Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в онкологии как средство для повышения эффективности химиотерапии при одновременном введении.

Изобретение также относится к ветеринарии и может быть использовано как адьювант при химиотерапии онкозаболеваний домашних животных.

Как правило, аналоги препарата - полимеризованного гемоглобина используются в качестве препаратов с функцией переноса кислорода. Это такие препараты, как «Геленпол», «Биопюр» и препарат «Геленпол» /RU 2132687, А61К 35/18, опубл.10.07.1999/, полученный из донорской крови. Препарат «Геленпол» представляет собой смесь тетрамера гемоглобина и олигомеров с различной длиной цепи. Олигомеры получены путем сшивания тетрамеров гемоглобина глутаровым альдегидом и модифицированы глутаминовой кислотой. Препарат фирмы Biopure, получен из гемоглобина эритроцитов крупного рогатого скота (патенты US 5084558, С07К14/805, опубл. 28.01.1992 и US 6506725, С07К14/805, опубл. 14.01.2003).

Известен полимеризованный гемоглобин с функцией переноса кислорода [Патент РФ №2340354, А61К 38/42, опубл.10.12.2008 и Патент РФ №2361608, А61К 38/42, опубл.20.07.2009]. Указанный полимеризованный глутаровым альдегидом гемоглобин, получают из крови животных, представляет собой лиофилизат и содержит не менее 90% полимеризованного гемоглобина с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да, а содержание метгемоглобина составляет не более 5%. Для всех вышеуказанных препаратов не показана функция повышения чувствительности опухолевых клеток к воздействию химиотерапии.

Известен агент защиты клеток крови и восстановления кроветворной системы и фармакологическая комбинация для лечения онкологических больных [Патент №2328304, А61К 38/42, опубл. 10.07.2008], который характеризуется тем, что включает модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин. Данное изобретение также относится к фармакологической комбинации, включающей в свой состав модифицированный глютаминовой кислотой полигемоглобин и цитостатик, при этом компоненты комбинации предназначены для раздельного или последовательного введения пациенту. В данной комбинации полигемоглобин обеспечивает пул красных кровяных клеток взамен пораженных в ходе терапии.

Известно средство, предложенное в патенте США 5631219, C12N5/0641, опубл. 20.05.1997, где предлагается для повышения качества жизни онкобольных и увеличении ее продолжительности стимулировать эритропоэз путем введения особо чистого гемоглобина, полученного по рекомбинантной технологии, извлекаемого из E.Coli, у которой экспрессирован ген гемоглобина, причем в этот ген введена мутация, обеспечивающая сшивание двух альфа- или двух бета- или нескольких альфа- и нескольких бета- субъединиц в тетрамер гемоглобина с помощью пептидного мостика.

Полимеризованный гемоглобин представляет смесь тетрамера гемоглобина и олигомеров с различной длиной цепи и является переносчиком кислорода, однако до настоящего времени они не рассматривались как адьюванты химиопрепаратов, поступающих с током крови, при лечении опухолей.

Таким образом, прямых аналогов - продуктов, созданных на основе гемоглобина млекопитающих, которые можно использовать для повышения эффективности химиотерапии опухолей головного мозга, в настоящее время не имеется.

Уже описанный выше препарат (Патент США 5631219, C12N5/0641, опубл. 20.05.1997) описывает механизм стимуляции эритропоэза при введении в кровеносное русло. Это свойство гемоглобина, обусловленное реакцией кроветворной системы по механизму положительной обратной связи на наличие внеэритроцитарного гемоглобина, дополняет общую картину положительного эффекта введения полимеризованного гемоглобина онкобольным, В качестве вероятного механизма можно рассматривать индукцию выброса из депо зрелых эритроцитов с последующей индукцией созревания незрелых проформ клеточных элементов крови. Эти данные позволяют рассматривать гемоглобин полимеризованный как препарат трехкомпонентного действия: индуктор образования эндогенного СО, индуктор эритропоэза и повышения эффективности клеточного дыхания, в дополнение к эффекту переноса кислорода, которым обладает полимеризованный гемоглобин.

Кроме того, препарат является источником свободного железа, которое поступая в значительном количестве в опухоль, индуцирует ферроптоз. Ферроптоз является окислительной формой некротической гибели клеток, весьма актуальной для многих дегенеративных заболеваний и рака. Ферроптоз характеризуется железо-зависимым перекисным окислением липидов и отличается от других способов гибели клеток. Ключевым фактором ферроптоза является фермент глутатионпероксидаза-4, который обеспечивает эффективный контроль перекисного окисления липидов. Разработка новых ингибиторов и индукторов ферроптоза открывает большой потенциал в разработке инновационных лекарств для лечения заболеваний, ассоциированных с ферроптозом. Известно, что ионы железа способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, причем, наибольшее количество эритроцитарного железа содержат клетки головного мозга.

Важной характеристикой мультиформной глиобастомы является продуцирование значительного количества VEGF с увеличением количества сосудов, как правило, имеющих стадию несовершенного неоангиогенеза. Возможность повышения количества поступающего в опухоль химиопрепарата может быть обеспечена путем повышения проницаемости гематоэнцефалического барьера и расширения диаметра сосудов, составляющих развитую сосудистую сеть опухоли.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств, обладающих одновременно кислородтранспортными, вазомодулирующими и химиомодифицирующими свойствами при низких концентрациях и дозах введения полимеризованного гемоглобина.

Заявленная техническая проблема решается применением гемоглобина полимеризованного в качестве адьювантного средства, усиливающего эффективность химиотерапии.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве средства, обеспечивающего вазодилятацию сосудов приводящих кровь к опухоли может применяться гемоглобин полимеризованный (лиофилизат для приготовления раствора для инфузий), содержащий не менее 90% полимеризованного гемоглобина с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да и метгемоглобина в его составе составляет не более 5%.

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения, в которых используется гемоглобин полимеризованный (лиофилизат для приготовления раствора для инфузий во флаконе вместимостью 100 мл), полученный стандартным способом/Патент РФ №2361608, А61К 38/42, опубл. 20.07.2009 и Патент РФ №2340354, А61К 38/42, опубл. 10.12.2008.

Экзогенный гемоглобин выполняет роль активатора индуцибельной гемоксигеназы-1, что приводит в повышению эндогенной продукции важнейшего низкомолекулярного медиатора - оксида углерода (СО), модулирующего сосудистый тонус, в том числе обеспечивая вазодилятацию сосудов приводящих кровь к опухоли.

В результате проведенных нами экспериментальных исследований обнаружено неизвестное до сих пор свойство гемоглобина полимеризованного (лиофилизата для приготовления раствора для инфузий) стимулировать образование эндогенного монооксида углерода, который, в свою очередь, индуцирует расширение диаметра сосудов, в том числе артериол и капилляров. Наличие гематоэнцефалического барьера в головном мозге создает большую проблему для доставки химиотерапевтических препаратов при развитии злокачественных опухолей различного рода, в том числе астроцитоме, глиобластоме и других опухолях нейроэктодермального ряда. В отличие от опухолей оболочек мозга (менингиом) эти опухоли диагностируются на поздних стадиях, прорастают в как в белое, так и в серое вещество головного мозга без развития болевого синдрома и плохо поддаются хирургическому лечению из-за затрудненного доступа и, как правило, множественных метастазов различного размера. Кроме того, помимо первичных опухолей именно в головном мозге обнаруживаются метастазы рака матки, молочной железы, меланомы и других опухолей. По данным Центрального регистра опухолей головного мозга США [http://www.CBTRUS.org] ежегодно в США происходит около 13 000 смертей и 18 000 новых случаев первичных злокачественных опухолей головного мозга и центральной нервной системы (ЦНС). Глиомы составляют примерно 77- 81% первичных злокачественных опухолей головного мозга. Это наиболее распространенная первичная внутричерепная опухоль. Глиобластома, наиболее распространенная разновидность глиомы (~45% всех глиом), имеет 5-летнюю относительную выживаемость ~5%. [Ostrom QT, Bauchet L, Davis FG, Deltour I, Fisher JL, Langer CE, Pekmezci M, Schwartzbaum JA, Turner MC, Walsh KM, Wrensch MR, Barnholtz- Sloan JS. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 2014 Jul;16(7):896-913. doi: 10.1093/neuonc/nou087. PMID: 24842956; PMCID: РМС4057143]. Они локализуются как в полушариях мозга, так и в мозжечке, могут быть одиночными или множественными. В настоящее время принято сочетать хирургическое лечение, радиолучевую терапию (гамманож, протонная терапия) и химиотерапевтическое лечение. Свойство гемоглобина полимеризованного модулировать вазодилятацию и вазоконстрикцию при химиотерапии позволяет повысить ее эффективность, обеспечивая повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), при этом оно является для онкологов фактом неочевидным и не вытекает из уровня техники в данной области, не обнаружено в патентной и научномедицинской литературе.

Вышеуказанное свойство гемоглобина полимеризованного может быть использовано в практическом здравоохранении и ветеринарии для повышения качества лечения. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Обнаруженное в ходе исследования на крупных лабораторных животных значительное влияние введения гемоглобина полимеризованного на гемодинамику крови и вазодилатацию микрососудов позволяет рассматривать его как экзогенный индуктор эндогенной продукции важнейшего низкомолекулярного медиатора - СО путем активации ферментных систем организма.

Заявленное изобретение иллюстрируется фиг. 1, на которой показана кривая Каплана-Майера, позволяющая оценить эффект от проведённой терапии; и фиг.2 - суммарный показатель выраженности опухолевого роста.

Статистическая обработка результатов исследований была проведена с применением параметрических и непараметрических методов. Различия между группами считались статистически значимыми при Р<0,05.

Пример 1. Гемоглобин полимеризованный крупного рогатого скота как средство повышающее чувствительность опухолевых клеток мультиформной глиобластомы к химиотерапии оценивался на модели перевиваемой глиобластомы крысы 101/8 (Банк клеточных культур НИИ морфологии человека. Москва) на взрослых половозрелых крысах-самцах Wistar, с массой тела 150-180 г, Список сокращений: ПЖ - продолжительность жизни, УПЖ- увеличение продолжительности жизни, СПЖ- средняя продолжительность жизни, ДОКС- доксорубицина гидрохлорид, ГЭБ- гематоэнцефалический барьер.

Перевиваемая глиобластома крысы 101/8 (разработана в НИИ морфологии человека, где хранится, поддерживается и используется) Животным проводили инъекцию препарата (далее ИИ) на 2, 5 и 8 сутки после имплантации опухоли. Препараты вводили в хвостовую вену (левую или правую). В группе комбинированной терапии препараты вводили последовательно в одну вену

Крысы были разделены на четыре группы

Группа 1. Контроль. Животным имплантировали глиобластому 101/8 и наблюдали за продолжительностью жизни. Терапию не проводили.

Группа 2. Доксорубицин. Животным с имплантированной глиобластомой проводили терапию водным раствором доксорубицина («Тева», Израиль) в дозе 1,5 мг/кг.

Группа 3. Гемоглобин полимеризованный крупного рогатого скота. Животным с имплантированной глиобластомой проводили терапию раствором композиции в PBS в дозе 228 мг/кг.

Группа 4 «Гемоглобин полимеризованный+ доксорубицин». Животным проводили комбинированную терапию: доксорубицин в дозе 1,5 мг/кг и гемоглобин полмеризованный в дозе 228 мг/кг.

Имплантацию глиомы 101/8 в мозг крысы проводили под кетамин- ксилазиновым (80 мг/кг, 20 мг/кг) наркозом тканью криоконсервированной или свежеизмельченной опухоли в количестве 800 тыс. - 1 млн клеток. Для этого зубоврачебной фрезой диаметром 2 мм в правой теменной кости черепа крысы на расстоянии 2 мм от сагиттального шва и 2 мм каудально от венечного шва делали отверстие. С помощью троакара диаметром 1,8 мм ткань опухоли вводили на глубину 4 мм от поверхности кости черепа, что соответствовало дну правого бокового желудочка. В случае необходимости кровотечение останавливали перекисью водорода. Рану засыпали порошком сульфамидных препаратов.

Исследуемые препараты вводили иммобилизованным крысам при помощи одноразового шприца в латеральную хвостовую вену. Иммобилизация животных проводилась в иммобилизационной плексигласовой камере Когана. Перед введением препарата хвост животного помещали на 2-3 мин в теплую (+40°С) воду, высушивали его марлевой салфеткой и обтирали 70%-ным раствором этилового спирта. Придерживая основание хвоста левой рукой, в правую брали наполненный шприц. Тонкой иглой сначала прокалывали кожу на латеральной поверхности хвоста, а затем стенку сосуда. При попадании иглы в просвет вены в шприце появлялась кровь, и при движении поршня затем ощущался свободный ток жидкости.

Критерии оценки эффективности: УПЖ и СГОК крыс, получавших лечение животных с интрацеребральной опухолью по сравнению с нелеченным контролем и группой с лечением доксорубицином.

На гистологических срезах мозга крысы Wistar, глиобластома 101/8 представлена злокачественной глиальной опухолью с высокой клеточностью, многочисленными митозами, очаговой микроваскулярной пролиферацией, обширными очагами некрозов и кровоизлияний. Сосуды в опухоли имели разный диаметр и форму, как правило, они были извитые, лакунообразно расширенные. Эндотелиальная выстилка сосудов была очагово нарушена. Клетки опухоли имели высокое яд ерно-цито плазматическое отношение. Ядра плеоморфны, мелкого или среднего размера, с атипичным расположением гетерохроматина. Границы опухоли нечеткие, с выраженной инфильтрацией окружающей ткани мозга опухолевыми клетками. Капсула отсутствовала. По морфологической картине и по аналогии с опухолями человека данная опухоль соответствовала критериям Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) для мультиформной глиобластомы/ астроцитомы IV степени. Гибель животных после трансплантации глиомы в группе без лечения наступала на 14-21 сутки в результате распространения опухоли в ограниченном пространстве полости черепа. Все животные после терапии чувствовали себя удовлетворительно. При развитии опухолевого процесса отмечались следующие клинические признаки: животные теряли активность и аппетит, шерстный покров становился тусклым и взъерошенным, отмечались другие признаки интоксикации. Животные в группе 1 и 3 стабильно прибавляли в весе до момента проявления симптомов глиобластомы (снижение веса за 2-3 дня до смерти, вялость, тремор, отказ от еды). Животные в группе 2 и 4 имели небольшую задержку прибавки в весе (отсутствие прибавки или легкое снижение веса) во время проведения терапии, что типично при терапии доксорубицином в данной дозе. В дальнейшем (начиная с 10 дня) прибавка в весе сохранялась до нарастания симптомов глиобластомы.

Вскрытие. У одного животного №3 из гр.4, умерщвленного на 46-е сутки после имплантации опухоли из-за наступившего паралича задних конечностей не обнаружено опухолевого узла. Вероятная причина смерти - разрушение спинного мозга или перекрытие опухолевыми клетками спинномозгового канала. Все остальные животные, погибшие или умерщвленные в результате нарастания симптомов развития глиобластомы, имели значительные опухолевые узлы в районе места подсадки (правое полушарие) со значительными кровоизлияниями. При вскрытии были обнаружены все типичные признаки смерти от кровоизлияния в результате развития глиобластомы. Животные № 2 и 4 из группы 4, несмотря на окончание эксперимента, умерщвлены не были, однако, признаков развития опухоли у них не было обнаружено. Эти животные считались вылечившимися от глиобластомы, так как для данного штамма характерна 100%-ная прививаемость .

Анализ продолжительности жизни животных. По результатам проведённых исследований проведён анализ выживаемости животных в группах. На Фиг. 1 показана кривая Каплана-Майера, позволяющая оценить эффект от проведённой терапии.

В результате проведения комбинированной терапии в группе 4 показано значительное увеличение продолжительности жизни животных по сравнению с остальными группами. Продолжительность жизни в гр. 4 увеличилась на 231% (табл. 1), при этом 2 животных из 10 (20%) пережили порог наблюдения в 100 дней без проявления признаков роста опухоли. УПЖ в гр. 4 по сравнению с гр.2 составило 160% (в таблице не представлено). Продолжительность жизни животных в гр. 4 достоверно отличалась от аналогичных показателей в гр.1, 2 и 3.

Продолжительность жизни животных из группы 3 была сопоставима по срокам с показателями из группы 1, что позволило предположить, что Композиция не имеет собственного противоопухолевого эффекта в отношении глиобластомы 101/8. Некоторое численное снижение продолжительности жизни в гр.З по сравнению с гр.1 (-8%) статистически недостоверно и вызвано скорее гетерогенностью роста опухоли у животных, чем гипотетическим противоопухолевым действием композиции, так как данные различия статистически незначимы.

Несмотря на то, что доксорубицин не проникает через ГЭБ в гр. 2 обнаружено небольшое УПЖ - 18%. Данный эффект является типичным в заданных условиях, и вероятно, объясняется тем, что ГЭБ опухоли становится частично проницаемым к 3-й инъекции (8 день роста опухоли) и доксорубицин проникает в мозг и оказывает небольшой цитотоксический эффект.

В таблице приведены показатели СПЖ, УПЖ и медиана (Me) продолжительности жизни животных по четырем группам.

Таблица 1 - Средняя продолжительность жизни и увеличение продолжительности жизни животных после проведенной терапии.

Кол-во СПЖ Me УПЖ к Достоверность разницы по животны (M±SD) контрол Манну-Уиттни х п ю, %

К гр.1 К гр. 2. (Контроль) (Доксорубиц ин)

Гр. 1 Контроль 12 16,3±2,2 16 Р<0,05

Гр.2 Доксорубицин 9 20,7±7,1 18 27 Р<0,05

Гр.З Гемоглобин 6 15±4,2 13,5 -8 Не Р<0,05 полимеризованный достоверно

Гр.4 Докс+Гемоглобин 10 54±31 48,5 231 Р<0,01 Р<0,01 полимеризованный

Обозначения: М- среднее, SD- стандартное отклонение, Me- медиана, УПЖ - увеличение продолжительности жизни.

Пример 2. Гемоглобин полимеризованный крупного рогатого скота применялась в качестве средства, обладающего адьювантными свойствами при химиотерапии мультиформной глиобластомы. Эффективность применения оценивалась на модели перевиваемой глиобластомы крысы 101/8 на взрослых половозрелых крысах-самцах Wistar, самцы с массой тела 150-180 г.

Перевиваемая глиобластома крысы 101/8. Животным проводили ИП на 2, 5 и 8 сутки после имплантации опухоли. Препараты вводили в хвостовую вену. В группе комбинированной терапии препараты вводили последовательно в одну вену.

Крысы были разделены на четыре группы:

Группа 1. Контроль. Животным имплантировали глиобластому 101/8 и наблюдали за продолжительностью жизни. Терапию не проводили.

Группа 2. Доксорубицин. Животным с имплантированной глиобластомой проводили терапию водным раствором доксорубицина («Тева», Израиль) в дозе 1,5 мг/кг.

Группа 3. Гемоглобин полимеризованный крупного рогатого скота. Животным с имплантированной глиобластомой проводили терапию раствором гемоглобина полимеризованного в PBS в дозе 456 мг/кг.

Группа 4 «Гемоглобин полимеризованный+ доксорубицин». Животным проводили комбинированную терапию: доксорубицин в дозе 1,5 мг/кг и гемоглобин полимеризованный в дозе 456 мг/кг. Животных вскрывали на 14 сутки после инокуляции опухоли, черепную коробку вскрывали, опухоль выделяли из головного мозга, Макроскопическое (визуальное) исследование мозга проводили по следующим параметрам:

• изменения внешнего вида мозга (цвет, форма);

• наличие визуально определяемого отека мозга;

• наличие визуально определяемых очагов кровоизлияний и их локализация.

Изменения оценивали полуколичественно от 0 до 2 баллов по каждому параметру, где 0 - отсутствие изменений, 2 - умеренно выраженные изменения, 2 - резко выраженные изменения. Суммарный показатель выраженности опухолевого роста (ПВОР) по отдельным животным составлял от 0 до 9.

Выделенный мозг фиксировали в забуференном формалине 48 часов, делали срезы и проводили гистологическое исследование по стандартной методике.

Результаты макроморфологических исследований: во всех группах была обнаружена опухоль в месте инокуляции (правое полушарие, вокруг бокового желудочка с прорастанием в боковой желудочек), выраженность кровоизлияний в окружающих тканях головного мозга, визуально определяемый отек и некрозов в ткани опухоли были одинаковыми для всех групп.

Во 2 и 4 группах на 14 сутки развития опухоли суммарный показатель опухолевого роста был меньше, чем этот показатель в группе контроля без лечения. При этом в 4 группе (Гемоглобин полимеризованный + доксорубицин) данный показатель был ниже, чем во 2 группе, получавшей только доксорубицин.

По результатам оценки макроморфологических изменений мозга введение гемоглобина полимеризованного повышало эффективность доксорубицина гидрохлорида. Суммарный показатель выраженности опухолевого роста в 4 группе статистически значимо отличался от этого параметра для групп 1-3 (Фиг.2) .

Таблица 2 - Суммарный показатель опухолевого роста

Введение только гемоглобина полимеризованного не вызывало значимого уменьшения объема опухоли. Была обнаружена значительная гетерогенность результатов, как в контрольных, так и в опытных группах, обусловленная индивидуальным генетическим полиморфизмом крыс Wistar. Тем не менее, в значении суммарного показателя опухолевого роста для разных групп выявлены статистически значимые различия, показывающие адьювантную активность гемоглобина полимеризованного, повышающего эффект доксорубицина, по сравнению с введением только доксорубицина.

По результатам гистологической оценки срезов опухоли отмечались все основные характеристики роста глиобластомы 101/8, определяющие течение процесса опухолеобразования. По сравнению с нелеченными животными интенсивность клеточного обновления глиобластомы 101/8 была выше у леченных доксорубицином животных, эффект был более выражен за счет повышения интенсивности гибели клеток. По количеству митозов отличий между группами обнаружено не было.

В результате проведенных исследований было установлено, что предлагаемое адъювантное средство на основе полимеризованного гемоглобина обладает функцией модификатора эффективности химиотерапии злокачественных опухолей. Внутривенное введение полимеризованного гемоглобина может оказывать адъювантный эффект при проведении химиотерапевтического лечения глиомы/глиобластомы.

Таким образом, модифицирующее химиотерапевтическое воздействие было достигнуто путем введения в организм экспериментальных животных следующих доз:

• 228 мг/кг массы тела гемоглобина полимеризованного

• 456 мг/кг массы тела гемоглобина полимеризованного

Назначаемая для приема доза гемоглобина полимеризованного варьирует в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол, масса тела, симптомы и тяжесть заболевания, способ введения химиопрепарата, в виде которого назначается.

Обычно, общая назначаемая доза составляет от 114 мг/кг до 456 мг/кг в день. Общая доза при капельном введении действующего вещества может быть разделена на несколько доз, например, для введения от 1 до 4 раз. Эффективная терапевтическая доза препарата может быть выбрана лечащим врачом.