TITULO

USO DE LA PROINSULINA PARA LA ELABORACIóN DE UNA COMPOSICIóN FARMACéUTICA NEUROPROTECTORA, COMPOSICIóN TERAPéUTICA QUE LA CONTIENE Y SUS APLICACIONES

CAMPO DE LA INVENCIóN

La presente invención está dentro del campo de la Biomedicina y más concretamente en el desarrollo de compuestos terapéuticos. En particular, la invención se refiere al uso especifico de la molécula proinsulina para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina como la retinosis pigmentaria, asi como de otras afecciones neurodegenerativas.

ESTADO DE LA TéCNICA

Las enfermedades neurodegenerativas comprenden una variedad de desórdenes progresivos del sistema nervioso central de origen genético-hereditario, traumático, esporádico o senil. La gran mayoría de las enfermedades neurodegenerativas presentan muerte celular programada de neuronas y/o células de glia en su origen o su progresión. Dicho proceso de muerte, que constituye una etapa irreversible del daño al tejido nervioso, aparece independientemente de la causa primaria del desorden, sea genética, traumática, esporádica o senil.

Numerosos factores de crecimiento juegan un papel fundamental en la regulación del balance entre la vida y la muerte de diversos tipos celulares, incluidos neuronas y células de glia. Entre ellos, los miembros de la familia de la insulina que incluyen la insulina, su precursor proinsulina, y los IGF-I e IGF-II (Várela-Nieto, I., de la Rosa, E. J., Valenciano, A. I., and León, Y. (2003) CeIl death in the nervous system: lessons from insulin and insulin-like

growth factors . Mol Neurobiol 28: 23-50). La retina forma parte del sistema nervioso central y es un modelo bien establecido para el estudio tanto de procesos fisiológicos como patológicos del sistema nervioso; por esta razón, es el modelo celular empleado en la presente invención. Uno de los procesos patológicos más importantes estudiados en la retina es el denominado Retinosis Pigmentaria, ya que esta patología comprende un amplio grupo de desórdenes hereditarios de la retina y representa una de las mayores causas de ceguera en el mundo, con una incidencia aproximada de una persona entre 4.000. Aunque se han caracterizado más de 120 loci implicados y hay distintas etiologías, en todos los casos se produce una pérdida crónica y progresiva por muerte celular programada de las neuronas de la retina, en concreto de los fotorreceptores, llevando a los individuos a la ceguera. Actualmente no hay tratamiento para la Retinosis Pigmentaria, y por el momento se están abordando estrategias de neuroprotección, terapia génica, neurorreparación y bioingenieria solamente en modelos animales con degeneración, como los ratones rd, las ratas RCS y otros modelos en perros, gatos, cerdos e, incluso, Drosophila. El ratón rdl (rod degeneration) fue uno de los primeros modelos para el estudio de mecanismos celulares y moleculares que determinan la degeneración celular, habiéndose llegado a determinar la naturaleza apoptótica de la muerte de los fotorreceptores (Chang, G. Q., Hao, Y., and Wong, F. (1993) Apoptosis: final common pathway of photoreceptor death in rd, rds, and rhodopsin mutant mice. Neuron 11: 595-605). Los diferentes ratones rd proporcionan un modelo ideal para el ensayo de nuevas aproximaciones terapéuticas al tratamiento de las distrofias hereditarias de la retina, ya que permiten estudiar el proceso degenerativo de los fotorreceptores desde un punto de vista molecular, celular y genético.

Las intervenciones de terapia génica tienden a reintroducir una copia funcional del gen mutado causante de la neurodegeneración . Se han realizado progresos con adenovirus recombinantes o vectores virales asociados a adenovirus. En concreto, la reposición de la subunidad β de la fosfodiesterasa de cGMP especifica de bastones (βPDE) en el ratón rd neonatal, logrando un rescate histológico del fenotipo rd de, al menos, 6 semanas (Bennett, J., Tanabe, T., Sun, D., Zeng, Y., Kjeldbye, H., Gouras, P., and Maguire, A. M. (1996) Photoreceptor cell rescue in retinal degeneration (rd) mice by in vivo gene therapy. Nat Med 2: 649-654) . Sin embargo, esta terapia requiere la identificación inequívoca del gen mutado en cada paciente, lo que en la actualidad sólo es posible en el 40% de los casos (Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P.O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., and Pang, CP. (2005) Gene mutations in retinosis pigmentaria and their clinical implications . Clin Chim Acta 351: 5-16) .

El transplante de células madre neuronales o precursores con el fin de desarrollar nuevos fotorreceptores constituye la finalidad de las terapias de neurorreparación . Los nuevos fotorreceptores tienen que restablecer las conexiones apropiadas con las neuronas de la retina interna.

La neuroprotección inducida mediante tratamiento con factores de crecimiento persigue evitar la muerte celular asociada al proceso neurodegenerativo. Se han probado diferentes formas de administración en varios modelos animales con degeneración de retina. Los primeros intentos consistieron en inyecciones intravitreas de varias proteínas recombinantes en ratas o ratones con degeneración de retina (Faktorovich, E. G., Steinberg, R. H., Yasumura, D., Matthes, M. T., and LaVail, M. M. (1990) Photoreceptor degeneration in inherited retinal dystrophy delayed by basic fibroblast growth factor. Nature 347: 83-86; LaVail, M. M., Unoki, K.,

Yasumura, D., Matthes, M. T., Yancopoulos, G. D., and

Steinberg, R. H. (1992) Múltiple growth factors, cytokines, and neurotrophins rescue photoreceptors from the damaging effects of constant light. Proc Nati Acad Sci U S A 89: 11249-11253) . Estos experimentos demostraron que el FGF2 enlentecia la degeneración de fotorreceptores en ratas RCS

(Royal Collage of Surgeon) . Varios factores de supervivencia, incluyendo el FGF2, FGFl, BDNF y CNTF, disminuyen la muerte de fotorreceptores inducida por daño luminoso (LaVail, M. M., Yasumura, D., Matthes, M. T., Lau-Villacorta, C, Unoki, K., Sung, CH. , and Steinberg, R. H. (1998) Protection of mouse photoreceptors by survival factors in retinal degenerations . Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 592-602). Inyecciones intravitreas de análogos de CNTF en modelos de ratón con degeneraciones hereditarias de la retina (modelo Q433ter, rd y nr; terminología usada para designar ciertos modelos de ratones con retinosis pigmentaria) resultaron en una evidente mejora de algunas degeneraciones. El efecto neuroprotector por análogos de CNTF también se ha comprobado en estudios en gatos con distrofia de conos-bastones autosómica dominante, en los que inyecciones intravitreas de CNTF tenían efectos beneficiosos (Chong, N. H., Alexander, R. A., Waters, L., Barnett, K. C, Bird, A. C, and Luthert, P. J. (1999) Repeated injections of a ciliary neurotrophic factor analogue leading to long-term photoreceptor survival in hereditary retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci 40: 1298-1305).

Otra aproximación ha sido utilizar vectores de terapia génica para expresar factores de supervivencia en retinas de ratones o ratas con degeneración de retina. En dos modelos de ratones, el rd y el Prph2Rd (mutación recesiva en periferina) (Travis, G. H., Brennan, M. B., Danielson, P. E., Kozak, CA. , and Sutcliffe, J. G. (1989) Identification of a photoreceptor- specific mRNA encoded by the gene responsible for retinal

degeneration slow (rds) . Nature 338: 70-73; Connell, G.,

Bascom, R., Molday, L., Reid, D., Mclnnes, R. R., and Molday,

R. S. (1991) Photoreceptor peripherin is the normal product of the gene responsible for retinal degeneration in the rds mouse. Proc Nati Acad Sci U S A 88: 723-726.), las inyecciones subretinianas de vectores adenovirales que codificaban para una forma secretable de CNTF retrasaron la muerte de fotorreceptores (Cayouette, M., and Gravel, C.

(1997) Adenovirus-mediated gene transfer of ciliary neurotrophic factor can prevent photoreceptor degeneration in the retinal degeneration (rd) mouse. Hum Gene Ther 8: 423- 430; Cayouette, M., Behn, D., Sendtner, M., Lachapelle, P., and Gravel, C. (1998) Infraocular gene transfer of ciliary neurotrophic factor prevents death and increases responsiveness of rod photoreceptors in the retinal degeneration slow mouse. J Neurosci 18: 9282-9293). Por su parte, la expresión transgénica de BDNF en la retina, que no resulta apenas activo por inyecciones intravitreas, retrasa la neurodegeneración en ratones Q344ter (Okoye, G., Zimmer, J., Sung, J., Gehlbach, P., Deering, T., Nambu, H., Hackett, S., Melia, M., Esumi, N., Zack, D. J., and Campochiaro, P. A. (2003) Increased expression of brain-derived neurotrophic factor preserves retinal function and slows cell death from rhodopsin mutation or oxidative damage . J Neurosci 23: 4164- 4172; Sung, CH. , Makino, C, Baylor, D., and Nathans, J. (1994) A rhodopsin gene mutation responsible for autosomal dominant retinosis pigmentaria results in a protein that is defective in localization to the photoreceptor outer segment. J Neurosci 14: 5818-5833). Estos resultados, asimismo, evidencian que, además de los problemas técnicos, una inyección intravitrea puntual puede ser insuficiente para tener efecto neuroprotector . Por su parte el CNTF, que por un lado si tiene efecto neuroprotector con una sola inyección,

ha resultado ser contraproducente cuando se induce su expresión prolongada mediante vectores AAV codificando para la forma secretable de CNTF, en ratones Prph2Rd y dos ratas transgénicas con degeneración de retina (Liang, F. Q., Alemán, T. S., Dejneka, N. S., Dudus, L., Fisher, K. J., Maguire, A. M., Jacobson, S. G., and Bennett, J. (2001) Long-term protection of retinal structure but not function using RAAV. CNTF in animal models of retinosis pigmentaria. Mol Ther 4: 461-472) ya que la función de los fotorreceptores empeoraba según un análisis por ERG.

Teniendo en cuenta todas las estrategias anteriormente expuestas la presente invención proporciona una solución práctica a los sistemas empleados hasta el momento. Con anterioridad se han puesto de manifiesto funciones de supervivencia de la insulina distintas a su función metabólica en el embrión de pollo, ya que la insulina, en forma de su precursor proinsulina, se expresa durante el desarrollo antes de que exista un esbozo pancreático. Durante el desarrollo del sistema nervioso, la proinsulina regula múltiples procesos celulares. En el embrión temprano es un factor de supervivencia, como se comprobó en un estudio inhibiendo la expresión del gen de la proinsulina o de su receptor mediante el uso de oligonucleótidos antisentido (Morales, A.V., Serna, J., Alarcon, C, de la Rosa, E. J., and de Pablo, F. (1997) Role of prepancreatic (pro)insulin and the insulin receptor in prevention of embryonic apoptosis. Endocrinology 138: 3967-3975). Su bloqueo mediante anticuerpos también aumenta el número de células apoptóticas en la retina de embrión de pollo (Diaz, B., Serna, J., De Pablo, F., and de la Rosa, E. J. (2000) In vivo regulation of cell death by embryonic (pro) insulin and the insulin receptor during early retinal neurogenesis . Development 127: 1641- 1649), mientras que su adición exógena al embrión reduce el

número de células apoptóticas (Hernandez-Sanchez, C, Mansilla, A., de la Rosa, E. J., Pollerberg, G. E., Martinez- Salas, E., and de Pablo, F. (2003) Upstream AUGs in embryonic proinsulin mRNA control its low translation level. Embo J 22: 5582-5592) . La molécula aislable de los embriones de pollo es proinsulina, el producto primario de traducción del gen, cuya actividad metabólica es pequeña, alrededor del 5-10% de la actividad de la insulina.

En las enfermedades neurodegenerativas crónicas las neuronas y/o las células de glia van muriendo de forma progresiva. Normalmente la sintomatologia de la enfermedad se manifiesta cuando se han muerto bastantes células. De ahi, la importancia de determinar moléculas eficaces que favorezcan la supervivencia celular para mantener una función visual relativamente normal. Aunque hay muchos tipos de enfermedades neurodegenerativas, cada una con una etiología diferente, todas cursan con una muerte final de las células afectadas. Esta muerte es del tipo programada, habiendo a su vez distintos tipos de muerte, ya sea apoptótica o no. A diferencia de los daños agudos, donde las células están en buen estado inicialmente antes del daño, en las enfermedades crónicas, las células conllevan un daño intrínseco que va a hacer que vayan muriendo en un momento determinado cuando ya no puedan soportar el daño y/o no puedan llevar a cabo la función que deben desempeñar.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN Descripción Breve

Un objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina, en adelante uso de un compuesto inductor de la presente invención, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento

de condiciones, desórdenes o enfermedades neurodegenerativas en las que se produzca muerte celular programada, preferentemente patologías neurodegenerativas del sistema nervioso central y periférico, y más preferentemente del grupo de enfermedades heredodegenerativas conocidas como retinosis pigmentaria. En un aspecto preferente de la invención, dicha composición farmacéutica es adecuada para su administración por via sistémica o local de forma mantenida.

Un objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una secuencia de nucleótidos, en adelante uso de la secuencia de nucleótidos proinsulina de la presente invención, que permite la expresión de una proteina o péptido neuroprotector, y que está constituida por una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NOl), b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) .

Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos está constituida por la SEQ ID NOl que codifica para la proinsulina humana.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de

la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos de d) es un vector de expresión, en adelante uso del vector de expresión proinsulina de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción genética codificante de una proteina proinsulina capaz de inducir neuroprotección .

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una célula eucariota, preferentemente humana, en adelante uso de células proinsulina de la invención, modificada genéticamente y que comprende la secuencia de nucleótidos, la construcción o el vector de expresión proinsulina de la invención y que puede expresar y liberar de forma adecuada la proteina proinsulina al medio extracelular . Otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una proteina o péptido, en adelante uso de la proteina proinsulina de la presente invención, que presenta actividad neuroprotectora, y que comprende una o varias secuencias de aminoácidos pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID NO2) , b) una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) .

Otra realización particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la invención en

el que el compuesto inductor es la proteína proinsulina humana (SEQ ID NO2) .

Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con alteraciones neurodegenerativas, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina de la invención, en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para mantener una administración mantenida por vía sistémica o local del compuesto inductor.

Una realización particular de la invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente grupo : a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NOl), b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) , y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) .

Otra realización particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos está constituida por la SEQ ID NOl, que codifica para la proinsulina humana.

Otra realización particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos es un vector de expresión de la proinsulina humana. Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una proteina o un péptido codificado por la secuencia, construcción genética o vector proinsulina de la invención. Una realización particular de la invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que la proteina o péptido inductor de la actividad de la proinsulina pertenece al siguiente grupo: a) una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana

(SEQ ID N02) , b) una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) , y b) , y d) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) .

Otra realización particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de aminoácidos está constituida por la proinsulina humana (SEQ ID NO2) .

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una célula, preferentemente humana, y más preferentemente una célula del sistema nervioso central, transformada por la

secuencia, construcción o vector de expresión de proinsulina de la invención.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la invención, en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología neurodegenerativa del sistema nervioso central o periférico que afecta a seres humanos, en la que se produzca muerte celular programada, consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada que permita atenuar dicha neuroregeneración .

Descripción Detallada Teniendo en cuenta que la mayoría de las afecciones neurodegenerativas, en particular en la Retinosis Pigmentaria, no tienen un tratamiento eficaz y/o efectivo, la presente invención proporciona una solución alternativa.

La presente invención se basa en que los inventores han demostrado que la proinsulina - factor de crecimiento de la familia de la insulina, normalmente conocida por ser la forma precursora de la insulina - es, además, un factor de supervivencia celular en procesos de neurodegeneración crónica, en particular en los procesos de neurodegeneración retiniana que tienen lugar en la retinosis pigmentaria.

Como modelo de degeneración de retina se ha elegido los ratones rdlO (Pdeb ^rdl0/rdl °) y rdl (Pdeb ^rdl/rdl ) , que portan una mutación homocigota recesiva en el gen de la enzima fosfodiesterasa de GMP cíclico especifica de bastones, lo que provoca una alteración en la función de esa enzima, lo que lleva a la muerte celular progresiva de los fotorreceptores, y la consiguiente degeneración secundaria del resto de tipos celulares de la retina, principalmente los conos.

Se han generado dos líneas de ratones transgénicos que expresan la proteína proinsulina humana y homocigotos recesivos para la mutación rdlO, los ratones Proins/rdlO

(Ejemplo 1.1). Estos ratones Proins/rdlO ^'7' con degeneración de la retina, producen proinsulina humana de forma constitutiva en el músculo estriado - que no se procesa a insulina - que se detecta en suero y no está sujeta a la regulación normal del páncreas por niveles de glucosa. Esto provoca que el animal tenga niveles circulantes mantenidos de proinsulina humana, sin depender de dosis, del estado del producto antes de la admistración- ya que al ser de producción endógena no se degrada como puede ser un producto comercial-, y del modo y momento de la inyección. Esto ha permitido no hacer estudios de farmacocinética para ver como administrarlo.

La presencia de proinsulina humana en músculo y suero en los ratones Proins/rdlO ^"7" de ambas líneas se comprobó con un kit de detección ELISA contra la proinsulina humana. Además, se midió la glucemia, y se comprobó que la proinsulina no tiene efectos metabólicos indeseados. Por otro lado, se ha comprobado mediante inyección subcutánea de proinsulina humana que dicha proinsulina es capaz de llegar a la retina neural (identificación de la proinsulina mediante el kit de ELISA en extractos de retina) , lo que implica que es capaz de pasar la barrera hematorretiniana .

Los efectos de la hiperproinsulinemia de los ratones Proins/rdlCT ^7' en la neurodegeneración retiniana se identificaron de diversas maneras. En primer lugar, se observó histológicamente el estado de la retina (Ejemplo 1). En los ratones transgénicos para proinsulina humana y homocigotos para rdlO la degeneración se retrasa y se ha comprobado que a P32 en la retina se mantienen mayor número

de bastones, conos y conexiones sinápticas, y que el estado de la retina es mejor (Ejemplo 1) .

El hecho de que en los ratones además se mantenga el estado de la retina mejor por más tiempo, es beneficioso. Si además de enlentecer el proceso de muerte celular en las células propiamente dañadas (los bastones de la retina) se mantiene en mejor estado el resto de la retina, como por ejemplo evitando la muerte de los conos que no tienen un daño intrínseco, sino que degeneran secundariamente, se están mejorando varios aspectos de la enfermedad. En este caso en concreto, si se mantiene los conos por más tiempo, aunque los bastones acaben por degenerar, se mantiene la visión diurna, aunque la nocturna se vaya perdiendo, y eso significa calidad de vida en un paciente con retinosis pigmentaria. Posteriormente, se analizó la función visual con los cinco tipos estandarizados de electrorretinogramas a lo largo del proceso degenerativo, comparando los ratones transgénicos con controles rdlO, y se ha comprobado que en los ratones Proins/rdlCT ^7' todavía a P55 siguen teniendo algo de función visual, cosa que en los ratones rdlO desaparece a P35, con lo que se puede concluir que la respuesta visual es mejor y se prolonga más en el tiempo en los ratones Proins/rdlO

(Ejemplo 2). Además, los ratones transgénicos Proins/rdlO ^'7' llegan a tener ERG comparables a ratones sanos, al menos en visión fotópica (diurna) a P30 (Ejemplo 2, Figura 4) .

Por otro lado, en la presente invención se observa que la utilización de proinsulina en una forma de administración que permite niveles fisiológicos mantenidos en el tiempo permite que la proinsulina ejerza su función neuroprotectora (ver Ejemplo 1.4), al contrario de lo que se observa con administraciones puntuales. Con respecto a esto último se han probado administraciones puntuales de proinsulina subcutáneas e intravitreas, pero no fueron exitosas en la mejora de la

neurodegeneración retiniana probablemente al no obtenerse niveles estables y mantenidos en el tiempo (Ejemplos 3 y 4) .

Otra ventaja adicional es que la proinsulina no tiene los efectos metabólicos de la insulina y, por lo tanto, se puede administrar a pacientes que no tienen alterado el metabolismo de la glucosa. Aunque en estudios in vitro la insulina también presenta actividad antiapoptótica, su actividad metabólica normal hace inviable su utilización para un tratamiento como el aqui descrito. El hecho de que sea la proinsulina circulante sérica la que logre este rescate, indica que es un buen tratamiento, ya que hace que sea de fácil administración. La aplicación de la proinsulina seria un tratamiento tanto preventivo como sofocante de enfermedad neurodegenerativa, ya que evita la muerte de las neuronas dañadas .

En resumen, niveles séricos crónicos de proinsulinemia

(1-15 pM) , obtenidos mediante expresión transgénica de proinsulina humana controlada por el promotor de la cadena ligera de la miosina, que también podrían ser obtenidos mediante otras formas de administración mantenida, por ejemplo, inyección subcutánea de proinsulina humana vehiculizada en soportes de liberación lenta o vectores de expresión aprobados para terapia génica, son capaces de alcanzar la retina y atenuar la neurodegeneración de los fotorreceptores en el modelo genético de ratones rdlO.

Por lo tanto, un objeto de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina, en adelante uso de un compuesto inductor de la presente invención, para la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para la prevención y el tratamiento de condiciones, desórdenes o enfermedades neurodegenerativas en las que se produzca muerte celular programada, preferentemente patologías neurodegenerativas del

sistema nervioso central y periférico, y más preferentemente del grupo de enfermedades heredodegenerativas conocidas como retinosis pigmentaria. En una realización preferida de la presente invención, la composición farmacéutica además comprende un vehículo adecuado para administrar la composición farmacéutica de forma mantenida por via sistémica o local.

En la presente invención, se entiende que una composición farmacéutica es adecuada para su administración por via sistémica o local de forma mantenida, cuando dicha composición es formulada, comprimida o vehiculizada farmacéuticamente de tal forma que se libere de forma constante en el cuerpo, manteniéndose a una dosis efectiva en el tejido diana durante un periodo de tiempo prolongado. En un aspecto de la invención, cualquier vehiculo apto para administrar de forma mantenida la composición farmacéutica de la presente invención, por ejemplo pero sin limitarnos a polímeros o parches, quedarla englobado dentro del ámbito de protección de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "compuesto inductor de la actividad de la proinsulina" se refiere a una molécula que mimetiza, incrementa la intensidad o prolonga la duración de la actividad neuroprotectora de la proteina proinsulina humana. Un compuesto activador puede estar constituido por una molécula química, un péptido, una proteina o una secuencia de nucleótidos, asi como aquellas moléculas que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos codificante de una proteina con actividad neuroprotectora.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "actividad neuroprotectora" se refiere a la atenuación del proceso de muerte celular programada de las células

primariamente afectadas en la enfermedad neurodegenerativa, y/o de las células secundariamente afectadas por la neurodegeneración, y/o a la potenciación de la actividad neurofuncional de las células remanentes. Tal como se utiliza en la presente invención el término "enfermedad neurodegenerativa" se refiere una enfermedad, desorden o patología perteneciente, entre otras a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, retinosis pigmentaria, demencia de cuerpos de Lewy, Esclerosis lateral amiotrófica, atrofias espinocerebelosas, demencia frontotemporal, enfermedad de Pick, demencia vascular, enfermedad de Huntington, enfermedad de Baten, lesión en médula espinal, degeneración macular y glaucoma.

Asi, un objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una secuencia de nucleótidos, en adelante uso de la secuencia de nucleótidos proinsulina de la presente invención, que permite la expresión de una proteina o péptido neuroprotector, y que está constituida por una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NOl), b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o O .

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia mostrada en la presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más nucleótidos, la adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que permita la codificación de un péptido o proteina capaz de mimetizar la actividad de la proinsulina humana (SEQ ID NO2) .

A partir de la información descrita en la presente invención y en el estado de la técnica, un técnico experto en el sector de la técnica puede aislar o construir una secuencia de nucleótidos análoga a las descritas en la presente invención para su posterior utilización.

En general, una secuencia de nucleótidos análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de nucleótidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. La forma preferente de la secuencia de nucleótidos a utilizar es la secuencia de nucleótidos de proinsulina de origen humano (SEQ ID NOl) y sus derivados.

Tal como se utiliza en la presente invención el término "secuencia de nucleótidos" se refiere a una secuencia de DNA, cDNA o mRNA.

Una realización particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos está

constituida por la SEQ ID NOl que codifica para la proinsulina humana.

La secuencia de nucleótidos definida en el apartado d) se corresponde con una construcción génica y con vector de expresión génica que permite la expresión de una proteina proinsulina. En el caso de la construcción génica, construcción génica proinsulina de la invención, también puede comprender, en caso necesario y para permitir un mejor aislamiento, detección o secreción al exterior de la célula del péptido expresado, a una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento, detección o secreción de dicho péptido. Por tanto, otro objeto particular de la presente invención lo constituye una construcción génica que comprende, además de la secuencia de nucleótidos proinsulina de la invención, cualquier otra secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o secuencia peptidica que permita el aislamiento, la detección o la secreción al exterior de la célula del péptido expresado, por ejemplo, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, una secuencia de polihistidina (6xHis), una secuencia peptidica reconocible por un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, para su identificación), o cualquier otra que sirva para purificar la proteina de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad: péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E-tag) (Using antibodies: a laboratory manual. Ed. Harlow and David Lañe (1999). CoId Spring Harbor Laboratory Press. New York. Capitulo: Tagging proteins. Pp. 347-377).

La secuencia de nucleótidos y la construcción génica descritas previamente pueden ser aisladas y obtenidas por un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2 ^nd ed., CoId Sping Harbor

Laboratory Press, N. Y., 1989 vol 1-3). Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión génica que permite la regulación de la expresión de la misma en condiciones adecuadas en el interior de las células. Por tanto, otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina donde la secuencia de nucleótidos de d) es un vector de expresión, en adelante uso del vector de expresión proinsulina de la invención, que comprende una secuencia de nucleótidos o una construcción génica codificante de una proteina proinsulina capaz de inducir neuroprotección . Un ejemplo de una realización particular lo constituye el uso de un vector de expresión elaborado en la presente invención en el que la expresión se regula mediante un promotor especifico de músculo y la secuencia de nucleótidos SEQ ID NOl (ver Ejemplo 1) .

En general, un vector de expresión comprende, además de la secuencia de nucleótidos o de la construcción genética descritas en la invención, un promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ret, etc.), preferentemente tisular, al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2, etc.), señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS) , secuencias codificantes de reguladores transcripcionales (enhancers) , silenciadores transcripcionales (silencers) , represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión, vectores virales (DNA o RNA), cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden

contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización particular de la presente invención dicho vector es un plásmido o un vector viral. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia al igual que para la transformación de microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidos - transformación química, electroporación, microinyección, etc. - descritos en diversos manuales

[Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989).

Molecular cloning: a laboratory manual, 2 ^nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N. Y.]. Una estrategia podría ser la de utilizar lentivirus para infectar las células diana, tal y como ya esta siendo intentado en otro tipo de terapias (Ralph GS, Binley K, Wong LF, Azzouz M, Mazarakis ND (2006) Gene therapy for neurodegenerative and ocular diseases using lentiviral vectors . Clin Sci (Lond) 110: 37-46) .

Los sistemas de expresión génica pueden permitir o no la integración del nuevo material genético en el genoma de la célula huésped. De esta forma, tanto la secuencia de nucleótidos, la construcción génica o el vector de expresión proinsulina pueden utilizarse como un medicamento para proteger células humanas, preferentemente neuronas y/o células guales humanas afectadas de una alteración neurodegenerativa, en un procedimiento de tratamiento y profilaxis de terapia génica de un ser humano afectado por una enfermedad que cursa con alteraciones neuronales y/o guales. Estos sistemas de expresión génica una vez administrados a un ser humano afectado por una enfermedad

neurodegenerativa pueden introducirse de forma general o especifica en células tisulares donde, una vez integradas en el genoma celular, permiten la expresión de una proteina proinsulina, la cual una vez secretada al medio extracelular alcanza el sistema nervioso central donde llevarla a cabo su acción neuroprotectora (ver ejemplos).

Por otro lado, estos sistemas de expresión génica pueden ser utilizados para transformar también células humanas fuera del cuerpo humano, autólogas o heterólogas con respecto al potencial receptor, convirtiéndose estas células en compuestos inductores de la proinsulina una vez que se administren a un ser humano enfermo de una enfermedad neurodegenerativa ya que expresan y liberan proteina proinsulina con actividad neuroprotectora de neuronas y/o células guales humanas.

Asi, otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una célula eucariota, preferentemente humana, en adelante uso de células proinsulina de la invención, modificada genéticamente y que comprende la secuencia de nucleótidos, la construcción o el vector de expresión proinsulina de la invención y que puede expresar y liberar de forma adecuada la proteina proinsulina al medio extracelular. Estas células pueden ser transformadas, infectadas o transíectadas mediante dichas secuencias de nucleótidos por técnicas de ingeniería genética conocidas por un experto en la materia. [Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory]. Las herramientas biofarmacéuticas y los procedimientos de terapia génica son suficientemente conocidas por un experto del sector de la técnica de tal

forma que con la información descrita en la presente invención pueden desarrollarse sin excesivo esfuerzo.

Otra realización particular seria el uso de una célula humana transformada mediante la secuencia de nucleótidos de la proinsulina humana (SEQ ID NOl), proveniente de distintas estirpes celulares, preferentemente del sistema nervioso central y más preferentemente una neurona que puede utilizarse como células regeneradoras de tejidos humanos.

Además, otro objeto particular de la invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina en el que el compuesto inductor es una proteina o péptido, en adelante uso de la proteina proinsulina de la presente invención, que presenta actividad neuroprotectora, y que comprende una o varias secuencias de aminoácidos pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID N02) , b) una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) .

En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a la secuencia mostrada en la presente memoria, por ejemplo, mediante la introducción de sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, incluyendo la inserción de uno o más aminoácidos, la adición de uno o más aminoácidos en cualquiera de los extremos de la molécula o la deleción de

uno o más aminoácidos en cualquier extremo o en el interior de la secuencia, y que mimetice la actividad neuroprotectora de la proinsulina humana.

A partir de la información descrita en la presente invención, un técnico experto en el sector de la técnica puede aislar o construir una secuencia de aminoácidos análoga a las descritas en la presente invención.

En general, una secuencia de aminoácidos análoga es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de aminoácidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.

Otra realización particular de la presente invención lo constituye el uso de un compuesto inductor de la invención en el que el compuesto inductor es la proteina proinsulina humana (SEQ ID NO2) . Otro objeto de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con alteraciones neurodegenerativas, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende un compuesto inductor de la actividad de la proinsulina de la invención, en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para administrar el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina de forma mantenida por via sistémica o local.

Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la

materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar neuroprotección, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.

En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier via de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la via de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por via parenteral, por via oral, por inhalación nasal, por via intraperitoneal, subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el "Tratado de Farmacia Galénica", C. Fauli i Trillo, 1993, Luzán 5, S. A. Ediciones, Madrid.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto o agente neuroprotector pertenece al siguiente grupo: secuencia, construcción genética o vector de expresión proinsulina que permiten la expresión de una proteina o péptido con actividad proinsulina.

Una realización particular de la invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una o varias secuencias de nucleótidos pertenecientes al siguiente grupo : a) una secuencia de nucleótidos constituida por la secuencia de nucleótidos codificante de la proinsulina humana (SEQ ID NOl), b) una secuencia de nucleótidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) .

Otra realización particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos está constituida por la SEQ ID NOl, que codifica para la proinsulina humana. Otra realización particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de nucleótidos es un vector de expresión de la proinsulina humana.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una proteina o un péptido codificado por la secuencia, construcción genética o vector proinsulina de la invención.

Una realización particular de la invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que la proteina o péptido inductor de la actividad de la proinsulina pertenece al siguiente grupo:

a) una secuencia de aminoácidos constituida por la secuencia de aminoácidos de la proinsulina humana (SEQ ID N02) , b) una secuencia de aminoácidos análoga a la secuencia de a) , c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b) , y d) una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente a: a), b) , y/o c) . Otra realización particular de la presente invención lo constituye la composición farmacéutica de la invención en la que la secuencia de aminoácidos está constituida por la proinsulina humana (SEQ ID N02) .

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica de la invención en la que el compuesto inductor de la actividad de la proinsulina es una célula, preferentemente humana, y más preferentemente una célula del sistema nervioso central, transformada por la secuencia, construcción o vector de expresión de proinsulina de la invención.

Otro objeto de la invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la invención, en un método de tratamiento o profilaxis de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología neurodegenerativa del sistema nervioso central o periférico que afecta a seres humanos, en la que se produzca muerte celular programada, consistente en la administración de dicha composición terapéutica en dosis adecuada que permita atenuar dicha neuroregeneración .

La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.

Otro objeto particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un método de tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa perteneciente al siguiente grupo: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, demencia de cuerpos de Lewy, Esclerosis lateral amiotrófica, atrofias espinocerebelosas, demencia frontotemporal, enfermedad de Pick, demencia vascular, enfermedad de Huntington, enfermedad de Baten y lesión en médula espinal.

Otra realización particular de la presente invención lo constituye el uso de la composición farmacéutica de la invención en un método de tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa perteneciente al siguiente grupo: retinosis pigmentaria, degeneración macular y glaucoma.

BREVE DESCRIPCIóN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una representación esquemática del inserto de cDNA del gen de la preproinsulina humana y del plá smido pMLC-hlns. (A) Se muestra una representación esquemática de la secuencia de DNA que está insertada en el plásmido. Corresponde al cDNA del gen de la proinsulina humana. En el esquema se muestra el mRNA del gen de 462 pares de bases (pb) , que está formado por tres exones (exonl= El, exón2= E2, exón 3= E3) . La secuencia de DNA insertada es la que se traduce, la ORF (del inglés "open reading frame") de 347 pb . Las zonas flanqueantes no traducidas, (5'UTR y 3'UTR) no están insertadas en la construcción. La proteina que se traduce es la preproinsulina de 110 aminoácidos (aa) . Esta proteina consta de un péptido señal (pep. señal), la cadena B, el péptido C y la cadena A. El péptido señal se elimina, quedando la molécula proinsulina. (B) El plásmido contiene el inserto descrito en el apartado anterior l.A, que codifica

para la proteína preproinsulina de 110 aminoácidos (zona gruesa en negro), bajo el control transcripcional del promotor constitutivo muscular MLCl (Miosin Light Chain) de las fibras de cadena ligera de la miosina del músculo estriado. Este plásmido es el utilizado para producir las dos líneas de ratones transgénicos productores de proinsulina humana que se cruzaron para alcanzar homocigosis para rdlO. La Figura 2 muestra secciones de criostato de 12 μm de ojos de ratones a P32 donde se aprecia el estado de bastones y conos que evidencian con distintos marcadores el avance de la degeneración. Ratón control silvestre (A y D), ratón transgénico productor de proinsulina y rdlO homocigoto, Proins/rdlO , (B y E) y ratón rdlO homocigoto control (C y F) . Mediante tinción nuclear con DAPI se puede apreciar la capa nuclear externa (CNE) donde se sitúan los núcleos de los bastones y conos. La capa nuclear interna (CNI) es donde se encuentran los núcleos de células bipolares, amacrinas, horizontales y Müller. Para el mareaje de conos se utilizó una aglutinina marcada con el fluorocromo Alexa 488, cuya reacción muestra los segmentos externos (flecha de arriba) y los pies sinápticos de los conos (flecha de abajo) . La barra representa 45 μm.

La Figura 3 muestra secciones de criostato de 12 μm de ojos de ratones a P32 donde se aprecia el estado de las conexiones sinápticas. Ratón control silvestre (A), ratón transgénico productor de proinsulina y rdlO homocigoto, Proins/rdlO

(B) , y ratón rdlO homocigoto control (C) . Se muestran las capas nucleares CNE, CNI y la capa de células ganglionares

(CCG) . Entre ellas se sitúan las capas plexiformes donde se producen las conexiones sinápticas, capa plexiforme externa

(CPE) y capa plexiforme interna (CPI) . La figura muestra el mareaje inmunohistoquímico con el anticuerpo SV2 que marca

las conexiones sinápticas en general. La barra representa 45 μm.

La Figura 4 representa los resultados de los registros electrorretinográ fieos realizados a P30. Ratón silvestre (wt) , ratón RdIO ^'7' control y ratón Proins/RdlO ^"7" , tanto de la linea 1 (Ll) como de la linea 2 (L2) . Para cada animal se muestran ejemplos de las respuestas electrorretinográficas registradas en condiciones escotópicas (nocturnas) , originadas en los bastones (fila superior) y respuestas mixtas (fila intermedia) . Se muestran asimismo las respuestas electrorretinográficas registradas en condiciones fotópicas

(diurnas) , originadas en conos (fila inferior) . Nótese la mayor amplitud de las respuestas obtenidas en ratones

Proins/rdlO ^"7" de ambas lineas (Ll y L2) en comparación con las respuestas de los ratones RdIO ^"7" .

La figura 5 muestra la correlación entre los niveles de proinsulina humana y el mantenimiento de parámetros de visión. Los niveles de proinsulina humana en ratones Proins/RdlO ^"7" se determinaron a P32 en el músculo cuadríceps de los ratones a los que se habia realizado una exploración electrorretinográfica completa a P30. Los respectivos valores de proinsulina y de los diferentes parámetros de visión siguen curvas hiperbólicas. Se muestran las amplitudes de las ondas electrorretinográficas b _max (registrada en respuesta a 1.5 log cd-s-m ^"2 ), OP (potencial oscilatorio) , b _fo t (registrada en respuesta a 1.5 log cd-s-m ^"2 ), y la respuesta Flicker. La Figura 6 muestra los resultados de los registros electrorretinográ fieos realizados a diferentes dias. Ratón silvestre (wt) , ratón RdIO ^"7" control y ratón Proins/RdlO ^"7" RdlO/rdlO, a diferentes dias de desarrollo postnatal: P35, P45 y P55. En A se muestra para cada tipo de animal y a los distintos tiempos de desarrollo postnatal, ejemplos de las respuestas registradas en condiciones escotópicas, exclusiva

de bastones (-2,55 log cd ^» s ^» m-2) y respuestas mixtas (1,48 log cd ^» s ^» m-2) En B se muestra también para cada tipo de animal y a los distintos tiempos de desarrollo postnatal, ejemplos de las respuestas registradas en condiciones fotópicas, generada en conos (1,48 log cd ^» s ^» m-2).

La figura 7 muestra la presencia de proinsulina humana en retina tras su inyección por via subcutánea. Cuantificación de proinsulina humana por ELISA en extractos de retina de ratones C57B1/6 inyectados subcutáneamente con las cantidades de proinsulina indicadas, 2 horas antes de la preparación del extracto, o diariamente, entre PIl y P14, siendo la última inyección también 2 horas antes de la preparación del extracto . La figura 8 muestra el efecto de las inyecciones subcutáneas de proinsulina humana en la histología de la retina de ratones en neurodegeneración . Secciones de retina de ratones RdI ^"7" a P14 inyectados cada 12 horas entre P6 y P14 ó P18 con proinsulina humana (B y D) o vehículo (A y C) . Mediante tinción nuclear con DAPI se puede apreciar la pérdida de los fotorreceptores en la capa nuclear externa en todos los casos. CNE, capa nuclear externa; CNI, capa nuclear interna; CCG, capa de células ganglionares . La barra representa 25 μm.

La figura 9 muestra el efecto de las inyecciones subcutáneas de proinsulina humana en la función visual de ratones en neurodegeneración. Electrorretinogramas de ratones RdI ^"7" inyectados cada 12 horas entre P6 y P14 ó P18 con proinsulina humana (Proins) o vehículo (PBS) . Se muestran electrorretinogramas de ratones mutantes rd hermanos de carnada sometidos a los diferentes tratamientos. La inyección de proinsulina no evitó el proceso de pérdida de función visual .

EJEMPLOS DE REALIZACIóN

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan aquí sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aqui se reivindica.

Ejemplo 1.- La proinsulina humana es capaz de evitar la muerte de bastones de la retina y de mantener las conexiones sinápticas en el ratón transgénico Proins/rdlO ^~/~ . 1.1.- Producción de dos lineas de transgénicos productores de proinsulina humana y homocigotos para la mutación rdlO (Proins/rdlO ^"7" ) Tras obtener varias lineas de ratones transgénicos productores de proinsulina humana, bajo el control del promotor constitutivo de la cadena ligera de la miosina

(MLCl) del músculo estriado, cuyo bagaje genético era 50%

C57B1/6 y 50% SJL, se cruzaron sucesivamente con ratones homocigotos rdlO (100% C57B1/6). Con esto se consiguió homogeneizar el bagaje genético hasta llegar a un porcentaje superior al 95% C57B1/6 y obtener ratones Proins/rdlO ^'7' . Esto se consiguió a partir del sexto retrocruce, obteniéndose dos lineas principales, Ll y L2 (en los ejemplos siguientes se ha utilizado animales L2, mientras que los resultados descritos en la Figura 4 ERG a P30, se han llevado a cabo también con animales de la Ll; los análisis de proinsulinemia y glucemia se han realizado en ambos) .

En la presente invención se entiende por ratón silvestre al ratón utilizado como control. No tiene ninguna alteración. Es comercial y su nombre es C57B1/6J, procedente de los laboratorios Jackson.

Se entiende por ratón rdl a los ratones comerciales que llevan la mutación en el gen de la fosfodiesterasa de GMP cíclico especifica de bastones, cuyo nombre comercial es Pdeb ^rdl/rdl , procedente de los laboratorios Jackson. Se entiende por ratón rdlO a los ratones comerciales que llevan la mutación en el gen de la fosfodiesterasa de GMP cíclico especifica de bastones, cuyo nombre comercial es Pdeb ^rdl0/rdl °, procedente de los laboratorios Jackson.

Se entiende por Ratón Proins/rdlO ^'7' a los ratones generados por cruce que son ratones rdlO y transgénicos productores de proinsulina humana bajo el promotor del músculo estriado MLCl . La construcción introducida en estos ratones lleva el cDNA de la proteina proinsulina humana controlada por el promotor muscular de la miosina de cadena ligera, cuya expresión es constitutiva (Figura IB, SEQ ID NOl) . Se observa una variabilidad en la expresión, que se puede deber a la distinta penetrancia del transgénico. Esto se correlaciona con la producción de proinsulina humana que se encuentra en suero. La construcción utilizada para generar el ratón transgénico consistió en un plásmido (pMLC-hlns) de un tamaño de 6,4 kb . La expresión va mediada por el promotor muscular constitutivo, de la cadena ligera de la miosina (MLC) . El cDNA del gen de la proinsulina humana esta clonado entre los dos sitios EcoRI (Figura IB) .

Genotipaje. El DNA genómico se obtuvo de los tejidos según la técnica descrita por Miller y cois, 1988 (Miller, S. A., Dykes, D. D. and Polesky, H. F. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 16, 1215.) . Las colas de ratones destetados se digirieron en 0,5 mi de tampón de lisis (Tris- HCl 40 mM, pH 8,0, EDTA 20 mM, SDS 0,5% y NaCl 200 mM) con 0,3 mg de Proteinasa K (Roche Diagnostics, Mannheim,

Alemania) . Tras precipitar el DNA, se cortó con la enzima HindIII (Roche) . Se utilizaron 10 μg de DNA genómico que se digirieron con la enzima HindIII en un volumen de 50 μl finales, durante toda la noche a 37°C. Se cargaron en cada pocilio individual de un gel de agarosa al 1% de 12 cm de largo para una buena separación de tamaño. Previo a la transferencia se preparó el gel con las siguientes soluciones: primero 15 minutos con solución de depurinación (0,5 M HCl), después 30 minutos con solución de desnaturalización (0,5 N NaOH y 1,5 M NaCl), y finalmente 30 minutos con solución de neutralización (0,5 M Tris-HCl, pH 8) . Con este tratamiento se consigue la fragmentación del DNA, lo que facilita su transferencia. Se utilizaron membranas de nylon (Schleicher & Schuell BioSciencie, USA) y el DNA se fijó a la membrana por radiación UV en el horno Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, EEUU) . La transferencia húmeda se realizó durante toda la noche a temperatura ambiente.

Para el genotipaje, se utilizó una sonda marcada radiactivamente con ³² P en la base dCTP contra la secuencia del cDNA de proinsulina humana insertada en la construcción. El molde para hacer la sonda se sacó del propio plásmido, digiriendo con EcoRI (Roche) .

El inserto liberado tras la digestión del constructo con EcoRI, se purificó por el kit DNA extraction (Millipore) . El mareaje de la sonda se realizó utilizando el Kit Random primer (Stratagene), en presencia de [ ³² PJdCTP. Posteriormente, la sonda se purificó en columnas Microspin G25 (Amershan Pharmacia Biotech) . La membrana se prehibridó a 65°C con una solución que contiene 50% formamida, Denhardt Ix (0,02% de Ficol, 0,02 % de polivinilpirrolodona y 0,02% de BSA), 1% de SDS, SSC 5x (0,15 M de NaCl y 15 mM de citrato sódico a pH 7,2) y 0.1

mg/ml de DNA de esperma de salmón durante al menos 2 horas; posteriormente se hibridó a 65°C toda la noche con la solución de prehibridación, a la que se le añadieron 1.5 xlO ⁶ cpm/ml de la sonda. Se realizaron dos lavados de 15 minutos con SSC 2x a temperatura ambiente, otro de 30 minutos con SSC2x 1% SDS y un último de 30 minutos con SSC 2x y 0,1 % de SDS a 62,5°C.

Una vez lavados los filtros, sin dejar que se secaran, se envolvieron en un plástico tipo GLAD y se expusieron entre dos pantallas de amplificación (Genescreen plus, DuPont) a una película fotográfica de 18x24 cm, tipo Kodak Biomax MS

(Eastman Kodak Company, Rochester, NY, EE.UU.). Se requirió un tiempo de exposición de 3-4 dias para obtener una señal nítida. La sonda producida contra el cDNA de la proinsulina humana detectó una banda de 1,5 Kb en el gel de DNA genómico.

Los ratones rdlO tienen una mutación puntual localizada en el exón 13 del gen de la enzima fosfodiesterasa 6 de GMP cíclico especifica de bastones. En los ratones silvestres existe en esa localización un sitio de corte con la enzima Cfoí. En el caso de los mutantes, desaparece el lugar de corte de la enzima. Esto permitió un control de la técnica de genotipaje intrínseco.

Se realizó la PCR sobre genómico con los siguientes cebadores: 3'- CTTTCTATTCTCTGTCAGCAAAGC -5' (Oligo A, SEQ ID NO3) y 3'- CATGAGTAGGGTAAACATGGTCTG -5' (Oligo B, SEQ ID NO4) que amplificaron un fragmento de 97 pb . Después el producto de PCR se sometió a digestión con la enzima Cfol (Roche) durante dos horas a 37°C. Después se fraccionó en un gel de agarosa Metaphor al 3%. Los ratones silvestres mostraron dos bandas, tras la digestión, de 54 y 43 pb . Los ratones homocigotos rdlO dieron una sola banda de 97 pb, ya que la enzima no corta el amplicón y los ratones heterocigotos rdlθ/+ mostraron tres bandas (de un alelo que se corta y el

otro no) . En este gen no se encontró ningún tipo de variabilidad entre individuos, lo cual se traduce en que la degeneración sigue un patrón estándar que se suele cumplir de la misma manera para todos los individuos que la poseen.

1.2.- Determinación de la glucemia y de los niveles de proinsulina en los ratones transgénicos .

A todos los ratones se les midió la glucemia con tiras reactivas (Accu-Chek, Roche) tras 12 horas de ayuno. Los niveles normales de un ratón suelen estar entre 100 y 200 mg/dl. En los dobles mutantes Proins/rdlO se encontró una variación de entre 80 y 150 mg/dl, que no se correlacionaba directamente con los niveles de proinsulinemia .

Para la detección de los niveles de producción de proinsulina humana por los ratones transgénicos, se utilizó un ensayo comercial ELISA (Lineo Research, MO, EEUU) que detecta específicamente la proinsulina humana.

Se analizaron músculo y suero, tanto de ratones transgénicos como controles. En el caso del suero, se siguieron todas las recomendaciones del fabricante, pero en el caso del músculo, se requirió una previa extracción proteica con un tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl pH 7,0, 100 mM de NaCl y 0,1% de Tritón) y una cuantificación de la misma con el kit BCA (Pierce, Rockford, IL, EEUU) . La proinsulina humana detectada en los extractos de músculo siempre fue muy elevada y se tuvo que corregir por la cantidad de proteina. La proinsulina humana detectada en suero osciló entre 1 y 15 pM. Esta concentración se midió en un volumen de 20 μl, de acuerdo con las instrucciones del kit. Las medidas se hicieron sistemáticamente a P30. Esto nos indicó que los ratones transgénicos Proins/rdlO ^'7' , producen proinsulina humana en músculo y que esta se vierte a la

circulación sanguínea desde donde es capaz de llegar a la retina neural .

1.3.- Inmunotinciones en secciones de criostato de la retina de los ratones transgénicos .

En ratones P32 se analizó la histología de la retina (figura 2), comparando ratones silvestres que no sufren degeneración (A y D) , ratones Proins/rdlO ^'7' (B y E) y ratones rdlO (C y F) , que si sufren degeneración. A P32, momento en que la degeneración está muy avanzada en las retinas de ratones rdlO ^'7' , se analizó el número de células fotorreceptoras que hay por columna, el estado y abundancia de conos y el estado de las sinapsis (Figura 3) . Se pretendía de esta manera comprobar el estado de la retina en general y del avance de la degeneración con distintos marcadores.

Todos los tejidos se embebieron en Tissue-tec (Sakura Finetek Europe B. U. Países Bajos), se congelaron en nieve carbónica y se conservaron a -80 ⁰ C hasta su procesamiento. Se realizaron secciones de criostato a 12 μm de grosor. Se recogieron en portas cubiertos con poli-L-lisina (Fisher Biotech, Pittsburgh, EEUU) y se mantuvieron a -80 ⁰ C hasta su utilización .

En todos los casos, fuera cual fuese la tinción a realizar, tras sacar los portas del congelador, se dejaron a temperatura ambiente durante media hora y se fijaron con paraformaldehido (PFA) al 4% durante 20 minutos, tras lo cual se lavaron con PBS.

Se decidió marcar los conos que quedaban, porque como degeneran secundariamente, sin tener ninguna mutación, podían dar una idea del estado de la retina y su mantenimiento. Por su parte, para ver el progreso de la degeneración en los bastones, sólo habla que contar el número de filas de células que quedaban en el grosor de la capa nuclear externa (CNE) .

Para el mareaje de conos, se utilizó una aglutinina marcada con el fluorocromo Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, EEUU) durante 2 horas en una solución de PBS con BSA al 0.1%. Los lavados se hicieron con una solución que contenia MgCl2 1 mM y CaCl2 1 mM. Con ello se detectaron los segmentos externos de los conos y los terminales axónicos de los mismos. Se montaron las secciones con medio de montaje con DAPI, para contrateñir los núcleos.

Los ratones controles silvestres sin degeneración, tienen entre ocho y doce filas de núcleos en la CNE (figura 2D) . El número de conos, que llevan los segmentos externos y también los botones sinápticos de estos mismos en la CPE, es bastante representativo por la tinción con aglutinina observada en la CPE (Figura 2A) . En el ratón rdlO ^" ^ ^" control el número de filas de bastones en la CNE fue bastante pequeño, entre 1 y 2 filas, ya que la degeneración en este punto estaba bastante avanzada (Figura 2F) . Lo más sorprendente es que los conos ya hablan empezado a degenerar en este punto, aunque no están primariamente afectados por la mutación (Figura 2C) . Se observó como apenas aparecieron segmentos externos de conos y los botones sinápticos de los mismos redujeron bastante su número. En los ratones Proins/rdlCT ^7' se observaron 5-6 filas de núcleos de bastones en este caso, que fue uno de los ratones en los que se detectó mayor proinsulinemia (Figura 2E) . El estado de los conos fue muy bueno; de hecho se asemejaba a los ratones silvestres. Se pueden ver los segmentos externos de los mismos y los botones sinápticos en la CPE que denotan muy buena preservación de conos (Figura 2B) . Se observó una variedad en la conservación de la CNE que se correlaciona con el nivel de proinsulina en sangre.

Además, se analizó el estado de las capas plexiformes (Figura 3) , donde tienen lugar las conexiones sinápticas de

las neuronas, porque lo que se desea con este tratamiento con proinsulina no solo es evitar o retrasar la muerte de la degeneración sino que las células que se mantengan vivas, ya tengan el daño intrínseco o se alteren secundariamente, y sean funcionales. Para la tinción con el anticuerpo SV2 (del inglés sinaptical vesicle 2), los cortes de criostato, tras la fijación con PFA al 4%, se permearon con tritón x-100 al 0,1% y se bloquearon con NGS (normal goat serum) al 10% en PBS durante 1 hora. El anticuerpo SV2, a una dilución 1:50, se une a una proteina de las vesículas sinápticas, marcando asi las capas plexiformes de la retina (capa plexiforme externa, CPE, y la capa plexiforme interna, CPI) . Se incubó a 4°C toda la noche en la solución de bloqueo. La incubación con el anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 (1/200) se realizó 1 hora a temperatura ambiente. Tras los correspondientes lavados con PBS, se montaron las secciones con medio de montaje con DAPI, para contrateñir los núcleos.

Se observó expresión en las dos capas plexiformes de la retina, la externa (CPE) y la interna (CPI) (Figura 3) . La capa plexiforme interna, donde suceden las conexiones de las interneuronas bipolares con las neuronas que proyectan al cerebro, las células ganglionares, mostró bastante tinción y buen estado en los tres casos. La diferencia se encontró en la capa plexiforme externa, donde están las conexiones de las células fotorreceptoras con las interneuronas bipolares, principalmente. La CPE estaba bastante definida e intensa en el ratón silvestre control (Figura 3A) y en el ratón transgénico Proins/rdlO (Figura 3B) . El ratón control rdlO mantuvo la tinción en la CPI, pero la CPE conservó poca tinción y bastante desorganizada (Figura 3C) . En este ratón control rdlO ^'7' incluso se encontraron intentos de proyecciones de sinapsis entre las capas nucleares, debido a la desorganización y a que las neuronas que quedan pierden su

sinapsis con los fotorreceptores . Esto indicó que el estado funcional de la retina en los ratones Proins/rdlO ^'7' es mejor que en los ratones con degeneración rdlO ^'7' sin tratamiento.

Esto demuestra que en el ratón transgénico Proins/rdlO ^'7' la proinsulina humana es capaz de mantener las conexiones sinápticas por más tiempo que en la situación de degeneración sin tratamiento. Esto implicarla que, además de retardar la muerte de las células en degeneración, las mantiene en buen estado y son capaces de ejercer su función biológica. Las mejoras observadas histológicamente en los ratones Proins/rdlCT ^7' con respecto a los rdlO ^'7' son más patentes con los registros electrorretinográficos posteriores (Figuras 4, 5 y 6) .

Por otro lado, para analizar el valor de los niveles de proinsulina en el efecto neuroprotector se llevaron a cabo ensayos con modelos diferentes al daño crónico y progresivo que se encuentra en los modelos genéticos de las enfermedades neurodegenerativas de la retina y de otras partes del sistema nervioso, asi como en los asociados a senilidad. Asi, se realizaron estudios preliminares donde se provocaba la muerte de células ganglionares de la retina en ratas adultas mediante un daño agudo - corte del nervio óptico- y se les administró proinsulina humana por via subcutánea. Este tratamiento produjo un leve retraso de la muerte de las células ganglionares, hasta el momento inevitable en este paradigma de daño agudo (datos no mostrados) . Igualmente, se administró mediante inyección subcutánea e intravitrea proinsulina humana como tratamiento en estos ratones rd

(Figuras 8 y 9) , pero la degeneración no se detuvo, aunque la proinsulina inyectada subcutáneamente era capaz de alcanzar la neurorretina (Figura 7). Estos resultados indican que la proinsulina sérica es capaz de alcanzar zonas dañadas del sistema nervioso central y ejercer acciones neuroprotectoras

únicamente cuando se alcanzan niveles mantenidos y prolongados .

Ejemplo 2.- La proinsulina humana mejora la función visual valorada por ERG en el ratón transgénico Proins/rdlCT ^7" en comparación con los ratones control y enfermo.

Aunque los ratones se mantienen siempre en ciclos de 12 horas de luz y oscuridad, para el estudio electrorretinográfico, los ratones fueron adaptados a la oscuridad durante toda la noche. A titulo informativo los conos están encargados de la visión fotópica (diurna) y los bastones de la escotópica (nocturna) . Los ratones se anestesiaron bajo una luz tenue roja con una inyección intraperitoneal de una solución que contenia ketamina (a razón de 95 mg/kg) y xylazina (a razón de 5mg/kg) . Las pupilas fueron dilatadas con una gota de una solución que contenia 1% de tropicamida (Colircusi Tropicamida, Alcon CUSí, SA, El Masnou, Barcelona, España) . El electrodo de registro es una lente que se colocó sobre el ojo del ratón. El electrodo de referencia se colocó en la boca, y el electrodo de tierra se dispuso en la cola. Los animales anestesiados se situaron en una caja de Faraday y se procedió a realizar todos los experimentos de naturaleza escotópica en absoluta oscuridad. Se registraron así las respuestas electrorretinográficas inducidas por flashes de luz de baja intensidad producidos por un estimulador Ganzfeld, permitiendo registrar las respuestas originadas sólo en bastones (respuesta de bastones) o conos y bastones

(respuesta mixta) en adaptación a la oscuridad. La intensidad de los estímulos luminosos utilizados se ajustaron a valores comprendidos entre los -4 y los 1,52 log cd-s-m ^"2 . La intensidad de luz se determinó mediante un fotómetro (Mavo Monitor USB) a nivel del ojo. Para cada intensidad de

estímulo, se promediaron un máximo de 64 respuestas. El intervalo entre estímulos luminosos varía dependiendo de la intensidad, así, para estímulos de baja intensidad (-4 log cd-s-m ^"2 ) el tiempo entre estímulos se ajustó a 10 segundos y para estímulos de elevada intensidad (1,52 log cd-s-m ^"2 ) fue de 60 segundos. Con el fin de registrar las respuestas aisladas de cono, se adaptó el animal a condiciones fotópicas. Bajo estas condiciones, el intervalo entre los flashes de luz se fijó en 1 segundo. Las señales eléctricas procedentes de la retina se amplificaron y filtraron entre 0,3 y 1000 Hz con un amplificador Grass (CP511 AC amplifier, Grass Instruments, Quincy, MA) . Las señales se digitalizaron (PC-card ADI instruments, CA) . Los registros se almacenaron en el ordenador para su posterior análisis.

Las respuestas mediadas por bastones se registraron en condiciones de adaptación a la oscuridad, ante la aplicación de flashes de luz de intensidades comprendidas entre -4 y los -1,52 log cd-s-m ^"2 . Las respuestas mixtas generadas por conos y bastones se registraron ante la aplicación de flashes de luz de intensidades comprendidas entre -1,52 y 0,48 log cd-s-m ^~2 . También se aislaron los potenciales oscilatorios, mediante la aplicación de filtros eléctricos comprendidos entre 100 y 1000 Hz. La respuesta mediada por los conos se registró en condiciones de adaptación a la luz (luz de fondo de el registro de 30 Cd-m ^~2 ) , ante la aplicación de flashes de luz de intensidades comprendidas -0,52 y 2 log cd-s-m ^"2 . Las respuestas Flicker (30 Hz) se registraron en adaptación a la luz, ante estímulos de 1,48 log cd-s-m ^"2 . En la Figura 4 se muestran las respuestas electrorretinográficas registradas tanto en adaptación a la oscuridad (c . escotópicas) como en adaptación a la luz (c . fotópicas) de ratones silvestres (WT), rdlO ^'7' controles y

Proins/rdlCT ^7' obtenidas a P30, tanto de la línea 1 como de la línea 2.

En la figura 5 se muestra el resultado de analizar en un mayor grupo de ratones la correlación entre las respuestas electrorretinográficas entre la insulina y los niveles de proinsulina. Esta correlación sugiera una relación dosis respuesta que apoya la posible eficiencia de una aproximación farmacológica con proinsulina humana.

Por otro lado, en la Figura 6, se muestran los registros electrorretinográficos correspondientes a ratones silvestres (wt) , rdlO controles y Proins/rdlO ^'7' de la línea 2 obtenidos a distintos tiempos de desarrollo postnatal (P35, P45 y P55) . Se muestran de forma separada los registros obtenidos en condiciones escotópicas (adaptación a la oscuridad) y fotópicas (adaptación a la luz) . Se observó como los ratones silvestres generaron respuestas electrorretinográficas escotópicas (bastones) y fotópicas (conos) de gran amplitud a P35. En los ratones rdlO ^"7" controles las respuestas fueron nulas a P35, tanto las respuestas generadas en bastones, como en conos. Los ratones Proins/rdlO , mantuvieron respuestas electrorretinográficas fotópicas y escotópicas muy significativas a P35 y consiguieron mantener cierto grado de respuesta hasta P55. Así, se observó que la respuesta visual era mejor en los ratones transgénicos Proins/rdlO y se prolonga más en el tiempo.

Ejemplo 3: Efecto de la proinsulina en inyección intravitreal en retina de ratón rdl .

Para la realización de los siguientes ejemplos 3 y 4 se emplearon ratones del tipo rdl los cuales comparten el fondo genético C57BL/6 con los rdlO, así como una mutación distinta pero en el mismo gen de la fosfodiesterasa de GMP cíclico específica de bastones.

Con relación al efecto de la proinsulina en inyección intravitreal en retina de ratón rdl in vivo, en concreto, a la inyección intravitreal de 1 μg, a una concentración de lμg/μl, de proinsulina humana en ratones rdl a P13. Los ojos derechos fueron inyectados con proinsulina y los izquierdos con el vehículo. Las inyecciones fueron únicas y los efectos se analizaron 24 ó 48 horas después, por TúNEL, tanto en retinas montadas en plano como en secciones. En estas últimas se evaluó también el número de fotorreceptores que quedaban en la capa nuclear externa. Para la detección de muerte celular se utilizó la técnica de TúNEL (del inglés, TdT- mediated dUTP Nick End Labelling) . La enzima transferasa terminal (TdT) añade nucleótidos (dUTP) marcados con fluoresceina a los extremos 3 ' OH libres del DNA, lo que permite detectar la fragmentación del DNA que se produce durante la muerte celular programada. El Kit de TúNEL empleado fue de Promega. La técnica se realizó sobre células, secciones o tejidos. Tras un paso de permeabilización según la naturaleza del tejido, se lavó con PBS y se procedió a la preincubación con la solución del Kit durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se preparó la mezcla de reacción según las instrucciones del fabricante y se procedió a la reacción durante 1 hora a 37°C. Seguidamente, se paró la reacción con la solución SSC2X durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se lavó con PBS y se montó con Vectashield. Para la detección de la muerte celular en retinas montadas en plano, la retina neural entera, disecada del resto de los elementos del ojo, se montó bajo la lupa sobre una membrana de nitrocelulosa negra (Sartorius, Goettingen, Alemania), para mejor contraste durante la manipulación. Generalmente, se colocó con la capa de fotorreceptores hacia arriba, adhiriéndose a la nitrocelulosa con la ayuda de unas pinzas finas de disección. Las retinas montadas en plano se fijaron con PFA al 4% (p/v)

en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,1, durante toda la noche a 4°C en placas de 24 pocilios. Al día siguiente se lavaron con PBS y con BSA (30 mg/ml en PBS) . La permeabilización se realizó con Tritón X-IOO al 1% (p/v) en PBS (4 veces, 30 minutos cada vez) y enzimáticamente, con colagenasa y proteinasa K, previamente eliminando los restos de Tritón X-IOO lavando bien con PBS. La colagenasa (20 U/ml, Sigma) se dejó actuar durante 1 hora a 37°C y después la proteinasa K (20 μg/ml, Promega) durante 15 minutos a 37°C. Después fue necesario refijar las retinas durante, al menos, dos horas. Se lavaron bien con PBS y con BSA (30 mg/ml en PBS) y se llevó a cabo la reacción de TúNEL, según se ha indicado anteriormente. Las retinas montadas en plano se analizaron por microscopía confocal (Leica TCS-SP2-A0BS) . Para localizar la muerte celular dentro de las capas de la retina, se realizó la técnica TúNEL sobre secciones de retina como las anteriormente descritas, siempre fijadas en PFA 4% (p/v) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,1 y crioprotej idas con sacarosa al 30% (p/v) en tampón fosfato 10 mM, pH 7,1. Para el mareaje de TúNEL en secciones se requiere menos permeación que para las retinas montadas en plano. Así pues, se hicieron dos series de permeación con BGT [Glicina 100 mM, BSA 3 mg/ml, Tritón X-100 0,25% (p/v) en PBS] de 15 minutos cada una. Se lavaron con PBS y se realizó la reacción TúNEL como se ha indicado. Para cubrir todas las secciones de un portaobjetos, se añadieron 50 μl de los reactivos correspondientes y se cubrieron con parafilm®

Ninguna de las cuantificaciones (TúNEL en secciones, TúNEL en retinas montadas en plano, fotorreceptores en secciones) proporcionó diferencias significativas entre el tratamiento con proinsulina y el vehículo.

Ejemplo 4: Efecto de la proinsulina en inyecciones subcutáneas en el ratón rdl .

Para poder realizar tratamientos más prolongados, se probó una nueva via de administración, la inyección subcutánea. Esta via, rutinariamente usada para la administración de insulina en pacientes diabéticos, es mucho menos traumática que la inyección intravitreal . Además, la administración de proinsulina humana de esta forma habla dado resultados preliminares positivos de retraso en la degeneración de las células ganglionares de la retina tras corte del nervio óptico en rata adulta. Se realizaron numerosos protocolos para optimizar el aporte farmacológico de la proinsulina humana (Tabla) .

TABLA: Muestra el abordaje experimental que se siguió en cada uno de los intentos de inyección de promsulma humana de forma subcutánea. En todos los casos la cantidad inyectada fue de 1,6 μg de promsulma humana, excepto en el caso 1, que fue una única dosis de 5 μg y en el caso 5, de P14 a P18, que fue de 2,5 μg. (nd= no determinado) . El numero de animales se refiere al total de hermanos por carnada y experimento, siendo normalmente la mitad de ellos inyectados con PBS y la otra mitad con promsulma humana.

En primer lugar, se determinó si mediante la inyección subcutánea la proinsulina alcanzaba la retina. Para ello se realizaron, en ratones inyectados subcutáneamente con proinsulina, estudios mediante un ELISA que detectaba la proinsulina humana (Figura 7) (Lineo Research, MO, EE.UU.)

Este ensayo estaba diseñado para detectar la proinsulina en suero, por lo que se tuvo que adaptar a extractos de músculo y retina. Para la detección de los niveles de producción de proinsulina humana por los ratones transgénicos, se analizaron extractos de músculo y retina, asi como suero. En el caso del suero, se extrajo sangre de la zona del lacrimal del ojo de los ratones con una pipeta Pasteur. Se trasvasó a un tubo eppendorf donde se dejó coagular durante dos horas a temperatura ambiente y se centrifugó a 1.300 g durante 15 minutos, para recoger el suero, el cual se congeló hasta su utilización. En el caso de los tejidos, se realizó una extracción proteica con un tampón de lisis [Tris-HCl 50 mM, pH 7, NaCl 100 mM y Tritón X-IOO 0,1% (p/v) ] y una cuantificación de la proteina extraída con el kit BCA (Pierce) . Las retinas neurales se extrajeron en un volumen de 60 μl cada una. Los músculos de las patas posteriores se extrajeron en un volumen de entre 200 y 300 μl, según el trozo de músculo conseguido. En el caso del suero, se siguieron todas las recomendaciones del fabricante, poniendo siempre duplicados de 20 μl . En el caso de los tejidos, se pusieron igualmente 20 μl de extracto, por duplicado, empleándose a veces diluciones seriadas para mayor precisión. Los datos de extractos de retina y músculo se corrigieron por la cantidad de proteina. Fue posible identificar proinsulina humana en un extracto de retina P14 de ratón silvestre tan sólo 2 horas después de una inyección subcutánea, de forma dosis dependiente. Una dosis de 1,6 μg produjo una concentración retiniana de 0.72 pM, mientras que una dosis de 5 μg produjo 3,62 pM. La administración diaria de 1,6 μg entre PIl y P14 fue capaz de producir unos niveles, posiblemente acumulados, más elevados, de 3,56 pM. Asi pues, este abordaje nos confirmó la capacidad de la proinsulina exógena periférica de alcanzar la retina

neural y la mayor efectividad de un tratamiento repetitivo, al menos, en conseguir niveles más altos de proinsulina en retina .

Comprobamos el efecto de tratamientos repetitivos en diversos intervalos sobre los fotorreceptores en neurodegeneración y sobre la función visual determinada por electrorretinograma

(Tabla; Figuras. 8 y 9) . Se inyectó primero una dosis diaria de 1,6 μg entre P8 y P15. En este caso, no hubo efecto protector a nivel histológico. Para iniciar el rescate más tempranamente, pensando que el efecto podría ser más evidente si se administraba la proinsulina antes de que empezara el proceso degenerativo, se probó el tratamiento entre P6 y P14 no lográndose mantenimiento de los fotorreceptores en esta ocasión. Con el fin de intentar la recuperación histológica y también evaluar la función visual mediante electrorretinograma, se modificó el protocolo procediéndose a dos inyecciones diarias de 1,6 μg de proinsulina humana entre P6 y P14. Algunos animales se mantuvieron hasta P18, incrementándose en este segundo periodo la dosis de proinsulina a 2,5 μg. Este tratamiento no tuvo efectos protectores ni a nivel histológico (Figura 8), ni a nivel funcional (Figura 9) .

El resultado más habitual fue falta de recuperación histológica y falta de función visual por ERG (Fig. 8 y Fig. 9) , a pesar de que la proinsulina inyectada era capaz de alcanzar la retina en la que aparentemente se encontraban todos los elementos que posibilitaban una respuesta a la misma .