Die Myokardfibrose ist eine Antwort auf die Überlastung des Herzmuskels, wel- che beispielsweise durch Bluthochdruck, Herzinfarkt oder Kardiomyopathien ver- ursacht wird. Zu diesem Phänomen tragen zahlreiche pathophysiologische Me- chanismen bei, wie etwa die Proliferation von Herzbindegewebszellen, die zu einer erhöhten Matrixbildung fuhren. Funktionelle Endzustände sind die Massen- zunahme des Herzmuskels und ein verstärkter bindegewebiger Umbau (Fibrose).

Ein Kennzeichen des Umbaus am Herzen ist somit die interstitielle Fibrose, wel- che zu einer erhöhten Steifheit der Herzwände führt. Dies mündet funktionell in eine diastolische Dysfunktion, die die Herzmuskelschwäche weiter verschlimmern kann. Teilweise werden diese Effekte durch eine verstärkte Expression von Genen verursacht, die für extrazelluläre Matrixproteine, wie Collagen I und III, die do- minanten Kollagene des Herzmuskels, kodieren.

Die zur Zeit am besten etablierte Strategie zur Verringerung der Herzfibrose be- steht in der pharmakologischen Inhibierung des Renin-Angiotensin-Systems, bei- spielsweise durch ACE-Inhibitoren oder Angiotensin 11-Blocker. Diese Substan- zen haben jedoch den Nachteil, dass sie in wenigstens 5% der Fälle zu Unverträg- lichkeiten bei den Patienten führen. Weiterhin wirken sie nur auf die durch das Renin-Angiotensin-System vermittelte Herzfibrose und nicht auf die durch andere Agonisten wie etwa durch TGF-beta (transforming growth factor beta) oder Endo- thelin-1 vermittelte Entwicklung einer myokardialen Fibrose. Es besteht daher der

Bedarf an alternativen Methoden, die eine Herzfibrose verringern oder vermeiden können.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass eine Inhibierung des Proteasom- systems effektiv eine Herzfibrose verringern bzw. vermeiden kann, was zu einer verbesserten Herzfünktion führt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung mindestens eines Proteasom-Inhibitors zur Behandlung fibrotischer Erkrankungen. Die fibro- tischen Erkrankungen können unterschiedlichste Organsysteme, wie Lunge, Le- ber, Haut, Gelenke, Skelett und/oder Drüsen betreffen. Insbesondere bezieht sie sich auf fibrotische Erkrankungen des kardiovaskulären Systems.

Das Ubiquitin-Proteasom-System ist der Hauptstoffwechselweg für den Abbau von intrazellulären Proteinen in eukaryontischen Zellen, wie z. B. von Signalmedi- atoren, Zellzyklusproteinen und Transkriptionsfaktoren. Es konnte gezeigt wer- den, dass eine Inhibierung des Proteasoms die zelluläre Proliferation blockiert, mit verschiedenen Signalwegen interferiert und die Genexpression beeinflusst (Lee, D. H. et al. (1998) Trends Cell Biol., 8397-403 ; Yu C. -L. et al. (1997) J. Biol.<BR> <P>Chem., 272, 14017-14020 ; Heldin C. -H. et al. (1999) Nat. Cell Biol., 1, E195- E197 und Desterro, J. M. P. et al., (2000) Cell Mol Live Sci., 57,1207-1219).

Als Proteasom-khibitoren sind zum einen niedermolekulare organische Verbin- dungen und zum anderen molekularbiologische Verbindungen geeignet, die vor- zugsweise im wesentlichen spezifisch das Proteasom inhibieren. Der Inhibiti- onstest kann beispielsweise wie bei Dahlmann B. et al. (2000) J. Mol. Biol., 303, 643-653 beschrieben durchgeführt werden. Der Begriff"im wesentlichen spezi- fisch"gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass der Inhibitor das Protea- som stärker inhibiert als andere intrazelluläre Proteasen, wie z. B. Calpain, Ca- thepsine oder TPPII, vorzugsweise ca. 10mal stärker, insbesondere ca. 100mal stärker, vor allem ca. 1000mal stärker inhibiert als andere intrazelluläre Proteasen.

Die Inhibitionwerte werden üblicherweise als ICso (Konzentration des Inhibitors bei 50% iger Inhibition) angegeben und miteinander verglichen. Als niedermole- kulare organische Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung versteht man organische Verbindungen mit einer relativen Molmasse von kleiner gleich 1000, vorzugsweise kleiner gleich 800. Als molekularbiologische Verbindungen ver- steht man gemäß der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, insbesondere RNA oder DNA, die die Expression einer Komponente des proteasomalen Systems in- hibieren, beispielsweise die Transkription oder Translation der Proteasom- kodierenden Nukleinsäuren, oder Proteine, insbesondere Bindepeptide oder -proteine, gegen mindestens eine Komponente des proteasomalen Systems, vor- zugsweise gegen Ubiquitin und/oder gegen das Proteasom. Beispielsweise ist die Nukleinsäure eine anti-sense-RNA oder eine Doppelstrang-RNA (dsRNA) gegen eine Proteasom-kodierende Sequenz, ein Duplex-bildendes Oligonukleotid gegen eine Proteasom-kodierende Sequenz und/oder ein Knock-out-Konstrukt gegen eine Proteasom-kodierende Sequenz. Als Bindeproteine oder-peptide eignen sich beispielsweise Antikörper oder ihre bindeaktiven Teile, z. B. einzelkettige Anti- körper (scAb) oder Fab-Fragmente, oder Derivate davon, z. B. bispezifische Anti- körper, gegen mindestens eine Komponente des proteasomalen Systems. Eine Beschreibung des proteasomalen Systems und geeigneter Proteasom-Inhibitoren findet sich beispielsweise in Kisselev A. F. & Goldberg A. L. (2001) Chemistry & Biology, 8,739-758.

Demzufolge eignen sich als Proteasom-khibitoren insbesondere Threoninprotea- se-Tnhibitoren, Serinprotease-Inhibitoren und/oder Cysteinprotease-hhibitoren, vor allem ein Peptid-Aldehyd, ein Peptid-Boronat, ein Peptid-Vinylsulfon, ein Peptid-Epoxyketon, ein Lactacystin, ein Peptid-alpha-Ketoaldehyd, ein alpha- Ketoamid, ein Indanonpeptid, ein Polyalkylenaldehyd und/oder ein Polyphenol, insbesondere ein Cathechin-3-gallat, welches z. B. aus grünem Tee gewonnen werden kann. Vor allem eignet sich der Proteasominhibitor Z-Leu-Leu-Leu-al (MG132), Z-Ile-Glu (OtBu)-Ala-Leu-al (PSI), CEP1612, Pyrazylcarbonyl-Phe- Leu-boronat (PS-341), Dansyl-Phe-Leu-boronat (DFLB), Morpholinonaphthyla-

lanin-Leu-boronat (MG273), NIP-Leu3-vinylsulfon (NLVS), Tyr-Leu3-VS, NIP- Leu-Leu-Asn-VS, Ada-Tyr-Ahx3-Leu3-VS, Ada-Lys (Bio)-Ahx3-Leu3-VS Ac (Me) -Ile-Ile-Thr-Leu-EX (Epoxomicin), Dihydroeponemycin, Lactacystin, clasto-Lactacystin-beta-lacton (Omuralid), PS-519, Ac-Leu-Leu-Nle-al (ALLN), 3,4-Dichloroisocoumarin (DCI), 4- (2-Aminoethyl)-benzolsulfonylfluorid (Pe- fablock SC), TMC-95A, Gliotoxin, (-) Epigallocatechin-3-gallat (EGCG), Ritona- vir, Lovastatin, Aclacinomicin A (Aclarubicin) und/oder Cyclosporin, die alle in Kisselev A. F. & Goldberg A. L. (2001, supra) und in Fig. 3 näher beschrieben sind, und worin Z eine Benzyloxycarbonylgruppe, al eine Aldehydgruppe, VS eine Vinylsulfongruppe, NIP eine 3-Nitro-4-hydroxy-5-iodophenylacetat-Gruppe und Bio eine Biotingruppe bedeutet. Besonders bevorzugt von allen Verbindungs- klassen sind Threoninproteaseinhibitoren und davon insbesondere die Verbindun- gen MG132, MG262, Lactacystin und/oder Epoxomicin, vor allem MG132 und/oder MG262.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Auswirkungen der Proteasom- Inhibierung auf die Herzfibrose in spontan hypertensiven Ratten (SH-Ratten) stu- diert. Überraschenderweise wurde bei einer Langzeitbehandlung über 12 Wochen mit dem spezifischen Proteasom-Inhibitor MG132 bei einer täglichen Dosis von 1 mg pro kg eine deutliche Inhibierung der Herzfibrose von ca. 40% festgestellt, wobei der Inhibitor sehr gut vertragen wurde. Die beschriebenen Effekte resultier- ten in einer verbesserten ventrikulären Funktion in den MG132-behandelten Tie- ren. In vitro wurde eine konzentrationsabhängige Inhibierung des Wachstums kardialer Fibroblasten und eine spezifische, konzentrationsabhängige Herabregu- lierung von Collagen Ia2 zu ca. 75% und von Collagen IIIal von ca. 90% beob- achtet. Obwohl bei einer systemischen Behandlung mit Proteasom-Inhibitoren als Inhibitoren eines zentralen zellulären Systems Zytotoxizität zu erwarten gewesen wäre, wurden bei der beschriebenen Langzeitbehandlung keine messbaren Ne- benwirkungen festgestellt, sondern im Gegenteil eine gute Verträglichkeit konsta- tiert. Somit eignen sich Proteasom-Inhibitoren in bevorzugter Weise zur Behand- lung fibrotischer Erkrankungen insbesondere des kardiovaskulären Systems.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auch auf die Behandlung von Pati- enten mit einer fibrotischen Erkrankung, vorzugsweise einer Fibrose des kardio- vaskulären Systems. Dabei ist sowohl eine systemische wie lokale Applikations- form möglich.

Die folgenden Methoden und Ergebnisse mit den Figuren 1 bis 3 sollen die Erfin- dung beispielhaft näher beschreiben, ohne sie darauf zu beschränken.

Beschreibung der Figuren : Figur 1 beschreibt die Auswirkungen einer MG132 Behandlung von SH-Ratten auf die Herzfibrose bestimmt durch quantitative Morphometrie von Sirius-Rot- gefärbten links-ventrikulären mikroskopischen Schnitten (Abb. lA-1C) und auf die Herzfunktion (Abb. 1D-1F).

Figur 1A zeigt einen repräsentativen Schnitt durch das Herz einer unbehandelten Kontroll-SH-Ratte, die eine gesteigerte myokardiale Fibrose zeigt. Das fibrotische Gewebe ist mit Sternchen beispielhaft markiert. Der Balken entspricht 20 um.

Figur 1B zeigt einen typischen Schnitt durch das Herz eines MG132 behandelten Tieres, welches eine deutlich verringerte Herzfibrose unter Inhibition des Protea- soms zeigt.

Figur 1C zeigt die quantitative Auswertung mittels computerunterstützterBilda- nalyse. Dabei ergibt sich eine um ca. 40% verringerte Herzfibrose unter MG132- Behandlung. Mittelwert i S. E. M. (standard error of mean = Standardabweichung/ Wurzel aus n), n=7-10 ; * : p<0.05.

Figur 1D zeigt die enddiastolischen Drücke (LVEDP) im linken Ventrikel der Ratten mit deutlich verringertem Druckniveau bei den MG132-behandelten Tie- ren. Mittelwert S. E. M., n=6-10, * : p<0. 05, ** : p<0. 01.

Figur 1E zeigt die maximale Druckanstiegsgeschwindigkeit (dp/dtmax), die bei den MG132-behandelten Tieren deutlich höher ist. Mittelwert S. E. M., n=6-10, * : p<0. 05, ** : p<0. 01.

Figur 1F zeigt die maximale Druckabfallsgeschwindigkeit (dp/dtmin), die unter MG132 Behandlung um Faktor 2 höher ist. Mittelwert zt S. E. M., n=6-10, * : p<0. 05, ** : p<0. 01.

Figur 2 zeigt die Auswirkungen von Proteasom-Inhibitoren auf die Proliferation und Kollagenexpression in primären Herzfibroblasten der Ratte.

Figur 2A zeigt die dosisabhängige Inhibierung der Proliferation durch MG132.

Die Zellen wurden mit 0,1 pM und 1 uM MG132 oder 0, 1% DMSO stimuliert und täglich gezählt. Mittelwert S. E. M., n=3.

Figur 2B zeigt die Quantifizierung der mRNA-Menge der Kollagene I (xl, Ia2 und IIIal mittels"real-time"PCR-Analyse. Unter MG132-Behandlung kommt es dosisabhängig zu einer drastischen Senkung der Expression von Collagen Ia2 und IIIaI. Mittelwert S. E. M., n=2.

Figur 3A und B zeigen die chemische Struktur verschiedener Proteasom- Inhibitoren.

Figur 4 zeigt eine real-time PCR-Analyse der Expression von MMP2 und MMP9 und der Kollagene Ial, Ia2 und IIIal unter basalen Bedingungen (Fig. 4C bzw.

Fig. 4D), sowie bei der Kostimulation mit MG132 und IL-ß (Fig. 4A bzw. Fig.

4B).

Figur 5 zeigt Zymographie-Experimente zum Nachweis von aktivem MMP2 und MMP9 unter basalen Bedingungen (Fig. 5A), bzw. bei der Kostimulation mit Pro- teasom-Inhibitor und IL-ß (Fig. 5B).

Figur 6 zeigt eine Bandshift-Analyse zum Nachweis von aktivem NFKB in Kern- extrakten nach Stimulation mit MG132 und/oder mit IL-ß.

Methoden Methode 1 : Gewinnung von Herzfibroblasten Herzfibroblasten wurden aus neonatalen Wistar-Ratten durch Plattieren der Nicht- Myozyten Fraktion von neonatalen Herzen präpariert. Die Herzen wurden 2-3 Tage alten neonatalen Ratten entnommen. Ventrikuläres Gewebe wurde mit 50 mg pro ml Trypsin in Hanks-Balanced Salt Saline (HBSS) (Ca2+-und Mg2+-frei, hivitrogentm, Karlsruhe, Deutschland) über Nacht bei 4°C und mit Kollagenase (0,5 mg pro ml) in Leibowitzmedium (L-15, Invikogen, Karlsruhe, Deutsch- land) für 45 Minuten bei 37°C behandelt. Nach dem Waschen wurden die Zellen für eine Stunde bei 37°C vorplattiert. Die adhärenten Zellen waren hauptsächlich Herzfibroblasten, die unter Standardbedingungen in Standard-M199-Medium mit 10% Neugeborenenkalbserum, L-Glutamin und Penizillin-Streptomycin (Invitro- geht", Karlsruhe, Deutschland) weiterkultiviert wurden. In den Experimenten wurden subkultivierte Fibroblasten der Passagen 3-7 verwendet.

Methode 2 : Proliferationstest MG132, ALLM und MG262 wurden von Calbiochem (D (San Diego, Californien, USA) gekauft und als 10 mM DMSO-Stammlösungen bereitgestellt.

Herzfibroblasten (5x104 Zellen pro ml) wurden auf 24 Lochplatten ausgesät. Ad- herente Zellen wurden entweder mit MG132 (0,1 und 1 fiuM) oder DMSO (0,1%) in Medium mit 10% Serum stimuliert und weiter für 7 Tage kultiviert. Das Medi- um wurde jeden zweiten Tag gewechselt. Die Proliferation wurde dadurch be- stimmt, dass täglich die lebenden Zellen in dreifacher Ausfertigung mittels Try- pan-Blau-Ausschlußmethode gezählt wurden. Diese Methode erlaubt die Unter- scheidung zwischen lebenden und toten Zellen : Der Farbstoff Trypanblau, mit dem die Zellen versetzt werden, kann nur in Zellen mit einer defekten Zellmem- bran eindringen, die sich daraufhin blau färben. Lebende Zellen mit einer intakten Zellmembran werden nicht angefärbt.

Methode 3 : Histologische Bestimmung der Fibrose Für die pathohistologische Evaluierung wurden die Rattenherzen in Paraffin ein- gebettet, in 3 um dicke Schnitte zerteilt, einer Hämatoxylin-Eosin-und Sirius- Rot-Färbung unterworfen und wie in Hocher, B. et al., (1999), Hypertension, 3, 816-822 beschrieben, analysiert. Das Ausmaß der Herzfibrose wurde durch quan- titative Morphometrie der Sirius-Rot-gefärbten Schnitte mit einem Bildanalyse- system (Quantimed 500, Image 1.61 Programm) evaluiert. Hierbei wurde das Ver- hältnis von rot gefärbtem Gewebe (Bindegewebe) gegen das Gesamtgewebe des Schnittes bestimmt.

Methode 4 : RNA und RT-PCR-Analyse Gesamt-RNA wurde mittels Trizolreagenz (InvitrogenT"", Karlsruhe, Deutschland) extrahiert. Anschließend wurde die RNA revers transkribiert (AMF Reverse Transkriptase, Roche Biochemicals, Mannheim, Deutschland) und mit DNase behandelt (Ambion, Huntingdon, UK). Es wurden PCR-Primer für die Rattenkol- lagen-RNAs Ial, Ia2, IIIal, für die RNAs der Matrix-Metalloproteinasen (MMP) 2 und 9 und für das"housekeeping"Gen Hypoxanthin-Phosphoribosyl- Transferase (HPRT) mit der Primerexpresssoftwareversion 1.2 (PerkinEl-

mer/Applied Biosystems, Wellesley, MA, USA) entworfen und von TIB Molbiol, Berlin, Deutschland gekauft. Die PCR-Reaktion wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers mit SybrGreen in einem ABI PRISM 5700 Sequenzdetektor (Per- kinElmer/Applied Biosystems, Wellesley, MA, USA) durchgeführt. Die relative Quantifizierung wurde mittels der vergleichenden CT-Methode, wie vom Herstel- ler beschrieben, durchgeführt.

Methode 5 : Tierstudien Altersgleiche männliche SH-Ratten wurden vom Jackson Laboratory, Maine, USA erhalten. Die Tiere wurden gemäß den internationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren gehalten. 6 Wochen alte Ratten wurden mit MG132 (1 mg pro kg Körpergewicht), 0,1% DMSO als Lösungsmittelkontrol- le oder physiologischer Kochsalzlösung (n=10 pro Gruppe, tägliche intraperito- neale Injektionen) für 12 Wochen behandelt. Die Tiere wurden mit einer Hoch- salzdiät gefüttert (Trinkwasser mit 2% Natriumchlorid). Der Blutdruck wurde wöchentlich mit Hilfe der Standard-Schwanzmanschetten-Methode gemessen. Die Blutwerte und Standardlabormarker der renalen und hepatischen Funktionen wur- den 6 Wochen nach der Behandlung und am Ende der Studie durch Standardme- thoden bestimmt. Am Ende der Studie wurden die Tiere mittels einer intraperito- nealen Injektion einer 20% igen Urethanlösung (0,9 g pro kg Körpergewicht) anäs- thesiert und die links-ventrikulären Druckparameter wie bei Saragoca, M. et al.

(1981) Hypertension, 3,380-385 beschrieben, bestimmt. Die Organe wurden ent- fernt, gewogen und entweder in flüssigem Stickstoff schockgefroren oder in Pa- raffin für die histologische Analyse eingebettet. Da keine Differenz zwischen DMSO-und salzbehandelten SH-Ratten bezüglich der oben genannten Parameter beobachtet wurde, dienten die DMSO-behandelten Tiere als Kontrolle für die MG132-Behandlung.

Die Daten wurden als Mittelwerte S. E. M. bestimmt, sofern nichts anderes ver- merkt wurde. Die Signifikanz der Differenz in den links-ventrikulären Druckpa- rametern und in der Quantifizierung der Herzfibrose wurden nach dem Student's

T-Test bestimmt. Für den Zellproliferationstest wurde die Signifikanz durch Ver- gleich der Regressionskoeffizienten von MG132 gegen die Kontrollgruppe ge- messen. Eine Fehlerwahrscheinlichkeit von p<0,05 wurde als signifikant erachtet.

Für alle statistischen Kalkulationen wurde die SPSS 9.0 Software benutzt.

Ergebnisse Die Behandlung von spontan hypertensiven Ratten mit dem spezifischen Protea- som-Inhibitor MG132 über 12 Wochen wurde im Allgemeinen über diese langen Zeitraum gut ertragen. In nach 6 Wochen und am Ende der Studie genommenen Blutproben wurden keine Veränderungen im Differentialblutbild oder eine Verän- derung der Labormarker, die Nebenwirkungen der Niere oder Leber zeigen, beo- bachtet. Darüber hinaus zeigten die MG132-behandelten Tiere keine signifikante Änderung im systolischen Blutdruck und im Herzgewicht (Tabelle 1).

Tabelle 1 Kontrolle 1 mg/kg MG132 Systolischer BD (mm Hg) 196, 759, 1 191, 4311, 2 Körpergewicht (g) 28636, 6 28015, 3 Herzgewicht (g) 1, 280, 07 1, 180, 07 HG/KG (mg/g) 4, 640, 61 4, 10, 34 BD steht für Blutdruck ; KG für Körpergewicht und HG für Herzgewicht Wie aus den Figuren 1A bis 1C ersichtlich ist, zeigten MG132 behandelte SH- Ratten eine deutliche Reduktion (-38%) der Herzfibrose verglichen mit den Kon- trolltieren bestimmt durch quantitative Morphometrie von Sirius-Rot gefärbten Sektionen der linken Ventrikel.

Die Prävention der Herzfibrose in MG132-behandelten SH-Ratten korrelierte gut mit der normalen links-ventrikulären Funktion, wobei die Kontrollen Anzeichen einer beginnenden links-ventrikulären Dysfunktion zeigten, wie in den Figuren 1D-1F dargestellt : Die Füllungsdrücke (LVEDP) waren deutlich niedriger, (Figur 1D : 152 versus 53 mm Hg, p=0, 017), die maximale Druckanstiegsgeschwin- digkeit dp/dtmax (Figur 1E : 8010i538 versus 3375i662 mm Hg, p=0,003) und die maximale Druckabfallsgeschwindigkeit dp/dtmin (Abb. 1F :-5046726 versus - 2290422 mm Hg/s, p=0,015)-die Parameter der Herzinotropie und Herzlu- sitropie sind-waren mehr als doppelt so hoch in den MG132-behandelten SH- Ratten verglichen zu den Kontroll-SH-Ratten.

Um mögliche Mechanismen aufzuklären, wie die Proteasom-Inhibierung zu der verringerten Herzfibrose in vivo beitragen kann, wurden primäre Herzfibroblasten der Ratte mit Proteasom-Inhibitoren behandelt. Wie in Figur 2A dargestellt, ver- ursachte die Behandlung von Herzfibroblasten mit 0,1 und 1 uM MG132 eine Dosis-abhängige Inhibierung der Proliferation. Darüber hinaus wurde die RNA- Expression von Collagen Ia2 und IIIal in dosisabhängiger Weise durch MG132 bis zu-73 % und bis zu 91% inhibiert (Figur 2B). Im Gegensatz dazu war die Col- lagen Ial Expression unbeeinflusst. Ein zweiter spezifischer Proteasom-khibitor MG262, welcher ein Boronatderivat von MG132 ist, inhibierte die Kollagenex- pression ähnlich effektiv (Figur 2B) und belegt somit die Spezifität der proteaso- malen Inhibition. Der Cathepsininhibitor ALLM, der als Peptid-Aldehyd (A- LLM-al) strukturell verwandt mit MG132 ist, zeigte demgegenüber keine Effekte auf die Kollagenexpression (Figur 2B).

Die endemisch auftretenden und gesundheitspolitisch extrem wichtigen Organ- fibrose (besonders Herzmuskelfibrose) sind von extremen Varianten von Fibro- sebildungen in Form von Entzündungsreaktionen auf Fremdkörper völlig zu tren- nen (vergleiche auch Kapselbildung bei Silikonimplantaten), über die H. Rupp, P.

Newrzella, H. König und B. Maisch in :"Hemmung der kardialen Fibrose durch

Blockierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB"auf der 67. Jahrestagung der <BR> <BR> Deutschen Gesellschaft für Kardiologie-Herz-und Kreislaufforschung, 19. -21.

April 2001, Mannheim, berichteten.

Speziell bei der millionenfach vorkommenden, erfindungsgemäß durch die Verab- reichung von Proteasom-Inhibitoren zur Prävention oder Therapie behandelbare Herzmuskelfibrosierung ist das pathophysiologische Agens die neuroendokrine Aktivierung mit der Freisetzung vasokonstriktorischer Mediatoren wie Katecho- lamine, Angiotensin II, Endothelin-l, TGF-beta und anderen, die im Rahmen ei- ner globalen Überlast (z. B. chronische Druckbelastung bei arterieller Hypertensi- on) oder einer regionalen Überlast (z. B. kompensatorische Hyperkinesie des in- takten Restmyokards bei Myokardinfarkt) verstärkt liberiert werden. Neben ihren vasokonstriktorischen Eigenschaften haben diese Mediatoren massive wachstums- induzierende Effekte im Sinne der Massenzunahme von Herzmuskelzellen und der Proliferation und vermehrten Syntheseleistung in Form von Extrazellulärmat- rixbildung von kardialen Fibroblasten.

Bei den erfindungsgemäß mit Proteasom-Inhibitoren behandelten, durch Überlas- tungen geschädigten fibrotischen Herzen werden in der feingeweblichen Untersu- chung in der Regel keine Hinweise auf eine inflammatorische Reaktion beobach- tet. Es ist wissenschaftlich gut belegt, dass diese durch Überlast induzierten kardi- alen Fibrosen unabhängig von der Aktivierung des inflammatorischen Transkrip- tionsfaktors NFB sind und über die Signalkette des TGF-beta laufen (Siehe Ki- tamoto et al., Circulation 2000 ; 102 : 806-12 ; Lijnen et al., Mol Gen Metab 2000 ; 71 : 418-35). Die erfindungsgemäß durch Proteasom-Inhibitoren behandelba- re kardiovaskulär relevante Fibrosierung wird folglich unabhängig von NFKB durch verschiedene Formen der Überlast mit konsekutiver neuroendokriner Akti- vierung verursacht.

Diese Aussagen werden eindeutig dadurch gestützt, dass die wesentlichen Sub- stanzgruppen, die gegen die Entwicklung einer Fibrose gerichtet sind, oder die zur Regression einer Fibrose beitragen, antagonistische Wirkungen auf spezifische vasoaktive Mediatoren haben. Gute Beispiele dafür sind Angiotensin Converting Enzyme-Inhibitoren (ACE-Hemmer), Angiotensin II Typ l-Rezeptor Antagonis- ten (AT-1-Antagonisten) und Endothelin-Rezeptorantagonisten.

Andere bevorzugte Ausführungsbeispiele von erfindungsgemäß mittels Protea- som-Inhibitoren behandelbaren Organfibrosen ohne dominierende inflammatori- sche Komponente sind stauungsbedingte Fibrosierung der Leber, Hochdruck- bedingte Fibrosierung der Nieren, Gelenkfibrosen bei Fehlstellungen.

Experimentelle Daten der vorliegenden Erfindung belegen, dass die erfindungs- gemäßen anti-fibrotischen Effekte von Proteasom-Inhibitoren unabhängig von der Aktivierung des inflammatorischen Transkriptionsfaktors NFxB sind.

1. Real-time PCR-Analyse der Expression von Kollagenen und MMP2 und 9 i. 4) : Hierzu wurden kardiale Fibroblasten unter serum-freien Bedingungen 24 Stunden mit Proteasom-Inhibitoren behandelt und aus der präparierten RNA die Expression der Kollagene Ial, Ia2 und IIIalund von MMP2 und 9 mittels real-time RT-PCR bestimmt. Wie in Fig. 4C und 4D gezeigt, wurde durch die erfindungsgemäße Inhibition des Proteasoms nicht nur die Expression der Kollagene sondern auch die der MMPs deutlich inhibiert. Diese inhibitorische Wirkung der Proteasom-Inhibitoren war erfindungsgemäß unter basalen Be- dingungen und ohne zusätzliche Zytokinstimulation der Zellen zu beobachten.

Um zu untersuchen, ob Proteasom-Inhibitoren auch nach Induktion der MMPs durch Stimulation mit dem NFKB-aktivierenden Zytokin Interleukin-lß (IL-

Iß) diese Effekte zeigen, wurden die kardialen Fibroblasten mit IL-lß und Proteasom-Inhibitor kostimuliert.

Die IL-lß-Stimulation führte zu einer deutlichen Expressionssteigerung der MMPs, insbesondere von MMP9 (Fig. 4A). Diese MMP ist als eine durch NFKB aktivierbare und durch Zytokinbehandlung stimulierbare Protease be- schrieben (Gum et al., J Biol Chem. 1996 ; 271 : 10672-80). Die gleichzeitige Gabe von Proteasom-Inhibitoren verhinderte nicht nur den IL-lß-induzierten Anstieg der Expression, sondern reduzierte überraschender Weise die Expres- sion bis unter die DMSO-Kontrollwerte (Fig. 4A). Dies belegt die erfindungs- gemäße Hemmung der Expression der MMPs durch Proteasom-Inhibierung, die zu einer stärkeren Hemmung der MMP-Expression führt als zu einer Hemmung der von IL-lß vermittelten MMP-Expression und somit unabhän- gig von der Hemmung der Aktivierung von NFKB ist.

Noch deutlicher konnte die erfindungsgemäße, von einer Inhibierung von NFKB unabhängige Wirkung von Proteasom-Inhibitoren bei der erfindungs- gemäßen Prävention und Behandlung von fibrotischen Erkrankungen in einer Analyse der Kollagenexpression unter IL-lß Stimulation gezeigt werden (Fig.

4B).

Wie bereits von Siwik et al., (Siwik et al., Am J Physiol Cell Physiol.

2001 ; 280 : C53-C60) beschrieben, führte die IL-lß Behandlung zu einer He- rabregulation der Kollagenexpression in kardialen Fibroblasten (Fig. 4B). Die- se Suppression lässt sich durch negativ regulatorische NFKB-Elemente im Promotor der Kollagene, d. h. durch eine suppressorische Wirkung von akti- viertem NFKB auf die Expression der Kollagene, erklären (Kouba et al., J Immunol. 1999 ; 162 : 3226-34). Die Kostimulation der Fibroblasten mit IL-lß

und mit Proteasom-Inhibitoren resultierte jedoch nicht in einer Aufhebung dieser Suppression der Kollagene durch NFKB, wie bei der Inhibierung der Aktivierung von NFxB durch Proteasomeninhibitoren zu erwarten gewesen wäre, sondern führte überraschender Weise zu einer noch stärkeren Suppres- sion der Kollagenexpression als mit IL-1 ß alleine (Fig. 4B).

Die vorliegenden Untersuchungen belegen, dass die erfindungsgemäße Be- handlung von fibrotischen Erkrankungen mittels Proteasominhibitoren unab- hängig von der Inhibierung der Aktivierung von NFKB ist. Vorteilhafter Wei- se ermöglicht die Erfindung die Inhibierung der Expression von MMPs und Kollagenen bei fibrotischen Erkrankungen unabhängig von der Inhibierung der Aktivierung von NFB. Vorzugsweise ermöglicht die Erfindung die Prävention und Behandlung von fibrotischen Erkrankungen, die nicht oder nicht vorrangig von NFB vermittelt werden.

2. Zymographie zum Nachweis von aktivem MMP2 und MMP9 (Fig. 5) : Die erfindungsgemäße Inhibierung der Expression aktiver MMP2 in kardialen Fibroblasten unter basalen, d. h. nicht durch NFidB stimulierten, Bedingungen mittels Proteasom-Inhibitoren wurde auch in Zymographie-Experimenten bes- tätigt (Fig. 5). Hierzu wurden die Zellkulturüberstände nach Inkubation mit Proteasom-Inhibitoren in Abwesenheit (Fig. 5A) bzw. Anwesenheit (Fig. 5B) von Il-lu bezüglich ihrer Gelatinase-Aktivität mittels Zymographie unter- sucht.

Erfindungsgemäß wurde die MMP2-Bildung durch den Proteasom-khibitor bereits in Abwesenheit von Il-1 ß, d. h. unabhängig von NFKB, verringert (Fig.

5A). Die durch Il-1 ß induzierte MMP2-und MMP9-Aktivierung wurde durch gleichzeitige Gabe von Proteasom-khibitoren ebenfalls verringert (Fig. 5B).

3. Bandshift-Analyse zum Nachweis aktiven NFcBs (Fig. 6) : Die oben dargestellten Ergebnisse belegen, dass die erfindungsgemäßen inhi- bitorischen Wirkungen der Proteasom-Inhibitoren auf die Kollagen-und MMP-Expression bei unstimulierten kardialen Fibroblasten auftreten und des- halb unabhängig von der Inhibierung der Aktivierung von NFKBsind. Dies wurde zusätzlich in Bandshift-Analysen mit Oligonukleotiden, die eine NFidB- DNA-Bindungstelle aufweisen, bestätigt. Dazu wurden Kernextrakte von kar- dialen Fibroblasten hergestellt, die in einer Zeitreihe in An-und Abwesenheit von Il-lß mit 0. 5 uM MG132 bzw. DMSO (Lösungsmittelkontrolle) behan- delt wurden.

Wie in Fig. 6 gezeigt, weisen kardiale Fibroblasten unter nicht-stimulierten, basalen Bedingungen keinen aktiven NFKB-Komplex auf (siehe Kontrollban- den). Unter Il-lß-Stimulation kommt es zu einer Aktivierung von NFKB, dar- gestellt als Bandshift. Die zeitgleiche Behandlung mit 0.5 LM MG132 zeigte erst nach 6 Stunden einen leichten inhibitorischen Effekt auf NFxB, der die überraschend starke Verringerung der Expression von MMP2 und MMP9 bei der gleichzeitigen Gabe von MG132 und IL-1 ß (s. o. Fig. 4A) nicht zu erklären vermag. Nach 24 Stunden war eine Verringerung der durch Il-lß-induzierten Aktivierung von NFB mit und ohne MG132 zu beobachten.

Die in vitro Experimente belegen somit, dass die erfindungsgemäßen inhibitori- schen Effekte von Proteasom-khibitoren auf die Expression von Kollagenen und

MMPs unabhängig vom inflammatorischen Transkriptionsfaktor NFKB vermittelt werden.

Auch die eingangs dargestellten Daten zur erfindungsgemäßen Verhinderung der kardialen Fibrose im Tiermodell der spontan hypertensiven Ratten belegen die erfindungsgemäße, von Entzündungsreizen unabhängige Suppression der Kolla- genexpression durch MG132 : Dieses Tiermodell geht erfindungsgemäß nicht von einem Entzündungsreiz als Auslöser für die kardiale Fibrose aus, sondern von einer ausgeprägten Hypertonie der Ratten.

Erfindungsgemäß greifen Proteasom-Inhibitoren nicht nur inhibierend in die Kol- lagen-und MMP-Expression ein, sondern zeigen ihr breites Wirkspektrum auch in der Suppression der Fibroblastenproliferation.

Die erfindungsgemäßen therapeutischen Interventionen umfassen vorzugsweise die systemische Gabe von Proteasom-Tnhibitoren. Vorzugsweise wird dabei einem Patienten wenigstens ein Proteasom-Inhibitor in einer Dosis verabreicht, in der vorteilhafter Weise systemische Nebenwirkungen, insbesondere zytotoxische Ne- benwirkungen, von Proteasom-Inhibitoren nicht oder nur in geringem Maße auf- treten. Die erfindungsgemäße Verwendung von Proteasom-hihibitoren zur Prä- vention und Therapie von Fibrosen ist deshalb gut verträglich, ermöglicht vor- zugsweise eine spezifische anti-fibrotische Behandlung und ermöglicht somit eine erfindungsgemäße Prävention und Therapie bei einer Vielzahl von Patienten.

Bei bevorzugten Ausführungen ermöglicht eine erfindungsgemäße systemische Gabe wenigstens eines Proteasom-Inhibitors eine Prävention und Behandlung vorzugsweise einer kardialen Fibrose, vorzugsweise einer durch Überlast verursachten kardialen Fibrose, vorzugsweise einer durch Überlast bei chronischer

Druckbelastung bei arterieller Hypertension verursachten kardialen Fibrose, vor- zugsweise einer durch Überlast bei kompensatorischer Hyperkinesie des intakten Restmyokards bei Myokardinfarkt verursachten kardialen Fibrose, vorzugsweise einer durch Überlast mit konsekutiver neuroendokriner Aktivierung verursachten kardialen Fibrose, vorzugsweise einer kardialen Fibrose, bei der eine Behandlung durch ACE-Hemmer, AT-1-Antagonisten und/oder Endothelin- Rezeptorantagonisten indiziert ist, vorzugsweise einer stauungsbedingten Fibro- sierung der Leber, vorzugsweise einer Hochdruck-bedingten Fibrosierung der Nieren und vorzugsweise aller Gelenkfibrosen bei Fehlstellungen von Gelenken.

Bei der erfmdungsgemäßen Prävention und der erfindungegemäßen Therapie von Fibrosen wird einem Patienten wenigstens ein Proteasom-Inhibitor, vorzugsweise in einer Dosierung von in etwa 0,5 pglkg Körpergewicht bis in etwa 0,5 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise in einer Dosierung von in etwa 1 ug/kg Körperge- wicht bis in etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise in einer Dosierung von in etwa 0,01 mg/kg Körpergewicht bis in etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht verab- reicht. Diese Dosierungen beziehen sich auf alle hierin genannten Proteasom- Inhibitoren, insbesondere die Threoninprotease-khibitoren, insbesondere MG132 und MG262. Vorzugsweise wird wenigsten einer der hierin eingangs erwähnten Proteasom-hihibitoren verabreicht, vorzugsweise MG132. Dabei werden vor- zugsweise vorteilhafte Verabreichungsformen verwendet, die dem Fachmann be- kannt sind, vorzugsweise feste und flüssige Arzneimittelzubereitungen, vorzugs- weise Infusionslösungen, die vorzugsweise wenigstens einen vorteilhaften Arz- neimittelzusatz enthalten, der dem Fachmann geläufig ist und der zur Verbesse- rung der Lagerfähigkeit und/oder der Verträglichkeit der Arzneimittelzubereitung beiträgt.