SECTOR DE LA TECNICA Industria alimentaria. Production de masas dulces y saladas. La presente invention consiste en la utilizacion de cepas de Torulaspora delbrueckii en la production de masas dulces congeladas. Estas cepas ademas de resistencia a la congelación, presentan un buen poder fermentativo en formulaciones con un elevado contenido en sacarosa.

ESTADO DE LA TECNICA La capacidad de las levaduras de panaderia para enfrentarse a diferentes condiciones de estrés es un factor clave en muchas aplicaciones comerciales. Uno de los retos mas extremos para las levaduras es la alta presion osmotica encontrada en masas dulces (Attfield, 1997; Randez-Gil y col., 1999). Estos productos contienen hasta un 30% de sacarosa, a menudo combinado con grasa, leche y sal, lo que contribuye a reducir la actividad de agua en la masa.

La exposition a estrés osmotic supone una rapid deshidratación celular que limita el crecimiento y la capacidad de production de gas (Blomberg y Adler, 1992; Hohmann, 1997). Como consecuencia de ello, el tiempo de fermentación se alarga y el volumen del producto final disminuye (Myers y col. , 1997). Esta situation se ve empeorada en masas dulces congeladas ya que el proceso de congelacion y descongelaci6n reduce notablemente la actividad de agua. Ademas, el almacenamiento en congelación tiene un efecto negativo en el proceso de panificacion, debido al dano celular por crecimiento de los cristales de hielo (Gelinas y col., 1993; Hatano y col., 1996). Para resolver estos problemas, es commun en la practice panadera aumentar la dosis de levadura en masas dulces y masas dulces congeladas. Sin embargo esta practice incrementa el coste del proceso y afecta de forma negativa al sabor y textura del producto. En este sentido, se han llevado acabo numerosos esfuerzos para desarrollar nuevas cepas de levadura con mayor poder fermentativo en masas congeladas (EP0921190, EP0838520 A3, EP0196233, JP5064581, JP3285673, EP1036841). Sin embargo, la mayoria de estas cepas no han

sido evaluadas para otras propiedades de interns en panificación o no cumplen los principales requisitos de una levadura de panaderia comercial.

Una caracteristica importante que influye en la capacidad fermentativa de una levadura destinada a elaborar masas dulces es su nivel de actividad invertasa. Esta enzima cataliza la hidrólisis de sacarosa en glucosa mas fructosa, lo cual incrementa la pression osmotic. Por ello, cepas de levadura de panaderia con baja actividad invertasa han sido seleccionadas para la producción de masas dulces (US5801049).

Estas cepas son optima para la elaboraci6n de masas conteniendo una baja concentración de sacarosa (<10%). Ahora bien, estas cepas no muestran osmotolerancia intrinseca y en condiciones de alta pression osmotic, su actividad fermentativa se ve inhibida.

Por otra parte, la incorporacion de sal (2%) a la formulacion de masas dulces, tiene efectos adicionales sobre la capacidad fermentativa de la levadura. La acumulación. de sodio y cloro en el citosol es nociva para muchos sistemas enzimaticos. Este efecto toxic se observa a concentraciones intracelulares de Na y Cl-de 50-100 mM, inferiores a las concentraciones requeridas para producir estrés osmotic (Serrano y col., 1997). Las concentraciones consideradas nocivas se alcanzan facilmente en la levadura, dada la baja actividad de agua en masas dulces, lo que incrementa la concentración efectiva de estos iones. Por todo ello, una cepa industrial destinada a la elaboración de masas dulces, debe exhibir osmotolerancia y resistencia a la toxicidad del sodio. A pesar de los numerosos esfuerzos, en la actualidad no se dispone de ninguna cepa que cumpla con estos dos requisitos.

La capacidad de fermentar una masa panaria, no es exclusiva de Saccharomyces cerevisiae. Levaduras como Zigosaccharomyces, Pichia o 7brulaspora han sido aisladas de masas fermentadas de arroz o de centeno (Almeida y Pais, 1996). Una de estas levaduras, en particular T. delbrueckii, es empleada de forma comercial en Japon para la fermentación panaria. Cepas tolerantes a la congelación de T. delbrueckii (JP5244934, JP6078754, EP0268012A1) T. pretoriensis y Kluyveromyces thermotolerants han sido aisladas y caracterizadas como adecuadas para masas congeladas. Sin embargo, la mayoria de estas cepas, no han sido extensamente evaluadas o no cumplen requisitos importantes para su posterior comercialización.

DESCRIPCION DE LA INVENCION BREVE DESCRIPCION La presente invencion supone una importante mejora en el proceso productivo de masas dulces frescas y congeladas, basado en la utilizacion de cepas de Torulaspora delbrueckii. La utilizacion de las cepas de Torulaspora delbrueckii descritas en esta invention para el proceso de production de masas dulces frescas y congeladas, ha sido reivindicado en la presente invencion.

Las cepas de Torulaspora delbrueckii descritas en esta invencion, cumplen los requisitos mas importantes de una cepa de uso comercial en panificacion : crecimiento rapid y alto rendimiento de biomasa en medios de melaza, acoplado a una buena capacidad fermentativa en masas dulces y saladas, tanto frescas como congeladas. Estas caracteristicas, responden a las demandas de los productores y consumidores de este tipo de masas. Ademas la utilizacion de estas cepas, tiene ventajas adicionales, ya que una sola cepa puede ser utilizada en diferentes tipos de formulaciones panarias, incluidas aquellas que contienen sal. La utilizacion de estas cepas que presentan una alta capacidad fermentativa, tanto en masas dulces como en masas saladas, y por tanto evitan la necesidad de emplear cepas distintas para el proceso de production de cada uno de estos dos tipos de masas, ha sido reivindicada en la presente invencion.

Estas cepas de T. delbrueckii han demostrado su capacidad fermentativa en masas dulces que contienen ingredientes como leche, huevo, margarina o emulgentes. La utilizacion de estas cepas en este tipo de masas ha sido zambien reivindicada en la presente invencion.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Las levaduras T. delbrueckii IGC5321 e IGC5323 fueron aisladas y caracterizadas parcialmente por Almeida y Pais (1996). Estos autores han demostrado la buena capacidad fermentativa de estas cepas en masas saladas congeladas. Sin embargo, no aparece en dicho trabajo ninguna referencia a la production de masas dulces frescas o congeladas. Tampoco se describe la production de biomasa en medios industriales limitandose su crecimiento a medios sintéticos.

Uno de los principales requisitos de una cepa industrial de panaderia es un crecimiento rapid y un buen rendimiento de biomasa en medios industriales de melaza. Como se observa en los datos presentados en la figura 1, las cepas de Torulaspora delbrueckii IGC5321 e IGC5323 crecen en medio de melaza con una velocidad de crecimiento de (0.29 h-') y de (0.28 h'') respectivamente, similar a la encontrada para cepas comerciales de Saccharomyces cerevisiae Plus Vital y Cinta Roja (0.32 h'1). En estas condiciones de cultivo, se obtiene un rendimiento en biomasa similar al observado en cepas comerciales (ver tabla 1).

TABLA 1. Rendimiento en biomasa de diferentes cultivos de levadura en medio melaza. Cepa Gramos por litro (s. h.) T. delbrueckii (IGC5321) 24. 5 Tdelbrueckii (IGC5323) 22. 2 Cinta Roja 26.5 Plus Vital 24. 2

El cultivo se llevo a cabo a 30°C y 200 r. p. m. Las cellas se inocularon a una DO 600 = 0. 05 y se determine la production de biomasa tras 24 horas de cultivo. s. h.: sustancia humera La biomasa asi obtenida ha sido utilizada para la produccion de masa panaria y masa dulce de acuerdo con la formulacion descrita en la tabla 2.

TABLA 2. Formulación de masas dulces y saladas Masa dulce Ingredientes Masa salada 8% azúcar 20% azúcar Harina 250 g 250 g 250 g Levadura 7 g 7 g 7 g Sal 5 g 5 Azucar-20 g 50 g Agua 118 ml 118 ml 118 ml W=13. 82 x 10'3 J (alveografo)

Como se recoge en la tabla 3, las cepas de Torulaspora estudiadas son capaces de fermentar tanto masas saladas como dulces. En especial la cepa IGC5321 presenta los niveles mas altos de producci6n de gas, incluso en masas con un contenido del 20% de sacarosa. En estas condiciones, las cepas comerciales de S. cerevisiae Plus Vital y S. cerevisiae Cinta Roja muestran una clara disminución de su capacidad fermentativa.

TABLA 3. Production de C02 en masas panarias y masas dulces ml de CO2/g de levadura (s. s) Masa dulce Masa Salada Cepa 8% azucar 20% azucar T. delbrueckii IGC5321 811 840 529 T. delbrueckiiIGC5323 780 765 525 Plus Vital 585 699 158 Cinta Roja 719 529 n. d. * Las masas panarias se elaboraron de acuerdo a lo descrito en el capitulo de"Ejemplo de realización de la invencion". La production de C02 se determine en un Rheofermentómetro (Chopin). s. s.: sustancia seca * no detectado Una caracteristica importante que determina la capacidad fermentativa de S. cerevisiae en masas saladas o con un contenido bajo en sacarosa es el nivel de actividad invertasa y maltasa. Asi, la fermentación de masas dulces esta inversamente correlacionada con el nivel de actividad invertasa (US5801049), mientras que en el caso de masas saladas un buen poder fermentativo esta correlacionado con un nivel elevado de actividad maltasa (Beudeker y col., 1990; Oliver, 1991). Como se muestra en la figura 2 las cepas de Torulaspora estudiadas presentan valores mas bajos de actividad maltasa que las cepas comerciales de S. cerevisiae analizadas. Este resultado no se correlaciona con la production de CO2 en masas saladas determinada para estas levaduras (Tabla 3). Sin embargo, cuando analizamos el nivel de actividad invertasa podemos comprobar que las cepas con niveles mas bajos de esta enzima son las que muestran un mejor poder fermentativo

en masas dulces. En este sentido, la cepa de S. cerevisiae comercializada para la fabricación de masas saladas (Cinta Roja), es la que presenta el mayor nivel de actividad invertasa y esto claramente implica una baja capacidad fermentativa en formulaciones conteniendo dosis elevadas de azucar.

En el caso de formulaciones con un contenido del 20% en sacarosa la pression osmotic es muy elevada por lo que un bajo nivel de actividad invertasa no es suficiente para mantener la fermentación (Tabla 3). Ademas, como se observa en la figura 3A la presencia de 2% de sal en las formulaciones ensayadas disminuye la capacidad fermentativa de las dos levaduras ensayadas. Este efecto es mas acusado en la cepa Plus Vital, en la que la disminución de la capacidad fermentativa va acompanada de una fase de latencia, con lo que se alarga el tiempo de fermentación.

A la vista de estos resultados estas levaduras se han sometido a diferentes condiciones de estrés osmotic y salino. Se ha estudiado su capacidad de crecimiento en medios de cultivo conteniendo sales como NaCl (1.4 M), KCl (1.4 M) o LiCl (0.4 M). Como se muestra en la figura 3B, el crecimiento de la cepa Plus Vital, se ve perjudicado por la presencia de una elevada concentración de KCl y totalmente abolido por LiCl o NaCl. En medios conteniendo 20% de sacarosa y 0.7 M de NaCl, de nuevo la capacidad de crecimiento de esta cepa se ve claramente afectada. Sin embargo, la cepa de T. delbrueckii IGC5321 muestra un buen crecimiento en estos medios, incluso en presencia de NaCl o LiCl, indicando que esta cepa es osmotolerante y resistente a la toxicidad del sodio. Estos resultados se corresponden bien con su alta capacidad fermentativa en masas dulces.

La resistencia a la congelación es una propiedad esencial en cepas comerciales de levadura para su utilización en masas congeladas. La pérdida de la capacidad fermentativa tras el proceso de congelación-descongelación se ha atribuido a la desecación y consecuente pérdida de electrolitos generada por estrés hiperosmótico (Hatano y col. , 1996; Myers y Attfield, 1999). Ademas a lo largo del almacenamiento en congelación, se produce un crecimiento de los cristales de hielo y como consecuencia de ello, la fractura de la membrana celular y de los organulos <BR> <BR> intracelulares (Grout y col. , 1990). Con el objeto de determinar como afectan estos dos procesos a la producci6n de gas, se analizó la capacidad fermentativa de las cepas bajo estudio, en masas dulces o saladas almacenadas en congelación durante

diferentes periods de tiempo. Como se observa en la figura 4 las cepas comerciales de S. cerevisiae disminuyen su capacidad fermentativa durante el proceso de congelaci6n-descongelacion, de un 25 a un 40% tanto en masas dulces como saladas (tiempo 0'). Por el contrario esta reduction fue tan solo del 10-12 % en masas elaboradas con T. delbrueckii IGC5321. Este resultado esta en concordancia con la aparente osmotolerancia intrinseca que presenta esta cepa de T. delbrueckii.

Finalmente, todas las cepas estudiadas muestran una clara disminucion gradual de su poder fermentativo con el tiempo de almacenamiento en congelación, siendo mas acusado para las cepas comerciales de S. cerevisiae analizadas en este estudio.

La mayoria de las masas dulces producidas en la industria contienen ingredientes como huevo o margarina. Siguiendo la formulacion indicada en la tabla 4, se elaboraron masas con las cepas Plus Vital y T. delbrueckii IGC5321, en las cuales se determine la production de C02 en fresco y tras diferentes periodos de almacenamiento en congelacion. De nuevo, como se muestra en la figura 5, T. delbrueckii IGC5321 mostro una mejor production de gas, medida a través del incremento de volumen, que la cepa control Plus Vital.

TABLA 4. Formulación de una masa tipo"briox" Ingredientes Harina 100 g Levadura 9 g Agua 23 ml Sal 1,5 g Azúcar 18 g Huevo entero batido pasteurizado 12 g Clara de huevo pasteurizada 20 g Leche en polvo l g Margarina 10 g Emulgente (80% lecitina y 20% DATEM) 1 g * W=40. 0 x 10-3 J (alveografo)

DESCRIPCION DETALLADA DE LOS DIBUJOS Figura 1: Curva de crecimiento a 30°C en medios industriales de melaza de las cepas de Torulaspora delbrueckii, IGC5321 (e) e IGC5323 (o) y de las cepas de Saccharomyces cerevisiae Cinta Roja (a) y Plus Vital (o).

Figura 2: Nivel de actividad invertasa y maltasa detectado en levaduras crecidas en medios industriales de melaza. Coulas de Torulaspora delbrueckii IGC5321 (Td21), Torulaspora delbrueckii IGC5323 (Td23), Saccharomyces cerevisiae Cinta Roja (CR) y Saccharomyces cerevisiae Plus Vital (PV) fueron cultivadas en medio melaza (DO6oo = 24-26) y procesadas para la determinación de actividades enzimaticas. Una unidad de actividad invertasa se define como la cantidad de enzima capaz de liberar 1 nmol de glucosa a partir de sacarosa por minuto y miligramo de proteina. Una unidad de actividad maltasa viene definida como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 nmol de para-nitrofenol por minuto y miligramo de proteina. Los valores representan la media de al menos dos experimentos independientes.

Figura 3: Efecto de la adicion de diferentes sales en el crecimiento y capacidad fermentativa de las levaduras ensayadas en este estudio. (A) Incremento en el volumen de la masa a lo largo del tiempo de fermentación de una masa dulce conteniendo sal (panel derecho) y de una masa dulce control (panel izquierdo) elaborada con la cepa Plus Vital (o, PV) o con la cepa T. delbrueckii IGC5321 (, Td21). (B) Comparación del crecimiento de estas cepas de levadura de panaderia en medio sintetico, YP-agar (1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% de agar), suplementado con 2% glucosa (YPD) o 20% de sacarosa (YPS) y diferentes sales, NaCl, KCl 6 LiCl. Las placas fueron incubadas a 30°C durante 2-4 dias.

Figura 4: Efecto de la congelación y del almacenamiento sobre la capacidad fermentativa de diferentes cepas de levadura de panaderia. Masas saladas (A) y masas dulces (B) elaboradas con las levaduras T. delbrueckii, IGC5321 (.) e IGC5323 (o) y S. cerevisiae, Cinta Roja (j) y Plus Vital (o), fueron congeladas a - 80°C durante 1 hora y almacenadas a-20°C durante 3 horas (0') o hasta 60 dias.

Los valores representan la cantidad relativa de gas producido respecto a una masa control no congelada y son media de dos experimentos independientes.

Figura 5: Production de gas en masas tipo"briox"frescas y congeladas. Incremento en el volumen de la masa elaborada con la cepa T. delbrueckii IGC5321 (barras

negras) o con Plus Vital (barras blancas). El tiempo 0 corresponde a la masa fresca, el resto de masas se procesaron a los tiempos indicados en la figura.

EJEMPLO DE REALIZACION DE LA INVENCION 1. Production de biomasa En esta invenci6n, la produccion de biomasa de levadura se ha llevado a cabo en frascos de 1 litro conteniendo 250 ml de medio de cultivo de melazas con la siguiente composición : 116.6 g de melaza de remolacha (con un contenido del 49% sacarosa), 1.5 g de sulfato amónico, 0.15 g de acido ortofbsforico y 20 ig de biotina por litro.

El medio se ajusté a pH 5.0 con 1M HCI.

El medio de cultivo es inoculado a una D0600 inicial de 0.05 a partir de un precultivo en el mismo medio. Tras 24 horas de cultivo a 30°C y 200 rpm, la levadura es recogida mediante centrifugacion y lavada con agua para eliminar los restos de melaza. Posteriormente es filtrada a través de una placa porosa, obteniéndose una pastilla de levadura con un contenido en humedad en torno al 72%.

2. Elaboración de masas y proceso de congelación Las masas descritas en la presente invention se han elaborado siguiendo la formulación presentada en la tabla 2. Los distintos ingredientes se han anadido en sólido con la exception del azúcar y la levadura que se han desleido en el agua que se aporta en la formulacion. Se amass en una amasadora MAHOT LABO 25 MIXER durante 8 minutos a alta velocidad. Se dividio en piezas de 315 g y se molder a mano hasta conseguir una lamina de masa de 0.5 cm, que se introdujo en bandejas de aluminio envueltas en plastic. Finalmente, se congelé a-80°C durante 1 hora y se almacen6 en una camara de congelación a-20°C.

3. Production de CO ? Se determine en un rheofermentómetro (Chopin) durante 3 horas a 28. 5°C. En todos los casos se analizo la production de gas en una pieza sin congelar a la que denominamos"masa control". El resto de piezas almacenadas en congelación se analizaron de la misma manera, tras su descongelación en una cabina de fermentación durante 30 minutos a 30° C.

4. Efecto de la congelacion/descongelacion La tolerancia a la congelacion se compara con la presentada por otras cepas de panaderia comerciales, crecidas en las mismas condiciones. Las masas fueron congeladas a-80°C durante 1 hora y almacenadas a-20°C durante 3 horas (0') o hasta 60 dias. Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 4.

5. Efecto de otros ingredientes en las masas tipo"briox" Se elaboraron masas siguiendo la formulacion presentada en la tabla 5 y se prepararon siguiendo el proceso descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Se midio el incremento en el volumen de las masas elaboradas con la cepa T. delbrueckii IGC5321, tanto frescas como congeladas durante el periodo de tiempo indicado en la grafica y se compare con el incremento del volumen en las mismas condiciones de la masa fermentada con la cepa Plus Vital.

6. Efecto del estres osmotico v salino en la capacidad fermentativa y en el crecimiento de cepas de levadura de panaderia Las cepas T. delbrueckii IGC5321 y Plus Vital se crecieron en medio YPD (1% extracto de levadura, 2% peptona y 2% glucosa) hasta fase exponencial (D06oo 0.3- 0.5), se recogieron por centrifugación, se diluyeron y se sembraron en YPD s6 ! ido (2% agar) conteniendo NaCl (1. 4 M), KCI (1.4 M) o LiCl (0.4M). Ademas se ensayo el crecimiento en placas de YP conteniendo 20% de sacarosa en ausencia de NaCl o en presencia de 0.7 M de NaCl. Las placas se incubaron a 30°C durante 2 a 4 dias.

El incremento de volumen de la masa se ha medido en un vaso calibrado usando masas de 100g elaboradas como se especifica en el Ejemplo 2.

BIBLIOGRAFIA<BR> Almeida, M. J. , y C. S. Pais. 1996b. Leavening ability and freeze tolerance of yeasts isolated from traditional corn and rye bread doughs. Appl. Environ. Microbiol.

62: 4401-4404.

Attfield, P. V. 1997. Stress tolerance : The key to effective strains of industrial baker's yeast. Nature Biotechnol. 15: 1351-1357.

Beudeker, R. F.; Dam, H. W; van Plaat J. B. ven der; Vellenga, K. (1990) Developments in baker's yeast production. En Verachtert, H.; De Mot, R. (eds) Yeast: Biotechnology and Biocatalysis. Deker, New York p. 103-146.

Blomberg, A. , y L. Adler. 1992. Physiology of osmotolerance in fungi. Adv. Microb.

Phys. 33: 145-212.

Gelinas, P. , Lagimonière, M. , y Dubord, C. 1993. Baker's yeast sampling and frozen dough stability. Cereal Chem. 70: 219-225.

Grout, B.; J. Morris y M. McLellan. 1990. Cryopreservation and the maintenance of cell lines. Trends Biotecnol. 8: 293-297. <BR> <BR> <P>Hatano, S. , Udou, M. , Koga, N. , Honjoh, K. , y Miyamoto, T. 1996. Impairment of the glycolytic system and actin in baker's yeast during frozen storage. Biosci.

Biotechnol. Biochem. 60: 61-64.

Hohmann, S. 1997. Shaping up: the response of yeast to osmotic stress, p. 101-146.

En S. Hohmann y W. H. Mager (ed.), Yeast Stress Responses. Springer, New York.

Myers, D. K. , D. T. M. Lawlor, y P. V. Attfield. 1997. Influence of invertase activity and glycerol synthesis and retention on fermentation of media with high sugar concentration by Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 63: 145-150.

Myers, D. K. y P. V. Attfield. 1999. Intracellular concentration of exogenous glycerol in Saccharomyces cerevisiae provides for improved leavening of frozen sweet doughs. Food Microbiol. 16: 45-51.

Oliver, S. (1991) Classical yeast biotechnology. En Tuite M. F.; Oliver S. G. (eds) Sacharomyces. Biotechnology hadboojks Vol. 4 Plenum Press, London p. 213-248.

Randez-Gil, F. , Sanz, P. , y Prieto, J. A. 1999. Engineering baker's yeast: room for improvement. Trends Biotechnol. 17: 237-244.

Serrano, R. , J. A. Marquez, y G. Rios. 1997. Crucial factors in salt stress tolerance, p.

147-169. En S. Hohmann y W. H. Mager (ed.), Yeast Stress Responses. Springer, New York.

EP0921190 (Katumi, M. y col. Solicitante : Oriental Yeast Co Ltd. Fecha de publicacion 1999-06-09). Frozen dough-resistant and hig-sugar dough-resistant, practical baker's yeast.

EP0838520, A3 (Chie, I. y col. Solicitante : Oriental Yeast Co Ltd. Fecha de publicacion 1998-04-29). Frozen dough-resistant, practical baker's yeast.

EP0196233 (Kazuo, U. y col. Solicitante : Kyowa Hakko Kogyo KK. Fecha de publicacion 1986-10-01). Freeze resistant dough and novel microorganism for use therein.

JP5064581 (Sueo, 1. y col. Solicitante : Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd. Fecha de publicacion 1993-03-19). New yeast, frozen bread dough cantaining the yeast, and production of the dough.

JP3285673 (Sueo, 1. y col. Solicitante : Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd. Fecha de publicacion 1991-12-16). New yeast, frozen bread dough containing same yeast and preparation of same dough.

US5,801, 049 (Endo y col. Solicitante : Asahi Chemical Ind. Fecha de publicaci6n 1998-09-01). Freeze-resistant baker's yeast having sugar resistance.

EP1036841A1 (Ando, M. y col. Solicitante : Oriental Yeast Co Ltd. Fecha de publicacion 2000-09-20). Sugar super-tolerant yeast for confectionery and bakery.

EP0268012A1 (Trivedi, N. y col. Solicitante : Universal Foods Corp. Fecha de publicacion 1988-05-25). Frozen yeast dough products.

JP5244934 (Osamu, Y. y col. Solicitante : Nippon Sanso KK. Fecha de publicacion 1993-09-24). Baker's yeast and frozen bread dough prepared by using the yeast.

JP6078754 (Yosuke, S. y col. Solicitante : Nikka Uisukii KK. Fecha de publicacion 1994-03-22). Torulaspora delbrueckii H299-18 and production of frozen dough for bread using the same.