UTILISATION D'UN EXTRAIT DE RADAMAEA MONTANA POUR LA PREPARATION D'UNE COMPOSITION COSMETIQUE

La présente invention a pour objet le domaine technique des compositions cosmétiques, dermatologiques et pharmaceutiques comprenant un agent anti- oxydant.

Les plantes du genre Radamaea ont le positionnement botanique suivant : embranchement : Angiospermes ; classe: Magnoliopsida ; sous classe : Asteήdae ; ordre : Scrofuiariales ; famille : Scrofυlariaceae. Au sein du genre Radamaea, l'espèce montana peut être identifiée grâce à certains traits morphologiques généraux: arbrisseau vivace, à rameaux légèrement pubescents ; feuilles vertes elliptiques, entières, à sommet arrondi et apiculé, à base atténuée.

Les plantes appartenant à l'espèce Radamaea montana appartiennent au genre Radamaea, genre endémique de Madagascar et dédié à Radama 1 ^er par Bentham, botaniste anglais. Le genre comprend 5 espèces : Radamaea latifolia (Bonati), Radamaea montana (Benth) Radamaea perrieri (Bonati), Radamaea prostrata (Benth) et Radamaea rυpestris (Bonati). Rabesa et collaborateurs (1993) soulignent dans la pharmacopée de l'Ambongo et du Boina « PATROA AMIN'NY TAREHIN'NY MANANGY » que la poudre de la racine, en macération, est utilisée sous forme de masque facial par les femmes. La pharmacopée a été éditée par le Centre d'information et de Documentation Scientifique et Technique d'Antananarivo page 500. Néanmoins, l'activité de tels extraits n'a jamais été mise en évidence. De plus, la forme sous laquelle l'extrait est utilisé est totalement inappropriée et même incompatible avec un usage cosmétique normal. En effet, le produit de macération obtenu présente une coloration marron foncé pour les feuilles et jaune marron foncé pour les graines et les racines et une forte odeur d'extrait végétal dans tous les cas. La concentration de l'extrait présent dans le produit de macération présente une couleur trop intense, non acceptable pour un produit cosmétique.

L'invention a plus particulièrement pour objet une composition adaptée à une application topique, à activité anti-radicalaire, antioxydante, en matière de protection de la peau ou de prévention du vieillissement cutané qui utilise un extrait de Radamaea montana ou un ou plusieurs principes actifs contenus dans un tel extrait.

Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont mis en évidence que les extraits de Radamaea montana présentaient des propriétés anti-radicalaires et de ce fait des propriétés anti-oxydantes.

Dans ce contexte, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un extrait de Radamaea montana pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, l'extrait de Radamaea montana étant utilisé en tant qu'agent anti-oxydant.

L'invention a également pour objet des compositions cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques comprenant un extrait de Radamaea montana utilisé en tant qu'agent anti-oxydant.

Dans le cadre de l'invention, les inventeurs ont également mis en évidence que les extraits de Radamaea montana présentaient une activité inhibitrice de la tyrosinase. Or, la tyrosinase est connue pour être une enzyme clé de la biosynthèse de la mélanine, elle est même impliquée dans différentes pathologies dermatologiques, comme l'apparition de taches de vieillesse, de marques dues à l'acné, de l'hyperpigmentation, ou encore dans le processus naturel de bronzage { Y.-J. Kima and H. Uyamab ; Tyrosinase inhibitors from natυral and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future ;, CeII. Mol. Life ScL 62 (2005) 1707-1723). Autant dire que l'inhibition de cette enzyme a de vastes applications en dermatologie ou en cosmétique ce qui rend particulièrement intéressant les composés naturels ou d'extraits végétaux inhibiteurs de la tyrosinase. Cette enzyme est donc impliquée dans un processus d'oxydation enzymatique entraînant Ja polymérisation de la mélanine et donc l'apparition d'une pigmentation naturelle ou pathologique {Jung-Hee Hwang and Byung Mu Lee ; Inhibitors of Tyrosinase and Melanin Synthesis. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 70: 393-407, 2007).

La préparation des compositions selon l'invention est donc réalisée avec un agent anti-oxydant ou un agent inhibiteur de la tyrosinase obtenu par extraction à partir d'une plante Radamaea montana. L'invention concerne donc l'utilisation d'une plante Radamaea montana pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, d'un agent anti-oxydant ou d'un inhibiteur de la tyrosinase.

Les compositions selon l'invention sont, entre autres, destinées à des traitements de la peau, entre autres pour lutter contre son vieillissement, pour l'obtention d'un effet réparateur ou protecteur, pour lutter contre l'apparition de taches de vieillesse, de marques dues à l'acné, ou pour lutter contre l'hyperpigmentation, ou encore dans des compositions blanchissantes. En particulier, l'extrait cellulaire de Radamaea montana permet de lutter contre l'oxydation des lipides de la peau. Les compositions cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques selon l'invention peuvent notamment être des compositions anti-radicalaires, des compositions pour prévenir ie vieillissement cutané, des compositions pour la protection solaire, des compositions de soin après exposition solaire, des shampoings réparateurs anti-radicalaires, des masques capillaires, des crèmes de jour protectrices, des crèmes pour lutter ou atténuer des phénomènes d'hyperpigmentation de la peau ou des crèmes pour obtenir un blanchiment ou éclaircissement de la peau. L'invention vise donc l'utilisation d'un extrait de Radamaea montana, en tant qu'agent anti-oxydant, et éventuellement en tant qu'inhibiteur de la tyrosinase, dans des compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques, ou encore, formulée autrement l'utilisation d'un extrait de Radamaea montana, pour la fabrication de compositions cosmétiques, pharmaceutiques ou dermatologiques anti-oxydantes, et éventuellement destinée à inhiber l'activité de la tyrosinase. De telles compositions peuvent, par exemple, être utilisées pour prévenir le vieillissement cutané, pour la protection solaire, pour lutter ou atténuer des phénomènes d'hyperpigmentation de la peau ou encore pour obtenir un blanchiment ou éclaircissement de la peau. Dans le cadre de l'invention, il a été mis en évidence que les plantes

Radamaea montana pouvaient être utilisées pour produire des agents antioxydants, inhibiteurs de la tyrosinase, agents servant à la préparation de compositions cosmétiques. En effet, de tels agents anti-oxydants, inhibiteurs de la tyrosinase sont présents dans les extraits des plantes Radamaea montana. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation d'une plante Radamaea montana pour la préparation d'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique, pour la production d'un agent anti-oxydant, ou pour la production d'un inhibiteur de la tyrosinase.

L'extrait utilisé est un extrait cellulaire de la plante qui peut être préparé selon toute méthode connue de l'homme du métier pour extraire des composés des tissus végétaux. L'extrait peut être obtenu à partir des racines, des feuilles, des tiges, des fruits, des graines et/ou des fleurs. De façon avantageuse, l'extrait sera issu des feuilles ou des graines, dont l'utilisation n'entraîne pas la mort de la plante dont elles sont extraites. De plus, les extraits des feuilles ou graines sont particulièrement actifs.

A titre d'exemples de méthodes d'extraction, on peut citer les méthodes classiques d'extraction en solvant à chaud ou à froid, la macération, la lixiviation, la cryoextraction, les extractions par le CO ₂ supercritique, seul ou en mélange avec un co-solvant les extractions utilisant un rayonnement ondulatoire, tel que les micro-ondes ou les ultrasons. Ces méthodes peuvent être combinées à une étape ultérieure de purification, filtration, concentration et/ou séchage.

De façon avantageuse, l'extrait utilisé est obtenu par extraction avec un solvant choisi parmi l'eau, les alcools, les alcanes, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. En particulier, l'extraction pourra être réalisée à l'aide d'un solvant, tel qu'un solvant alcoolique choisi parmi l'éthanol ou le méthanol ou encore le polyéthylène glycol ou le chloroforme. Un solvant tel que précédemment cités est particulièrement préféré pour l'extraction à partir des graines et/ou des feuilles de la plante. Dans le cas d'une extraction par solvant, par exemple, on peut procéder de la façon suivante : la partie de la plante sélectionnée est récoltée. Cette partie de la plante dont l'extrait est souhaitée, qui peut se trouver sous forme fraîche ou sèche, est broyée et/ou déchiquetée dans le solvant sélectionné, puis laissée à macérer, de préférence sous agitation, dans le solvant, de préférence pendant 1 heure à 30 jours. De façon avantageuse, on utilisera un rapport massique partie de la plante sur solvant compris entre 1/1 et 1/10 (m/m). L'extraction peut être réalisée à une température comprise entre -10 et 7O ⁰ C, et notamment entre 18 et 6O ⁰ C ou à reflux du solvant d'extraction utilisé. L'extraction peut également être réalisée par lixiviation.

L'extrait obtenu peut alors être concentré, ou séché, par exemple par évaporation ou lyophilisation. L'extrait obtenu peut être incorporé tel quel à la composition ou bien être purifié, traité ou fractionné, de façon à enrichir en

principe actif recherché. En particulier, l'extrait utilisé sera riche en flavonoïdes et dérivés et/ou en xantones et dérivés et/ou apocaroténoides.

Les extraits de feuilles obtenus contiennent une proportion importante de flavonoïdes et xanthones. En particulier les composés suivants sont généralement présents dans les feuilles et les tiges :

- 6-C-glucosyl-apigénine (isovitexine, CAS : 38953-85-4) de formule (I) :

(D

8-C-glucosyl-apigénine (vitexine, CAS : 3681-93-4) de formule (II)

2-C-β-D-glucopyranosyl-l,3,6,7-tetrahydroxyxanthone (mangiférine, CAS : 4773-96-0) de formule (III) :

(III)

1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone (CAS : 3542-72-1) de formule (IV)

(IV)

amentoflavone (CAS : 1617-53-4) de formule (V)

(V)

- l,3,6,7-tétrahydroxγ-8-prénylxanthone (CAS : 70786-45-7) de formule (VI) :

13 14 (VI)

pyranoamentoflavone (CAS : 145701-10-6) de formule (VII)

(VII)

- 7"-0-méthylamentoflavone (sotetsuflavone, CAS : 2608-21-1) de formule

(VIII)

6"-(2-hydroxy-3-méthyl-3-butenyl)-amentoflavone (CAS : 199181-95-8) de formule (IX) :

12" 13"

(IX)

De façon préférée, l'extrait utilisé est obtenu à partir des tiges etyou feuilles de Radamaea montana et comprend au moins ou au moins deux, voire tous les composé (I) à (IX) ci-dessus.

Les extraits de racines ou de graines obtenus contiennent une proportion importante d'apocaroténoides. En particulier, les composés suivants sont généralement présents dans les racines et dans les graines : acide 13-(l,2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl)-2,7,l 1-triméthyl (2E,4E,6E,8E,10E,12E)-tridecahexanoique (CAS : 64803-86-7) de formule (X) :

- acide 17-(l,2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl)-2,6,ll,15-tetr améthyl (4E,6E,8E,10E,12E,i4E,16E)-heptadecahexanoique (composé nouveau) de formule (XI) :

- 13[(lR,2R)]-l,2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl]-2,7,ll -triméthyl (2E,4E,6E,8E _/ 10E,12E)-tridecahexaenal (CAS : 57951-41-4) de formule (XII) :

(XII)

- acide 17-(l,2,4-trihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl)-2,6,ll,15-t etraméthyl (4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E)-heptadecahexanoique (composé nouveau) de formule (XIII) :

De façon préférée, l'extrait utilisé est obtenu à partir des racines et/ou graines de Radamaea montana et comprend au moins ou au moins deux, voire tous les composés (X) à (XIII) ci-dessus. Selon un autre de ses aspects, l'invention a également pour objet les compositions cosmétiques, dermatologiques ou pharmaceutiques comprenant un ou plusieurs des composés (III), (V) à (XIII) listés précédemment, obtenu par synthèse chimique ou par isolement à partir d'un extrait organique de Radamaea montana. Les composés (XI) et (XIII) ci-dessus sont nouveaux et font partie intégrante de l'invention. Ils pourront être utilisés pour leurs propriétés anti-radicalaires et a nti -oxydantes, leur obtention pouvant se faire par synthèse chimique ou par isolement à partir d'un extrait organique ci-dessus.

Pour former la composition selon l'invention, l'extrait de Radamaea montana est introduit dans un milieu physiologiquement acceptable contenant un support ou au moins un excipient physiologiquement acceptable. Le support peut être constitué d'eau et/ou d'au moins un solvant organique dans les proportions adéquates. Les excipients physiologiquement acceptables sont notamment définis par la pharmacopée européenne. Ils peuvent, par exemple faciliter la pénétration de l'extrait au niveau de la peau.

De façon avantageuse, la composition selon l'invention comprend, de préférence, de 0,00001% à 10% (m/m) préférentiellement de 0,0001% à 1% (m/m) d'extrait de Radamaea montana, ce pourcentage correspondant à un pourcentage massique donné en équivalent d'extrait sec. Dans le cas, où la composition comprend à la place d'un extrait de Radamaea montana, un ou plusieurs des composés (III), (V) à (XIII) listés précédemment, obtenu par synthèse chimique, le composé actif ou l'ensemble de ces composés actifs représente, de préférence, de 0,00001% à 10% (m/m), préférentiellement de 0,0001% à 1% (m/m) de la composition.

En particulier, la composition se présente sous une forme galénique choisie parmi les émulsions biphasiques huile dans eau, eau dans huiles, les émulsions triphasiques, les lotions, les laits, les gels, les hydrogels, les crèmes, les pommades, les savons, les shampoings, les onguents et les produits à pulvériser. L'extrait Radamaea montana peut, notamment, être incorporé à la composition sous forme sèche obtenue par évaporation, atomisation ou lyophilisation, sous forme liquide ou sous forme encapsulée ou associée à des vecteurs sélectionnés parmi les liposomes, macro-, micro- et nanoparticules, macro-, micro- et nanocapsules, talcs, bentonites et autres supports minéraux. Dans les compositions selon l'invention, l'extrait de Radamaea montana peut être combiné à un ou plusieurs additifs sélectionnés parmi les lipides, les épaississants, les tensioactifs, les émulsifiants, les gélifiants, les viscosifants, les conservateurs, les extraits de plantes, les extraits tissulaires, les agents hydratants, les agents pigmentants ou dépigmentants, les émollients, les extraits marins, des principes actifs d'origine synthétique. On peut citer :

- parmi les gélifiants, la gomme xanthane, les carboxyvinyt polymères tel que l'Ultrez 10TM ou leurs sels de triéthanolamine comme le Carbomer - TEATM,

- parmi les épaississants, l'alcool cétylique, le palmitate de cétyle ou les alcools cétostéaryliques comme le Sténol C7 ou le Sipol C16, C18, C7,

- parmi les conservateurs, le phénoxyéthanol, le méthyl-paraben, le propyl- paraben, I ¹ EDTA trisodique, le benzoate de sodium,

- parmi les émulsifiants, le stéarate de glycérol, le sucrose sesquistéarate, le Polysorbate 60, le Arlace! 60, Arlacel 165, Tween 60, Span 60, PEG 20, Méthyl- glucose sesquistéarate, PEG 20 oleyl éther,

- parmi les émollients, les triglycérides capriques et capryliques, le méthyl polysiloxane, l'octyl dodécanol, l'isononyl isononanoate. La composition peut encore comprendre d'autres ingrédients communément utilisés pour la formulation des produits cosmétiques, par exemple un véhicule tel que l'huile de vaseline, ou l'huile de tournesol oléique, un agent humectant tel que la glycérine ou le butylène glycol, un neutralisant tel que la triéthanolamine, un complexant tel que l'EDTA disodique et trisodique ou encore un agent de consistance tel que le stéarate de glycol.

Le ou les autres principes actifs qui peuvent être contenus dans la composition, sont choisis en fonction de l'application recherchée pour la composition considérée. Ces principes actifs complémentaires peuvent être, en particulier, choisis parmi les agents drainants tel qu'un extrait de Lierre grimpant, les agents raffermissants tel qu'un extrait de Kigelia Africana, les agents antiirritants tel que le stéarate glycerrhétinique, les filtres anti-UV tels que les alkylbenzoate de 12 à 15 atomes de carbones, l'acide octyl-méthoxycinnamique, l'acide octylsalicylique ou le butyl-méthoxydibenzoyl-méthane, les antiinflammatoires comme l'α-bisabolol. La composition pourra contenir un extrait obtenu à partir des feuilles, des tiges, des graines ou des racines d'une plante de l'espèce Radamaea montana, associé avec des graines de sésames, de l'arachide ou du lait de coco.

Les quantités de ces différents additifs et adjuvants sont celles classiquement utilisées et seront adaptées en fonction de la composition cosmétique souhaitée et de sa forme galénique.

A titre illustratif et non limitatif, sont décrits ci-après, en référence aux Figures annexées, différents procédés pouvant être mis en oeuvre pour la réalisation de différents extraits de plantes de l'espèce Radamaea montana.

Les Figures 1 et 11 montrent schématiquement des protocoles d'extraction. Les Figures 2 à 10 et 12 à 15 donnent sous la forme de tableau les données

RMN ¹ H ou ¹³ C de différents composés isolés à partir d'extraits de Radamaea montana.

Les analyses HPLC sont réalisées grâce à un système Waters (600E) couplé avec une barrette d'iode (Waters 991), en utilisant une phase inverse en Ciβ et en appliquant les conditions expérimentales suivantes:

- une colonne "phase inverse (phase stationnaire lipophile) Cis": particules de silice (diamètre 5μm) greffées par des chaînes hydrocarbures en Cis ; diamètre intérieur 4,6 mm, longueur 25 cm;

- un éluant de lipophilie croissante: mélange de: Solvant A : H ₂ O + 2% d'acide acétique

Solvant B : acétonitrile (CH ₃ CN) /H ₂ O 8/2 + 2% d'acide acétique

Débit : ImI /min

Détection UV: λ max fixé à 340nm

Le programme d'élution est le suivant

La MPLC est effectuée sur un système de Bϋchi équipé d'une pompe B-688 couplée à un programmeur du gradient B-687, avec une colonne (46 x 2,6 cm) et une pré-colonne (11 x 1,5cm). La phase stationnaire utilisée est la phase

Lichroprep RP18 (15-25μm; Merck), avec un gradient de MeOH dans l'eau et/ou

Acétonitrile dans l'eau.

Les spectres de masse ont été obtenus sur un spectromètre de Hewlett- Parkard 1100MSD. La technique d'ionisation utilisée est l'electrospray (en mode de positif le plus souvent).

Les spectres RMN ID et 2D (HSQC, HSQC-TOCSY, HMBC) sont réalisés dans le DMSO, à l'aide d'un spectromètre RMN de Bruker Advence DRX 500.

Les séries spectrales UV, sont réalisées à l'aide d'un spectrophotomètre

UV/Vis, Agilent 8453, et selon les protocoles publiés par Mabry et al., en 1970 pour l'indentification des flavonoïdes. (Mabry, TJ. M., Markham, K.R., Thomas,

M.B., 1970. The systematic identification of flavonoïds. Springer Verlag, Berlin &

New York).

I- Extraction et Isolement des composés de feuille

I-1-Extraction

Chacun des deux types d'extrait est amené à sec et repris par un faible volume de méthanol.

I-2-Méthodes préparatives d'isolement des composés présents dans l'extrait de feuille

La purification et la détermination structurale des composés présents dans l'extrait ont été effectuées selon un protocole expérimental classique d'extraction, de séparation et de purification dont les étapes sont résumées à la Figure 1.

I-2-l-Séparation préliminaire

Seul l'extrait éthanolique a été purifié.

I-2-l-l-Fractionnement sur colonne Un fractionnement de l'extrait éthanolique 80% de feuille (6g) a été réalisé par chromatographie sur colonne ouverte de sephadex LH20 (69 x 4 cm) dans le MeOH.

26 fractions ont été récupérées selon leur fluorescence en lumière de Wood. Après contrôle en HPLC et CCM sont sélectionnées les fractions 9 à 16 et 22 à 23. I-2-l-l-a-Rechromatographie et purification finale

Fractions 9 à 11:

Par CCM de polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthyicétone (2-4-4) avec 10 plaques, 14 mg de composé 8-C-glucosyl-apigénine et 1 mg du composé 6-C-glucosyl-apigénine ont été récupérés.

U 6-C-GLUCOSYL-APIGENINE (ISOVITEXINE) DE FORMULE (I) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence sous UV à 365nm : Brun-violet

Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-4) : Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ciβ à 340nm : 18,54'

Série spectrale UV :MeoH 271nm, 336nm AICI ₃ 262nm, 278nm, 352nm, 382nm

AlCb+HCI 260nm, 280nm, 344nm, 380nm NaOAc 279nm, 303nm, 385nm

NaOAc +H ₃ BO ₃ 274nm, 346nm, 408nm NaOH 278nm, 329nm, 398nm

MS m/z :433 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 1 Figure 2.

La 8-C-glucosyl-apigénine (vitexine) de formule (II) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence sous UV à 365nm : Brun-violet

R _f sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-4) Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ciβ à 340nm : 18,54'

Série spectrale UV :MeoH 270nm, 336nm AICI ₃ 277nm, 305nm, 350nm, 386nm

AICI3+HCI 278nm, 303nm, 343nm, 383nm NaOAc 280nm, 30OnFn, 379nm

NaOAc +H ₃ BO ₃ 271nm, 329nm, 344nm NaOH 279nm, 329nm, 395nm

MS m/z :433 [M+Hf

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 2 Figure 3.

Fractions 12 et 13 : (225mg)

Après chromatographie sur une colonne de MPLC C18 15-25μm (46 x 1,5cm avec gradient de 0% à 100% de MeOH danslη ₂ O), le composé 2-C-0-D- glucopyranosyl-l,3,6,7-tetrahydroxyxanthone a été récupéré par cristallisation dans la fraction 10 (6mg) et dans la fraction ll(4mg).

La 2-C-/?-D-glucopyranosyl-l,3,6,7-tetrahydroxyxanthone (mangiférine) de formule (III) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification :

Fluorescence sous UV à 365nm : Jaune vif

Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH-méthyléthylcétone (2-4-4)

0,16

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ciβ à 340nm : 14,69'

Série spectrale UV :MeoH 241nm, 257nm, 315nm, 366nm AICI ₃ 236nm, 265nm, 357nm, 388nm

AlCb+HCI 237nm, 266nm, 345nm, 413nm NaOAc 240nm, 380nm

NaOAc +H3BO3 260nm, 312nm, 372nm

NaOH 240nm, 271nm, 304nm, 390nm

MS m/z : 423 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 3 Figure 4.

Fraction 16 :(153mg) Par CCM de polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-

4) avec 20 plaques de polyamide, lOmg du composé 1,3,6,7- tétrahydroxyxanthone ont été récupérés dont la purification est achevée sur colonne MPLC C18 15-25μm (23 x 1,5cm) avec gradient de 0% à 100% de MeOH dans I ¹ H ₂ O) dans les fractions 1 à 13 (3mg). La 1,3,6,7-tétrahydroxyxanthone de formule (IV) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence sous UV à 365nm : Jaune vif

Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH-méthyléthylcétone (2-4-4) : 0,30

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Cis à 340nm : 24,29' MS m/z : 261 [M+H] ⁺ Les données RMM du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 4 Figure 5.

Fractions 22 et 13 : (123mg)

Le composé amentoflavoπe (4mg) a été obtenu de la fraction 22 et 23 après CCM de polyamide DC6 dans le toluène-MeOH-méthyléthylcétone (2-4-4) avec 15 plaques de polyamide.

L'amentoflavone de formule (V)

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification :

Fluorescence sous UV à 365nm : Brun-violet Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-4) :

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Cie à 340nm: 31,15'

MS m/z : 539 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 5 Figure 6 I-2-l-2-Partage liquide-liquide

Le 84 g restant de l'extrait éthanolique 80% a été dissout dans 100 ml de MeOH puis additionné avec 900 ml d'H ₂ O, ce qui nous a donné 1000 ml d'extrait. Ce dernier a été fractionné par un partage liquide-liquide. Cet extrait a été dans un premier temps partagé avec une phase apolaire Hexane, ensuite une autre phase apolaire CHCb, puis une phase peu polaire ACOEt et enfin une phase polaire BuOH. Après évaporation des solvants, ce partage a permis d'obtenir quatre fractions de polarité croissante: Hexane, CHCb, ACOET et BuOH.

I-2-l-2-a-Séparation par fractionnement

L'exploration des extraits hexanique, chloroformique et butanolique n'a révélé aucun composé intéressant, et seul l'extrait d'AcOEt soumis à des expérimentations supplémentaires. Les 4 g du résidu de la phase d'AcOEt ont été fractionné sur colonne NIPLC

Ci ₈ 15-25μm avec un gradient de 50% à 100% de MeOH dans le CHcI ₃ . 42 fractions ont été récupérées selon leur fluorescence en lumière de Wood. Après contrôle en HPLC et CCM sont sélectionnées les fractions 13 à 18.

I-2-l-2-b-Rechromatographie et purification finale Fraction 13 : (17mg)

Par CCM de polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-

4) sur 16 plaques, nous avons récupéré 17mg du composé 1,3,6,7- tetrahydroxyxanthone-8-C-prénylxanthone dont la purification est enfin obtenue sur colonne de MPLC C18 15-25μm (46 x 1,5cm avec gradient de 30% à 100% de MeOH dans H ₂ O) dans la fraction 5 de celle-ci (2mg).

La l,3,6,7-tétrahydroxyxanthone-8-prenylxanthone de formule (VI) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence sous UV à 365nm : Jaune vif

Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH-méthyléthylcétone (2-4-4) : 0,52

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Cis à 340nm : 39,03' MS m/z : 329 [M+H] ⁺ Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 6 Figure 7.

Fractions 14 et 15:(2g)

Après CCM de polyamide DC6 dans le toluène-MeOH-méthyléthylcétone (2-4- 4) sur 21 plaques, sont récupérés 67mg du composé pyranoamentoflavone, dont la purification s'est poursuivie sur colonne de sephadex LH20 (23 x 1,5) dans le MeOH.

Pyranoamentoflavone se retrouvant dans les fractions 10 et ll(22mg) de celle-ci, sa purification ultime est enfin achevée sur colonne de MPLC Ciβ 15-25 μm (23 x 1,5cm avec un gradient de 30% à 100% de MeOH dans H ₂ O) dans les fractions 14, 15 et 16(6mg). La pyranoamentoflavone de formule (VII) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence sous UV à 365nm : Brun-violet

Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH-méthyléthylcétone (2-4-4) : 0,81

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ciβ à 340nm : 42,69' Série spectrale UV :MeoH 272nm, 310nm, 342nm

AICI ₃ 260nm, 299nm, 327nm, 377nm

AlCb+HCI 260nm, 300nm, 327nm, 370nm NaOAc 278nm, 293nm, 361nm

NaOAc +H3BO3 275nm, 310, 346nmnm NaOH 276nm, 315nm, 395nm

MS m/z : 605 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 7 Figure 8.

Fraction 16 : (337mg)

Lors d'une chromatographie sur colonne de sephadex LH20 (30 x 2cm) dans le MeOH, le composé 7"-0-Methylamentoflavone (sotetsuflavone) était resté sur la colonne (il ne se dissolvait pas dans le MeOH). Après récupération du résidu sur la colonne (182mg), la purification est faite sur colonne MPLC C18 15- 25μm (23 x 1,5cm avec gradient de 30% à 100% de MeOH dans H ₂ O). Le composé 7"-0-méthylamentoflavone (sotetsuflavone) s'est retrouvé dans toutes les fractions (45mg).

La 7"-0-méthylamentoflavone (sotetsuflavone) de formule (VIII) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence sous UV à 365nm : Brun-violet Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-4)

0,81

Temps de rétention en HPLC sur une colonne de à 340nm : 35,28'

Série spectrale UV :MeoH 271nm, 339nm AICI ₃ 278nm, 299nm, 348nm, 389nm

AlCb+HCI 281nm, 300nm, 343nm, 388nm NaOAc 272nm, 382nm

NaOAc +H ₃ BO ₃ 273nm, 393nm NaOH 273nm, 393nm NaOH après 5 ¹

MS m/z : 553 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 8 Figure 9

Fractions 17 et 18 :( 244mg)

Par une colonne de sephadex LH20 (30 x 2cm) dans le MeOH, le composé 6"-(2-hydroxy-3-méthyl-3-butényl) amentoflavone se trouvait dans les fractions 14 à 18 (82mg). Sa purification est poursuivie par CCM de polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-4) avec 35 plaques.

Nous avons récupéré 17mg dont la purification est enfin achevée sur colonne MPLC Ci ₈ 15-25μm (23 x 1,5cm avec gradient de 0% à 100% de MeOH dans H ₂ O dans les fractions 9 à 16(3mg).

La 6"-{2-hydroxy-3-methyl-3-butenyl) amentoflavone de formule (IX) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification :

Fluorescence sous UV à 365nm : Brun-violet

Rf sur polyamide DC6 dans le toluène- MeOH- méthyléthylcétone (2-4-4) : 0.21

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ci ₈ à 340nm : 37,93'

MS m/z : 623 [M +H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 9 Figure 10.

II- Extraction et Isolement des composés de racine

II-1-Extraction (lixiviation)

Chacun des deux types d'extrait est amené à sec et repris par un faible volume de méthanol.

II-2-Méthodes préparatives d'isolement des apocarotenoïdes La purification et la détermination structurale des apocarotenoïdes ont été effectuées d'après le protocole expérimental présenté sur Figure 11.

II-2-l-Séparation préliminaire

Après contrôle en HPLC et CCM, il ressort que les 2 extraits (dichlorométhanique et méthanolique) ont les mêmes contenus et ont été réunis, pour donner un extrait de 42,937g.

II-2-l-l-Séparation par fractionnement

L'ensemble de deux extraits (42,937g) a été fractionné par une VLC Ci ₈ (15- 25μm) successivement dans l'Hexane, dans l'ACOET et dans le MeOH. Cette VLC a permis un fractionnement du bloc en 27 fractions regroupées de la façon suivante, après contrôle en HPLC et CCM en 15 fractions.

II-2-l-l-a-Rechromatograρhie et purification finale

Fraction J (2,619g):

Après chromatographie sur une colonne de MPLC Ci ₈ 15-25μm (46x1, 5cm avec gradient de 50% à 100% de MeOH dans Iη2O) l'acide 13-(l,2-dihydroxy- 2 _/ 6,6-triméthylcyclohexyl)-2,7,ll-triméthyl(2E _/ 4E _/ 6E,8E,10E,12E) tridecahexanoique ( formule X) (777mg) a cristallisé dans la fraction 42 et l'acide 17-(l _/ 2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl)-2,6,ll,15- tetraméthyl(4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E) heptadecahexanoique (formule XI) (69,84 mg) dans les fractions 60 à 65.

L'acidel3-(l,2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl)-2,7,ll- triméthyl(2E,4E,6E,8E _/ 10E,12E)-tridecahexanoique de formule (X) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence : Jaune -orange

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Cis à 254nm, 300nm et 400nm : 20.61'

MS m/z : 401 [M+H]

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 10 Figure 12.

L'addel7-(l,2-dihydroxy-2,6,6H:riméthylcyclohexyl)-2,6,l l,15- tetraméthyl(4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E)-heptadecahexanoique de formule (XI) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence : Rouge -orange

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Cis à 254nm, 300nm et 400nm 23,71'

MS m/z : 467 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 11 Figure 13.

Un autre composé nommé RP8, présent dans les fractions 50 à 53 a été purifié en MPLC Ci ₈ 15-25μm (46 x 1,5cm avec gradient de 50% à 100% d'acétonitrile dans Iη2O) l,63mg ont été récupérés dans les fractions 13 à 16.

Fraction <7(753mg) :

Une chromatographie sur colonne de MPLC Ciβ 15-25μm (46x1, 5cm avec gradient de 50% à 100% de MeOH dans I ¹ H ₂ O) a permis de récupérer 3mg de 13[(lR,2R)]-l,2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl]-2,7 _/ ll- triméthyl(2E,4E,6E,8E,10E,12E) tridecahexaenal dans la fraction 14.

Le 13[(lR,2R)-l,2-dihydroxy-2,6,6-triméthylcydohexyl]-2,7,l 1- triméthyl(2E,4E,6E _/ 8E,10E,12E)-tridecahexaenal, de formule (XII) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification : Fluorescence : Jaune -orange

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ci ₈ à 254nm, 300nm et 400nm : 7,16' MS m/z : 385 [M+H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ^X3 C sont présentées dans le tableau 12 Figure 14.

Fraction N (3,001g): Après une chromatographie sur colonne de MPLC Cis 15-25μm (46 x 1,5cm avec gradient de 50% à 100% de MeOH dans I ¹ H ₂ O) un composé nommé RPlO a été présent dans la fraction 23. Sa purification a été poursuivie sur une colonne ouverte de cellulose microcristalline (36 x 2,5cm avec gradient de chloroforme 50% à 100% dans l'éther de pétrole), le composé RPlO se retrouvant dans les fractions 5 et 6 de celle-ci. La purification est enfin achevée sur colonne MPLC Ciβ

15-25μm (23 x 1,5cm avec gradient de 0% à 100% de MeOH dans H ₂ O dans les fractions 9 à 10 (5mg).

Après deux chromatographies sur colonnes ouvertes de Cellulose microcristalline (36x2,5cm avec gradient de Chloroforme 50% à 100% dans l'EP) de la fraction 25, un composé nommé RP9 (7mg) a été obtenu.

Après une chromatographie sur colonne de MPLC Ciβ 15-25 μm (46xl,5cm avec gradient de 0% à 100% de MeOH dans I ¹ H ₂ O) 18mg d'acide 17-( 1,2,4- trihydroxy-2,6,6-triméthylcyclohexyl)-2,6,ll,15- tetraméthyl(4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E) heptadecahexanoique ont été purifiés dans les fractions 27 et 28.

L'acide 17-(l,2 _/ 4-trihydroxy-2,6,6-triméthylcydohexyl)-2,6,ll,15-tetraméth yl (4E,6E,8E,10E,12E,14E,16E)heptadecahexanoique de formule (XIII) :

présente les caractéristiques suivantes ayant permis son identification :

Temps de rétention en HPLC sur une colonne Ciβ à 254nm, 300nm et 400nm : 14,88'

MS m/z : 483 [M+ H] ⁺

Les données RMN du proton et du carbone ¹³ C sont présentées dans le tableau 13 Figure 15.

Un composé nommé RP6 se trouvant dans les fractions 20 et 21 (31mg) a été purifié sur une deuxième colonne MPLC Ciβ 15-25μm (avec gradient de 0% à 100% MeOH dans H ₂ O) où 3,3mg de composé pur ont été récupérés dans les fractions 15 et 16. Fraction O (23,44g):

Après une VLC Ci ₈ 15-25μm (avec gradient de 0% à 100% MeOH dans I ¹ H ₂ O), un composé RP7, se trouvant dans la fraction méthanolique 80%(728mg), a été obtenu.

Sa purification s'est poursuivie par une chromatographie sur une colonne de MPLC Ci ₈ 40-63μm (50x4,5cm avec gradient de 0% à 100% de MeOH dans

I ¹ H ₂ O), le composé RP7 se retrouvant dans les fractions 17àl9(18mg) de celle-ci. Une colonne de sephadex LH20 dans le MeOH a permis finalement de récupérer 4mg de composé RP7 dans les fractions 6 et 7.

III- Extraction et Isolement des composés de graine

III-1-Extraction (lixiviation)

Chacun des deux types d'extrait est amené à sec et repris par un faible volume de méthanol. III-2- Méthodes préparatives d'isolement des apocarotenoïdes

La purification et la détermination structurale des apocarotenoïdes ont été effectuées d'après un protocole expérimental analogue à celui de la Figure 11.

III-2-l-Séparation préliminaire

Seul l'extrait méthanolique a été analysé. III-2-l-l-Séparation par fractionnement

130,5g a été fractionné par une VLC de silice (15-40μm) dans le MeOH /H ₂ O, 10 fractions ont été obtenues. Après une purification et une co-chromatographie de chaque composé avec les composés des racines, il s'avère que les extraits de graines contiennent les mêmes composés que ceux des racines. IV- Activités antioxydantes des principaux composés de Radamaea montana et de l'extrait de feuille, racine et de graine

L'évaluation du pouvoir antioxydant a été effectuée avec deux tests : un test de réduction d'un radical organique ABTS et un test de réduction d'un ion métallique CUPRAC. Le test ABTS utilisé est basé sur la description originale de Re et al. en 1999 (Free Radical Biology and Médecine, 26, 1231-1237), avec les modifications apportées par Arts et al. en 2002 (Journal of Agriculture and Food Chemistry, 50, 7970-7981). Le test CUPRAC utilisé est le test qui a été décrit par Apak et al. (Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2004, 52, 7970-7981).

Les activités antioxydantes des principaux composés de Radamaea montana présents dans l'extrait de feuille, en équivalent Trolox en CUPRAC et en ABTS sont données ci-après :

Les activités antioxydantes des principaux composés de Radamaea montana présents dans l'extrait de graine et de racine, en équivalent Trolox en CUPRAC et en ABTS sont données ci-après :

Les activités antioxydantes des extraits organiques de feuille, racine et graine de Radamaea montana en équivalent Trolox en CUPRAC et en ABTS sont données ci-après :

L'évaluation du pouvoir antioxydant a également été effectuée avec un test d'action de réduction de la tyrosine par la tyrosinase {inhibition de cette action avec des produits antioxydants). Ce test a été développé et optimisé à partir des descriptions de V. J. HEARING Jr (Methods in Enzymology, 1987, vol. 42, 154- 165), de Y.-J. KIM, H. UYAMA (Cellular and Molecular Life Sciences 2005, 62, 1707-1723) et de T. SABUDAK et al. (Natural Product Research, 2006, vol. 20, n°. 7, 665-670). La tyrosinase, est une enzyme-clé présente chez les plantes et les animaux dans la biosynthèse de la mélanine. Elle catalyse l'oxydation des monophénols, diphénols et quinones. Les antioxydants inhibent donc l'action de la tyrosinase. Cette inhibition peut être suivie en temps réel grâce à la vitesse de l'apparition et à l'intensité de sa coloration du milieu réactionnel (formation du complexe L-DOPA-quinone) mesurable en spectrométrie.

Tyrosinace

L-Tyrosine + O ₂ L -DOPA

L -DOPA Tyrosinace L-DOPA-quinone + H ₂ O

L-DOPA= L-3,4- Dihydroxyphenylalanine

Les activités antioxydantes des principaux composés de Radamaea montana présents dans les extraits de feuilles, racine et graine, sont donnés sous forme d'IC ₅ o* dans le tableau ci-dessous :

NOM Réf. IC50* en μg/ml

Epicatechine gallate (témoin actif dans la

Epicatechi G. 55,8 littérature) Acide kojique (témoin actif dans la littérature) Kojic acid 57,0 l,3,6,7-tetrahydroxy-8-prénylxanthone RF4bis 126,2 Extrait éthanolique de racine de Radamaea

Rada racine 145,2 montana l,3,6,7-tetrahydroxy-8-3,3-

RF4 153,8 (diméthylallyl)xanthone mangiférine RF3 154,5 Extrait éthanolique de feuille de Radamaea

Rada feuille 188,0 montana Radamanine A RP2 214,9

6"-(2-hydroxy-3-méthyl-3-butényl)-

RF7 264,7 amentoflavone

Amentoflavone RF5 283,6

Sotetsuflavone RF6 337,7

Extrait éthanolique de graine de Radamaea

Rada graine 644,4 montana Apigénine-8-C-glucoside RFl 2134,9

*IC5o= Concentration nécessaire en μg/ml de produit testé pour obtenir 50% d'inhibition de la tyrosinase.

Les données ont par ailleurs été validées en introduisant dans les expérimentations d'évaluation de l'effet biologique deux témoins réputés actifs l'Epicatechine gallate et l'acide kojique. Les valeurs relevées pour ces deux témoins sont tout à fait en accord avec celles retrouvées dans la littérature (Y.-J. KIM, H. UYAMA (Cellular and Molecular Life Sciences 2005, 62, 1707-1723), J-H HWANG and B M LEE (Journal of Toxicology and Environmental Health, part A, 2007, 70, 393-407)). Dans cette même littérature, les extraits de plantes sont considérés comme actifs lorsque les IC _5O sont inférieurs à 500 μg/ml.

V- Exemples de compositions

Gel après soleil

Eau déminéralisée QSP 100 % Glycérine de 1 à 5% de préférence 3, 00 % Gélifiant acrylique de 0,1 à 1 % de préférence 0,30 % Triéthanolamine de 0,1 à 1% de préférence 0,50 % Conservateur antimicrobien de 0,5 à 1 % de préférence 0,55 % Huile végétale ou huile minérale de 1 à 5 % de préférence 2 % Parfum de 0,1 à 1% de préférence 0,15 % Radamaea montana (extrait sec) de 0,0001 % à 0,05 %, de préférence 0,001%

Crème anti-radicalaire

Stéarate de sorbitol de 1 à 2 % de préférence 1,50 %

Stéarate de glycéryl et Polyéthylène glycol-100 de 2 à 5 % de préférence 3,25 % Huiles minérales et huiles végétales de 10 à 20 % de préférence 13,50 %

Eau déminéralisée QSP 100 %

Propylène glycol de 1 à 5 % de préférence 2,50 %

Gélifiant acrylique de 0,1 à 1% de préférence 0,40 %

Triéthanolamine de 0,1 à 1 % de préférence 0,40 % Conservateur antimicrobien de 0,5 à 1 % de préférence 0,80 %

Parfum de 0,1 à 1% de préférence 0,15 %

Gélifiant (par exemple du type SEPIGEL, commercialisé par la Société

SEPPIC) de 0,1 à 2 % de préférence 0,70 %

Radamaea montana (extrait sec) de 0,0001 % à 0,05 %, de préférence 0,001%

Lait solaire

Eau déminéralisée QSP 100 %

Dioxyde de titane de 0,1 à 2 % de préférence 0,20 %

Sorbitolde 0, 5 à 5 % de préférence 1 % Triéthanolamine de 0,1 à 1 % de préférence 0,30 %

Stéarate de glycéry! et Polyéthylène glycol-100 de 1 à 5% de préférence 2 %

Stéarate de glycéryl de 0,1 à 1 % de préférence 0,30 %

Acide stéarique de 0,5 à 5 % de préférence 1%

Huiles végétales et huiles minérales de 5 à 15% de préférence 8 % Filtre solaire (cinnamate) de 0,5 à 10 % de préférence 5 % Antioxydant de 0,01 à 0,1 % de préférence 0,07 % Gélifiant acrylique de 0,1 à 1% de préférence 0,10 % Conservateur antimicrobien de 0,5 à 1 % de préférence 0,80 % Parfum de 0,1 à 1% de préférence 0,40 % Radamaea montana (extrait sec) de 0,0001 % à 0,05 %, de préférence 0,001%

Shampooing réparateur antiradicalaire Eau QSP 100 %

Cocamidopropyl bétaïne 15 à 20 %

Alkyl éther sulfates 10 à 15 %

Caprypyl/Capryl glucoside 2 à 10 %

Cocamide DEA 2 à 4 % Glycérine 1 à 5 %

PEG-120 Méthyl Glucose Dioléate 1 à 5 %

Parfum 0,2 à 1 %

Conservateur 0,05 à 0,8 %

EDTA 0,05 à 0,1 % Radamaea montana (extrait sec) de 0,0001 % à 0,1 % Masque capillaire

Eau QSP 100 %

PEG-6 Stéarate + Ceteth-20 + Glycéryl stéarate + Steareth-20 5 à 10 %

Alcool cétylique 2 à 5 % Quaternium-80 1 à 5 %

Beurre de Karité 1 à 5 %

Huiles minérales et esters émollients 1 à 5 %

Glycérine 1 à 5 %

Diméthicone copolyol 1 à 3 % Parfum 0,1 à 1 %

Conservateur 0,1 à 0,7 %

Carbomer 0,05 à 0,5 %

Triéthanolamine 0,05 à 0,5 %

Radamaea montana {extrait sec) de 0,0001 % à 0,1 %

Crème de jour protectrice Eau QSP 100 %

Esters émollieπts 10 à 15 %

Glycéryl stéarate et PEG-100 stéarate 4 à 6 %

Butylène Glycol 2 à 5 %

Huile de germes de Blé 2 à 5 % Alcool cétylique 1 à 5 %

Diméthicone 1 à 4 %

Polyméthyl méthacrylate 0,5 à 2 %

Parfum 0,3 à 1 %

Conservateur 0,1 à 0,8 % Carbomer 0,05 à 0,5 %

Triéthanolamine 0,05 à 0,5 %

Butyl Hydroxy Toluène 0,05 à 0,1 %

Radamaea montana (extrait sec) de 0,0001 % à 0,1 %