MARTÍNEZ TABOADA, Víctor (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
FONTALBA ROMERO, Ana (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
GUTIÉRREZ SAIZ, Olga (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
FERNÁNDEZ LUNA, José Luis (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
MARTÍNEZ TABOADA, Víctor (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
FONTALBA ROMERO, Ana (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
GUTIÉRREZ SAIZ, Olga (Fundación Marqués De Valdecilla, Escuela Universitaria de Enfermería 5ª pl., Av. Valdecilla s/n Santander, E-39008, ES)
REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR, que comprende la detección de un polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8
(CyslOStop/ClOX) en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de este polimorfismo en, al menos, un alelo del gen CARD8 es indicativa de una evolución más rápida de la actividad de la AR padecida por el sujeto que la evolución de la actividad de la AR padecida por un sujeto diagnosticado de AR que no presenta el polimorfismo.
2. Método según la reivindicación 1, en la que la detección del polimorfismo en ambos alelos del gen CARD8 es indicativo de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más activa o grave en comparación con la evolución de la actividad de dicha enfermedad en pacientes que no tienen este polimorfismo, o tienen el polimorfismo en un único alelo.
3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en la que la actividad de la AR se mide empleando el parámetro DAS o DAS68.
4. Un método in vitro para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR que comprende detectar un polimorfismo en el gen CARD8, que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR, en donde la presencia de dicho polimorfismo en, al menos, un alelo del gen CARD8, es indicativa de una baja eficacia del fármaco en el tratamiento de la AR.
5. Método para diseñar una terapia personalizada a sujeto diagnosticado con AR que comprende
(i) detectar un polimorfismo en el gen CARD8, que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, y (ii) en caso de detectar dicho polimorfismo, seleccionar un fármaco que no vaya dirigido a bloquear la actividad de NFKB en el tratamiento de la AR.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra biológica procedente de dicho sujeto es una muestra sanguínea o una muestra de tejido que comprende un ácido nucleico.
7. Método según la reivindicación 6, en donde el ácido nucleico es ADN o ARN.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la detección del polimorfismo comprende
(a) una reacción de amplificación empleando oligonucleotidos específicos para el gen CARD8, y/o
(b) una reacción enzimática de restricción empleando la enzima AIwI.
9. Método según la reivindicación 8, en la que la reacción de amplificación es seleccionada entre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por desplazamiento de banda, la amplificación basada en la transcripción, la replicación se secuencia auto-sostenida (3SR), el sistema de la replicasa Qβ, la amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), la reacción de reparación en cadena (RCR) y la amplificación por la polimerasa del fago phi29.
10. Método según las reivindicaciones 8 y/ó 9 que comprende, además, la detección del polimorfismo con una reacción de hibridación mediante una sonda de oligonucleotidos marcada específica para el gen CARD8.
11. Empleo de un polimorfismo en el gen CARD8 como marcador genético de pronóstico en un sujeto diagnosticado con AR 5 en el que dicho polimorfismo da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX).
12. Uso de un kit para predecir la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de un polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX).
13. Uso de un kit para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado con AR a los fármacos administrados en el tratamiento de dicha enfermedad que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de un polimorfismo en el gen CARD8, que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX).
14. Uso según la reivindicación 12 ó 13, en el que el reactivo específico es una secuencia de nucleótidos, preferentemente, ADN o ARN.
15. Un método in vitro para predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR, que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de dicha proteína es indicativa de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más lenta que la actividad de la AR padecida por un sujeto que no presenta dicha proteína o, alternativamente,
(ii) la cuantificación de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde si la cantidad de proteína CARD8 detectada es menor que la cantidad de proteína CARD 8 detectada en un sujeto que no presenta el polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), entonces dicha cantidad es indicativa de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más rápida que la evolución de la actividad de la AR padecida por un sujeto diagnosticado con AR que no presenta dicho polimorfismo en el gen
CARD8.
16. Método según la reivindicación 15, en la que la actividad de la enfermedad se mide empleando el parámetro DAS o DAS68.
17. Un método in vitro para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR, que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR, en donde la presencia de dicha proteína es indicativa de la alta eficacia del fármaco en el tratamiento de la AR o, alternativamente,
(ii) la cuantificación de la proteína CARD 8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado de AR, en donde si la cantidad de proteína CARD8 detectada es menor que la cantidad de proteína CARD 8 detectada en un sujeto que no presenta el polimorfismo en el gen CARD 8 que da lugar a la aparición de codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), entonces dicha cantidad es indicativa de que los fármacos administrados son menos eficaces que si los fármacos se administran a un sujeto diagnosticado con AR que no presenta dicho polimorfismo en el gen CARD 8.
18. Método para diseñar una terapia personalizada a un sujeto diagnosticado con AR que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, y (ii) en caso de detectar dicha proteína, seleccionar un fármaco que vaya dirigido a bloquear la actividad de NFKB en el tratamiento de la AR.
19. Método según la reivindicación 15 a 18, en la que la detección o cuantificación de la proteína CARD8 se lleva a cabo mediante western-bloting, ELISA o Radioinmunoensayo (RIA).
20. Empleo de la proteína CARD8 como marcador de pronóstico en un sujeto diagnosticado con AR.
21. Uso de un kit para predecir la evolución de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de la proteína CARD 8.
22. Uso de un kit para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de la proteína CARD8.
23. Uso según la reivindicación 21 ó 22, en el que el reactivo específico es un anticuerpo. |
EMPLEO DE UN POLIMORFISMO EN EL GEN CλRD8 PARA PRONóSTICO
DE LA ARTRITIS REUMATOIDE
CAMPO DE LA INVENCIóN
La presente invención se relaciona con un polimorfismo asociado con la artritis reumatoide y su empleo como marcador genético en un método para el pronóstico de la misma.
ANTECEDENTES
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria de etiología desconocida que se caracteriza por la afectación de las articulaciones diartrodiales y por el desarrollo de una sinovitis crónica que va a conducir de forma progresiva a la destrucción articular, a la incapacidad funcional y a un importante deterioro de la calidad de vida de los pacientes. Además de la afectación articular, la AR se va a caracterizar también por un proceso inflamatorio sistémico mantenido y por la posibilidad de desarrollar manifestaciones extra-articulares graves que a menudo van a condicionar el pronóstico de la enfermedad. La AR es la enfermedad articular inflamatoria crónica más frecuente y su prevalencia en España es del 0,5%.
La historia natural de la AR es larga y no existe ningún tratamiento que haya demostrado ser curativo. El objetivo del tratamiento de la AR es inducir la remisión completa de la enfermedad o, alternativamente, conseguir la mínima actividad inflamatoria posible.
En el momento actual, se recomienda que todos los pacientes con AR sean tratados con un fármaco modificador de la evolución (FME) tan pronto como se establezca el diagnóstico clínico de la enfermedad, independientemente del cumplimiento de los criterios de clasificación del ACR (American College of Rheumatology) para AR, puesto que la precocidad en el inicio del tratamiento se asocia con una mayor probabilidad de respuesta favorable. El tratamiento inicial recomendado en todos los pacientes que no hayan sido tratados anteriormente con ningún FME es el metotrexato (MTX) o, si se prevé un curso especialmente incapacitante por las características de la
enfermedad, puede estar indicada la terapia combinada de inicio con MTX y un agente anti-TNF (anti-factor de necrosis tumoral) con el objetivo de inducir una rápida remisión y posteriormente, intentar retirar el agente anti-TNF y mantener la remisión de la AR con el MTX en monoterapia.
Una vez iniciado cualquier tipo de tratamiento hay que evaluar la respuesta utilizando el DAS (Disease Activity Score) y monitorizar su toxicidad. Si en el plazo de 3 meses no se obtiene una respuesta satisfactoria o aparece toxicidad relacionada con el/los FME/s empleado/s, se debe valorar la posibilidad de cambiar el tratamiento, añadir un nuevo fármaco o modificar su posología. Es imprescindible que un paciente con AR que no haya respondido a un determinado tratamiento con FME, en monoterapia o combinación, pueda optar a otros tratamientos de probada eficacia en un plazo de tiempo lo más breve posible.
El pronóstico de la AR es variable de unos pacientes a otros. Dado que la mayor proporción de alteraciones radiológicas y en menor grado, de pérdida de la capacidad funcional, ocurre en los 2 ó 3 primeros años de evolución, cuanto antes se pueda establecer un pronóstico sobre la enfermedad antes se tendrán mayores elementos para tomar una decisión fundada sobre la estrategia de tratamiento más adecuada.
En la evaluación del pronóstico hay que tener en cuenta factores sociodemográficos, marcadores genéticos, factores dependientes de la enfermedad, factores dependientes del tratamiento y factores psicológicos y sociales, aunque en el momento actual y con las herramientas de las que se dispone es difícil predecir la evolución de la enfermedad en un paciente concreto. No existe ningún parámetro que por sí sólo permita estimar el pronóstico de la AR, por lo que se debe recurrir a la combinación de varios de ellos. En este sentido conviene no olvidar que el peor factor pronóstico es la inflamación articular mantenida.
Se consideran factores predictivos de incapacidad funcional, erosiones radiológicas y/o mortalidad, y en consecuencia de mal pronóstico, los siguientes:
Factores sociodemográficos: sexo femenino y bajo nivel de estudios.
Marcadores genéticos: hasta la fecha no existen marcadores genéticos bien identificados. El HLA-DRBl se ha sugerido como factor pronóstico en determinadas poblaciones, pero no se ha podido comprobar su utilidad de forma universal. - Factores dependientes de la enfermedad: FR positivo, anti-CCP positivo, N 0 elevado de articulaciones tumefactas, elevación de los reactantes de fase aguda, HAQ elevado, rapidez de aparición de las erosiones y presencia de manifestaciones extra-articulares. Factores dependientes del tratamiento: tiempo de tratamiento y retraso en el inicio del tratamiento con FMEs.
Factores psicológicos y sociales: depresión y apoyo social.
Como se ha comentado previamente, la AR es una enfermedad frecuente, que se acompaña de una importante incapacidad funcional y por lo tanto, de un coste económico y social muy elevado. A pesar de que en la actualidad se disponen de agentes terapéuticos eficaces, sólo un porcentaje muy reducido de los pacientes puede alcanzar la remisión completa de la enfermedad. A día de hoy, no se disponen de marcadores que puedan predecir de forma fiable la evolución y el pronóstico a medio- largo plazo de la enfermedad, lo que impide diseñar estrategias terapéuticas de distinta intensidad asociada a estos marcadores pronósticos.
La identificación de nuevos marcadores pronósticos en la AR que puedan ayudar a seleccionar distintos subgrupos de pacientes con formas más graves de la enfermedad, permitirá el desarrollo de terapias más precoces e intensivas, lo que contribuirá sin ninguna duda a mejorar el pronóstico de esta enfermedad.
COMPENDIO DE LA INVENCIóN
La presente invención describe la asociación entre el polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 y el pronóstico de la artritis reumatoide (AR) en pacientes que ya han sido diagnosticados con dicha enfermedad, por lo que la detección de dicho polimorfismo permite predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en dicho sujeto, determinar el tratamiento apropiado y monitorizar la efectividad del tratamiento a lo largo del tiempo durante el desarrollo de la enfermedad.
Por tanto, en un aspecto la presente invención se relaciona con un método in vitro para predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR, que comprende la detección de un polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX) en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de este polimorfismo en, al menos, un alelo del gen CARD8 es indicativa de una evolución más rápida de la actividad de la AR padecida por el sujeto que la evolución de la actividad de la AR padecida por un sujeto diagnosticado de AR que no presenta el polimorfismo.
En otro aspecto, la presente invención también se relaciona con un método in vitro para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR que comprende detectar el polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR, en donde la presencia de dicho polimorfismo en, al menos, un alelo del gen CARD8, es indicativa de una baja eficacia del fármaco en el tratamiento de la AR.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diseñar una terapia personalizada a un sujeto diagnosticado con AR que comprende
(i) detectar el polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, y (ii) en caso de detectar dicho polimorfismo, seleccionar un fármaco que no vaya dirigido a bloquear la actividad de NFKB en el tratamiento de la AR.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del polimorfismo rs2043211 como marcador genético de pronóstico en la AR.
Aspectos adicionales de la presente invención lo constituyen el uso de kits para predecir la actividad de AR en un sujeto diagnosticado con AR, o la respuesta de un sujeto diagnosticado con AR a los fármacos administrados en el tratamiento de dicha enfermedad que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia polimorfismo rs2043211.
Análogamente al empleo de la detección del polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 para predecir la evolución de la actividad de la AR, la detección o cuantificación de la proteína CARD8 también puede emplearse para predecir la evolución de la actividad de Ia AR.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR, que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de dicha proteína es indicativa de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más lenta que la actividad de la AR padecida por un sujeto que no presenta dicha proteína o, alternativamente,
(ii) la cuantificación de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde si la cantidad de proteína CARD8 detectada es menor que la cantidad de proteína CARD 8 detectada en un sujeto que no presenta el polimorfismo rs2043211, entonces dicha cantidad es indicativa de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más rápida que la evolución de la actividad de la AR padecida por un sujeto diagnosticado con AR que no presenta dicho polimorfismo en el gen CARD8.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR, que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR, en donde la presencia de dicha proteína es indicativa de la alta eficacia del fármaco en el tratamiento de la AR o, alternativamente,
(ii) la cuantificación de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado de AR, en donde si la cantidad de proteína CARD8 detectada es menor que la cantidad de proteína C ARD 8 detectada en un sujeto que no presenta el polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8, entonces dicha cantidad es indicativa de que los fármacos administrados son menos eficaces que si los fármacos se administran a un sujeto diagnosticado con AR que no
presenta dicho polimorfismo en el gen CARD8.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diseñar una terapia personalizada a un sujeto diagnosticado con AR que comprende (i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, y
(ii) en caso de detectar dicha proteína, seleccionar un fármaco que vaya dirigido a bloquear la actividad de NFKB en el tratamiento de la AR.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de la proteína CARD8 como marcador de pronóstico en un sujeto diagnosticado con AR. La presencia de dicha proteína en un sujeto diagnosticado con AR es indicativa de que el pronóstico de la enfermedad es positivo, es decir, el número de articulaciones inflamadas o tumefactas en dicho sujeto no va a aumentar a lo largo del tiempo (o su aumento va a ser lento), en comparación con sujetos que no presentan dicha proteína CARD8.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit para predecir la evolución de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de la proteína CARD8.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de la proteína CARD8.
BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra el análisis del polimorfismo ClOX en la proteína CARD 8. Análisis representativo de los genotipos de CARD8 en ADN genómico de sujetos normales mediante secuenciación (A) de ADN y mediante PCR seguido de digestión (B) de AIwI. Obsérvese que la banda inferior visualizada en el gel de agarosa contiene ambos fragmentos de restricción (152 y 165 pb). (C) Representación esquemática de la proteína CARD 8 que muestra la localización del polimorfismo ClOX que genera un codón de terminación prematuro. (D) Se analizó la expresión de la proteína CARD8 en células de sangre periférica mediante inmunotransferencia de tipo Western con un
anticuerpo policlonal específico. Obsérvese la ausencia de la proteína en portadores del genotipo AA. Se determinaron también los niveles de αTubulina para garantizar una misma carga. (E) Se transfectaron células HEK293T con la isoforma de CARD8 de tipo natural, L, o truncada, S, y se analizó a continuación mediante inmunotransferencia de tipo Western. V, células transfectadas con el vector de expresión vacío como control negativo.
La Figura 2 es un gel de electroforesis que muestra la correlación entre los genotipos de CARD8 y la capacidad de unión de ADN de NFKB. Se analizaron diferentes líneas celulares que llevan los genotipos (A) TT o los AA con respecto a la formación de complejos de unión NFKB-ADN mediante un ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando una sonda radiomarcada que contiene una secuencia (B) consenso de NFKB. Se preincubaron extractos nucleares con anticuerpos frente a subunidades de NFKB (p50 y p65) y con anticuerpos anti-GATA 1 irrelevantes para demostrar la especificidad de la unión.
La Figura 3 son unas gráficas que muestran la capacidad de las variantes de CARD8 para modular la actividad transcripcional de NFKB. (A) Se transfectaron células HEK293 con las cantidades indicadas de las variantes de CARD8 cortas, S, y largas, L, con una plásmido indicador de luciferasa que contiene seis elementos receptivos de NFKB. Tras 16 horas de tratamiento con TNFα inductor de NFKB se determinó la actividad de luciferasa. (B) Expresión de las variantes de proteína de CARD 8 en células transfectadas. (C) y (D) Se transfectaron dos líneas celulares con las variantes de CARD8 y después se trataron, o no, con TNFα. Se determinaron los niveles de ARNm de dos genes diana de NFKB, cIAPl y Al mediante RT-PCR cuantitativo. V, células transfectadas con el vector de expresión vacío como control negativo.
La Figura 4 son unas gráficas que muestran la asociación entre el desenlace de pacientes con AR y los genotipos de CARD8. (A) Frecuencia de las diferentes características clínicas estudiadas en portadores de los diferentes genotipos en un estudio retrospectivo (n = 91). (B) Estudio prospectivo (n = 109) que muestra la actividad de la enfermedad (DAS) durante un periodo de seguimiento de dos años.
DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN
En la evaluación del pronóstico de la AR hay que tener en cuenta numerosos factores, tales como, factores sociodemográficos, marcadores genéticos, factores dependientes de la enfermedad, factores dependientes del tratamiento y factores psicológicos y sociales. En el momento actual y con las herramientas de las que se disponen, es difícil predecir la evolución de la enfermedad en un paciente concreto pues no existe ningún parámetro que, por sí sólo, permita estimar el pronóstico de la AR.
Sorprendentemente, los inventores de la presente invención han descubierto que la presencia de un polimorfismo en el gen CARD8 (rs2043211), que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), en un sujeto diagnosticado con AR, permite predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en dicho sujeto, determinar el tratamiento apropiado y monitorizar la efectividad del tratamiento a lo largo del tiempo durante el desarrollo de la enfermedad. Dicho polimorfismo, ahora asociado con la artritis reumatoide, era conocido en el estado de la técnica como asociado a la enfermedad de Crohn y la enfermedad del intestino inflamado (IBDV) [Dermot, P.B., et al. 2006. TUCáN (CARDS) Genetic Variants and Inftammatory Bowel Disease. Gastroenterology, VoI. 131: 1190-1196]
Según se entiende en la presente invención, un "polimorfismo" es la existencia de dos o mas alelos de un gen presentes en una población, en una frecuencia de, al menos, un uno por ciento. Es decir, un polimorfismo es una variación en la secuencia de nucleótidos de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una misma población.
El polimorfismo rs2043211 es un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el gen CARD8/TUCAN que comprende una tansversión de Timina (T) a Adenina (A) 5 lo que causa la aparición de un codon stop (TGA) en lugar de un codon que codifica un resto de cisteína (TGT) en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos (CyslOStop/ClOX). Dicho polimorfismo origina el truncamiento de la proteína CARD8/TUCAN codificada por dicho gen.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro, para predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR, de aquí en adelante "método A", que comprende la detección de un polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX) en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de este polimorfismo en, al menos, un alelo del gen CARD8 es indicativa de una evolución más rápida de la actividad de la AR padecida por el sujeto que la evolución de la actividad de la AR padecida por un sujeto diagnosticado de AR que no presenta el polimorfismo.
Adicionalmente, si dicho polimorfismo rs2043211 está presente en ambos alelos del gen CARD8, entonces la evolución de la actividad de la AR en el sujeto diagnosticado con dicha enfermedad va a ser más activa o grave que si el polimorfismo es detectado en un único alelo.
Por tanto, en una realización particular, el método A comprende la detección del polimorfismo en ambos alelos del gen CARD8, lo cuál es indicativo de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más activa o grave en comparación con la evolución de la actividad de dicha enfermedad en pacientes que no tienen este polimorfismo, o tienen el polimorfismo en un único alelo.
Según se emplea en la presente descripción, la expresión "actividad de la AR" se refiere a la presencia de inflamación en un sujeto diagnosticado de AR. La evaluación de la actividad de la AR se apoya en la valoración de un conjunto de parámetros que incluyen, el número de articulaciones dolorosas y tumefactas, la VSG (velocidad de sedimentación globular) y la valoración de la actividad de la enfermedad por el paciente en una EVA (escala analógica visual). Todos estos parámetros se integran en el DAS (Disease Activity Score), que es un método validado y ampliamente aceptado para evaluar y monitorizar la actividad de la AR.
El DAS es el método más utilizado en la práctica clínica e incluye el número de articulaciones dolorosas sobre 44 (índice de Ritchie), número de articulaciones
tumefactas, velocidad de sedimentación globular y la evaluación de la actividad global de la enfermedad por el paciente en una EVA de 10 cm en donde "0" muy bien y "10" muy mal. El cálculo del DAS se realiza según la fórmula siguiente:
DAS= 0,54(vIR) + 0,065 (NAT 44) + 0,33 (In VSG) + 0,0072 (EVA)
Se recomienda el índice completo basado en la exploración de 68 articulaciones para el dolor y 66 para la tumefacción (excluye caderas) (DAS 68). Existe un DAS modificado basado en el recuento de 28 articulaciones (DAS 28), que excluyen las articulaciones de los pies y los tobillos:
DAS 28=0,56(vNAD28) + 0,28 (vNAT28) + 0,70 (In VSG) + 0,014 (EVA) siendo
IR= índice de Ritchie; NAT= Número de articulaciones tumefactas; VSG= velocidad de sedimentación globular; NAD= número de articulaciones dolorosas. .
Por tanto, en una realización particular del método de la invención, la actividad de la AR se mide empleando el parámetro DAS o DAS68.
Así, en la presente invención se entiende por "evolución de la actividad de la AR" al número de articulaciones inflamadas o tumefactas que va a presentar un sujeto diagnosticado con AR a lo largo del tiempo, es decir, cuando en la presente invención se indica que, por ejemplo, "la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más activa o grave en comparación con la evolución de la actividad de dicha enfermedad en pacientes que no tienen dicho polimorfismo rs2043211", quiere decir que el número de articulaciones inflamadas o tumefactas que presenta el sujeto que tiene el polimorfismo va a aumentar a lo largo del tiempo, dando lugar a una manifestación más grave de la enfermedad en comparación con un sujeto que no tiene dicho polimorfismo (en caso de no presentar el polimorfismo, el número de número de articulaciones inflamadas o tumefactas no va a aumentar a lo largo del tiempo o el aumento va a ser más lento).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para predecir la
eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR, de aquí en adelante método B, que comprende detectar el polimorfismo rs2043211 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR, en donde la presencia de dicho polimorfismo en, al menos, un alelo del gen CARD8, es indicativa de una baja eficacia del fármaco en el tratamiento de la AR.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diseñar una terapia personalizada a un sujeto diagnosticado con AR, de aquí en adelante método C, que comprende (i) detectar un polimorfismo en el gen CARD8, que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, y
(ii) en caso de detectar dicho polimorfismo, seleccionar un fármaco que no vaya dirigido a bloquear la actividad de NFKB en el tratamiento de la AR.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fármacos empleados en el tratamiento de la AR que no van dirigidos a bloquear la actividad de NFKB son los esteroides, inhibidores de COX2 (Celebrex, Vioxx), etc.
La detección del polimorfismo en el gen CARD8 en cualquiera de los métodos de la invención, métodos A, B y C, puede realizarse por mediante múltiples procedimientos conocidos por el experto en la materia, los cuales implican el aislamiento del ácido nucleico de una muestra biológica procedente del sujeto que se quiere evaluar.
El aislamiento del ácido nucleico de la muestra biológica puede realizarse por procedimientos conocidos por el experto en la materia. Dichos procedimientos pueden encontrarse, por ejemplo, en Sambrook y cois., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3 rd ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., VoI. 1-3.
Además, la presente invención no está limitada por la fuente de ácido nucleico, sino que la muestra biológica puede comprender sangre, saliva, fluido amniótico, tejido, etc. Así, en una realización particular de la invención, la muestra biológica procedente del sujeto
es una muestra sanguínea o una muestra de tejido que comprende un ácido nucleico, preferentemente, ADN o ARN.
Posteriormente al aislamiento del ácido nucleico, se procede a la detección del polimorfismo. Sistemas y métodos para la detección de polimorfismos asociados a genes incluyen, pero no se limitan a, métodos de hibridación y tecnología array (e.g. tecnología disponible de Aclara BioSciences, Affymetrix, Agilent Technologies, Inc., etc), métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (e.g. TAQMAN, Applera Corp., GENECODE system, Erigen, etc.), ensayos de extensión de círculo rodante, ensayos de excisión invasiva, uso de espectroscopia de masas, ensayos de hibridación empleando una sonda complementaria al polimorfismo, ensayo de extensión de cebadores, métodos de escisión enzimática, NASBA, métodos de hibridación en sandwich, métodos que emplean marcadores moleculares, reacción en cadena de la ligasa y similares. Métodos de llevar a cabo la detección de polimorfismos se describen en Sambrook y cois., 2001 (citado at supra) y en la solicitud de patente US2007/0105128.
Preferentemente, la detección del polimorfismo en la presente invención se lleva a cabo mediante la técnica del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción ó RFLP (restriction fragment length polymorphism) tal como se muestra en el Ejemplo que acompaña a la presente descripción que comprende, básicamente, en detectar el polimorfismo empleando enzimas de restricción.
Por tanto, en una realización particular de la presente invención, la detección del polimorfismo comprende
(a) una reacción de amplificación empleando oligonucleotidos específicos para el gen CARD8, y/o
(b) una reacción enzimática de restricción empleando la enzima AIwI.
En una realización todavía más particular, la reacción de amplificación es seleccionada entre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la amplificación por desplazamiento de banda, la amplificación basada en la transcripción, la replicación se secuencia auto-sostenida (3SR), el sistema de la repíicasa Qβ, la amplificación basada
en la secuencia de ácido nucleico (NASBA), la reacción de reparación en cadena (RCR) y la amplificación por la polimerasa del fago phi29.
A continuación de la reacción enzimática, los fragmentos obtenidos se separan 5 mediante, por ejemplo, una electroforesis en gel y dependiendo del número de fragmentos obtenidos, se determina la presencia o no del polimorfismo.
En una realización todavía más particular, la detección del polimorfismo comprende, además, una reacción de hibridación mediante una sonda de oligonucleótidos marcada ó específica para el gen CARD8.
Tal como se ha indicado anteriormente, la presencia del polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 en un sujeto diagnosticado con AR, permite predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en dicho sujeto. 5
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo del polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 como marcador genético de pronóstico en un sujeto diagnosticado con AR, en el que dicho polimorfismo da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la0 proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX).
Aspectos adicionales de la presente invención lo constituyen el uso de kits que comprenden, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia del polimorfismo rs2043211, para predecir la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado5 con AR o la respuesta de un sujeto diagnosticado con AR a los fármacos administrados en el tratamiento de dicha enfermedad
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit para predecir la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR que comprende, al menos, un0 reactivo específico para detectar la presencia del polimorfismo rs2043211, es decir, un polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX).
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit para predecir la respuesta de un sujeto diagnosticado con AR a los fármacos administrados en el tratamiento de dicha enfermedad que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia del polimorfismo rs2043211.
En una realización particular, el reactivo específico comprendido dentro del kit es una secuencia de nucleótidos, preferentemente, ADN o ARN. Dicha secuencia de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, una sonda que híbrida específicamente con la secuencia de nucleótidos que comprende el polimorfismo rs2043211, una pareja de cebadores para amplificar la región del gen CARD8 donde se encuentra dicho polimorfismo, etc.
Como se ha explicado al inicio de la presente descripción, la presencia del polimorfismo rs2043211 en el gen CARD8 origina el truncamiento de la proteína CARD8/TUCAN codificada por dicho gen. Por tanto, la presencia o ausencia de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR permite predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en dicho sujeto, determinar el tratamiento apropiado y monitorizar la efectividad del tratamiento a lo largo del tiempo durante el desarrollo de la enfermedad.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para predecir la evolución a lo largo del tiempo de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR, que comprende (i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde la presencia de dicha proteína es indicativa de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más lenta que la actividad de la AR padecida por un sujeto que no presenta dicha proteína o, alternativamente, (ii) la cuantificación de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, en donde si la cantidad de proteína CARD8 detectada es menor que la cantidad de proteína CARD8 detectada en un sujeto que no presenta el polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de un
codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), entonces dicha cantidad es indicativa de que la evolución de la actividad de la AR padecida por el sujeto va a ser más rápida que la evolución de la actividad de la AR padecida por un sujeto diagnosticado con AR que no presenta dicho polimorfismo en el gen
CARD8.
En una realización particular, la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con dicha enfermedad, se mide empleando el parámetro DAS o DAS68.
El significado de expresiones como "actividad de la AR" o "evolución de la actividad de la artritis reumatoide" yá han sido ampliamente explicadas en la presente descripción.
El presente método comprende la detección o, alternativamente, la cuantificación de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR. Dicha muestra biológica puede ser orina, sangre, plasma, suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial, bilis, semen, líquido cefalorraquídeo, etc. Preferentemente, la muestra biológica será una muestra de tejido. La muestra biológica puede obtenerse por cualquier método convencional conocido en el estado de la técnica.
La puesta en práctica del presente método requiere la detección de la proteína CARD8 o, alternativamente, la cuantificación de la proteína CARD8. Tanto la detección como la cuantificación de la proteína CARD8 pueden llevarse a cabo mediante técnicas ampliamente conocidas por el experto en la materia.
Así, la detección/cuantificación de la proteína CARD8 puede llevarse a cabo mediante el empleo de anticuerpos específicos contra uno o más epítopos de la proteína CARD8 y la posterior detección/cuantificación de los complejos antígeno-anticuerpo (proteína CARD8-anticuerpo).
Existe una amplia variedad de ensayos inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación de complejos específicos antígeno-anticuerpo; numerosos
ensayos de unión de proteínas, competitivos y no competitivos, han sido previamente descritos y un gran número de estos ensayos estás disponibles comercialmente.
La proteína CARD8 se puede cuantificar, por ejemplo, con anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos, específicos contra la proteína CARD8; siendo estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y derivados.
Existe una amplia variedad de ensayos bien conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, que utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas se incluyen el Western-blot o transferencia Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (Double antibody sandwich- ELISA o ensayo ELISA sandwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la proteína CARD8, incluyen técnicas de cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de unión a lectina.
Preferentemente, en una realización particular de la invención, la detección o cuantificación de la proteína CARD8 se lleva a cabo mediante western-bloting, ELISA o Radioinmunoensayo.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para predecir la
eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR, que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado con AR, en donde la presencia de dicha proteína es indicativa de la alta eficacia del fármaco en el tratamiento de la AR o, alternativamente,
(ii) la cuantificación de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de un sujeto diagnosticado de AR, en donde si la cantidad de proteína CARD8 detectada es menor que la cantidad de proteína CARD8 detectada en un sujeto que no presenta el polimorfismo en el gen CARD8 que da lugar a la aparición de codon de parada prematuro en la posición 10 de la secuencia de aminoácidos de la proteína CARD8 (CyslOStop/ClOX), entonces dicha cantidad es indicativa de que los fármacos administrados son menos eficaces que si los fármacos se administran a un sujeto diagnosticado con AR que no presenta dicho polimorfismo en el gen CARD8.
La detección o, alternativamente, la cuantificación de la proteína CARD8 puede llevarse a cabo por cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para diseñar una terapia personalizada a un sujeto diagnosticado con AR que comprende
(i) la detección de la proteína CARD8 en una muestra biológica procedente de dicho sujeto, y (ii) en caso de detectar dicha proteína, seleccionar un fármaco que vaya dirigido a bloquear la actividad de NFKB en el tratamiento de la AR.
Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de fármacos o principios activos empleados en el tratamiento de la AR dirigidos a bloquear la actividad de NFKB son inhibidores de TNFα (como etenercept and infliximab), inhibidores de IKK2 (como TCPA-I), inhibidores de la IL-I, inhibidores de IFN-β, la especia turmérico (turmeric) [Cúrcuma longa L.] etc.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de la proteína CARD8 como marcador de pronóstico en sujetos diagnosticados de AR, en el que dicha proteína es indicativa de que el pronóstico de la enfermedad es positivo en comparación con sujetos que no presentan dicha proteína CARD8.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de un kit para predecir la evolución de la actividad de la AR en un sujeto diagnosticado con AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de la proteína CARD 8.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit para predecir la eficacia de los fármacos administrados en el tratamiento de la AR que comprende, al menos, un reactivo específico para detectar la presencia de la proteína CARD 8.
En una realización particular de la invención, el reactivo específico es un anticuerpo.
El siguiente ejemplo pretende ser ilustrativo de la invención y en ningún caso, limitativo de la misma.
EJEMPLO
Empleo de un polimorfismo en el gen CARD8 como marcador de pronóstico de la AR
I. MATERIAL Y MéTODOS
Sujetos
Se evaluaron doscientos pacientes con AR diagnosticados según los criterios del Colegio Americano de Reumatología (Arnett, F.C., et al. (1988) The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 31, 315-24) de 1987. Se hizo un seguimiento de los pacientes en dos unidades de reumatología diferentes y tienen características diferentes (Tabla 1).
Tabla 1. Características principales de los pacientes con AR incluidos en el estudio cohorte 1 cohorte 2
(n= 91) (n = 109)
Mujeres (%) 68,1 72,5
Edad (años) 54,5 ± 13 * 52 ± 16 *
Intervalo hasta el diagnóstico
(meses) 33,6 ± 6 * 4 ± 2,3 *
Duración del seguimiento (años)
13,6 ± 0,7 * 2
FR positivo (%) 59,3 74,1
EC positivo (%) 58,2 61,7
Enfermedad erosiva (%) 90,1 95,9
Pacientes (%) tratados con:
FARME 98,9 88,3
Terapia combinada 52,7 34
Terapia biológica 23,1 22,3
media ± desviación estándar
* lapso de tiempo entre la aparición de los síntomas y el diagnóstico de AR. FR, factor reumatoide; EC, epítopo compartido (HLA-DRBl); FARME, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad.
Los pacientes sometidos a estudio en el Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (Santander) incluyeron 91 pacientes no seleccionados con AR de larga duración. Se disponía de estudios anteriores de muestras de ADN e información clínica, incluyendo datos demográficos, características de la enfermedad y tratamiento. Los pacientes a los que se hizo un seguimiento en el Hospital Universitario La Paz (Madrid) incluyeron 109 pacientes no seleccionados atendidos en la clínica de artritis temprana de la unidad de reumatología. Todos estos pacientes fueron sometidos a estudio de manera prospectiva cada seis meses y se registraron los datos demográficos, clínicos, radiológicos y de tratamiento en una base de datos. Como grupo control, se obtuvieron 200 muestras de ADN de sujetos de España no relacionados entre sí. Las muestras control procedían de personas que no tenían un historial conocido de enfermedad grave, incluyendo
trastornos infecciosos autoinmunológicos o crónicos. El estudio se aprobó por el Comité Etico de Investigación del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla y todos los sujetos dieron un consentimiento informado antes de la participación en este estudio.
Líneas celulares
Se mantuvieron las líneas celulares humanas Namalwa, 1411, DU145, 2102, SHSY5Y, Elijan, MCF7, y HEK293T en el medio RPMI 1640 (Biochrom KG, Berlín, Alemania) complementado con un 10% de suero de ternero fetal (Flow Laboratories, Irvine, CA). Se incubaron células SUMí 59 en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/HAM'S F-12 (Biochrom KG) complementado con un 5% de suero de ternero fetal, 5 μg/ml de insulina, y 1 μg/ml de hidrocortisona (ambas de SIGMA, St. Louis, MO).
Genotipifícación Se analizó un único polimorfismo de nucleótido (SNP ID: rs2043211) situado en el tercer nucleótido del codón 10 de CARD 8. Este polimorfismo consiste en una transversión de T por A que genera un codón de terminación prematuro.
Se extrajo ADN de sangre completa utilizando el kit de sangre QIAamp DNA (QIAGEN, Valencia, CA, EE.UU.) y se amplificó con cebadores para CARD8 5' GCCTATGCTATCATCAGGCACC 3' y 5' TTCATTCTCCCCTGAGTTCGAT 3' humana (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 respectivamente). El fragmento amplificado (317 pb) se digirió con AIwI (New England BioLabs, Beverly, MA), que reconoce el alelo A que genera dos fragmentos de 165 pb y 152 pb. Los productos de digestión se desarrollaron sobre un gel de agarosa al 2%. También se secuenciaron aproximadamente el 30% de todas las muestras de ADN en ambas direcciones con los mismos cebadores utilizados en la amplificación, para verificar la autenticidad del polimorfismo.
Ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
Se Usaron las células y se resuspendieron las fracciones nucleares en HEPES 20 mM de pH 7,9, NaCl 420 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, y glicerol al 20%. Se incubaron extractos nucleares (10 μg de proteína total) con una sonda de ADN de doble hebra
marcada con 32 P correspondiente a un sitio de NFKB de consenso [ 5 GGGAATTTCC 3 (SEQ ID NO: 3)]. Las muestras se desarrollaron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 5% en Tris-borato 200 mM, EDTA 2 mM. Se secaron los geles y se visualizaron mediante autorradiografía. Se llevaron a cabo supercambios utilizando anticuerpos policlonales de conejo específicos para p50, p65 y GATAl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)
PCR cuantitativa a tiempo real
Se preparó ARN total utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para evaluar la expresión de ARNm, se llevó a cabo un PCR a tiempo real cuantitativo tal como se describió previamente (Gutiérrez, O., et al. (2002) Induction of Nod2 in myelomonocytic and intestinal epithelial cells via nuclear factor-kappa B activation. J. Biol. Chem., 277, 41701-5). Se amplificó el ADNc generado utilizando cebadores para cIAP-1 humano, gliceraldehido-3-fostato-deshidrogenasa (Gutiérrez, O., et al. (2002) citado at supra) y Al (Inohara, N., et al. (2003) Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2. Implications for Crohn's disease. J Biol. Chem., 278, 5509-12). Se calculó la razón de la abundancia de transcritos cIAP-1 y Al con la de los transcritos GAPDH como descrito (Gutiérrez, O., et al. (2002) citado at supra).
Transfecciones y ensayos de indicadores de genes
Se cotransfectaron células HEK293T con 1-2 μg de ADNc de CARD8 clonado en el vector pCR3.1, 0,25 μg del plásmido indicador de pBVIx-Luc, que contiene seis sitios de reconocimiento de NFKB en la secuencia promotora unida al gen luciferasa (Inohara, N., et al (2001) Human Nodl Confers Responsiveness to Bacterial Lipopolysaccharides. J Biol. Chem., 276, 2551-2554) y 0,2 μg de pRSV-β- galactosidasa mediante lipofección utilizando Superfect (Qiagen, Hilden, Alemania). 24 horas después de la transfección, se incubaron las células con 5 ng/ml de TNFα durante 16 horas y a continuación se prepararon extractos de células y se analizaron con respecto a la actividad de luciferasa relativa mediante un sistema de ensayos de genes indicadores de doble luz (Applied Biosystems). Se normalizaron los resultados con respecto a la eficacia de la transfección con los valores obtenidos con pRSV-β-gal.
Análisis de inmunotransferencia de tipo Western
Se separaron extractos de células (60 μg de proteína) en un gel de poliacrilamida al 8%, y se transfirieron a nitrocelulosa como se describió en Benito, A., et al, 1996 (Benito, A., et al. (1996) Apoptosis induced by erythroid differentiation of human leukemia cell lines is mhibited by BcI-XL. Blood, 87, 3837-43). Se bloquearon las inmunotransferencias con BSA (albuminosa de suero bovino) al 3% y se incubaron con anti-CARD8 de conejo (Bouchier-Hayes, L., et al. (2001) CARDINAL, a novel caspase recruitment domain protein, is an inhibitor of múltiple NF-kappa B activation pathways. J Biol. Chem., 276, 44069-77), o anticuerpos anti-αTubulina de ratón (SIGMA) seguido de la incubación con anticuerpos anti-ratón o anti-conejo de cabra conjugados a fosfatasa alcalina. Se detectó un anticuerpo ligado mediante un sistema de quimioluminiscencia (Applied-Biosystems, Foster City, CA).
Análisis estadísticos
Se calcularon todas las estadísticas con el paquete estadístico SPSS (versión 13.0; SPSS, Inc., Chicago, IL). Las variables continuas se resumen como medias ± desviación estándar (SD). Las variables categóricas se compararon utilizando la prueba de chi- cuadrado o la prueba exacta de Fisher en caso apropiado. La prueba t de Student se utilizó para comparar variables continuas entre dos grupos. Se utilizó un análisis de la varianza de un factor con la prueba de comparación múltiple de Tukey después de esto para analizar diferencias en DAS media entre pacientes con diferentes genotipos de CARD8. Se determinó la puntuación de la actividad de la enfermedad en diferentes intervalos de tiempo llevando a cabo análisis de mediciones repetidas de la varianza. Con el fin de evaluar la contribución independiente de los genotipos de CARD8 al desenlace de la enfermedad, se incluyeron factores clínicos que se sabe que están asociados a la AR como covariantes en un análisis de regresión lineal múltiple. Todas las pruebas estadísticas fueron bidireccionales y el nivel de significancia se fijó a p<0,05.
II. RESULTADOS
Un polimorfismo de nucleótido único en CARD8 conduce a una proteína truncada
El SNP rs2043211 comprende una transversión de una T por una A (Figura IA y IB) y cambia un residuo de cisterna (TGT) por un codón de terminación (TGA) en la posición de aminoácido 10 (ClOX) que, presumiblemente conduce a una proteína severamente
truncada (Figura IC). El análisis de este SNP en 200 muestras de ADN de donantes normales reveló un 8% de portadores de genotipo AA y un 44% de AT. La relevancia de este polimorfismo se evaluó en primer lugar mediante el análisis de la expresión de la proteína CARD8 en células de sangre periférica procedente de portadores de diferentes genotipos, y como se muestra en la Figura ID, portadores homocigóticos del alelo A carecen de la proteína de longitud completa, y aquellos que portan ambos alelos muestran una reducción en los niveles de proteína CARD8. Para confirmar adicionalmente este resultado, se transfectaron células HEK293T con ADNc de CARD8 que porta o bien el polimorfismo T o bien el A y entonces se sometieron a análisis de inmunotransferencia de tipo Western. La Figura IE muestra que las células transfectadas con la construcción que contiene T (isoforma larga) produjo una proteína del tamaño esperado, y no produjo las que llevan el polimorfismo de terminación (isoforma corta).
El polimorfismo de ClOX suprime la capacidad de CARD8 para inhibir la señalización de NFKB
Los primeros 320 aminoácidos de CARD8 parecen contener la región responsable del efecto inhibidor sobre NFKB (Bouchier-Hayes, L., et al. (2001) CARDINAL, a novel caspase recruitment domain protein, is an inhibitor of múltiple NF-kappa B activation pathways. J Biol. Chem., 276, 44069-77). Así, se estudió si la proteína trucada en la posición de aminoácido 10 conservaba todavía la capacidad inhibidora. En primer lugar se analizó el polimorfismo de terminación ClO en un gran número de líneas celulares y se identificaron cuatro homocigóticos para el genotipo TT y cuatro para el genotipo AA (Figura 2A). La actividad de NFKB en estas células se evaluó mediante . EMSA utilizando una sonda consenso de NFKB. Como se muestra en la Figura 2B, tres de las células homocigóticas TT tienen muy poca o ninguna activación constitutiva de NFKB en comparación con la mayoría de las líneas celulares homocigóticas AA (Figura 2B). Para estudiar adicionalmente la relevancia del polimorfismo ClOX sobre la actividad de NFKB, se cotransfectaron células HEK293T con las variantes genéticas de CARD8 y un gen indicador de la luciferasa activado mediante una secuencia promotora que contiene seis elementos que responden a NFKB (Figura 3 A). La expresión de CARD8 exógeno se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western (Figura 3B). Puesto que TNFα se considera ampliamente como. uno de los estimulantes inflamatorios más
potentes, y conduce a la activación de NFKB, se indujo el gen indicador después de la incubación de células transfectadas con TNFα. Esta inducción se redujo más de 3 veces en células que expresan la isoforma larga (CARD8-L), mientras que no se observó cambio alguno en células transfectadas con la variante corta (CARD8-S). Además, las células transfectadas con CARD 8 -L mostraron una reducción significativa (más de 5 veces) en los niveles de ARNm de cIAPl, un gen diana de NFKB 5 en respuesta a TNFα. De nuevo, la expresión de CARD8-S no inhibió la actividad transcripcional de NFKB (Figura 3C). Se obtuvieron resultados similares cuando se transfectaron células DU 145 con o bien CARD8-L o bien CARD8-S. Aunque la longitud completa bloqueó la inducción de otro gen diana de NFKB, Al, en estas células, la proteína truncada no tuvo un efecto significativo (Figura 3D). Estos datos indicaron que CARD8-S había perdido la capacidad para interferir con la activación de NFKB en respuesta a estímulos inflamatorios.
El polimorfismo ClOX está asociado con Ia gravedad de la enfermedad en pacientes con AR
Los datos anteriores sugirieron una fuerte correlación entre el polimorfismo ClOX de CARD8 y el nivel de activación de NFKB. NFKB desempeña un papel relevante en la inducción de mediadores inflamatorios en trastornos inflamatorios crónicos tales como AR (Andreakos, E., et al. (2005) The toll-like receptor-nuclear factor kappaB pathway in rheumatoid arthritis. Front. Biosci, 10, 2478-88). Con el fin de evaluar la contribución del alelo de CARD8-S en la predicción del diagnóstico y/o pronóstico de la AR, se estudió el polimorfismo ClOX en muestras de ADN de 200 pacientes con AR. La parte inicial del estudio se llevó a cabo en 91 pacientes con AR de larga duración. Las frecuencias de genotipo no fueron significativamente diferentes entre poblaciones de pacientes (9% AA, 45% AT, 46% TT) y control (8% AA, 44% AT, 48% TT). De manera interesante, aunque la presencia del alelo de CARD8-S no se asociaba al diagnóstico de AR, se asociaba claramente a la gravedad de la enfermedad (Figura 4A). La homocigocidad para el alelo de CARD8-S se asociaba a manifestaciones extraarticulares (p=0 5 03). La presencia de, al menos, un alelo de CARD8-S se asoció también a la presencia de erosiones (p = 0,007), el uso de terapia combinada con al menos dos fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (FARME) (p = 0,03), y con una menor probabilidad de remisión clínica (p = 0,03).
Los resultados sugirieron que el polimorfismo ClOX se asociaba a una enfermedad más grave en una muestra de pacientes con un retraso considerable en el diagnóstico y AR de larga duración. La relevancia clínica de esta asociación se investigó además en una cohorte independiente que implicó a 109 pacientes con AR temprana evaluada a intervalos regulares (cada seis meses) según un protocolo bien establecido que incluye una puntuación de la actividad de la enfermedad (DAS) para recuentos de articulaciones extendidos, capacidad funcional medida mediante la puntuación del cuestionario de evaluación de la salud (HAQ), hallazgos de laboratorio (factor reumatoide, anticuerpos del péptido anticíclico citrulinado (CCP), reactivos de fase aguda) y datos radiográficos evaluados con la puntuación de Sharp-van der Heijde. Según el grupo anterior de pacientes con AR, las frecuencias de genotipo no fueron significativamente diferentes entre pacientes (9% AA, 47% AT, 52% TT) y controles. Sin embargo, se encontró que aquellos pacientes con al menos un alelo de CARD8-S tenían niveles significativamente mayores de anticuerpos anti-CCP que los controles (891,7 ± 101,8 frente a 549,4 ± 91,7 U/ml, 95% CI 70,5-614, p = 0,014). Además, la DAS extendida fue significativamente mayor en pacientes homocigóticos para el alelo de CARD8-S que en portadores homocigóticos del alelo de CARD8-S durante dos años de seguimiento (Figura 4B), como se determinó mediante análisis de mediciones repetidas de la varianza (p = 0,014 en el punto de tiempo de 2 años). Como se observa frecuentemente que la actividad de la enfermedad de un paciente puede fluctuar alrededor del nivel de actividad de la enfermedad de "nada o mínima", una mejor forma de expresar el estado de la enfermedad sería la cantidad cumulativa de la actividad de la enfermedad durante un cierto periodo de tiempo (área bajo la curva). En concordancia con el resultado anterior, en la prueba Tukey a consecuencia de esto se encontró un aumento significativo de la DAS cumulativa en portadores AA con respecto a portadores TT (p = 0,034; diferencias medias 3,73; 95% CI 0,23-7,24).
III. DISCUSIóN
NFKB es un factor de transcripción principal, si no el principal que controla la inmunidad y la inflamación (Ghosh, S., et al. (1998) NF-kappa B and ReI proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu Rev Immunol, 16, 225- 60). La regulación mejor conocida de la ruta de NFKB es a través de la asociación de
complejos de NFKB con las proteínas de inhibición IKB que conduce a la retención citoplasmática de NFKB. Recientemente, se ha demostrado que CARD8 es otro inhibidor de NFKB puesto que bloquea la activación de este factor de transcripción en respuesta a una serie de estímulos (Bouchier-Hayes, L., et al. (2001) CARDINAL, a novel caspase recruitment domain protein, is an inhibitor of múltiple NF-kappa B activation pathways. J Biol. Chem., 276, 44069-77; Razmara, M., et al (2002) CARD- 8 protein, a new CARD family member that regulates caspase- 1 activation and apoptosis. J Biol Chem, 277, 13952-8; Stilo, R., et al. (2002) CARD 8/C ARDIN AL and DRAL participate in a common pathway for modulation of NF-kappaB activation. FEBS Lett., 521, 165-9).
La presente invención describe las consecuencias funcionales de un polimorfismo de CARD8 que genera un codón (ClOX) de terminación prematuro. Se ha mostrado que este polimorfismo truncó gravemente la proteína y que las líneas celulares que llevaban ambos alelos con truncamiento (CARD8-S) tienen un nivel basal aumentado de complejos de unión ADN-NFKB. Además, a diferencia de la proteína de longitud completa, CARD8-S no podía inhibir la actividad transcripcional de NFKB en respuesta a TNFα. Así, aunque la capacidad inhibidora de CARD8 se ha localizado en el extremo N-terminal de la proteína (6, 7), el péptido corto que contiene los primeros 10 aminoácidos, que resulta del polimorfismo con truncamiento no retiene esta capacidad funcional. Las mutaciones en la ruta de señalización de NFKB que suprimen o reducen la activación de NFKB, se han asociado a una serie de trastornos genéticos heredados, principalmente síndromes de inmunodeficiencia (Courtois, G. and Gilmore, T.D. (2006) Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene, 25, 6831-43). Una mutación heterocigótica que afecta al gen que codifica para IκBα se ha descrito en pacientes que muestran un síndrome de inmunodeficiencia grave (Courtois, G., et al. (2003) A hypermorphic IkappaBalpha mutation is associated with autosomal dominant anhidrotic ectodermal dysplasia and T cell immunodeficiency. J Clin Invest, 112, 1108-15; Janssen, R., et al. (2004) The same IkappaBalpha mutation in two related individuáis leads to completely different clinical syndromes. J Exp Med, 200, 559-68). Esta alteración dio como resultado una afectación específica de la degradación de IκBα, que se necesita para que NFKB se transloque al núcleo donde promueve la expresión de una serie de genes. Las mutaciones en NEMO, otro
componente de la ruta reguladora de NFKB, suprime la activación de NFKB y puede dar lugar a un gran número de defectos en seres humanos (Courtois, G. and Gilmore, T.D. (2006) citado at supra; Smahi, A., et al. (2000) Genomic rearrangement in NEMO impairs NF-kappaB activation and is a cause of incontinentia pigmenti. The International Incontinentia Pigmenti (IP) Consortium. Nature, 405, 466-72). Así, la existencia de mutaciones asociadas a la inrnunodeficiencia que conducen a la inactivación de un factor de transcripción clave para las repuestas inmunitarias e inflamatorias, proporciona un fundamento para considerar que una variante genética que reduce la acción inhibidora en NFKB, puede ser clínicamente relevante en trastornos inflamatorios crónicos en los que este factor es constitutivamente activo.
Se estudió que el polimorfismo ClOX de CARD8 en la AR, una enfermedad crónica en la que NF-κB se ha reconocido como un regulador fundamental de la inflamación (Makarov, S. S. (2001) NF-kappa B in rheumatoid arthritis: a pivotal regulator of inflammation, hyperplasia, and tissue destruction. Arthritis Res, 3, 200-6). Aunque no había diferencias en la distribución de genotipos entre grupos de control y de pacientes, aquellos pacientes que llevaban el alelo CARD8-S en la homocigosis tenían una enfermedad más grave que los portadores del alelo de longitud completa. Se encontró que después de dos años de seguimiento de un grupo de pacientes con AR temprana, la actividad de la enfermedad medida como DAS, era significativamente mayor en pacientes homocigóticos para el CARD8-S. Merece la pena observar que la DAS, un índice combinado que incluye recuentos de articulaciones sensibles e inflamadas, la determinación de reactivos de fase aguda y la evaluación global de la actividad total de la enfermedad por el paciente, es uno de los índices de actividad más ampliamente utilizados en la AR (Fransen, J. and van Riel, PX. (2005) The Disease Activity Score and the EULAR response criteria. Clin Exp Rheumatol, 23, S93-9). Por tanto, los datos sugieren que a pesar de un diagnóstico temprano y un tratamiento temprano adecuado, aquellos pacientes que llevan el alelo con truncamiento tienen una cantidad mayor de actividad de la enfermedad y de inflamación de las articulaciones. En este contexto, se ha descrito la activación de NFKB en el endotelio vascular y las células de las paredes sinoviales de tipo A en el tejido sinovial de pacientes con AR (Marok, R., et al. (1996) Activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB in human inflamed synovial tissue. Arthritis Rheum., 39, 583-91) y sistemáticamente, uno de los determinantes
principales de la gravedad de la AR es la persistencia de la inflamación sinovial (Van der Heijde, D.M., et al. (1992) Prognostic factors for radiographic damage and physical disability in early rheumatoid arthritis. A prospective folio w-up study of 147 patients. Br J Rheumatol, 31, 519-25). Así, un polimorfismo que convierte una proteína CARD8 en inactiva puede reducir el control sobre la ruta de señalización de NFKB dando lugar a un factor de transcripción más activo y una amplificación del proceso inflamatorio.