Utilisation d'un symbiotique pour le traitement de la dermatite atopique

Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui produisent un bénéfice pour la santé de leur hôte. Cet effet bénéfique s'explique notamment par l'amélioration de l'équilibre de la flore intestinale (1). Les plus connus sont les lactobacilles et les bifidobactéries qui permettent, en se multipliant dans l'intestin, de réduire par simple compétition la population bactérienne potentiellement pathogène. Les prébiotiques sont quant à eux des substances qui ne peuvent être digérées par l'organisme et/ou qui ont des effets bénéfiques sur la personne qui les consomme en stimulant la croissance ou l'activité de certaines bactéries non pathogènes et naturellement présentes dans le côlon.; La durée de vie limitée et le faible taux de survie des probiotiques demeurent toutefois des obstacles majeurs à leur utilisation en thérapie. Il y a donc un besoin pour des prébiotiques appropriés, ainsi que des combinaisons optimisées de prébiotiques et de probiotiques (symbiotiques) permettant d'obtenir une amélioration significative de l'efficacité des probiotiques. Une telle combinaison présenterait bien entendu des avantages certains pour le traitement d'affections atopiques, et tout particulièrement de la dermatite atopique (DA).

A ce jour, il n'existe aucune donnée sur l'utilisation de prébiotiques ou de symbiotiques dans le traitement de la dermatite atopique.

La dermatite atopique est une dermatose dont la prévalence chez les enfants des pays occidentaux est située entre 10 et 25% (2, 3). Son évolution est chronique avec amélioration fréquente à l'adolescence. Les formes modérées et sévères, de par la chronicité des lésions prurigineuses, inesthétiques et nécessitant des soins locaux quotidiens, ont un retentissement psychologique important. Le traitement de fond repose sur l'application régulière d'émollients, associée à des règles hygiéno- diététiques. Les poussées nécessitent l'application de corticoïdes ou d'immunosuppresseurs sous forme topique. Cependant les rechutes sont courantes, la chronicité peut détériorer la qualité de vie tant du patient que de sa famille, et l'usage prolongé de traitement induit des effets secondaires.

La pathogénie de la dermatite atopique repose sur une dysrégulation de l'immunité à médiation cellulaire avec déséquilibre dans le rapport Th1/Th2, au profit d'une réponse de type Th2. L'augmentation constante de la prévalence de la dermatite atopique dans les pays occidentalisés serait corrélée à l'amélioration des conditions d'hygiène. Les

enfants seraient ainsi moins exposés aux agents infectieux pendant leurs premiers mois ou années de vie et développeraient ainsi une réponse Th2 préférentielle (4-7). Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement commercialisé permettant de corriger cette dysrégulation immunitaire. Les probiotiques sont des micro-organismes vivants, commensaux du tube digestif, qui peuvent avoir des propriétés antiallergiques en favorisant une réponse de type Th 1 (8, 9). Tous les probiotiques n'ont cependant pas les mêmes propriétés immunologiques. Dans un récent article réalisé avec des cellules dendritiques de souris, la bactérie Lactobacillus rhamnosus a montré de manière significative qu'elle induisait la production de cytokines favorisant la réponse Th1 [à savoir les interleukines IL-12, IL- 6, le facteur α de nécrose des tumeurs « TNF tumour necrosis factor α »] sans augmenter la production d'IL-10 (connue pour son rôle actif dans la réponse Th2) (10). Cette souche présente donc un grand intérêt dans le traitement de la dermatite atopique. II a été montré par ailleurs que L. rhamnosus GG était efficace dans la prévention de la dermatite atopique (11 et 12) et, à un degré moindre, dans le traitement des jeunes enfants (13-15). Ces études ont été réalisées avec de très jeunes enfants et l'efficacité du traitement pourrait être dû à une colonisation initiale de la microflore intestinale. Cependant, les effets immuno-modulateurs des probiotiques sont aussi observés chez les enfants et les adultes, et pourraient donc être efficaces sur ces groupes d'âge (16). A ce jour, une unique étude a évalué l'utilisation de probiotiques pendant 6 semaines seulement, chez des enfants âgés de 6 mois ou plus (17). Si cette étude permet de mettre en évidence que des probiotiques peuvent permettre de réduire l'inflammation intestinale consécutive à la dermatite atopique, l'efficacité à long terme de l'usage de probiotiques pour traiter la dermatite atopique n'est cependant pas traitée.

Il existe donc un important besoin pour une association symbiotique d'un prébiotique et d'un probiotique, permettant d'une part d'assurer un bon taux de survie du probiotique et d'autre part de traiter la dermatite atopique.

La présente invention montre l'efficacité du symbiotique (probiotique L rhamnosus et prébiotiques), dans la prévention et le traitement de la dermatite atopique, en particulier chez des enfants de plus de deux ans.

La présente invention concerne tout particulièrement l'utilisation de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35 (probiotique) associée à du lactose (notamment en association avec un milieu à base de lactose), dans le traitement de la dermatite atopique. Par traitement de la dermatite atopique, on comprend traitement curatif et/ou

préventif. L'invention met également en lumière l'importance du lactose dans le traitement de la dermatite atopique.

La souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est une souche dérivée de l'espèce Lactobacillus rhamnosus (aussi nommée Lactobacillus casei subsp. rhamnosus), cette dernière étant déposée à l'ATCC sous le numéro ATCC 7469. La souche particulière Lactobacillus rhamnosus Lcr35 peut être obtenue selon le protocole défini dans l'exemple 1.

La présente invention concerne l'utilisation d'un produit comprenant une bactérie Lactobacillus rhamnosus en association avec du lactose dans le traitement de la dermatite atopique. De préférence, la bactérie Lactobacillus rhamnosus est dans un milieu à base de lactose. L'utilisation est de préférence pour la fabrication d'un médicament, d'un complément alimentaire, etc., pour traiter un patient atteint de dermatite atopique ou pour la prévention d'une telle affection. Le traitement ou la prévention, au sens de la présente invention, comprend la réduction du risque allergique et l'amélioration de l'état de santé du patient.

Le produit selon l'invention est donc une combinaison d'un probiotique (bactérie Lactobacillus rhamnosus) et d'un prébiotique (lactose, et plus spécifiquement milieu à base de lactose). Un tel produit peut donc être dénommé symbiotique. Le lactose est en effet connu pour son activité prébiotique ; il arrive dans l'intestin sous forme non transformée, il constitue alors un aliment pour certaines populations bactériennes de la flore intestinale, ce qui justifie son appellation de prébiotique.

Du fait de l'implication du lactose dans les allergies au lait, l'utilisation de ce dernier comme prébiotique par les présents inventeurs est particulièrement originale. De préférence, la bactérie considérée, entrant dans la composition du produit, est capable de fermenter le lactose.

En effet, les inventeurs ont constaté que le taux de survie du probiotique était très largement augmenté lorsque ledit probiotique était associé avec un élément nécessaire à sa croissance. Ainsi, dans un produit selon l'invention, sont présents le probiotique capable de fermenter le lactose ainsi que, notamment, du lactose, nécessaire à la survie du probiotique.

Selon un aspect particulièrement préféré de la présente invention, ladite bactérie est la bactérie Lactobacillus rhamnosus Lcr35. En effet, la souche L rhamnosus Lcr35 a la capacité de fermenter le lactose alors que la souche L. rhamnosus GG par exemple ne peut le faire. Un symbiotique tel que défini dans la présente invention peut bien entendu contenir au moins deux, voire plusieurs, probiotiques différents. Il peut s'agir d'une bactérie

Lactobacillus rhamnosus avec une bactérie d'un autre genre, ou bien il peut s'agir d'au moins une ou plusieurs bactéries du genre Lactohacillus, d'espèces différentes. Le produit symbiotique tel que décrit comprend de préférence la bactérie vivante. Par vivante, il faut comprendre que l'intégrité de la cellule est conservée et que les processus cellulaires se produisent ou peuvent se produire si la bactérie est cultivée dans un milieu et des conditions adéquates. Toute bactérie vivante peut être de nouveau ensemencée sur un milieu de culture adéquat et se multiplier, dans des conditions adéquates. La présente invention comprend donc notamment l'utilisation de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 sous forme lyophilisée ou sous forme congelée.

Un produit selon l'invention est considéré comme un symbiotique. En effet, la bactérie est un probiotique alors que le milieu à base notamment de lactose est un prébiotique. Par médicament ou préparation alimentaire ou complément alimentaire, etc., il faut entendre toute forme acceptable sur le plan pharmacologique, notamment sous forme de préparation pour nourrisson, de produit destinés aux enfants en bas âge, d'aliment diététique et de régime, d'aliment diététique de complémentation orale, de produit d'hygiène, de denrée alimentaire ou diététique à fins médicales particulières (ou spéciales), ou dispositif médical, ou toute autre forme adaptée bien connue de l'homme du métier. Le produit est de préférence sous une forme galénique adaptée à l'administration orale, par exemple sous forme de suspension buvable ou de gélule. Il peut également se présenter sous forme de poudre ou granule à ajouter aux aliments ou à une boisson, ou bien à sucer.

Par dermatite atopique, il faut entendre toutes les affections diagnostiquées comme étant des dermatites atopiques ou eczéma atopique, ainsi que les affections atopiques dont les symptômes sont essentiellement identiques et qui reçoivent par ailleurs des traitements identiques.

Le patient traité recevant le produit tel que décrit est de préférence un être humain, de préférence un enfant. Par enfant, on entend toute personne âgée de moins de 18 ans, de préférence moins de 15 ans ou moins de 12 ans. Le patient est de préférence un enfant de plus de 1 an, tout particulièrement un enfant âgé d'au moins deux ans.

Alternativement, le patient considéré peut être un ^nammifère autre que l'homme, par exemple un singe, un chien, un chat ou un lapin.

Une classe préférée de patients pour une utilisation selon la présente invention est les enfants ayant entre 2 et 12 ans. Une autre population de patients susceptibles de recevoir un produit selon la présente invention est constituée de sujets qui présentent des allergies au lactose, notamment

des allergies au lait de vache. De préférence les allergies considérées sont des allergies bénignes ou modérées au lactose.

Par traitement de la dermatite atopique, on entend notamment toute action visant à supprimer ou à réduire les symptômes de la dermatite atopique, ainsi que toute action préventive tendant à empêcher, retarder ou ralentir leur apparition.

La durée du traitement est à définir en fonction de l'évolution de la dermatite atopique, elle est de préférence supérieure à 2 semaines. Elle peut être de 3 mois ou plus, notamment au moins 6 mois ou une année. Il peut s'avérer approprié de poursuivre le traitement sur plusieurs années, par exemple sur 2, 5 ou 8 années, en particulier dans le cas d'une application préventive.

De préférence, dans le traitement ou la prévention de la dermatite atopique, le produit selon l'invention est administré au moins une fois par semaine, de préférence au moins une fois par jour. Dans le cadre de la présente invention, une posologie préférée est de trois fois par jour. Le produit selon l'invention peut se présenter sous toute forme appropriée. Des formes appropriées sont bien connues de l'homme du métier. Elles doivent notamment permettre d'assurer la survie du probiotique. En effet, si le probiotique n'est pas vivant au moment de l'ingestion, les effets bénéfiques du symbiotique sont absents. Il est très important de tenir compte de trois facteurs essentiels qui sont l'atmosphère, l'humidité et la température. Les différents moyens de conservation des probiotiques sont bien connus de l'homme du métier.

De préférence, le produit est sous forme lyophilisée. En effet, cette forme assure non seulement une excellente conservation, mais elle permet également de préserver toute bactérie vivante faisant partie du produit selon l'invention. Il est important de déterminer le dénombrement du probiotique lors de l'obtention d'un produit lyophilisé selon l'invention.

La bactérie contenue dans le produit peut être le seul élément lyophilisé, mais de préférence, la bactérie est lyophilisée avec le produit contenant le milieu à base notamment de lactose. Le produit peut bien sûr comprendre des constituants additionnels, en sus de la bactérie et du milieu à base entre autres de lactose. De tels constituants sont ou bien ajoutés avant lyophilisation des autres composants, ou bien après (cas par exemple des excipients permettant la mise en forme galénique du produit). Le milieu à base de lactose est un milieu contenant au moins 5% en masse de lactose, de préférence au moins 20%.

Ledit milieu est de préférence stérile, avant ensemencement avec le probiotique.

De préférence, un tel milieu est un milieu de culture (de fermentation) contenant donc d'autres substances. Le milieu est de préférence un milieu essentiellement constitué de lait, par exemple de lait écrémé.

Le milieu à base de lactose contient avantageusement également de l'amidon de pomme de terre. Il peut contenir également de la dextrine maltose. Tout autre composé ou excipient pharmacologiquement acceptable peut également entrer dans la composition d'un milieu à base de lactose comme défini.

Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, le milieu à base de lactose correspond à un milieu de culture compatible avec la fermentation du lactose par la bactérie probiotique comprise dans le produit selon l'invention. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la bactérie est cultivée sur un milieu de culture, qui est éventuellement complémenté par la suite pour former un produit selon l'invention, c'est-à-dire un symbiotique (combinaison d'un probiotique et d'un prébiotique). Une telle situation est étayée par un exemple dans la partie expérimentale de la présente demande (voir exemple 1).

Il est particulièrement avantageux que le milieu à base de lactose soit issu du milieu de culture du probiotique. Ainsi, en vue de l'obtention du produit, il est inutile de changer le probiotique de milieu. Ceci évite un trop grand nombre d'étapes de centrifugation ; en effet, lors des centrifugations, les parois cellulaires des micro-organismes peuvent être endommagées, ce qui nuit à leur survie. Ainsi, en évitant de changer le probiotique de milieu et en réduisant ainsi le nombre de centrifugations, on assure un meilleur taux de survie au probiotique. De préférence, le probiotique utilisé n'est pas ensemencé ou cultivé sur du MRS. Du fait que le prébiotique correspond à un milieu de culture adapté pour le probiotique (bactérie), lorsque le produit selon l'invention est ingéré (et notamment quand il se présente sous forme lyophilisée et qu'il est remis en suspension avant l'ingestion), la bactérie se trouve immédiatement dans un milieu compatible avec sa survie. Un taux de survie augmenté des probiotiques serait ainsi obtenu. De préférence, la bactérie a été cultivée pendant au moins 4 heures, au moins 12h, de préférence entre 24 et 48 heures, voire plus, par exemple environ 72 heures, sur un milieu de culture à base notamment de lactose qui est ensuite éventuellement complémenté pour former le produit selon l'invention.

L'invention repose en effet sur les effets obtenus par le symbiotique, c'est-à-dire par le combinaison d'un probiotique (la bactérie de l'espèce Lactobacillus rhamnosus) et d'un prébiotique (le lactose, de préférence sous forme de milieu à base de lactose). Les effets obtenus sont encore plus avantageux quand la bactérie a été cultivée sur le

milieu à base en autres de lactose. En effet, dans ces conditions, le milieu contient également des métabolites résultant de cette culture. Or certains de ces métabolites ont des propriétés antimicrobiennes particulièrement avantageuses (31). L'association de ces composés (probiotique, prébiotiques et métabolites) contribue à l'effet bénéfique sur la dermatite atopique.

Dans un produit selon la présente invention, le nombre de bactéries ou germes par gramme de produit est de préférence compris entre 1x10 ⁸ et 1x10 ¹⁰ . Avant une éventuelle lyophilisation du produit symbiotique selon l'invention, celui-ci est généralement sous forme liquide. Dans une telle situation, pour une utilisation dans le traitement de la dermatite atopique, le produit comprend de préférence une concentration dans le milieu égale ou supérieure à 1x10 ⁸ UFC (unités formant colonie ou germes) par mL

Pour une application dans la prévention ou le traitement de la dermatite atopique, on administre au patient environ entre 1x10 ⁸ et 1x10 ¹⁰ UFC de Lactobacillus rhamnosus par prise. Plusieurs prises peuvent être administrées par jour, par exemple sous forme de 3 prises quotidiennes. Les doses peuvent être ajustées, notamment en fonction de la corpulence du patient à traiter et de son éventuelle réaction au traitement. Comme mentionné dans les paragraphes précédents, une bactérie particulièrement préférée de l'espèce Lactobacillus rhamnosus Céquivalent à Lactobacillus casei subsp. rhamnosus) capable de fermenter le lactose est la souche Lcr35 qui peut être obtenue selon le protocole défini dans l'exemple 1. D'autres protocoles sont bien connus de l'homme du métier.

Dans le choix d'un probiotique pour obtenir un produit selon l'invention, il est essentiel de rechercher une bactérie qui n'ait aucun effet pathogène et qui soit de préférence connue comme ayant de bonnes propriétés en ce qui concerne son taux de survie. Un autre paramètre à prendre en compte est sa résistance aux procédés technologiques. Il peut également être avantageux que le probiotique en question possède des résistances à la plupart des antibiotiques classiques. A l'inverse, il est des situations où le probiotique est de préférence sensible à la majorité des antibiotiques connus. De plus, une souche pour utilisation selon la présente invention doit également présenter la capacité à coloniser la flore intestinale. ¹

La souche spécifique Lactobacillus rhamnosus Lcr35 est particulièrement préférée dans le cadre de la présente invention car elle présente les différents avantages mentionnés ci-dessus. Elle est de plus résistante à la streptomycine, à la tétracycline, à l'érythromycine, à l'acide nalidixique, à l'acide pipémidique, à l'acide fusidique, à la colistine, à la polymyxine, au sulfaméthoxazole et à la triméthoprime.

Les caractères fermentaires de cette souche sont particulièrement avantageux. Alternativement, l'invention concerne également l'utilisation du lactose seul ou en combinaison avec un probiotique, dans le traitement ou la prévention de la dermatite atopique.

Légende des figures :

Figure 1 : génotypage de la souche Lactobacillus rhamnosus Lcr35. Figure 1A : séquence intergénique ADNr 16S-23S ; Figure 1B : ADN ribosomal 16S. Figure 2: représentation des régions séquencées de Lactobacillus rhamnosus Lcr35. Figures 3A et 3B : comparaison des profils métaboliques 50 API CH des souches Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et Lactobacillus GG.

Exemple 1 : Obtention de la souche _; Lactobacillus rhamnosus Lcr35 lyophilisée et conditionnement. Réactivation :

Les germes obtenus dans le commerce (Bacilor® des laboratoire Lyocentre) ou issus de la souchothèque des laboratoires Lyocentre, sont remis en activité en ensemençant avec 100 à 200 mg du produit lyophilisé 10mL de milieu au lait écrémé enrichi (glucose 15g/L, extrait de levure 5g/L). Ce tube est placé dans une étuve à 37°C pendant 72 heures.

1mL de la culture de ce premier tube est introduit dans un second tube contenant 10mL de milieu au lait enrichi stérile, ce tube est placé à l'étuve à 37 ⁰ C, pendant 72 heures. Cette opération est recommencée plusieurs fois de manière à obtenir une population la plus importante possible, supérieure à 1x10 ⁹ germes par mL.

Préparation du pied de cuve :

1mL de cette souche réactivée est introduit dans un ballon contenant 18OmL de lait écrémé enrichi stérilisé puis cultivé à 37 ⁰ C pendant 72 heures, ce pied de cuve sert à ensemencer les ballons.

Milieu de culture : .. , '

Afin de pouvoir disposer d'une culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus (aussi dénommée Lactobacillus rhamnosus) de titre adapté, celle-ci est élaborée simultanément selon 2 procédés de culture différents : - sur milieu simplifié - sur milieu enrichi

6 001979

a) constituants des milieux :

1. Milieu simplifié : lait écrémé en poudre 100g

Eau, qsp 1,000 L

2. Milieu enrichi: lait écrémé en poudre 16,650g

Glucose 4,450g

Sulfate de manganèse 0,028g Citrate de sodium 0,560g

Phosphate monopotassique 1,780g

Phosphate dipotassique 3,560g

Autolysat de levure de bière . 1 ,670g

Eau, qsp 1 ,000 L

b) Préparation et stérilisation des milieux : 1. Milieu simplifié :

formule : lait écrémé en poudre 100g

Eau, qsp 1.000 L

Méthode : Dans un contenant, mettre 200 litres d'eau et ajouter par petites fractions sous agitation lente les 28kg de lait écrémé en poudre. Après complète dispersion, ajuster à 280 L avec de l'eau. Ce lait est réparti en contenants correctement bouchés et stérilisés à l'autoclave pendant 30 minutes à 115°C.

2. Milieu enrichi :

Formule pour un contenant de 2000 litres lait écrémé en poudre 30,00kg

Glucose 8,00kg

Sulfate de manganèse 0,05kg Citrate de sodium 1 ,00kg

Phosphate monopotassique 3,20kg

Phosphate dipotassique 6,40kg

- Autolysat de levure de bière. 3,00kg

Eau, qsp 1800,00 L

Méthode :

Dans un contenant, mettre 1000L d'eau, puis sous agitation rapide, ajouter le lait ; après complète dispersion ajouter le glucose, le sulfate de manganèse, le citrate de sodium, les phosphates mono et dipotassique, et enfin l'autolysat de levure de bière. Après dispersion complète, ajuster à 1800 litres par de l'eau. Ensuite, toujours sous agitation, stériliser ce milieu à 115 ⁰ C pendant 30 minutes puis refroidir pour le ramener à 37°C.

Ensemencement et culture a) milieu simplifié : Introduire par contenant de 1 à 2 ml de préculture provenant du pied de cuve, sous une hotte à flux d'air laminaire vertical.

Ensuite ces contenants sont placés pendant 72 heures dans des étuves de bactériologie maintenues à 37 ⁰ C, plus ou moins 2°C.

b) milieu enrichi :

Introduire par contenant de 1800 litres, 2,4 litres de préculture provenant du pied de cuve. Maintenir grâce à un dispositif thermostaté approprié la température à 37°C pendant 48 heures sous agitation lente.

Préparation de la culture pour lyophilisation : a) milieu simplifié : constituants :

- culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus 136, 8 L

- amidon de pomme de terre 35,0 kq

- lactose 15,0 kg

- suspension d'hydroxyde de.calcium q.s. pqύr neutralisation pH=7,0 Méthode de préparation :

Sous hotte à flux d'air laminaire, verser la culture obtenue dans une cuve de 200 litres, agiter fortement pour briser le caillé et ajouter sous agitation rapide l'amidon de pomme de terre et le lactose. Quand leur dispersion est totale, mesurer le pH qui doit être

voisin de 3. Ensuite, avec de l'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange jusqu'à pH=7,O ± 0,1.

b) milieu enrichi constituants :

- culture de Lactobacillus case/ var. rhamnosus 1800,0 L

- amidon de pomme de terre 6,6 kg

- lactose 3,3 kg

- dextrine maltose 6,0 kg - suspension d'hydroxyde de calcium q.s. pour neutralisation pH=7,0

Méthode de préparation :

La culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus est centrifugée en continu dans une centrifugeuse pour éliminer totalement le surnageant. Le culot est récupéré sous hotte à flux d'air laminaire, il est mélangé sous agitation rapide avec les excipients de lyophilisation. Ensuite, à l'aide d'hydroxyde de calcium, neutraliser ce mélange jusqu'à pH=7,0 ± 0,1.

Lyophilisation Les préparations de culture de Lactobacillus casei var. rhamnosus pour lyophilisation sont réparties aseptiquement dans des plateaux en acier inoxydable.

Congeler rapidement à -40 ⁰ C, ensuite effectuer la sublimation à -22 ⁰ C. Quand le produit a dépassé le seuil de 0 ⁰ C, réaliser un étuvage à +37 ⁰ C.

Selon les préparations mises en œuvre, les quantités obtenues de produit sec lyophilisé sont environ les suivantes :

Broyage, mélange, conditionnement a) broyage

Dans une pièce à atmosphère déshumidifiée (H. R. inférieure à 50% et filtrée (filtration 99,999)), la culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus est récupérée, broyée et tamisée sur calibreur de type oscillant équipé d'une grille de 60 MESH, un échantillon est prélevé pour dénombrement des lactobacilles. Le produit est conservé dans des containers hermétiquement clos.

Après titrage des Lactobacillus case/ var. rhamnosus vivants, les produits sont homogénéisés afin d'obtenir une matière première de titre désiré.

b) mélange Afin d'obtenir des lots de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus de 200 à 225 kg dont le titre est compris entre 1x10 ⁹ et 1x10 ¹⁰ germes par gramme, un mélange est effectué dans un mélangeur doux selon la méthode suivante :

-Q. S. de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus sur milieu simplifié. -Q. S. de culture lyophilisée de Lactobacillus casei var. rhamnosus sur milieu enrichi, de telle sorte que le poids du mélange final soit compris entre 200 et 225 kg d'une poudre dont le titre est compris entre 1x10 ⁹ et 1x10 ¹⁰ germes par gramme.

c) conditionnement Après mélange, des échantillons sont prélevés pour contrôles. Le reste du mélange est conditionné en fonction de la demande en containers adaptés hermétiquement clos. Puis cette poudre est mise en forme galénique.

Exemple 2 : Etude de l'effet sur la dermatite atopique d'un produit à base de LCR35 Les objectifs de cette étude sont d'une part, l'étude de l'efficacité du Lactobacillus casei variété rhamnosus en association avec un prébiotique dans le traitement de la dermatite atopique modérée à sévère de l'enfant, d'autre part, l'évaluation des effets indésirables et la tolérance clinique de ce traitement.

Type d'étude :

Etude prospective contrôlée en double aveugle versus placebo. Etude de phase 2.

Connaissances actuelles 1) La dermatite atopique

La dermatite atopique est une dermatose fréquente (prévalence estimée entre 10 et 25% dans les pays occidentaux) (2, 3). Son évolution est chronique avec amélioration fréquente à l'adolescence. Les formes modérées et sévères, de par la chronicité des lésions prurigineuses, inesthétiques et nécessitant des soins locaux quotidiens, ont un retentissement psychologique important, peuvent altérer la relation parents / enfant et retentissent sur la qualité de vie de l'enfant et sa famille.

1o

Le traitement de fond repose sur l'application régulière d'émollients, associée à des règles hygiéno-diététiques. Les poussées nécessitent l'application de corticoïdes ou d'immunosuppresseurs sous forme topique.

La pathogénie de la derrήatite atopique repose sur une dysrégulation de l'immunité à médiation cellulaire avec déséquilibre du rapport Th1/Th2 au profit d'une réponse de type Th2. Il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement commercialisé permettant de corriger cette dysrégulation immunitaire.

2) Les probiotiques

Les probiotiques sont des microbes commensaux du tube digestif ayant potentiellement des propriétés anti-allergiques en favorisant une réponse de type Th 1

(8-9). Ils sont utilisés depuis près de 40 ans dans le traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée de l'enfant et de l'adulte. Cependant tous les probiotiques n'ont apparemment pas les mêmes propriétés. Dans une étude sur les cellules dendritiques de souris le Lactobacillus casei apparaît comme le probiotique induisant à faible concentration la production majoritaire d'interleukines favorisant la réponse Th1 (IL12,

IL6, TNFαj sans augmenter la production d'ILIO (principale interleukine de la réponse

Th2) (10).

Les probiotiques ont déjà démontré leur efficacité en prévention primaire de la maladie atopique (11) et sur une courte série dans le traitement de la dermatite atopique du nourrisson (13). Ces études interviennent à un âge très précoce et l'efficacité de ce traitement est possiblement due à la colonisation initiale de la microflore intestinale.

Cependant les effets immunomodulateurs des probiotiques s'observent aussi chez le grand enfant et l'adulte: ils pourraient donc également être efficaces dans ces tranches d'âge (16). Enfin ces traitements s'avèrent particulièrement sûrs puisque seuls quelques rares cas d'endocardites et de septicémies ont été décrits chez des sujets gravement immunodéprimés.

L'utilisation notamment de la souche LCR35 comme source de L casei offre de multiples avantages.

- Cette souche est commercialisée depuis 1967 (sous le nom d'Antibiophilus® puis de Bacilor® visa 01/12/1959, AMM 29/03/1974) dans le traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée. , -

- Sa tolérance est excellente. Aucun effet indésirable n'a été relevé en France ou à l'étranger.

- Il contient du Lactobacillus casei variété rhamnosus (aussi appelé Lactobacillus rhamnosus) qui semble être aujourd'hui un probiotique prometteur dans le traitement et la prévention des manifestations atopiques.

Matériels et méthodes 1 ) Critères d'inclusion

L'étude a été réalisée sur une période de 17 mois. Les patients, des enfants âgés de 2 à 12 ans présentant une dermatite atopique modérée à sévère, ont été inclus dans cette étude après obtention du consentement écrit des parents et également des enfants en âge de comprendre. Le diagnostic de la dermatite atopique a été réalisé selon les critères standardisés (18). Seuls les patients présentant un SCORAD supérieur à 15 ont été inclus dans l'étude.

2) Critères de non inclusion

Les patients présentant une immunodépression connue (congénitale ou acquise) ainsi que ceux qui prenaient ou avaient pris un traitement pouvant induire une immunodépression générale (corticoïdes par voie générale ou médicament immunosuppresseur) dans les trois mois précédents, n'ont pas été inclus dans l'étude.

3) Conditions de réalisation du double aveugle

Les enfants ont été répartis par tirage au sort en 2 groupes.

Le premier a reçu le symbiotique (contenant du Lactobacillus casei variété rhamnosus sous la forme du Bacilor®) ; le second a reçu uniquement le prébiotique (sans Lactobacillus casei variété rhamnosus).

La randomisation a été réalisée avant le début de l'étude, selon la sévérité de la dermatite atopique (SCORAD < OU > 40) et selon la saison (hiver, printemps, été, automne).

Les sachets contenant les probiotiques (+prébiotiques + métabolites) ne peuvent être différenciés ni par le patient, ni par le médecin, des sachets ne contenant que le prébiotique.

4) Modalités d'administration

Le symbiotique comprenant le Lactobacillus casei variété rhamnosus est administré par voie orale sous forme de sachets de Bacilor® (produit par les laboratoires

Lyocentre, à Aurillac, France) à 1 ,5g. Chaque dose de 1,5g est conservée dans des sachets d'aluminium, étanches à l'air. Les doses de symbiotique contiennent environ

1 ,2x10 ⁹ unités formant colonie (ou germes) de L rhamnosus Lcr35 + une préparation d'un prébiotique spécifique et des métabolites sécrétés par la bactérie. La préparation prébiotique est dérivée du milieu de fermentation de L rhamnosus

Lcr35, et contient du lait écrémé en poudre (en moyenne 0,344g- 33% de protéine

bovine, 52% de lactose), de l'amidon de pomme de terre (en moyenne 0,759g) et du lactose (en moyenne 0,397g).

Les doses de préparation de symbiotiques et de prébiotiques ont été données sous forme de poudre pour suspension buvable, trois fois par jour, durant 3 mois. Il a été 5 demandé aux patients de dissoudre la préparation dans de l'eau ou tout autre liquide froid de leur convenance. Aucun des patients n'a modifié son régime alimentaire durant la période de l'étude.

Durant la période de l'étude, les traitements habituels des patients pour la dermatite atopique sont restés inchangés ; tous les patients appliquaient des émollients et o presque tous utilisaient des dermocorticoïdes ou des immunosuppresseurs locaux. Les traitements topiques étaient notés ainsi que toutes les autres prises médicamenteuses qu'elles soient régulières ou occasionnelles. La consommation de dermocorticoïdes et d'immunosuppresseurs locaux a été évaluée quantitativement par estimation en poids des tubes utilisés, à chaque visite. 5

5) Critères d'évaluation de l'efficacité du traitement

Ni le patient, ni ses parents, ni le dermatologue investigateur ne connaissaient le traitement administré au patient.

Des évaluations cliniques ont été réalisées avant le début du traitement, à un mois 0 (M1), à deux (M2) et trois mois (M3). Chaque patient a été examiné par le même dermatologue à chaque visite.

L'évolution de la symptomatologie et de l'efficacité du traitement sont quantifiées par un score global de gravité: le SCORAD (pour SCORing Atopic Dermatitis) développé le εuropean Task Force for Atopic Dermatitis' (19). Ce score strictement clinique 5 constitue la référence dans l'évaluation des traitements de la dermatite atopique.

Le score dénommé SCORAD combine l'évaluation clinique de l'intensité et de l'étendue des symptômes avec un score subjectif lié au prurit et à l'insomnie indiqué par le patient, ses parents ou bien les deux, sur une échelle visuelle. Le SCROAD objectif se situe entre 0 et 83. Quand on ajoute le prurit et l'insomnie, le score peut 0 alors être compris entre 0 et 103.

Lors de la visite initiale, les patients sont classés ,dans un groupe modéré (SCORAD entre 16 et 39) ou sévère (SCORAD supérieur à 40). A chaque visite, le SCORAD objectif et le SCORAD total sont calculés. L'IGA (Investigator's Global Assessment ou Evaluation Globale de l'Investigateur, une échelle à 6 niveaux incluant les catégories 5 suivantes : 0, rien ; 1 , presque rien ; 2, léger ; 3, modéré ; 4, sévère ; 5, très sévère) a aussi été évalué à chaque visite. Le nombre de poussées et l'utilisation de

Ib

dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux durant le mois précédent ont également été notés ainsi que les possibles effets secondaires. Lors de la dernière visite, l'opinion des patients et/ou celle des parents sur l'efficacité du traitement (aggravation, inchangé, amélioration) ainsi que sur la tolérance ont été notés. Enfin, les parents ont été joints 6-12 mois après la fin de l'étude pour déterminer s'ils ont observé une rechute de la maladie après l'arrêt du traitement.

6) Surveillance des effets secondaires

La surveillance est exclusivement clinique. Elle est mensuelle.

7) Analyse statistique

Le nombre de patients nécessaires, pour mettre en évidence une différence de scorad de 15 points entre les deux groupes, avec un écart-type de 16, un risque de première espèce (alpha) de 5%, une puissance de 80% et un pourcentage maximal de patients exclus au cours de l'essai clinique de 20%, a été donc de 22 personnes par groupes. Les différences potentielles liées au sexe, à d'autres maladies atopiques et à l'utilisation des traitements topiques entre les deux groupes ont été analysés à l'aide du test du χ ₂ (ou par le test exact de Fisher, selon le cas). Le taux de base (qui est le taux au départ de l'étude avant toute intervention) pour l'âge, les nombres de poussées par mois, l'utilisation de traitements topiques, le SCORAD (total) et le SCORAD objectif ont été comparés pour les deux groupes à l'aide du test t (ou du test de Kruskal-Wallis pour les données non-paramétriques).

A la fin de la période d'étude, les changements dans le SCORAD et dans le SCORAD objectif, par référence au taux de base, dans chaque groupe de traitement, ont été analysés à l'aide du test t de Student apparié; le SCORAD objectif et le SCORAD entre les deux groupes à M3 ont été comparés à l'aide du test t pour des échantillons indépendants. Cette analyse a également été effectuée dans le sous-groupe des patients présentant d'autres manifestations atopiques. Seuls ceux ayant achevé l'étude (résultat primaire et SCORAD disponible à M3) ont été inclus dans ces analyses. Cependant, les analyses ont été répétées sur la totalité de la population de l'étude, après avoir remplacé les SCORAD manquants à M3 par la moyenne des SCORAD dans chaque groupe de traitement, sur la base des données disponibles à M3. Les résultats des patients de chaque groupe ayant obtenu une baisse du SCORAD supérieure ou égale à 50%, ou supérieure ou égale à 90% par rapport au taux de base à M3, ont également été analysés à l'aide du test exact de Fisher. Les scores IGA ont été analysés de manière similaire en utilisant les tests de Wilcoxon et Mann-Whitney.

Enfin, le nombre total de poussées et les quantités de traitements topiques utilisés durant la période de l'étude ont également été comparés entre les deux groupes et ce pour le mois précédant l'étude et pour le dernier mois de l'étude (test de Kruskal-Wallis et test de Friedman pour les échantillons appariés). Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel SPPS pour Windows.

Résultats :

Etude de la population :

Parmi les 48 patients inclus dans l'étude, neuf (groupe symbiotique, n=7; groupe prébiotique, n=2; P=O, 13) ont été exclus de l'étude. Les raisons de ces exclusions sont la non présentation des patients aux consultations prévues, (groupe symbiotique, n=5; groupe prébiotique, n=2) ou le retrait du consentement éclairé (groupe symbiotique, n=2). Trente-neuf patients (moyenne d'jâge 5,82 ans, moyenne de SCORAD =39,7) ont mené cette étude jusqu'à son terme. Les caractéristiques de la population de l'étude sont indiquées dans le tableau 1. Aucune différence statistique n'a été mise en évidence entre les deux groupes sur la base de l'âge, de la présence d'autres manifestations atopiques, du nombre de poussées mensuelles, de -l'utilisation de dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux et sur le SCORAD objectif et le SCORAD. Le taux de base pour le SCORAD objectif est de 29,1 (groupe symbiotique = 28,7 contre groupe prébiotique = 29,4), et la moyenne de référence du SCORAD est de 39,2 (groupe symbiotique = 39,1 contre groupe prébiotique = 39,3).

Effets cliniques

L'évolution du SCORAD objectif et du SCORAD dans les deux groupes est indiquée respectivement dans les tableaux 2 et 3. Dans le groupe symbiotique, le SCORAD moyen était de 39,1 avant le traitement (n=24) contre 20,7 après trois mois de traitement (n=17 ; P<0,0001 , sur la base de 17 observations complètes). Dans le groupe prébiotique, le SCORAD moyen était de 39,3 avant le traitement (n=24) contre 24,0 après trois mois (n=22 ; P<0,0001). La différence entre les deux groupes de traitement est nette mais faible d'un point de vue statistique tant au niveau du SCORAD objectif 'qu'au niveau du SCORAD après 3 mois de traitement (P=0,418 et P=0,535, respectivement). Ces résultats sont compatibles avec ceux obtenus dans les analyses réalisées en remplaçant les valeurs manquantes pour le SCORAD et le SCORAD objectif à M3. Comme la réponse au traitement était plus prononcée chez les patients allergiques comparés aux patients non allergiques dans la première étude réalisée chez des

enfants de plus de un an (17), les inventeurs ont également analysé les résultats en tenant compte de la présence, ou non, d'autres manifestations atopiques. Vingt-cinq patients présentaient d'autres manifestations atopiques (13 dans le groupe prébiotique et 12 dans le groupe symbiotique). Au taux de base, le SCORAD était de 41 ,7 ± 11 ,4 dans le groupe prébiotique contre 49,6 ± 16,8 dans le groupe symbiotique (P=O, 181). Les deux groupes ont montré une baisse importante de leurs SCORAD après trois mois de traitement ; la différence observée entre les deux groupes n'atteint toutefois pas la significativité statistique. L'évolution des scores IGA est similaire à celle des SCORAD. Dans le groupe recevant des symbiotiques, le score IGA moyen était de 3,33 (intervalle de confiance :2,97-3,70) avant traitement (n=24) contre 2,41 (IC : 1 ,75-3,07) après trois mois de traitement (n=17 ; P=O, 002, sur la base de 17 observations complètes).

Dans le groupe recevant des prébiotiques, le score IGA moyen était de 3,42 (intervalle de confiance :3,20-3,63) avant traitement (n=24) contre 2,73 (IC : 2,31-3,14) après trois mois de traitement (n=22 ; P=0,006).

Utilisation de médicaments topiques :

Les traitements topiques utilisés par les patients ont été classés en trois groupes : les dermocorticoïdes (n=34) ; les pommades ayant comme principe actif un inhibiteur de la calcineurine (n=11) et les émollients (n=3). La pommade de tacrolimus 0,03% est le seul produit utilisé dans le groupe des inhibiteurs de la calcineurine. En comparant la consommation des tubes de pommade pendant toute la période de l'étude au sein de chacun des deux groupes (prébiotiques et symbiotiques), aucune différence statistique n'a été observée (P=0,966). Des résultats similaires ont été obtenus en comparant l'utilisation durant le dernier mois de l'étude (P=O, 919). Dans les deux groupes, l'utilisation de dermocorticoïdes ou de pommades ayant comme principe actif un inhibiteur de la calcineurine (tacrolimus) durant le mois précédant l'étude était plus élevée que durant le mois M3 (prébiotique, P=O, 005 ; symbiotique, P=O, 07).

Tolérance au traitement :

Le traitement a été bien toléré dans les deux groupes. Aucun effet secondaire sérieux

I n'a été observé ; seuls trois épisodes de douleurs abdominales modérées ont été notés_ deux dans le groupe recevant le symbiotique et un dans le groupe recevant le prébiotique.

Tableau 1 : caractéristiques de la population sous étude (totale et dans chaque groupe)

Total Symbiotique Prébiotique Valeur p

Nombre de patients 48 (100.0) 24(100.0) 24(100.0)

Age [années, moyenne (plage)] 5.85(2-12) 5.38(2-11) 6.33(2-12) NS

Autres maladies atopiques 25 (52) 12(50) 13 (54) NS

Asthme 17 (68) 9(75) 8(62) NS

Rhinite allergique 19 (76) 8(67) 11 (85) NS

Conjonctivite allergique 11 (44) 5(42) 6(46) NS

Poussées [mois ; moyenne (plage)] 7.5 (0-30) 8.83 (0-30) 6.13(1-30) NS

Traitements

Dermocorticoïdes 34(71) 16(67) 18 (75)

Classe 2 29 (60) 15 (63) 14 (58) co

Classe 3 5(11) 1 (4) 4(17)

Tacrolimus 0,003% 11 (23) 6(25) 5(21)

Emollients seuls 3(6) 2(8) 1(4)

Utilisation mensuelte.[g; moyenne (plage)] 1.29(0-5) 1.25(0-4) 1.32(0-5) NS

Taux base SCORAD objectif [médiane (EIQ)] 29.0(19.9-37.4) 28.7(16.1-36.6) 29.0(21.6-37.7) NS

SCORAD au-dessus du taux de base [médiane 39.7 (27.6-46.2) 39.7(26.5-46.1) 39.2(30.6-48.1) NS

(EIQ)]

Les valeurs données sont n (%) sauf indication contraire.

SCORAD= SCORing Atopic Dermatitis ; EIQ = écart interquartile.

Tableau 2 : évolution du SCORAD objectif

SCORAD objectif Taux de base (n=24) 1 mois (n=20) 2 mois (n=17) 3 mois (n=17)

Groupe symbiotique Moyenne (95% IC) 29 (22.9-34.5) 26 (20.2-32.1) 19 (13.0-25.4) 16 (8.9-23.8) Médiane (EIQ) 29 (16.1-36.6) 28 (15.7-37.2) 22 (7.5-25.7) 8 (7.2-32.2) n = 24 /7 = 23 n = 22 n = 22

Groupe prébiotique Moyenne (95% IC) 29 (25.3-33.6) 25 (18.5-31.1) 21 (16.0-25.2) 20 (14.2-25.7) Médiane (EIQ) 29 (21.6-37.7) 19 (14.5-38.0) 19 (13.5-27.4) 17 (10.1-30.2)

SCORAD= SCORing Atopic Dermatitis ; EIQ = écart interquartile ; IC = intervalle de confiance

o

Tableau 3 : évolution du SCORAD

SCORAD Taux de base (n=24) 1 mois (n=20) 2 mois (n=17) 3 mois (n=17)

Groupe symbiotique. Moyenne (95% IC) 39 (31.9-46.4) 35 (28.5-42.5) 26 (18.1-34.0) 21 (11.7-29.8) Médiane (EIQ) 40 (26.5-46.1) 37 (23.2-48.6) 30 (11.5-35.5) 14 (8.0-39.5)

/7 = 24 /7 =23 n= 22 /7 = 22

Groupe prébiotique Moyenne (95% IC) 39 (34.7-43.9) 32 (24.6-39.2) 26 (20.8-31.6) 24 (17.3-30.7) Médiane (EIQ) 39 (30.6-48.1) 26 (19.0-46.5) 26 (18.4-32.5) 21 (13.4-36.4)

SCORAD= SCORing Atopic Dermatitis ; EIQ = écart interquartile ; IC = intervalle de confiance

Suivi :

Tous les enfants pour lesquels une amélioration de la dermatite atopique a été observée durant le traitement, sauf deux, ont subi une rechute de la maladie, ou tout au moins une détérioration de l'état de la peau dans les 2 à 4 mois après la fin du traitement (soit par le symbiotique soit par le prébiotique).

Discussion :

Une amélioration de la dermatite atopique à la fin de l'étude a été observée dans les deux groupes de patients (groupes recevant un prébiotique et groupe recevant un symbiotique), avec un niveau de satisfaction élevé. L'amélioration dans le groupe des patients recevant le symbiotique, d'un point de vue statistique, n'apparaît que peu supérieure au groupe de patients recevant le prébiotique.

Chaque souche bactérienne probiotique a des propriétés spécifiques et une capacité à proliférer et survivre dans le tube digestif. La souche L rhamnosus LCR35 utilisée dans la présente étude possède de nombreuses propriétés intéressantes. Elle présente 96% d'homologie avec L rhamnosus GG par comparaison des séquences 16S-23S. Cette séquence signature pour la souche L rhamnosus LCR35 est donnée dans la figure 1. De plus, la souche L. rhamnosus Lcr35 a la capacité de fermenter le lactose alors que la souche L. rhamnosus GG ne peut le faire. Enfin, des études précédentes ont démontré la capacité de L rhamnosus Lcr35 à effectuer une colonisation à long terme de la muqueuse intestinale après son administration par voie orale (20). L'évaluation de l'efficacité de symbiotiques dans le traitement de la dermatite atopique est intéressante car l'association à des prébiotiques adéquats peut améliorer le taux de survie de souches de probiotiques suite à l'ingestion (21).

Les inventeurs ont donc fait l'hypothèse que la combinaison prébiotiques-probiotiques pourrait donner de meilleurs résultats dans le traitement de la dermatite atopique par rapport à des probiotiques seuls. Des résultats récents montrent que le lactose et l'amidon de pomme de terre peuvent être considérés comme des prébiotiques (22, 23). Cependant, l'utilisation d'une préparation spécifique de prébiotique (comme décrite plus haut) repose sur sa capacité à améliorer la prolifération et la survie de la souche L. rhamnosus Lcr35 in vitro.

De manière intéressante, comme la préparation de prébiotique utilisée est le milieu de fermentation de L. rhamnosus Lcr35, le traitement symbiotique est composé du milieu de culture contenant les prébiotiques, du probiotique mais en plus des métabolites sécrétés par ce probiotique. Ces métabolites peuvent être définis comme des

eubiotiques. La combinaison (probiotique, prébiotique, eubiotique) est présente dans le produit Bacilor® commercialisé par les laboratoires Lyocentre. Son efficacité dans le traitement symptomatique d'appoint de la diarrhée est reconnue et le produit est commercialisé pour cette indication thérapeutique. La durée de l'étude a été fixée à 3 mois afin de bénéficier d'une période suffisante pour évaluer les effets du traitement tout en limitant la probabilité d'une interférence avec une variation spontanée d'intensité de la maladie.

Le traitement de la dermatite atopique des enfants âgés de deux ans et plus par des symbiotiques [prébiotiques+ la souche de L rhamnosus Lcr35 (1,2x10 ⁹ unités formant colonie, trois fois par jour)] a une efficacité supérieure au traitement composé uniquement de prébiotiques, bien que la différence soit peu prononcée. Ceci est démontré à la fois par l'évolution du SCORAD au cours de l'étude mais également par l'évaluation subjective des patients concernant l'efficacité du traitement. Bien que la sévérité et l'importance des lésions soient restées constantes, le traitement avec les symbiotiques semble avoir fait diminuer le nombre de poussées et l'utilisation de médicaments topiques. La différence statistique pour ces deux paramètres reste cependant faible.

En fait, il a bien été observé une diminution plus importante du SCORAD moyen dans le groupe symbiotique (20,5 contre 15,6), mais cette différence est dans les limites de la significativité d'un point de vue statistique.

A ce jour, aucune étude n'a évalué l'efficacité de symbiotiques et de prébiotiques dans le traitement de la dermatite atopique, ou dans toute autre maladie atopique. Cependant, il a récemment été démontré chez des patients en bonne santé que les prébiotiques et les probiotiques (versus placebo), pouvaient diminuer de manière significative la génération et l'accumulation de produits de fermentation potentiellement toxiques (24).

Ainsi, des prébiotiques en eux-mêmes peuvent avoir un impact important sur la flore intestinale et peuvent aussi induire des changements immunologiques. Bien que des études supplémentaires soient nécessaires, les données préliminaires suggèrent que la consommation de prébiotiques peut avoir une influence sur des paramètres liés à l'immunité à médiation cellulaire etdonc modifier, Ie rapport Th1/Th2 (25, 26). Ainsi, des prébiotiques spécifiques peuvent agir sur la flore intestinale pour induire une immunomodulation susceptible d'être bénéfique à la diminution des manifestations de la dermatite atopique. Bien que les présents résultats démontrent l'importance des prébiotiques (spécialement en combinaison avec des probiotiques pour former des symbiotiques),

d'autres facteurs éventuels, autres que les traitements, ont toutefois été recherchés pour expliquer l'amélioration de l'état des patients.

L'effet des saisons peut être éliminé parce que l'inclusion des patients s'est déroulée tout au long de l'année, et la randomisation a été réalisée en tenant compte des saisons. Cependant, la fréquence des visites ainsi que l'inclusion dans un essai clinique avec l'espoir de voir sa maladie améliorée, a pu jouer un rôle psychologique favorable pour les patients comme pour leur famille.

L'absence de comparaison avec un réel placebo (les prébiotiques ne pouvant être considérés comme un placebo) ne permet pas de conclure définitivement ; cependant, quelque soit l'impact psychologique d'un placebo, il ne permet pas en général d'induire une amélioration du SCORAD de plus de 5 points (13, 17, 27-29). Or, dans la présente étude, les traitements avec le prébiotique et avec le symbiotique (et les métabolites) ont tous les deux permis d'obtenir une baisse du SCORAD de plus de 15 points (15,6 et 20,5 points respectivement). De plus, cette amélioration ne peut pas être liée à une augmentation de la consommation de dermocorticoïdes ou d'immunosuppresseurs locaux. Au contraire, l'utilisation de ces substances a très nettement baissé à la fin de la présente étude. Enfin, la rechute de la maladie observée dans les 2 à 4 mois après l'arrêt du traitement pour quasiment tous les patients, suggère aussi que l'amélioration n'était pas due à un hasard ou à une évolution spontanée de la dermatite atopique. Toutes ces données confirment l'efficacité des prébiotiques, et surtout des symbiotiques, dans le traitement de la dermatite atopique (DA).

Les présents résultats vont dans le même sens que l'amélioration clinique observée dans d'autres études qui ont évalué l'utilisation de probiotiques (mais non de symbiotiques) dans le traitement de la DA. Bien qu'un effet important ait été observé dans la première des études évaluant l'efficacité de probiotiques chez des enfants de moins de deux ans (13), l'amélioration observée dans la seconde étude, dans laquelle les enfants étaient âgés d'au moins un an, était nettement moins significative (17). La différence d'efficacité entre ces études (13 et17) pourrait s'expliquer par les critères d'inclusions (« très spécifiques ») des patients de l'étude (13) qui étaient : - des patients âgés de moins de deux ans, avec une allergie prouvée au lait de vache.

L'amélioration observée dans le SCORAD pour la présente étude avec à la fois des prébiotiques et des symbiotiques semble être supérieure à celle observée dans l'étude menée par Rosenfeldt (17). Cette différence pourrait s'expliquer par la différence dans la durée du traitement [6 semaines dans l'étude de Rosenfeldt (17) contre 3 mois dans

^

la présente étude]. Mais il est très probable que l'utilisation d'une association probjotiques/prébiotiques/métabolites joue également un rôle important dans la différence observée. L'étude de Rosenfeldt a en effet été réalisée avec uniquement un probiotique. Cependant, il est à noter que très peu de données sont disponibles concernant le rôle respectif des probiotiques, prébiotiques, symbiotiques et métabolites dans la modulation du système immunitaire. Une étude récente suggère que les probiotiques et les prébiotiques pourraient agir via des mécanismes différents (30). Deux études en double aveugle avec placebo ont été rapportées récemment, toutes les deux réalisées avec des probiotiques pour traiter des enfants atteints de DA et âgés de moins de 28 mois.

Dans la première, Lactobacillus GG, un mélange de quatre souches de probiotiques, et un placebo ont été donnés aux patients atteints de la DA suspectés d'être allergiques au lait de vache, pendant 4 semaines (14). Aucune différence n'a été montrée entre les groupes de traitement, immédiatement ou après 4 semaines de traitement, mais dans un sous-groupe [enfants sensibles à Plmmunoglobuline E (IgE)], le groupe Lactobacillus a montré une réduction statistiquement supérieure du .SCORAD par rapport au groupe placebo. Dans la seconde étude, L. fermentum et un placebo ont été administrés pendant 8 semaines (15). La réduction du SCORAD durant la période a été significative dans le groupe de probiotique mais non dans le groupe placebo.

Il faut noter que dans ces deux études, une réduction du SCORAD pour le groupe placebo a été observée (-20 et -10 points selon l'étude). L'observation plus précise des placebos utilisés pourrait apporter une explication à l'effet inhabituel du placebo dans le traitement de la DA. En effet, de la cellulose et de la maltodextrine ont été utilisés respectivement dans l'étude de Weston et al (15) et Viljanen et al (14). Les substances choisies pour le placebo sont toutes les deux des substances qui peuvent être considérées comme des prébiotiques. Ainsi, les résultats obtenus avec de tels 'placebos' dans ces études pourraient être similaires à ceux obtenus dans le groupe prébiotique de la présente étude. Ces résultats mettent aussi en lumière l'importance du choix d'un vrai placebo (et non un composé avec des propriétés prébiotiques) lors de la réalisation d'essais cliniques sur le DA avec des prébiotiques, probiotiques ou des symbiotiques. En conclusion, un composé symbiotique (L rhamnosus Lcr35 plus un prébiotique) est capable d'améliorer les manifestations de la dermatite atopique chez des enfants âgés de deux ans ou plus. L'importance de l'amélioration observée dans cette étude

souligne l'intérêt des prébiotiques et des symbiotiques dans le traitement de la dermatite atopique.

Exemple 3 : Séquence signature de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 L'identification a été réalisée par PCR puis séquençage du gène des ARN ribosomaux 16S et de la partie intergénique 16-23S. Le séquençage est un séquençage double brin (procédé LI-COR), suivi d'un alignement avec des séquences d'autres souches. Les résultats et la stratégie sont présentés dans les figures 1 et 2.

Résultats de l'analyse de la séquence de la partie 16S

Position : 16S

Longueur : 1320 paires de bases

Ambiguïté de lecture < 5%

Résultats de l'analyse de la séquence de la partie 16-23S

Position : 16-23S Longueur : 483 paires de bases Ambiguïté de lecture < 5%

La souche analysée appartient à la sous espèce Lactobacillus casei subsp rhamnosus. Le séquençage de la presque totalité du gène ribosomal 16S ne permet pas de différencier Lactobacillus casei subsp casei de Lactobacillus casei subsp rhamnosus aussi dénommé Lactobacillus rhamnosus.

La séquence signature de Lactobacillus casei subsp rhamnosus se situe dans la partie intergénique 16-23S.

Exemple 4 : Comparatif entre le profil API de Lactobacillus rhamnosus Lcr35 et celui de Lactobacillus GG.

Les figures 3A et 3B présentent le profil métabolique API 50 CH des souches Lactobacillus rhamnosus LCR35 et Lactobacillus GG, pour des temps de 24 et 48 heures.

Le profil API 50 CH est une galerie " Recherche " permettant d'étudier le métabolisme de 49 sucres et adaptée à :

- l'identification des Bacillus avec le milieu API 50 CHB, en 48 heures environ,

- l'identification des Lactobacillus avec le milieu API 50 CHL, en 48 heures, - l'identification et le biotypage des entérobactéries avec le milieu API 50 CHE en 48 heures,

- toute autre application " recherche " d'étude du métabolisme des sucres. L'identification API (R) est bien connue de l'homme du métier.

II apparaît nettement que les deux souches Lactobacillus rhamnosus LCR35 et Lactobacillus GG n'ont pas exactement le même profil, notamment pour du lactose. Une différence de comportement in vitro vis-à-vis du métabolisme des sucres sous entend une différence de comportement in vivo.

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