wasserentfernung über z. B. azeotrope Destillation, Memb- rantrennverfahren, Vakuumdestillation) müssen zur Erzielung befriedigender Ausbeuten ein- gesetzt werden.

Der Nachteil bei enzymatisch katalysierten Reaktionen liegt oft in der Verfügbarkeit und Sta- bilität der am Prozess beteiligten funktionellen Proteine. Aus dem Stand der Technik sind bereits Enzyme bekannt, die durch Immobilisierung beispielsweise durch Mikroeinkapselung stabilisiert vorliegen und mehrfach Verwendung finden können.

Die Umsetzung von hydrophoben Verbindungen kann bereits durch den Einsatz von Wasser in Öl (W/O) Mikroemulsionen durchgeführt werden, wie es von Orlich und Schomaeker in

Enzyme Microb. Technol. ; 2001 ; 28 ; 1 ; 42-48 für die Lipase aus Candida rugosa beschrie- ben wird. Sehr kritisch für die erfolgreiche Umsetzung ist jedoch die Konzentration an Wasser in der Lösung sowie die Zusammensetzung der Komponenten der W/O-Mikroemulsion.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung hat somit darin bestanden, ein System für enzyma- tisch katalysierte Reaktionen zur Verfügung zu stellen, bei dem die Substratkonzentrationen variiert werden können wobei jedoch die Grenzflächen und damit die Konzentrationen an Öl und Wasser soweit konstant bleiben, dass sie keinen großen Einfluss auf die Reaktion und auf die Aktivität des Enzyms haben. Des weiteren sollten diese Systeme kostengünstig und recyc- lingfähig sein.

Beschreibung der Erfindung Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von O/W-Emulsionen als Reaktionsmedium für enzymatisch katalysierte Reaktionen, enthaltend mindesten Wasser, Emulgatoren sowie eine Ölphase, wobei die Emulsion nach dem PIT-Verfahren hergestellt wird und eine Tröpf- chengröße von 50 bis 400 nm aufweist.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass O/W-Emulsionen die nach dem PIT-Verfahren hergestellt wurden, die eingangs geschilderten Anforderungen in ausgezeichneter Weise erfül- len.

PIT-Emulsionen Emulsionen sind disperse Zubereitungen aus mindestens zwei nicht ineinander löslichen Flüs- sigkeiten von denen eine wässrig ist. Zur Homogenisierung nicht mischbarer Öl/Wasser- Phasen durch Emulgierung werden Emulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme einge- setzt. Ohne Einfluss von stabilisierenden Emulgatoren würden sich die Phasen aufgrund ihrer unterschiedlichen Polaritäten wieder trennen. Die amphiphilen Emulgatoren sitzen an den Grenzflächen zwischen den fein verteilten Tröpfchen und der kohärenten Phase und verhin- dern durch sterische oder elektrostatische Abschirmung ihr Zusammenfließen (= Koaleszenz).

Emulgatoren sind Verbindungen, die in ihrer Molekülstruktur hydrophile und lipophile Bau- steine miteinander verbinden. Auswahl und Ausmaß der jeweiligen Bausteine im betroffenen Emulgatormolekül beziehungsweise Emulgatorsystem werden häufig durch den HLB- (number) Wert gekennzeichnet, der eine Aussage zur Hydrophilic-Lipophilic-Balance macht.

Dabei gilt üblicherweise : Emulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme mit vergleichs- weise stark hydrophilen Anteilen führen zu hohen HLB-Werten und in ihrer praktischen An-

wendung in der Regel zu den Wasser-basierten O/W-Emulsionen mit disperser Ölphase. E- mulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme mit vergleichsweise stark lipophilen Anteilen führen zu vergleichsweise niedrigeren HLB-Werten und damit zur W/O-Invertemulsion mit geschlossener Ölphase und disperser Wasserphase.

Es ist bekannt, daß Öl-in-Wasser-Emulsionen (O/W), die mit nichtionogenen Emulgatoren hergestellt und stabilisiert sind, bei Erwärmen eine in der Regel reversible Phaseninversion erfahren können, d. h., dass innerhalb eines bestimmten Temperaturintervalls ein Wechsel des Emulsionstyps von O/W zu W/O (Wasser-in-Öl-Emulsion) erfolgt. Da dabei das Öl zur äuße- ren, kontinuierlichen Phase wird, sinkt die Leitfähigkeit der Emulsion auf Null. Der Mittel- wert der Temperaturen zwischen maximaler und gerade auf Null gefallener Leitfähigkeit der Emulsion bei Temperaturerhöhung wird Phaseninversionstemperatur (PIT) und die auf diese Weise hergestellten Emulsionen werden PIT-Emulsionen genannt.

Es ist auch bekannt, dass die Lage der PIT von vielen Faktoren abhängig ist, zum Beispiel von der Art und des Phasenvolumens der Ölkomponente, von der Hydrophilie und der Struktur der Emulgatoren und der Zusammensetzung des Emulgatorsystems.

Wesentlich für die Feinteiligkeit der PIT-Emulsion ist deren Herstellungsverfahren. In der Regel werden die Wasser-und Ölphase mit den Emulgatoren vermischt und danach auf eine Temperatur oberhalb der PIT erwärmt. Die Leitfähigkeit muß dabei auf Null fallen. Anschlie- ßend wird die Emulsion wieder auf die Ausgangstemperatur abgekühlt (in der Regel Raum- temperatur, ca. 20°C). Dabei erfolgt erst durch Überschreiten und das anschließende Unter- schreiten der PIT die Ausbildung der erfindungsgemäß verwendeten Emulsion.

Es ist bekannt, dass nur solche PIT-Emulsionen besonders feinteilig sind, welche bei der Pha- seninversion eine Mikroemulsionsphase mit niedriger Grenzflächenspannung zwischen Öl und Wasser oder eine lamellare flüssigkristalline Phase ausbilden. Der entscheidende Schritt ist dabei immer die Rückinvertierung bei Abkühlung.

Die erfindungsgemäßen Emulsionen zeichnen sich insbesondere durch ihre Feinteiligkeit aus.

Die Tröpfchengröße beträgt 50 bis 400 nm. Vorzugsweise liegt die Tröpfchengröße im Be- reich von 70 bis 300 nm, insbesondere im Bereich von 80 bis 250 nm und besonders bevor- zugt im Bereich von 90 bis 160 nm. Bei den Tröpfchengrößen wird eine Verteilung nach Gauss angenommen. Die Messung erfolgt beispielsweise durch Lichtstreuung oder Absorpti- on.

Diese feinverteilten Emulsionen behalten ihre Homogenität durch die Brownsche Molekular- bewegung. Diese Brownsche Molekularbewegung ist eine thermische Zufallsbewegung von Teilchen < 5 um. Sie ist die treibende Kraft der Diffusion und behindert sowohl die Sedimen- tation als auch das Aufrahmen (Flotation). Ein großer Vorteil besteht darin, dass energieauf-

wendige Rührvorgänge vermindert werden können. Sie führt zu einer verbesserten Diffusion von Substrat und Enzym und zu verminderten Energiekosten.

Die Substratkonzentrationen können variiert werden ohne dass die Tropfengröße verändert werden muss. Eine hohe Substratkonzentration kann erreicht werden, ohne das eine Koales- zens der Tropfen auftritt. Die geringe Oberflächenspannung erhöht die Transferrate der Mole- küle an der Öl/Wasser Grenzfläche. Die hohe Reproduzierbarkeit und Stabilität der PIT- Emulsionen ermöglicht biochemische Studien an Enzymen und deren Reaktivität sowie die Möglichkeit bereits bekannte Reaktionsbedingungen und Aktivitäten für Enzyme noch weiter zu optimieren.

Die PIT-Emulsionen enthalten, neben Wasser noch eine Ölphase, die Verbindungen aus der Gruppe der Fettsäurealkylester a) oder der nativen pflanzlichen Öle und deren Derivate b) enthält. Es handelt sich bei den Gruppen a) und b) um hydrophobe, in Wasser nicht oder nur sehr gering lösliche Verbindungen, die bevorzugt die Ausgangsstoffe, also Substrate für die durch enzymatische Katalyse gewünschten Produkte darstellen können aber auch als Hilfsstof- fe eingesetzt werden können.

Geeignete Ester der Gruppe a) leiten sich insbesondere ab von gesättigten, ungesättigten, line- aren oder verzweigten Fettsäuren mit insgesamt 7 bis 23 Kohlenstoffatomen. Es handelt sich also um Verbindungen der Formel (I) R'-COO-W (I) wobei Rl für einen Alkylrest mit 6 bis 22 C-Atomen steht und R2 ein Alkylrest mit 1 bis 4 C- Atomen ist, wobei Methyl-und Ethylreste besonders bevorzugt sind. Am vorteilhaftesten ist der Einsatz von Methylestern. Die Methylester der Formel (I) können auf übliche Weise, z. B. durch Umesterung von Triglyceriden mit Methanol und anschließender Destillation, erhalten werden. Geeignete Fettsäuren sind die Capron-, Heptan-, Capryl-, Perlagon-, Caprin-, Unde- can-, Laurin-, Tridecan-, Myristin-, Pentadecan-, Palmitin-, Heptadecan-, Stearin-, Nonade- can-, Arachin-und Behensäure. Ungesättigte Vertreter sind beispielsweise Lauroelein-, My- ristolein-, Palmitolein-, Petroselaidin-, Öl-, Elaidin-, Ricinol-, Linol-, konjugierte Linolsäure (CLA), insbesondere die cis9, transll-CLA oder die translO, cisl2-CLA, Linolaidin-, Linolen-, konjugierte Linolsäure Gadolein-, Arachidon und Erucasäure. Auch Mischungen der Methyl- ester und/oder Ethylester dieser Säuren sind geeignet. Besonders bevorzugt ist die Verwen- dung solcher PIT-Emulsionen, die Methylester und/oder Ethylester aus der Gruppe Methylo- leat, Methylpamitat, Methylstearat, Methylpelargonat, Ethyloleat, Ethylpamitat, Ethylstearat und/oder Ethylpelargonat enthalten. Es können aber auch Methylester und/oder Ethylester auf Basis natürlicher Fettsäuremischungen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise aus Lein-,

Kokos-, Palm-, Palmkern-, Oliven-, Ricinus-, Rüb-, Soja-oder Sonnenblumenölen (bei Raps- und Sonnenblumenöl jeweils neue und alte Züchtungen) erhalten werden.

Geeignete Verbindungen der Gruppe b) sind native Öle pflanzlichen Ursprungs. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Triglyceride und Triglyceridmischungen, wobei das Glycerin mit längerkettigen Fettsäuren jeweils vollständig verestert ist. Besonders geeignete pflanzliche Öle sind ausgewählt aus der Gruppe Erdnuß-, Kokos-und/oder Sonnenblumenöl.

Wichtige Bestandteile der erfindungsgemäß verwendeten PIT-Emulsionen sind die eingesetz- ten Emulgatoren bzw. Emulgatorensysteme. Vorzugsweise werden als Emulgatoren nichtio- nische Emulgatoren, insbesondere ethoxylierte Fettalkohole und Fettsäuren eingesetzt. Zur Ausbildung von PIT-Emulsionen ist es vorteilhaft ein zweikomponentiges Emulgatorsystem, enthaltend einen hydrophilen Emulgator (A) und einen hydrophoben Coemulgator (B) einzu- setzen. Als hydrophile nichtionische Emulgatoren (A) eignen sich Stoffe, die einen HLB-Wert von etwa 8 bis 18 aufweisen. Unter dem HLB-Wert (Hydrophil-Lipophil-Balance) soll ein Wert verstanden werden, der gemäß HLB = (100-L) /5 errechnet werden kann, wobei L der Gewichtsanteil der lipophilen Gruppen, d. h. der Fettalkyl- oder Fettacylgruppen in Prozent in den Ethylenoxidanlagerungsprodukten ist.

Fettalkoholethoxylate im Sinne der erfindungsgemä#en Lehre folgen der allgemenen Formel (II) R3-O-(CH2CH2O)n-H (II) wobei R3 für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest mit 6 bis 24 Kohlenstoffatomen steht und n eine Zahl von 1 bis 50 bedeutet. Besonders bevorzugt sind solche Verbindungen der Formel (Il), in der n für eine Zahl von 1 bis 35 und insbesonde- re von 1 bis 15 steht. Besonders bevorzugt sind weiterhin solche Verbindungen der Formel (II), in der R3 für einen Alkylrest mit 16 bis 22 Kohlenstoffatomen steht.

Die Verbindungen der Formel (u) werden in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von Fettalkoholen mit Ethylenoxid unter Druck, ggf. in Gegenwart saurer oder basischer Katalysa- toren erhalten. Typische Beispiele sind Capronalkohol, Caprylalkohol, 2-Ethylhexylalkohol, Caprinalkohol, Laurylalkohol, Isotridecylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol, Palmoleyl- alkohol, Stearylalkohol, Isostearylalkohol, Oleylalkohol, Elaidylalkohol, Petroselinylalkohol,

Linolylalkohol, Linolenylalkohol, Elaeostearylalkohol, Arachylalkohol, Gadoleylalkohol, Be- henylalkohol, Erucylalkohol und Brassidylalkohol sowie deren technische Mischungen, die z. B. bei der Hochdruckhydrierung von technischen Methylestern auf Basis von Fetten und Ölen oder Aldehyden aus der Roelen'schen Oxosynthese sowie als Monomerfraktion bei der Dimerisierung von ungesättigten Fettalkoholen anfallen. Bevorzugt sind technische Fettalko- hole mit 12 bis 18 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Kokos-, Palm-, Palmkern-oder Talgfettalkohol.

Fettsäureethoxylate, die ebenfalls als Emulgatorkomponente (A) in Betracht kommen, folgen vorzugsweise der Formel (m), R4Co2 (CH2CH2O) mH (III) in der R4 für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und m für Zahlen von 5 bis 50 und vorzugsweise 12 bis 35 steht. Typische Beispiele sind Anlage- rungsprodukte von 10 bis 30 Mol Ethylenoxid an Laurinsäure, Isotridecansäure, My- ristinsäure, Palmitinsäure, Palmoleinsäure, Stearinsäure, Isostearinsäure, Ölsäure, Elaidinsäu- re, Petroselinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Elaeostearinsäure, Arachinsäure, Gadoleinsäure, Behensäure und Erucasäure sowie deren technische Mischungen, die z. B. bei der Druckspal- tung von natürlichen Fetten und Ölen oder bei der Reduktion von Aldehyden aus der Roelen- schen Oxosynthese anfallen. Vorzugsweise werden Anlagerungsprodukte von 10 bis 30 Mol Ethylenoxid an Fettsäuren mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen eingesetzt.

Partialglyceride, die als Emulgatorkomponente (B) in Betracht kommen, folgen vorzugsweise der Formel (IV), in der COW für einen linearen oder verzweigten Acylrest mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und x, y und z in Summe für 0 oder für Zahlen von 1 bis 50, vorzugsweise 15 bis 35 steht.

Typische Beispiele für im Sinne der Erfindung geeignete Partialglyceride sind Laurin- säuremonoglycerid, Kokosfettsäuremonoglycerid, Palmitinsäuremonoglycerid, Stearinsäure- monoglycerid, Isostearinsäuremonoglycerid, Ölsäuremonoglycerid, konjugierte Linolsäure- monoglyceride und Talgfettsäuremonoglycerid sowie deren Addukte mit 5 bis 50 und vor- zugsweise 20 bis 30 Mol Ethylenoxid. Vorzugsweise werden Monoglyceride bzw. technische

Mono/Diglyceridgemische mit überwiegendem Monoglyceridanteil der Formel (IV) ein- gesetzt, in der COR5 für einen linearen Acylrest mit 16 bis 18 Kohlenstoffatomen steht.

Üblicherweise werden Emulgatormischungen eingesetzt, die die Komponenten (A) und (B) im Gewichtsverhältnis 10 : 90 bis 90 : 10, vorzugsweise 25 : 75 bis 75 : 25 und insbesondere 40 : 60 bis 60 : 40 enthalten.

Als weitere geeignete Emulgatoren kommen beispielsweise nichtionogene Tenside aus einer der folgenden Gruppen in Frage : 'Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid vorzugsweise 4 bis 10 Mol Ethy- lenoxid und/oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C- Atomen ; Glycerinmono-und-diester und Sorbitanmono-und-diester von gesättigten und unge- sättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Ethylenoxidanlage- rungsprodukte mit 1 bis 30 Mol Ethylenoxid ; Alkylmono-und-oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest und de- ren ethoxylierte Analoga ; Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl ; 'Polyol-und insbesondere Polyglycerinester wie z. B. Polyglycerinpolyricinoleat oder Polyglycerinpoly-12-hydroxystearat. Ebenfalls geeignet sind Gemische von Verbin- dungen aus mehreren dieser Substanzklassen ; * Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl ; . Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter Cl2/22- Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipentaerythrit, Zuckeralkohole (z. B. Sorbit) sowie Polyglucoside (z. B.

Cellulose) ; Wollwachsalkohole ; Polyalkylenglycole.

Die Anlagerungsprodukte von Ethylenoxid und/oder von Propylenoxid an Glycerinmono-und - diester sowie Sorbitanmono-und-diester von Fettsäuren oder an Ricinusöl stellen bekannte, im Handel erhältliche Produkte dar. Es handelt sich dabei um Homologengemische, deren mittlerer Alkoxylierungsgrad dem Verhältnis der Stoffmengen von Ethylenoxid und/oder Pro- pylenoxid und Substrat, mit denen die Anlagerungsreaktion durchgeführt wird, entspricht.

Zur Auswahl geeigneter Emulgatorsysteme kann es zweckmäßig sein, rechnerisch die Ermitt- lung der PIT des jeweiligen Systems durchzuführen. Insbesondere gilt das aber auch für po- tentielle Optimierungen in der Auswahl der Emulgatoren beziehungsweise Emulgatorsysteme und ihrer Anpassung an die durch sonstige Überlegungen zum technischen Handeln vorgege- bene Auswahl und Abmischung von wäßriger Phase einerseits und Typ der Ölphase anderer- seits. Entsprechendes Fachwissen ist aus an sich ganz anderen Bereichen, insbesondere aus dem Bereich der Kosmetika-Herstellung, entwickelt worden. Verwiesen wird insbesondere auf die Veröffentlichung TH. Förster, W. von Rybinski, H. Tesmann und A. Wadle"Calculatiozl of optimum emulsifier mixtuYes for phase inversion emulsification", in International Journal of Cosmetic Science 16,84-92 (1994). Dargestellt ist hier im einzelnen wie auf rechnerischem Weg für vorgegebene 3-Komponenten-Systeme aus einer Ölphase, einer Wasserphase und einem Emulgator auf der Basis des für die Ölphase charakteristischen EACN-Wertes (equiva- lent alkane carbon number) der Temperaturbereich der Phaseninversion (PIT) über die CAPICO-Methode (calculation of phase inversion in concentrates) errechnet werden kann.

Diese Veröffentlichung Förster et al. bezieht insbesondere wiederum wesentliche Literatur für den hier angeschnittenen Themenkomplex ein, die im Zusammenhang mit der Offenbarung dieser Veröffentlichung Förster et al. zu sehen ist. Im einzelnen wird dann anhand zahlreicher Beispiele dargestellt, wie mittels der CAPICO-Methode im Rahmen des EACN-Konzepts die Auswahl und Optimierung der Emulgatoren/Emulgatorsysteme zur optimalen Einstellung vorgegebener Werte für den Temperaturbereich der Phaseninversion zugänglich wird.

Die erfindungsgemäß verwendeten PIT-Emulsionen enthalten vorzugsweise von 20 bis 90 Gew. -% Wasser, insbesondere von 30 bis 80 Gew.-% und ganz besonders bevorzugt von 30 bis 60 Gew. -%. Der Rest auf 100 Gew. -% entfällt auf die Ölphase sowie Emulgatoren und ggf. weitere Hilfs-und Zusatzstoffe. Die Ölphase selbst ist vorzugsweise in Mengen von 10 bis 80 Gew.-%, insbesondere von 40 bis 70 Gew. -% enthalten. Dabei enthält die Ölphase vorzugsweise ausschließlich die Komponenten a) oder b) bzw. Mischungen dieser Kompo- nenten. Die Emulgatoren, bzw. Emulgatorensysteme sind vorzugsweise in Mengen von 1 bis 25 Gew. -%, insbesondere in Mengen von 5 bis 20 und besonders bevorzugt in Mengen von 5 bis 15 Gew. -% enthalten. Die erfindungsgemäß verwendeten Emulsionen weisen vorzugswei- se Phaseninversionstemperaturen im Bereich von 20 bis 95 °C und insbesondere von 30 bis 95 °C auf.

Die erfindungsgemäß verwendeten Enzyme stellen Enzyme dar, die grenzflächenaktiv sind.

Vorzugsweise werden Enzyme aus der Gruppe der Hydrolasen und/oder Acyltransferasen ein- gesetzt die entweder allein oder in Kombination mit mehreren Enzymen eingesetzt werden können.

Besonders bevorzugt sind Hydrolasen ausgewählt aus der Gruppe, die gebildet wird von Es- terasen, Phospholipasen, Lipasen und Lipasen/Acyltransferasen. Bei letzten handelt es sich um Enzyme, die grenzflächenaktiv sind und Reaktionen katalysieren, die charakteristisch für Lipasen sind. Es wurde gefunden, dass diese Polypeptide in der Lage sind, Transesterifizie- rungen in Gegenwart kurzkettiger Alkohole zu katalysieren bei einem Wassergehalt im Reak- tionsgemisch, der einer Wasser-Aktivität größer 0,8 entspricht. Bei diesem Gehalt an Wasser würde eine herkömmliche Lipase in Abhängigkeit von der Alkoholkomponente überwiegend die Hydrolyse der Ester katalysieren. Es handelt sich also um Enzyme, welche sowohl charak- teristische Merkmale für Lipasen als auch für Acyltransferasen zeigen. Bei dem erfindungs- gemäßen, natürlich vorkommendem Enzym handelt es sich aufgrund von Sequenzhomologien zu bislang bekannten Enzymen wie beispielsweise Lipase aus Candida parapsilosis um eine Lipase und aufgrund seiner enzymatischen Aktivität um eine Acyltransferase.

Typische Beispiele für geeignete Enzyme, die jedoch nicht einschränkend sein sollen, sind Lipasen und/oder Lipasen/Acyltransferasen von Organismen die ausgewählt sind aus der Gruppe, die gebildet wird von Alcaligenes, Aspergillus niger, Aspergillus oryzea, Aeromonas aerophila, Bacillus species, Candida albicans, Candida antarctiea (Trychosporon oryzae, <BR> <BR> Pseudozyma antarctica), Candida antarctica, Candida cylindracea, Candida glabrata, Can- dida maltosa, Candida parapsilosis, Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida viswa- nathii, Chromobacterium viscosum, Fusarium solani, Geotrichum candidum, Issatchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C. kefyr, C. pseudotropicalis), Mucor <BR> <BR> javanicus, Peniciliuna camenberti, Penicilium roqueforti, Pichia guilliermondii (Candida guil- <BR> <BR> <BR> liermondii), Porcine pancreas, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizomucor miehei, Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae, Rhizopus niveus, Rhizopus javanicus und Ther- momyces laraugenosus sowie deren Gemischen. Bevorzugt, weil besonders aktiv, sind Lipasen und Lipasen/Acyltransferasen aus den Organismen Alcaligenes, Candida, Chromobacterium, Rhizomucor, Pseudomonas, Rhizopus und Thermomyces insbesonderer um Enzyme aus Can- dida parapsilosis, Pichia guilliermondii (Candida guilliermondii) oder Candida antarctica.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Enzyme können in unterschiedlichen Formen eingesetzt werden. Prinzipiell sind alle dem Fachmann gebräuchlichen Darreichungsformen von Enzy- men anwendbar. Unter die Definition"Enzym"fallen erfindungsgemäß auch die Begriffe Pro- tein und Enzym-Protein. Erfindungsgemäß ist sowohl das Enzymprotein als auch das Gesamt- protein welches in einem Teil der Proteinsequenz die Funktion des erfindungsgemäßen Prote- ins beinhaltet anzuwenden. Vorzugsweise werden die Enzyme in reiner Form oder als techni-

sches Enzympräparat entweder immobilisiert auf Trägermaterial und/oder in Lösung, insbe- sondere in wässriger Lösung eingesetzt und in sogenannten"repeated batches"wiederverwen- det. Ebenfalls bevorzugt sind kristallisierte Enzyme, sogenannte CLEC's, beispielweise zu beziehen von der Firma Altus. Der Anteil an aktiven Enzym in den jeweiligen technischen Enzympräparaten variiert von Hersteller zu Hersteller. Der Anteil liegt jedoch im Mittel zwi- schen 1 und 10 % aktiven Enzym.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Enzyme werden in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung eingesetzt in einer Menge von 0,001 bis 20 Gew. -% berechnet als reines Enzym oder als Enzympräparat, bezogen auf die Gesamtmenge an eingesetzter Ölphase. Im Besonde- ren liegt die einzusetzende Menge bei 0,002 bis 1 Gew. -% und besonders bevorzugt bei 0,002 bis 0,2 Gew. -%.

Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei den enzymatisch katalysierten Reaktionen bevor- zugt um Hydrolysen, Umesterungen oder Veresterungen, wobei die Umesterungen besonders bevorzugt sind.

Im Sinne der Erfindung werden durch die enzymatisch katalysierten Reaktionen unter Ver- wendung der erfindungsgemäßen PIT-Emulsion kosmetische und/oder pharmazeutische Pro- dukte und/oder Feinchemikalien hergestellt. Im besonderen werden Carotinoide, sterolhaltige Ölkomponenten und/oder Vitamin E hergestellt.

Die erfindungsgemäßen O/W-Emulsionen, enthaltend mindesten Wasser, Emulgatoren sowie eine Ölphase und hergestellt nach dem PIT-Verfahren eignen sich hervorragend für die Ver- wendung als Reaktionsmedium für enzymatisch katalysierte Reaktionen. Hieraus lässt sich direkt ein weiterer Gegenstand der Erfindung ableiten. Es handelt sich um ein Verfahren zur enzymatisch katalysierten Hydrolyse, Umesterung oder Veresterung von Fettsäurealkylestern und/oder Triglyceriden, bei dem O/W-Emulsionen als Reaktionsmedium eingesetzt werden, die nach dem PIT-Verfahren hergestellt werden. Die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzten Emulsionen entsprechen in ihren Bestandteilen, Bedingungen und näheren Aus- führungsformen den Emulsionen, die bereits für die Verwendung dieser O/W-Emulsionen näher beschrieben wurden. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt kos- metische und/oder pharmazeutische Produkte und/oder Feinchemikalien hergestellt. Im be- sonderen werden Carotinoide, sterolhaltige Ölkomponenten und/oder Vitamin E hergestellt.

Bei diesem Verfahren kann man es sich zu nutze mache, dass die nicht wasserlöslichen Sub- strate, in der Ölphase der PIT-Emulsion löslich werden und so der enzymatisch katalysierten Reaktion zugänglich sind.

Die PIT-Emulsionen enthaltend das Substrat werden erfindungsgemäß dem Reaktionsgefäß welches die Lipase bzw. Lipase/Acyltransferase immobilisiert oder nicht immobilisiert sowie ggf. weitere Hilfs-und Zusatzstoffe enthält, zudosiert. Die Einzelheiten dieses Verfahrens,

insbesondere die Menge an Enzym und der zudosierten Emulsion, ergeben sich aus der Art der Enzyme und der gewählten PIT-Emulsion und können vom Fachmann an die spezifischen Gegebenheiten angepasst werden. Durch Erhitzen des Systems kann eine Phasentrennung er- reicht werden und der Emulgator in der wässrigen Phase und das Produkt in der Ölphase in einfacher Weise voneinander getrennt werden. Durch die Verwendung von Festbettreaktoren enthaltend das Enzym ist eine Abtrennung und Wiederverwendung des Enzyms gegeben.

Die Feinteiligkeit der Öltröpfchen führt zu einer großen Oberfläche zwischen Öl-und Was- serphase und ermöglicht so einen schnellen Kontakt und eine erhöhte Reaktionsrate zwischen den Enzymen und der die Substrate enthaltenden Ölphase.

In einer besonderen Ausführungsform dieses Verfahrens werden Enzyme eingesetzt, die be- reits für die Verwendung der erfindungsgemäßen O/W-Emulsion aufgelistet wurden.

Die erfindungsgemäßen Reaktionsbedingungen der enzymatisch katalysierten Reaktion rich- ten sich nach dem optimalen Reaktionsbereich der ausgewählten Enzyme und nach den ver- wendeten Emulsionen. Im Besonderen handelt es sich um Bedingungen bei denen unter ande- rem die Reaktionstemperatur zwischen 15 und 50 °C, bevorzugt eine Temperatur zwischen 20 und 40 °C, insbesondere eine Temperatur von 35 °C gewählt wird.

Beispiele Herstellbeispiel H1 Umesterung von Ölsäureethylester mit Methanol oder Hydrolyse von Ölsäureethylester durch Lipase/Acyltransferase und Hydrolyse des eingesetzten Ölsäureesters.

Zur Herstellung der PIT-Emulsion von C18 : 1 Ölsäureethylester wurde eine Mischung aus 0,25 g Polyoxyethylen-12-Cetylstearylalkohol (Eumulgin0 B1) und 0,2 g Polyoxyethylen-6- Cetylalkohol mit 1 g Ölsäureethylester und 3 g ultrareinem Wasser unter Rühren bis auf 95 °C aufgeheizt, bis alle Komponenten geschmolzen waren. Anschließend wurde unter Rühren bis auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Phaseninversionstemperatur (PIT) lag bei ungefähr 66 °C. Diese Emulsion (10 gmol/ml) wurde zu einer auf pH 6,5 gepufferten Lösung enthaltend Lipa- se/Acyltransferase (CLIP2) und 2,2 mol/1 Methanol als Substrat gegeben und die Hydrolyse bzw. die Methanolyse in µmol/min/ml in Abhängigkeit von der Enzymmenge [u. g/ml] be- stimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1 : Enzymmenge e [µg/ml Hydrolyse [mol/min/ml] Methanolyse mol/min/ml] 1 0, 001 0, 005 2 0, 003 0, 009 5 0, 015 0, 025 10 0, 038 0, 050 15 0, 088 0, 066 Des weiteren wurde die Aktivität des Enzyms in der PIT-Emulsion mit Ölsäureethylester in Gegenwart von Methanol oder Isopropanol bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 3 dargestellt.

Tabelle 2 : Aktivität des Enzyms [14 tg/ml] bei 45 °C

Methanol [mol/l] Hydrolyse [mol/min/ml] Methanolyse mol/min/ml] 0 0, 089 0 0, 5 0, 037 0, 024 1 0, 024 0, 034 2, 2 0, 009 0, 074 4 0, 002 0, 128 Tabelle 3 : Aktivität des Enzyms [35 Fg/ml] bei 30 °C Iso ro anol [mol/1] Hydrolyse [µmol/min/ml] Isopropanolyse [µmol/min/ml 0 0, 042 0 0, 1 0, 043 0 0, 2 0, 031 0, 009 0, 5 0, 032 0, 017 1, 0 0, 027 0, 046 1, 25 0, 023 0, 066 1, 5 0, 022 0, 11 1, 75 0, 020 0, 17 2, 0 0, 009 0, 19 2, 25 0, 009 0, 20 2, 5 0, 0003 0, 17 3, 0 0 0, 027

Diskussion der Ergebnisse : Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Umesterung der Methanolyse als auch die Hydrolyse durchführbar sind in einer PIT Emulsion und das das Enzym die besonderen Fähigkeiten nicht verliert. Es zeigt sich weiterhin, dass eine Methanolyse in Gegenwart von Wasser der PIT- Emulsion gegenüber einer Hydrolyse bevorzugt ist.

Die Umesterung zu Isopropyloleat in dem genannten System ist ebenfalls durchführbar wobei die Aktivität des Enzyms bei 2,25 mol/1 Isopropanol ein Maximum anzeigt.