Utilisation d/ un polysaccharide excrété par l'espèce V±bx±o d±àbol±cus à des fins de régénération et de protection du parodonte

La présente invention se rapporte à la régénération du tissu conjonctif non minéralisé du parodonte.

Des bactéries productrices d' exopolysaccharide (EPS) ont été isolées parmi des microorganismes provenant des écosystèmes hydrothermaux profonds. HE800 est un EPS produit par la souche Vibrio diabolicus . Sa masse molaire moyenne en poids est d'environ 800 000 g/mol à l'état natif. Il est caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire originale constituée par 4 résidus osidiques :

[(-3)-D GlcNac β (1-4) D GIcA β (1-4) D GIcA β (1-4) D GalNac α (l-)]n

HE800 a été décrit dans la demande internationale au nom de IFREMER publiée sous le numéro WO9838327 ainsi que dans les articles suivants : Raguénès et al, Int J Syst Bact, 1997 , 47, 989-995 et Rougeaux et al, Carbohyd. Res, 1999, 322, 40- 45. De nombreuses applications pour cet exopolysaccharide ont été décrites. A titre d'exemple d'application, on peut citer la demande internationale WO0202051, qui décrit les propriétés bénéfiques de HE800 en cicatrisation osseuse. Aucune application de HE800 n'est à ce jour connue en ce qui concerne la régénération du tissu conjonctif non minéralisé du parodonte.

Le parodonte est un ensemble de tissus dont le but est le soutien et le maintien de la dent dans son alvéole. Il est constitué de deux tissus mous que sont la gencive et le ligament parodontal (desmodonte) et de deux tissus calcifiés, le cément et l'os alvéolaire. Cet organe à la particularité de se situer dans un environnement, où il est soumis à de

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continuelles agressions (bactériennes, mécaniques, chimiques) . La cavité buccale est en effet, un milieu humide abritant une flore bactérienne commensale. L'intégrité du parodonte dépend essentiellement de l'équilibre entre les tissus buccaux et cette flore bactérienne. Toute déstabilisation de cette relation favorise la prolifération d'une flore pathogène pouvant amener à la destruction des tissus parodontaux. Pour répondre à ces contraintes le parodonte est en constant remodelage.

La gencive est le tissu de recouvrement du parodonte, elle constitue ainsi une protection, contre les attaques bactériennes, pour les éléments du parodonte qu'elle recouvre (cément, desmodonte, et os alvéolaire) . Histologiquement, ce tissu est constitué d'un tissu conjonctif recouvert d'un épithélium d'origine ectodermique . Le tissu conjonctif gingival est constitué d'une matrice extracellulaire gingivale très semblable quant au contenu macromoléculaire à celle du derme. La gencive contrairement au derme est en relation directe avec différents tissus minéralisés et présente plusieurs types de fibres collagéniques liant la gencive à l'os alvéolaire, au cément ou à d'autres fibres liées à la dent voisine.

Les collagènes fibrillaires représentent 50 à 60% des protéines retrouvées dans le tissu conjonctif gingival. Les analyses phénotypiques montrent que ces collagènes sont à 91% de type I, 8% type III et moins de 1% de type V. La matrice extracellulaire constitue l'armature du tissu conjonctif. Elle confère au tissu leur forme, leur résistance mécanique, leur souplesse et assure des fonctions physiologiques importantes. Elle est aussi nécessaire au maintien de l'état différencié des cellules qui la synthétisent et la remodèlent. Par l'intermédiaire de

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récepteurs membranaires tels que les intégrines, elle est en étroite association avec les cellules résidentes comme les fibroblastes ce qui lui permet, selon son état, d'en contrôler la migration, la prolifération ou les activités métaboliques. En retour, ces cellules peuvent remodeler la matrice qui les environne. Elles peuvent alors exprimer des protéases pour la dégrader ou resynthétiser de nouveaux composants matriciels. La matrice extracellulaire est donc en constant équilibre (dégradation-resynthèse) . Cet équilibre peut être irrémédiablement bouleversé lors de certaines pathologies . En effet, dans les syndromes inflammatoires, le pouvoir destructeur des cellules résidentes est exacerbé sous l'influence des cellules de l'inflammation, ces dernières, après activation dégradent aussi la matrice. D'autres pathologies peuvent contribuer au dérèglement de la dynamique matricielle telles que les fibroses au cours desquelles l'expression d'un ou de plusieurs composants matriciels est exacerbée .

Dans ce contexte, la bonne restructuration de la matrice extracellulaire est le garant de la régénération tissulaire. L'organisation de la trame collagénique est un élément essentiel de cette restructuration tissulaire. En effet, ces collagènes constituent la classe protéique majoritaire des matrices extracellulaires et en particulier celles du parodonte .

La gencive, contrairement au derme, est soumise à un important et constant remodelage. Ce remodelage est la conséquence de la coexistence entre la plaque bactérienne se déposant sur la dent et le tissu gingival, et du stress mécanique auquel est soumise la gencive lors de la mastication. Ces facteurs affectent plus ou moins directement les fibroblastes gingivaux qui représentent la majorité des cellules présentes dans le tissu conjonctif gingival. Ces

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fibroblastes sont en grande partie responsables du remodelage observé dans la gencive saine. Pour maintenir l'attache de la gencive au cément et à l'os alvéolaire les fibroblastes gingivaux doivent être capables de répondre constamment aux contraintes qui s'exercent sur le tissu qui les abrite. Cette activation permanente se traduit par une très grande hétérogénéité phénotypique des fibroblastes gingivaux. On distingue notamment les myofibroblastes des fibroblastes, les myofibroblastes prolifèrent en cas de processus inflammatoire. Le fibroblaste est la cellule clef de 1' homéostasie tissulaire.

Si cette hétérogénéité fibroblastique présente un avantage dans des conditions physiologiques, elle peut se révéler extrêmement délétère dans le cadre de pathologies parodontales s' installant dans la chronicité. En effet, toute altération durable de l'équilibre cellulaire peut entraîner 1' activation non désirée de certains phénotypes cellulaires comme par exemple la prolifération des myofibroblastes au dépend des fibroblastes.

L'acide hyaluronique de haut poids moléculaire est couramment utilisé pour traiter de nombreuses pathologies buccales. EP0444492 décrit l'utilisation de l'acide hyaluronique pour traiter les maladies inflammatoires de la cavité buccale, comme la gingivite. WO2005000321 décrit l'utilisation de l'acide hyaluronique pour traiter les aphtes de la cavité buccale. Pour ces traitements, l'acide hyaluronique est utilisé sous différentes formulations, on peut citer à titre d'exemple le gengigel® qui se présente sous forme de spray ou de bain de bouche.

L'acide hyaluronique qui est un produit d'origine animale est produit à partir d'extrait d'animaux ou bien par génie génétique .

L'objet de la présente invention est d'identifier un composé capable de préserver l' homéostasie tissulaire parodontale et/ou de favoriser la restructuration, c'est-à-dire la restauration, d'une trame collagénique altérée des tissus conjonctifs non minéralisés du parodonte, et de favoriser la prolifération des fibroblastes gingivaux afin de rétablir 1' homéostasie gingivale.

Un tel composé présentera ainsi une activité protectrice et régénératrice sur les tissus conjonctifs non minéralisés du parodonte et facilitera le rétablissement de l' homéostasie tissulaire .

Les inventeurs ont mis en évidence, de façon surprenante et inattendue, qu'un polysaccharide de masse molaire moyenne en poids comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol, caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire comprenant les 4 résidus osidiques suivants :

[(-3)-D GlcNac β (1-4) D GIcA β (1-4) D GIcA β (1-4) D GalNac α (1-)]

présente les propriétés suivantes : il induit une sélection des souches fibroblastiques, il stimule la mobilisation et la prolifération des fibroblastes dans la matrice extracellulaire, il accélère la fibrillation collagénique et favorise ainsi la reconstitution de la matrice conjonctive. De ce fait, ce polysaccharide accélère la régénération en accélérant la restructuration des tissus conjonctifs. Il permet d'aboutir à une régénération complète de sorte que l'apparition de situations pathologiques de type fibrotique ou inflammatoire est évitée.

Ce polysaccharide permet la restructuration de la trame collagénique des tissus conjonctifs non minéralisés du

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parodonte, et il constitue un support permettant l'adhésion et la prolifération cellulaire des fibroblastes gingivaux.

Ainsi, de par ses propriétés le polysaccharide est particulièrement adapté aux applications suivantes : la régénération des tissus conjonctifs du parodonte ainsi que le traitement de pathologies buccales, en particulier celles liées à un état inflammatoire ou à un état traumatique.

De plus, de par ces mêmes propriétés, le polysaccharide permet la fabrication de matrice de collagène aux propriétés améliorées. En effet, la trame collagénique des matrices de collagènes comprenant le polysaccharide présente une meilleure résistance devant des facteurs physiques tels que la température et les contraintes mécaniques. Enfin, il favorise la culture des fibroblastes gingivaux et permet la réalisation de substitut de gencive.

La présente invention a pour objet l'utilisation d'un polysaccharide ou d'un sel de ce polysaccharide de masse molaire moyenne en poids comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol, préférentiellement comprise entre 700 000 et 900 000 g/mol, caractérisé par une séquence osidique répétitive linéaire comprenant les 4 résidus osidiques suivants :

[(-3)-D GlcNac β (1-4) D GIcA β (1-4) D GIcA β (1-4) D GalNac α (1-)] pour la fabrication d'une composition, d'un médicament ou d'un dispositif médical ayant une activité protectrice et/ou régénératrice sur les tissus conjonctifs non minéralisés du parodonte .

Typiquement le polysaccharide peut se présenter sous la forme d'un sel.

Typiquement le polysaccharide est un polysaccharide excrété par l'espèce Vibrio diabolicus ou un dérivé obtenu à partir de celui-ci. Des modes de préparation ont été décrits dans les documents suivants : WO 98/38327, Raguénès et al, Int J Syst Bact, 1997, 47, 989-995 et Rougeaux et al, Carbohyd. Res, 1999, 322, 40-45. A titre d'exemple, des dérivés de masse molaire moyenne en poids comprise entre 500 000 et 2 000 000 g/mol peuvent être obtenus par dépolymérisation partielle, par pontage et/ou par des modifications chimiques, en particulier, par sulfatation et/ou par acétylation. A titre d'exemple, WO0046252 décrit une méthode de pontage de l'acide hyaluronique, typiquement cette méthode pourra être adaptée pour générer des dérivés pontés du polysaccharide excrété par l'espèce Vibrio diabolicus.

Un mode de réalisation de l'invention concerne la fabrication d'une composition, d'un médicament, d'un dispositif médical pour traiter une pathologie buccale du tissu conjonctif non minéralisé du parodonte.

En particulier la pathologie buccale est liée à un état inflammatoire ou à un état traumatique.

Préférentiellement la pathologie buccale est choisie dans le groupe consistant en la parodontite, la gingivite, la fibrose gingivale, la récession gingivale, l'aphte, l'aphtose buccale récidivante, les maladies aphteuses, et les pathologies bulleuses .

Typiquement la composition ou le médicament fabriqué est destiné une administration topique au niveau du parodonte. Par composition topique, on entend une composition qui agit en un point déterminé et qui est applicable directement sur la muqueuse buccale.

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La composition et le médicament peuvent être sous la forme d'une composition topique à usage buccal, en particulier sous la forme d'un gel, d'une solution d'une émulsion ou d'un spray. Typiquement une composition topique selon l'invention est fabriquée de manière connue en soi . A titre d' exemple une composition topique selon l'invention contient le polysaccharide à une concentration comprise entre 0,005 et 10% en poids sur le poids total de la composition, plus préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 5% en poids.

Un gel selon l'invention pourra comprendre du sorbitol, du maltitol, du xylitol et/ou de la carboxymethylcellulose sodique .

Cette même composition ou ce même médicament peut servir à imprégner un pansement buccal.

Un mode de réalisation de l'invention concerne une pâte dentifrice, un bain de bouche, un spray, une colle pour denture et un pansement buccal comprenant le polysaccharide. Typiquement l'homme du métier pourra utiliser les techniques usuelles pour la mise au point de ces produits. A titre d'exemple une pâte dentifrice, un bain de bouche ou un spray selon l'invention contient le polysaccharide à une concentration comprise entre 0,005 et 1% en poids sur le poids total de la composition, plus préférentiellement à une concentration comprise entre 0,01 et 0,1% en poids. Une pâte dentifrice selon l'invention pourra comprendre à titre d'exemple un ou plusieurs des composés suivants : du sorbitol, du maltitol, du xylitol et/ou de la carboxymethylcellulose sodique. Typiquement, un bain de bouche selon l'invention pourra contenir un ou plusieurs des excipients suivants : le polysorbate 60, la saccharine

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sodique, le salicylate de méthyle, l'essence de girofle ; l'essence d'anis, l'essence d'eucalyptus, l'acide citrique, le menthol. Un bain de bouche selon l'invention pourra également contenir un agent actif supplémentaire comme par exemple l' hexétidine.

Pour toutes les compositions, médicaments, pâtes dentifrices, bains de bouche, sprays, colles pour denture selon l'invention, le polysaccharide peut être utilisé comme l'unique agent actif ou accompagné d'autres agents actifs comme par exemple un antibactérien, un antibiotique, des vitamines ou des oligoélements .

Selon un autre de réalisation, l'invention concerne une matrice de collagène comprenant le polysaccharide selon 1' invention.

Typiquement le collagène de la matrice est un collagène choisi dans le groupe constitué des collagènes de type I, III, V ou d'un mélange de ceux-ci. Préférentiellement le collagène est un collagène de type I.

Typiquement pour fabriquer une telle matrice de collagène, l'homme du métier utilisera les techniques couramment utilisées pour la fabrication des matrices de collagènes à partir de collagènes fibrillaires acido-solubles . En présence du polysaccharide selon l'invention, les collagènes fibrillaires acido-solubles se fibrillent naturellement après neutralisation du pH. Alternativement la matrice de collagène selon l' invention pourra être obtenue par pontage du polysaccharide selon l'invention avec le collagène. Pour réaliser le pontage l'homme du métier utilisera les techniques couramment utilisées pour le pontage de

polysaccharides avec le collagène. EP1374857 est une illustration d'une technique de pontage utilisable. De manière avantageuse, la matrice pourra comprendre en outre un facteur de croissance qui favorise la colonisation de la matrice par les fibroblastes gingivaux et la reconstitution du tissu conjonctif.

Préférentiellement le facteur de croissance pourra être choisi dans le groupe consistant en TGF-beta, PDGF, FGFs, BMPs (bone morphogenetic proteins), VEGF, CTGF (connective tissue growth factor) .

Typiquement la matrice pourra servir de dispositif médical résorbable ou d'implant. Une telle matrice permettra le remplacement mécanique et fonctionnel de structures endommagées avec un minimum de réactions indésirables. Cette matrice une fois implantée dans le tissu à régénérer servira de structure de guidage et balisera le potentiel régénératif du tissu. La matrice favorisera la pénétration des fibroblastes de façon ordonnée après la greffe de la matrice, tout en incitant ces mêmes fibroblastes à produire leur propre matrice extracellulaire.

Selon un mode de réalisation préférée de l'invention la matrice pourra comprendre en outre des fibroblastes gingivaux de façon à constituer un substitut de gencive. Ce substitut pourra être implanté in vivo. De manière avantageuse, ce sont les fibroblastes gingivaux du patient sur lequel la greffe doit être effectuée qui servent à coloniser la matrice.

Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un support de culture cellulaire caractérisé en ce que la surface du support sur laquelle les cellules sont cultivées comprend le polysaccharide selon l'invention.

Typiquement le polysaccharide est sous forme d'un film, d'une membrane ou d'une structure alvéolée tridimensionnelle.

Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de culture de fibroblastes gingivaux, caractérisé en ce que les dits fibroblastes sont cultivés sur une matrice selon l'invention ou sur un support tel que décrit précédemment .

Le contenu de tous les documents cités doit être considéré comme faisant partie de la présente description.

La présente invention sera mieux illustrée ci-après à l'aide des exemples qui suivent. Ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLES

1. Matériels et Méthodes

1.1. Préparation de l' exopolysaccharide HE800 à partir de cultures de Vîbrio Diabolxcus (la souche Hξ800) .

Des modes de préparation d'HE800 ont été décrits dans les documents suivants : WO 98/38327, Raguénès et al, Int J Syst

Bact, 1997, 47, 989-995 et Rougeaux et al, Carbohyd. Res,

1999, 322, 40-45. a) Cultures de Vibrio diabolicus

La souche HE800 est cultivée sur milieu 2216E [OPPENHEIMER,

J. Mar. Res. 11, 10-18 (1952)] enrichi avec du glucose (30 g/1) . La production est effectuée à 30 ⁰ C et à pH 7,4 en fermenteur de 2 litres contenant 1 litre du milieu 2216E-

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glucose. Après 48 heures de culture, le moût présente une faible viscosité (de l'ordre de 40 centipoises à 60 rpm) .

b) Purification de l ' exopolysaccharide

Les bactéries sont séparées du moût par une centrifugation à 20 000 g pendant 2 heures, puis le polysaccharide est précipité à partir du surnageant à l'aide d'éthanol pur, puis on effectue plusieurs lavages éthanol/eau en proportions croissantes d'éthanol, selon le procédé décrit par TALMONT et al. [Food Hydrocolloids 5, 171-172 (1991)] ou VINCENT et al. [Appl. Environ. Microbiol. , 60, 4134-4141 (1994)]. Le polysaccharide obtenu est séché à 30 ⁰ C et conservé à température ambiante. 2,5 g de polysaccharide purifié par litre de culture ont ainsi été obtenus.

1.2. Obtention des fibroblastes

Les expériences ont été réalisées sur des fibroblastes d'origine dermique et des fibroblastes d'origine gingivale. Ces deux types de fibroblastes adoptent vis-à-vis du HE800 un comportement très similaire, par conséquent les résultats obtenus avec les fibroblastes dermiques sont extrapolables aux fibroblastes gingivaux.

1.2.1) Milieux de culture :

Les cultures sont effectuées dans un milieu, dit complet, composé, de Dubelco MEM Glutamax I contenant de 100 U/ml de pénicilline 100 μg/ml de streptomycine et 2μg/ml de fungizone (Gibco BRL Cergy Pontoise France) supplémenté ou non (milieu carence) en sérum de veau foetal (SVF) .

1.2.2) Origine des prélèvements tissulaires :

Les biopsies dermiques utilisées sont mises en culture dans les 3 heures qui suivent leur prélèvement par le praticien. Les prélèvements utilisés sont obtenus après circoncision, à partir de prépuces d'enfants cliniquement sains. Les biopsies gingivales sont prélevées sur des patients jeunes (moins de 30 ans) exempt de pathologies . Ces biopsies sont situées au niveau de la gencive attachée de prémolaires extraites pour raisons orthodontiques . Ces gencives sont de plus, déclarées cliniquement saines par le praticien. Ces biopsies sont des bribes tissulaires détachées au cours de l'extraction et qui n'ont demandé aucune modification de l'acte opératoire.

1.2.3) Mise en culture :

Les prélèvements dermiques et gingivaux sont rincés deux fois dans un milieu DMEM contenant une concentration d'antibiotique supérieure à la normale (pénicilline 6x, streptomycine 4x, fungizone2x) puis ils sont découpés en très petits explants (≈2mm ² ). Ces explants sont déposés à la pipette Pasteur stérile ou avec la pointe du scalpel, dans un flacon de culture de 25 cm ² , coté parenchyme sur le plastique. La boîte est relevée et laissée 15 minutes dans cette position pour que les explants, à sec, adhèrent au plastique.

Les explants ayant adhéré sont recouverts de quelques gouttes de DMEM supplémenté à 20 % en sérum de veau fœtal (SVF) . La boîte de culture est alors placée pendant une nuit dans un incubateur à 37 ⁰ C, sous une atmosphère composée de 5 % de CO ₂ et de 95 % d'air. Le lendemain le surnageant est remplacé par du milieu frais comprenant 20% de SVF, il est renouvelé par la suite toutes les semaines. Après trois semaines les fibroblastes ont colonisé tout le fond de la boîte (les

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kératinocytes présents dans l'expiant n'adhèrent pas dans ces conditions de culture), on procède alors au repiquage. Les explants sont retirés à l'aide d'une pince, les cellules sont rincées deux fois au PBS, puis trypsinisées (Trypsine EDTA Gibco) . La trypsinisation est alors stoppée par l'ajout de DMEM comprenant 10% de SVF. Les cellules sont comptées au compteur (Coulter) puis réensemencées dans plusieurs boîtes de culture. Elles sont, à ce moment, considérées en premier passage et sont entretenues dans un milieu complet contenant 10 % de SVF. Lorsque les cellules sont à nouveau confluentes un autre passage est effectué suivant la même procédure, et ce jusqu'au début des expérimentations.

1.3. Préparation des films et culture des fibroblastes

1.3.1) Préparation des films d'HE800 et culture des fibroblastes

Un surfactage est effectué par le dépôt de 200μl d'une solution à 2mg/ml d'HE800 au fond des puits de culture (boîte 24 puits, 2cm ² ) . La boîte de culture est déposée sous hotte de culture sur une platine chauffante réglée à 37 °C, pendant au moins 5 heures. Après évaporation, un film d'HE800 se constitue au fond de la boîte. Les fibroblastes gingivaux sont ensemencés à raison de 10000 cellules par puits et cultivés pendant 7 jours. Une numération des cellules est effectuée chaque jour, certains puits sont fixés pour l'étude morphologique et l' immuno-détection de l' α-actine des muscles lisses .

1.3.2) Préparation de films de collagène et de films composite collagène-HE800 et culture des fibroblastes :

Le collagène utilisé est un collagène de type I acido-soluble (2mg/ml) obtenu à partir de queue de rat (Institut Jacques

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Boy, Reims). Le surfactage des boîtes de culture s'effectue par le dépôt de 200μl d'un mélange de collagène (40μg total) et d'HE800 (5, 50, ou 200μg total).

La boîte de culture (boîte 24 puits, ou labtek, 2cm ² par puits) est déposée sous hotte de culture sur une platine chauffante réglée à 37 ⁰ C, pendant au moins 5 heures. Après évaporation, un film de collagène avec ou sans HE800 se constitue au fond de la boîte. Des fibroblastes sont ensemencés sur ces films afin de s'assurer de la biocompatibilité de la nouvelle surface de culture.

1.3.3) Caractérisation de la structure des films :

Les films de collagène et les films composites sont fixés à l'éthanol absolu -20 ⁰ C puis réhydratés pour être colorés au rouge sirius ( (coloration de Junquera, spécifique des collagènes). Ainsi, en rouge Sirius, sous lumière transmise tous les collagènes sont colorés, mais seuls les collagènes correctement fibrilles sont capables de dévier la lumière polarisée .

1.4. Culture en Lattis (matrice de σollagène) : préparation de tissu conjonctif non minéralisé équivalent.

Les lattis sont constitués avec le même collagène I que celui utilisé pour former les films collagéniques . Après neutralisation de la solution acide de collagène (3mg/lattis) , le gel contenant les cellules et qui est en cours de polymérisation est versé dans une boîte de pétri de 5cm de diamètre. HE800 est ajouté au collagène avant l'addition des cellules à raison de 150μg, 300μg ou 600μg par lattis (respectivement 5%, 10%, et 20% de la quantité totale de collagène)

1.4.1) Préparation de la solution stock

Pour 50 ml de solution stock ajouter 10ml de Sérum de Veau Fœtal

1.4.2) Préparation des lattis :

Toutes les étapes de préparation du lattis se font dans la glace.

-Remuer puis verser dans la boîte de Pétri puis laisser pendant 5 min à 37 ⁰ C le lattis.

-Après Ih les boîtes sont légèrement remuées afin de décoller les lattis des rebords.

-Les milieux de culture sont changés chaque semaine.

1.4.3) Caractérisation des lattis (des matrices de collagène) :

A différents temps de culture (11 et 40 jours) les lattis sont récupérés fixés dans du paraformaldéhyde puis préparés en vue de l'inclusion en paraffine. Des coupes de 7μm d'épaisseur sont alors effectuées au microtome. Les colorations spécifiques de ces coupes permettent d' observer

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et d'étudier la structure, la cellularité des tissus conjonctifs reconstruits. Certains des paramètres mis en évidence peuvent par la suite être étudiés par analyse d'images et ainsi être quantifiés. La qualité de la fibrillation collagénique est observée après coloration au rouge Sirius, la cellularité des tissus conjonctifs équivalents a pu être estimée par analyse d' images après coloration des coupes à l' hémalun-éosine .

1.4.4) Détermination du nombre de fibroblastes contenus dans les lattis :

La coloration par l' hémalun-éosine permet de distinguer les cellules de la matrice qui les environne. En effet l'hémalun colore les noyaux des cellules en bleu noir, tandis que l'éosine colore en rouge plus ou moins intense les cytoplasmes et les structures extracellulaires (éosinophile) . Le contraste ainsi créé permet de distinguer chaque cellule sous un microscope équipé d'une caméra CDD reliée à un analyseur d'images semi-automatique. Les cellules se trouvant dans les champs définis par le grandissement microscopique sont alors comptées dans les lattis à 11 et 40 jours. Une dizaine de champs par coupe a été analysée. Deux groupes de cellules peuvent ainsi être différenciés selon leur situation géographique : les cellules se trouvant à l'intérieur du lattis (matrice de collagène) d'une part et les cellules se trouvant à la périphérie du lattis d'autre part. Pour calculer la cellularité des tissus conjonctifs équivalents chaque lattis est considéré cylindrique, la périphérie du lattis se définissant comme une couronne de lOμm d'épaisseur (équivalente au diamètre de deux assises cellulaires) représentant 2% du volume total du lattis.

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1.5. Immuno-détection indirecte de l'oc-actine des muscles lisses .

Les cellules fixées sont re-perméabilisées dans l'éthanol à 70% (20min) , puis réhydratées dans du PBS (10 min) . Les peroxydases endogènes sont bloquées avec une solution méthanol (30%), H ₂ O ₂ (0,3%). Cette opération est suivie d'un rinçage au PBS (2min) puis d'un blocage des sites antigéniques non spécifiques par une solution PBS/lait écrémé 1% (Ih). Les cultures sont alors incubées avec un anticorps primaire (IgG de souris) dirigé contre l'α-actine humaine (1/30; 50min) puis rincées au PBS (3 x 10 min) . Les cellules sont alors incubées, dans le noir pendant 60 min avec un anticorps anti-IgG de souris biotinylé (1/200), rincées au PBS (3 x 10 min) puis incubées avec de la streptavidine couplée à la peroxydase (1/200 ).

Après rinçage (PBS 3x 10 min), la révélation de l'activité peroxydasique avec la 3-3' diaminobenzidine s'effectue dans un tampon Tris/HCl (10OmM, pH 7,2-7,4) contenant 0,1% de H ₂ O ₂ (15 min, à l'obscurité). L'activité peroxydasique fait apparaître un matériel fibrillaire brun (correspondant aux microfilaments d'α-actine) dans le cytoplasme des cellules positives .

Les produits utilisés proviennent de la firme DAKO. Les expériences contrôles concernant l' immunodétection de l'α- actine des muscles lisses ont été réalisées en omettant l'anticorps primaire et/ou en utilisant un anticorps secondaire d'une autre espèce animale que celle ayant permis l'obtention de l'anticorps primaire.

2. Résultats et Discussion.

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2.1. Prolifération des fibroblastes gingivaux cultivés sur film de HE800.

Les surfaces de culture ont été traitées par le HE800, afin de former un film polysaccharidique au fond des boîtes. On observe, lors premiers jours de culture (Jours 2 et 4) que le nombre de cellules ensemencées dans les boîtes enduites par le HE800 est largement inférieur au nombre de celles des boîtes témoins (Tableau I). Au dernier jour de l'expérimentation, par contre on remarque une inversion de ces résultats (Tableaux I et II) . Les courbes présentées montrent que les cellules cultivées sur film d'HEδOO observent un temps de latence avant l'entrée en phase exponentielle de croissance, plus long que celui exprimé par les cellules cultivées sur plastique. D'autre part, alors que le nombre de cellules des cultures témoins atteint un plateau les jours les plus tardifs de l'expérience (cf. Tableau III), les cultures sur film HE800 continuent à proliférer. Les observations effectuées lors de la culture ou après fixation des cellules permettent d' avancer des hypothèses quant aux comportements cellulaires exprimés dans les différentes conditions de culture :

Les cultures sur film d'HEδOO se caractérisent lors des premiers jours de cultures par la présence de nombreuses cellules qui n'adhèrent pas au support. Cette non-adhésion peut expliquer le retard à la prolifération observée lors des comptages cellulaires dans ces cultures.

Les cellules témoins sont réparties de manière uniforme dans la boîte, sans orientation particulière, alors que les cellules ensemencées sur film HE800 s'organisent en cordons au centre de la boîte. Ces résultats montrent l'incidence d'HEδOO sur l'adhésion cellulaire. En effet les regroupements cellulaires qui sont observés habituellement, dans les

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cultures gingivales, n'ont pas d'orientation spécifique. Après les 2 premiers jours de culture ces cordons cellulaires commencent à former une structure centrale circulaire, allant en se densifiant exclusivement vers le centre (prolifération centripète) . On peut aussi observer de nombreuses cellules à la périphérie de la boîte mais sans orientation particulière. Certaines cellules peuvent être présentes dans les zones séparant les regroupements cellulaires, elles sont isolées et semblent beaucoup plus étirées en longueur que les autres cellules des boîtes HE800 ou même témoin.

Le marquage immuno-cytochimique concernant l'α-actine des muscles lisses montre :

- Dans les témoins, de nombreuses cellules positives côtoient des cellules n'exprimant pas ces microfilaments. -Dans les cultures en présence d'HE800, les cellules présentes dans les formations circulaires centrales n'expriment pas l'α-actine des muscles lisses par contre, des cellules exprimant cette isoforme de l'actine peuvent être trouvées en périphérie de la boîte.

Ces résultats sont le reflet d'une sélection des souches fibroblastiques, en effet certaines cellules peuvent ne pas exprimer naturellement les récepteurs membranaires nécessaires à leur adhésion sur le film d'HEδOO. Parmi les sous-populations fibroblastiques non adhérentes, on retrouve celles qui expriment l'α-actine des muscles lisses c'est-à- dire les myofibroblastes . Dans les expériences contrôles (omission de l'anticorps primaire ou utilisation d'un anticorps secondaire inapproprié) aucune positivité n'a été observée .

(RèGLE 26)

Tableau I : Variation du nombre de cellules par puits au cours de la culture

Tableau II: Pourcentages de prolifération Tableau III : Temps de doublement (heures)

Td Td Td 0-2 2-4 4-7

Témoin 84, 68 29 58 333.2 HE800 9522, 64 25 50 90

2.2. Structuration du collagène de type I en présence d'HE800.

2.2.1) Premières constatations

Afin de réaliser les films comprenant à la fois du collagène et de l' exopolysaccharide HE800, des solutions d'HE800 et de collagène I sont préalablement mélangées avant dépôt sur les boîtes de culture. De manière surprenante, il a été constaté que l'addition de l' exopolysacharide bactérien à la solution collagénique provoque l'apparition d'un agglomérat dense de couleur blanche. Cet agglomérat a pu être étalé sur une lame histologique puis colorée au rouge Sirius, colorant spécifique des collagènes. Ces lames histologiques montrent qu'effectivement le matériel étalé sur la lame est coloré par le rouge Sirius. De plus l'observation d'un matériel déviant dans différentes directions la lumière polarisée montre bien la présence de collagène sous sa forme fibrillaire.

2.2.2) Organisation de filins composites collagène/HE800 :

Les différents films déposés sont composés de :

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- (1) collagène (40μg)

- (2) collagène (40μg) + HE800 (50μg)

- (3) collagène (40μg) + HE800 (200μg)

L'observation au microscope du fond des boîtes montre pour les films (3) l'apparition d'un réseau dense composé de longs filaments. Les films (2) comportent quelques fibres beaucoup plus courtes, tandis que les films (1) n'en comportent pratiquement pas. Les 3 films se colorent au rouge Sirius, mais seul le film (3) montre un réseau fibrillaire déviant la lumière polarisée.

Ces résultats indiquent que HE800 promeut la formation de fibres collagéniques, mais aussi permet une meilleure résistance de la trame collagénique devant des facteurs physiques tels que la température et les contraintes mécaniques .

2.3. Tissu conjonctif non minéralisé: Microscopie photonique et électronique

Les cellules sont cultivées dans une matrice collagénique (modèle de culture tridimensionnelle) afin de mimer au mieux les interactions cellules/matrice observées dans le tissu conjonctif. Ces lattis ou tissus conjonctifs équivalents sont composés de collagène I seul (Témoins) ou de collagène I et d'HE800 en différentes proportions (quantité d'EPS = 20, 10 et 5% par rapport à la quantité de collagène contenu dans le lattis, c'est-à-dire respectivement 300, 150 et 75μg) .

2.3.1) Rétraction des lattis :

Le premier paramètre étudié est la vitesse de rétraction des lattis : Les courbes de rétraction des lattis témoins et des lattis comprenant de 1ηE800 sont similaires. Malgré ces similarités, on remarque que les lattis HE800 ont une vitesse

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de rétraction plus lente que les lattis témoins lors des jours précoces de culture. Après le ll ^eme jour la rétraction des lattis est presque totale.

2.3.2) Nombre de fibroblastes contenus dans les lattis :

Le nombre de cellules présentes dans chaque lattis varie, aux deux temps de culture entre 180 000 et 250 000 cellules. Le nombre de cellules à la périphérie représente 2 à 12% du nombre total de cellules. Ces données sont compatibles avec ce qui a été décrit dans la littérature pour ce modèle de culture. Les résultats des tableaux IV, V et VI montrent le nombre de cellules par unité volumétrique (mm ³ ) présentes dans la totalité du lattis et dans ses différentes régions . Les densités cellulaires volumétriques totales des lattis après 11 et 40 jours sont comprises entre 3200 et 5900 cellules/mm ³ (cf. tableau IV). Ces valeurs sont comparables à celles retrouvées dans un tissu conjonctif humain normal comme cela à été décrit précédemment (Miller et al., Exp Dermatol. 2003 Aug; 12 (4) : 403-11) . La cellularité physiologique des lattis témoins et des lattis comprenant du HE800 atteste donc de la validité du modèle de culture utilisé et de la compatibilité d'HE800 avec ce modèle physiologique .

La densité cellulaire totale (cf. tableau IV) des lattis témoins ne varie pas quelque soit le temps de culture. Au ll ^eme jour de culture, la densité cellulaire totale des lattis HE800 est inférieure de 25 à 40% à celles des lattis témoin. Au 40 ^eme jour de culture les densités cellulaires des lattis témoins et des lattis HE800 sont équivalentes. Les variations de densités cellulaires observées à l'intérieur des lattis (cf. tableau V) reproduisent exactement celles de la totalité du lattis. L'organisation topologique des cellules de la

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couronne périphérique (tableau VI) diverge par contre totalement de celles des tableaux IV et V :

- A 11 jours de culture les densités cellulaires de la couronne périphérique sont 4 fois supérieures à celles de l'intérieur du lattis et ne présentent que peu de variation entre les tissus conjonctifs équivalents témoins et les tissus conjonctifs équivalents comprenant HE800 (tableau VI) .

- A 40 jours de culture, une forte diminution de la cellularité périphérique est observée. Si cette diminution n'est que de 40% pour les lattis témoins, elle atteint 100 à 250% pour les lattis contenant du HE800. La densité cellulaire des lattis témoin reste 3 fois plus élevée à la périphérie qu'à l'intérieur (tableau IV et VI) par contre ces densités sont comparables pour les lattis HE800.

La cellularité globale des lattis HE800 est plus faible que celle des lattis témoins aux jours précoces de culture puis deviennent équivalentes au jours tardifs de culture. Ces variations qui se répercutent sur les densités cellulaires des régions internes peuvent s'expliquer par une stimulation de la prolifération cellulaire, ou une migration massive de cellules périphériques vers l'intérieur.

En effet à la périphérie des lattis, le nombre de cellules diminue au cours du temps de culture, cette diminution est particulièrement accentuée dans les lattis comprenant du HE800 (diminution par 2 à 3,5 fois du nombre de cellules). Cette diminution peut s'expliquer par, une perte d'adhésion des cellules périphérique qui se détache de la matrice extracellulaire et/ou une migration massive de ces cellules à l'intérieur. Cela explique les gains globaux de cellularité, au cours du temps, dans les lattis contenant HE800.

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Tableau IV : Densité cellulaire dans la totalité du lattis nombre de cellule par mm ³ (entre parenthèse : diamètre des lattis en mm) .

Tableau V : Densité cellulaire à l'intérieur du lattis nombre de cellule par mm ³ .

Tableau VI : Densité cellulaire à la périphérie du lattis : nombre de cellule par mm ³

Conclusion : HE800 favorise la prolifération des fibroblastes dermiques dans la matrice extracellulaire et/ou favorise leur mobilisation c'est-à-dire la sélection, la migration et la pénétration massive des cellules périphériques .

2.4.3) Etat de la matrice collagénique :

2.4.3.1) Microscopie photonique

La coloration au rouge Sirius (coloration de Junquera) permet de colorer spécifiquement les collagènes, dans la peau par exemple ses collagènes apparaissent sous la forme d'une structure filamenteuse lâche, colorée en rouge.

Les colorations au rouge Sirius des coupes histologiques après observation en lumière transmise et lumière polarisée montrent que l'addition d'HE800 lors de la formation du lattis permet la formation d'une matrice beaucoup plus dense et à des temps beaucoup plus courts que dans les lattis témoins .

Pour exemple : la densité de la matrice collagénique témoin après 40 jours de culture est équivalente à celle observée dans les matrices collagéniques constituées en présence de HE800 à 11 jours de culture. Cet effet sur la densité est beaucoup plus important aux doses les plus faibles (10%, 5%) .

2.4.3.2) Microscopie électronique

La microscopie électronique a été pratiquée sur des tissus conjonctifs équivalents cultivés pendant 11 jours. Un bon état ultrastructural des cellules a été observé, que ce soit dans les témoins ou que ce soit dans les lattis formés en présence des différentes concentrations d'HEδOO. Aucunes fibres collagéniques n'a pu être observées dans les lattis témoins, les lattis comprenant 20% de HE800 permettent d'observer quelques éléments fibrillaires pris dans un gel constitué de l' exopolysaccharide. Les lattis comprenant 10% et 5 % d' exopolysaccharides sont très différents, en effets de nombreuses fibres collagéniques sont présentes, elles sont réparties dans tout le lattis et présentent, pour certaines,

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une striation périodique. Ces fibres ou fibrilles collagéniques sont piégées dans le gel constitué par 1ηE800.

Conclusion : I/HE800 accélère la fibrillation collagénique et favorise la constitution d'une matrice extracellulaire.