「タマビジン」は、担子菌タモギタケ由� ��のビオチン結合性タンパク質であり、タマ� ��ジン1およびタマビジン2の2種類がある(WO 02 /072817を参照)。本発明者らは、鋭意研究の結� ��、タマビジン2は、ビオチンに対して、従来 のアビジン、ストレプトアビジンと同様に、 非常に高い親和性を有していることを明らか にした。即ち、タマビジン2とビオチンは、� �くの抗原抗体反応のおよそ1000倍の強さの親� ��性を有していることを明らかにした。また� ��従来のアビジンにおいて問題となっている� ��非特異結合性(DNAに対する)が、殆どないこ� �を実証した。さらに、タマビジン2は、スト� ��プトアビジンよりも10℃以上耐熱性が強い� �とを見出し、この性質はタマビジン2を固体� ��体に結合させた後も、維持されることを発� ��した。さらに本発明者らは、鋭意研究の結� ��、タマビジン1はビオチンに強く結合し、さ らにストレプトアビジンよりも5℃耐熱性が� �いことを見出した。これらの研究の結果、� �発明者らは高温条件においてもビオチン結� �活性を保持する、耐熱性ビオチン結合性タ� �パク質を連結させた固体担体を提供するこ� �が可能であることを見いだし、本発明に想� �した。よって、本発明は、耐熱性ビオチン� �合性タンパク質を連結させた固体担体、お� �びその使用、ならびに、耐熱性ビオチン結� �性タンパク質を用いる、ビオチンと連結し� �物質の精製、濃縮、検出、および捕捉方法� �提供する。

 以下、本発明を詳細に説明する。

  耐熱性ビオチン結合性タンパク質 を連結させた固体担体
 本発明は、耐熱性ビオチン結合性タンパク� ��を連結させた固体担体を提供する。

 本明細書において、耐熱性ビオチン結合� ��タンパク質は、タマビジン1、タマビジン2� �またはそれらの変異体を意味する。具体的� �は、本発明の固体担体に連結させる耐熱性� �オチン結合性タンパク質は、配列番号2もし� ��は配列番号4のアミノ酸配列を含んでなるタ ンパク質、または、配列番号1もしくは配列� �号3の塩基配列を含んでなる核酸によってコ� ��ドされるタンパク質、であってよい。ある� ��は、本発明の固体担体に連結させる耐熱性� ��オチン結合性タンパク質は、配列番号2もし くは配列番号4のアミノ酸配列を含んでなる� �ンパク質、または、配列番号1もしくは配列� ��号3の塩基配列を含んでなる核酸によってコ ードされるタンパク質、の変異体であって、 タマビジン1または2と同様のビオチン結合活� ��および耐熱性を有するタンパク質であって� ��い。本明細書において、タマビジン1、タマ ビジン2、およびそれらの変異体を総称して� �単にタマビジンと呼ぶことがある。

 タマビジン1または2の変異体は、配列番� �2または4のアミノ酸配列において、1または� �数のアミノ酸の欠失、置換、挿入および/ま� ��は付加を含むアミノ酸配列を含んでなるタ� ��パク質であって、タマビジン1または2と同� �のビオチン結合活性および耐熱性を有する� �ンパク質であってもよい。置換は、保存的� �換であってもよく、これは、特定のアミノ� �残基を類似の物理化学的特徴を有する残基� �置き換えることである。保存的置換の非限� �的な例には、Ile、Val、LeuまたはAla相互の置� �のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の� �換、LysおよびArg、GluおよびAsp、GlnおよびAsn� �互の置換のような極性残基の間での置換な� �が含まれる。

 アミノ酸の欠失、置換、挿入および/また は付加による変異体は、野生型タンパク質を コードするDNAに、例えば周知技術である部位 特異的変異誘発(例えば、Nucleic Acid Research,  Vol.10, No. 20, p.6487-6500, 1982参照、引用によ� �その全体を本明細書に援用する)を施すこと� ��より作成することができる。本明細書にお� ��て、「1または複数のアミノ酸」とは、部位 特異的変異誘発法により欠失、置換、挿入お よび/または付加できる程度のアミノ酸を意� �する。また、本明細書において「1または複� ��のアミノ酸」とは、場合により、1または数 個のアミノ酸を意味してもよい。

 部位特異的変異誘発法は、例えば、所望� ��変異である特定の不一致の他は、変異を受� ��るべき一本鎖ファージDNAに相補的な合成オ� ��ゴヌクレオチドプライマーを用いて次のよ� ��に行うことができる。即ち、プライマーと� ��て上記合成オリゴヌクレオチドを用いてフ� ��ージに相補的な鎖を合成させ、得られた二� ��鎖DNAで宿主細胞を形質転換する。形質転換� ��れた細菌の培養物を寒天にプレーティング� ��、ファージを含有する単一細胞からプラー� ��を形成させる。そうすると、理論的には50%� ��新コロニーが一本鎖として変異を有するフ� ��ージを含有し、残りの50%が元の配列を有す� ��。上記所望の変異を有するDNAと完全に一致� ��るものとはハイブリダイズするが、元の鎖� ��有するものとはハイブリダイズしない温度� ��おいて、得られたプラークをキナーゼ処理� ��より標識した合成プローブとハイブリダイ� ��させる。次に該プローブとハイブリダイズ� ��るプラークを拾い、培養してDNAを回収する� ��

 なお、生物活性ペプチドのアミノ酸配列� ��その活性を保持しつつ1または複数のアミノ 酸の欠失、置換、挿入および/または付加を� �す方法としては、上記の部位特異的変異誘� �の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法� �および遺伝子を選択的に開裂し、次に選択� �れたヌクレオチドを除去、置換、挿入また� �付加し、次いで連結する方法もある。

 タマビジン1または2の変異体はさらに、� �列番号2または4のアミノ酸配列と少なくとも 60%以上、好ましくは65%以上、70%以上、75%以上 、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、98%以上 または99%以上、より好ましくは99.3%以上のア� ��ノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含んで� ��るタンパク質であって、タマビジン1または 2と同様のビオチン結合活性および耐熱性を� �するタンパク質であってもよい。

 2つのアミノ酸配列の同一性%は、視覚的� �査および数学的計算によって決定してもよ� �。あるいは、2つのタンパク質配列の同一性� ��ーセントは、Needleman, S. B. 及びWunsch, C. D . (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970)のアルゴリズ ムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝 学コンピューターグループ(UWGCG)より入手可� �なGAPコンピュータープログラムを用い配列� �報を比較することにより、決定してもよい� �GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメ� �ターには:(1)Henikoff, S. 及びHenikoff, J. G. (Pr oc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919, 1992)に� �載されるような、スコアリング・マトリッ� �ス、blosum62;(2)12のギャップ加重;(3)4のギャッ� ��長加重;及び(4)末端ギャップに対するペナル ティなし、が含まれる。

 当業者に用いられる、配列比較の他のプ� ��グラムもまた、用いてもよい。同一性のパ� ��セントは、例えばAltschulら(Nucl. Acids. Res.,  25, p.3389-3402, 1997)に記載されているBLASTプロ� ��ラムを用いて配列情報と比較し決定するこ� ��が可能である。当該プログラムは、インタ� ��ネット上でNational Center for Biotechnology Infor mation(NCBI)、あるいはDNA Data Bank of Japan(DDBJ)� ��ウェブサイトから利用することが可能であ� ��。BLASTプログラムによる同一性検索の各種� �件(パラメーター)は同サイトに詳しく記載さ れており、一部の設定を適宜変更することが 可能であるが、検索は通常デフォルト値を用 いて行う。または、2つのアミノ酸配列の同� �性%は、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver. 7(ゼネティックス製)などのプログラム、また は、FASTAアルゴリズムなどを用いて決定して� ��よい。その際、検索はデフォルト値を用い� ��よい。

 2つの核酸配列の同一性%は、視覚的検査� �数学的計算により決定可能であるか、また� �より好ましくは、この比較はコンピュータ� �プログラムを使用して配列情報を比較する� �とによってなされる。代表的な、好ましい� �ンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピ� �ータ・グループ(GCG;ウィスコンシン州マディ ソン)のウィスコンシン・パッケージ、バー� �ョン10.0プログラム「GAP」である(Devereux, et  al., 1984, Nucl. Acids Res., 12: 387)。この「GAP� �プログラムの使用により、2つの核酸配列の� ��較の他に、2つのアミノ酸配列の比較、核酸 配列とアミノ酸配列との比較を行うことがで きる。ここで、「GAP」プログラムの好ましい デフォルトパラメーターには:(1)ヌクレオチ� �についての(同一物について1、および非同一 物について0の値を含む)一元(unary)比較マトリ ックスのGCG実行と、SchwartzおよびDayhoff監修「 ポリペプチドの配列および構造のアトラス(At las of Polypeptide Sequence and Structure)」国立バ� ��オ医学研究財団、353-358頁、1979により記載� �れるような、GribskovおよびBurgess, Nucl. Acids  Res., 14: 6745, 1986の加重アミノ酸比較マトリ� ��クス;または他の比較可能な比較マトリック ス;(2)アミノ酸の各ギャップについて30のペナ ルティと各ギャップ中の各記号について追加 の1のペナルティ;またはヌクレオチド配列の� ��ギャップについて50のペナルティと各ギャ� �プ中の各記号について追加の3のペナルティ; (3)エンドギャップへのノーペナルティ:およ� �(4)長いギャップへは最大ペナルティなし、� �含まれる。当業者により使用される他の配� �比較プログラムでは、例えば、米国国立医� �ライブラリーのウェブサイト:http://www.ncbi.nlm .nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能 なBLASTNプログラム、バージョン2.2.7、またはU W-BLAST2.0アルゴリズムが使用可能である。UW-BL AST2.0についての標準的なデフォルトパラメー ターの設定は、以下のインターネットサイト :http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに� ��BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア 付けマトリックスを使用し、使用可能である 選択パラメーターは以下の通りである:(A)低� �組成複雑性を有するクエリー配列のセグメ� �ト(WoottonおよびFederhenのSEGプログラム(Computers  and Chemistry, 1993)により決定される;Woottonお� ��びFederhen, 1996「配列データベースにおける� ��成編重領域の解析(Analysis of compositionally bi ased regions in sequence databases)」Methods Enzymol.,  266: 544-71も参照されたい)、または、短周期 性の内部リピートからなるセグメント(Claverie およびStates(Computers and Chemistry, 1993)のXNUプ� �グラムにより決定される)をマスクするため� ��フィルターを含むこと、および(B)データベ� ��ス配列に対する適合を報告するための統計� ��的有意性の閾値、またはE-スコア(Karlinおよ� ��Altschul, 1990)の統計学的モデルにしたがって 、単に偶然により見出される適合の期待確率 ;ある適合に起因する統計学的有意差がE-スコ ア閾値より大きい場合、この適合は報告され ない);好ましいE-スコア閾値の数値は0.5であ� �か、または好ましさが増える順に、0.25、0.1� ��0.05、0.01、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-2 0、1e-25、1e-30、1e-40、1e-50、1e-75、または1e-100� ��ある。

 タマビジン1または2の変異体はまた、配� �番号1または3の塩基配列の相補鎖にストリン ジェントな条件でハイブリダイズする塩基配 列を含んでなる核酸によってコードされるタ ンパク質であって、タマビジン1または2と同� ��のビオチン結合活性および耐熱性を有する� ��ンパク質であってもよい。

 ここで、「ストリンジェントな条件下」� ��は、中程度または高程度にストリンジェン� ��な条件においてハイブリダイズすることを� ��味する。具体的には、中程度にストリンジ� ��ントな条件は、例えば、DNAの長さに基づき� ��一般の技術を有する当業者によって、容易� ��決定することが可能である。基本的な条件� ��、Sambrookら,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版,第6-7章,Cold Spring Harbor Laboratory Press,  2001に示され、そしてニトロセルロースフィ� �ターに関し、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)� �前洗浄溶液、約40-50℃での、約50%ホルムアミ ド、2×SSC-6×SSC(または約42℃での約50%ホルム� �ミド中の、スターク溶液(Stark's solution)など� ��他の同様のハイブリダイゼーション溶液)の ハイブリダイゼーション条件、および例えば 、約40℃-60℃、0.5-6×SSC、0.1% SDSの洗浄条件の 使用が含まれる。好ましくは中程度にストリ ンジェントな条件は、約50℃、6×SSCのハイブ� ��ダイゼーション条件(及び洗浄条件)を含む� �高ストリンジェントな条件もまた、例えばDN Aの長さに基づき、当業者によって、容易に� �定することが可能である。

 一般に、こうした条件は、中程度にストリ� ��ジェントな条件よりも高い温度および/また は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション(� �えば、約65℃、6×SSCないし0.2×SSC、好ましく� ��6×SSC、より好ましくは2×SSC、最も好ましく� ��0.2×SSCのハイブリダイゼーション)および/ま たは洗浄を含み、例えば上記のようなハイブ リダイゼーション条件、およびおよそ65℃-68� ��、0.2×SSC、0.1% SDSの洗浄を伴うと定義され� �。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩� �液では、SSC(1×SSCは、0.15M NaClおよび15mM ク� �ン酸ナトリウムである)にSSPE(1×SSPEは、0.15M  NaCl、10mM NaH ₂ PO ₄ 、および1.25mM EDTA、pH7.4である)を代用するこ とが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーシ ョンが完了した後で15分間行う。

 また、プローブに放射性物質を使用しな� ��市販のハイブリダイゼーションキットを使� ��することもできる。具体的には、ECL direct  labeling & detection system(Amersham社製)を使用� ��たハイブリダイゼーション等が挙げられる� ��ストリンジェントなハイブリダイゼーショ� ��としては、例えば、キット中のhybridization b ufferにBlocking試薬を5%(w/v)、NaClを0.5Mになるよ� �に加え、42℃で4時間行い、洗浄は、0.4% SDS� �0.5xSSC中で、55℃で20分を二回、2xSSC中で室温� ��5分を一回行う、という条件が挙げられる。

 タマビジン1または2の変異体のビオチン� �合活性および耐熱性は、公知の手法のいず� �かにより測定することが可能である。例え� �、Kadaら(Biochim. Biophys. Acta., 1427: 44-48 (1999) )に記載されるように蛍光ビオチンを用いる� �法により測定してもよい。この方法は、ビ� �チン結合タンパク質のビオチン結合サイト� �蛍光ビオチンが結合すると、蛍光ビオチン� �蛍光強度が消失する性質を利用したアッセ� �系である。あるいは、表面プラズモン共鳴� �原理としたバイオセンサーなど、タンパク� �とビオチンの結合を測定することが可能な� �ンサーを用いて、変異体タンパク質のビオ� �ン結合活性を評価することもできる。耐熱� �は、上記のビオチン結合活性を評価する際� �、測定温度を変化させて測定することで評� �することができる。

 本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビオ� ��ン結合性タンパク質は、ビオチンに対して� ��い親和性を有しており、その解離定数K _d は10 ^-8  Mのオーダー以下、好ましくは10 ^-9  Mのオーダー以下、10 ^-10  Mのオーダー以下、10 ^-11  Mのオーダー以下、10 ^-12  Mのオーダー以下、10 ^-13  Mのオーダー以下である。典型的には、その 解離定数K _d は10 ^-13 ~10 ^-9  Mのオーダーであってよい。

 本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビ� ��チン結合性タンパク質は、公知の卵白由来� ��アビジンやストレプトアビジンと比較して� ��い耐熱性を有する。ここで、耐熱性とは、� ��温域でのタンパク質安定性および高温域に� ��けるビオチン結合活性の双方をいう。

 高温域でのタンパク質安定性は、SDS-PAGE� �析においてタンパク質バンドの発色が室温� �場合と比較して50%消失する温度として評価� �ることができる。本発明の固体担体に連結� �せる耐熱性ビオチン結合性タンパク質につ� �て、SDS-PAGE分析においてタンパク質バンドの 発色が室温の場合と比較して50%消失する温度 は、71℃より高く、好ましくは75℃以上、77.5� ��以上、80℃以上、82.5℃以上、85℃以上、87℃ 以上、であってよい。

 高温域におけるビオチン結合活性は、ビ� ��チンの結合が室温の場合と比較して50%減少� ��る温度として評価することができる。本発� ��の固体担体に連結させる耐熱性タンパク質� ��ついて、ビオチンの結合が室温の場合と比� ��して50%減少する温度は、73℃より高く、好� �しくは75℃以上、78℃以上、80℃以上、82.5℃� ��上、85℃以上、であってよい。

 本発明の固体担体に連結させる耐熱性ビ� ��チン結合性タンパク質は、担子菌由来のタ� ��パク質を精製することにより、または組換� ��タンパク質として得ることができる。

 本発明において、耐熱性ビオチン結合性� ��ンパク質を連結させる固体担体は、固体ま� ��は不溶性材料(例えば、濾過、沈殿、磁性分 離などにより反応混合物から分離することが できる材料)である担体であれば特に限定さ� �ない。

 固体担体を構成する材料は、セルロース、� ��フロン ^TM 、ニトロセルロース、アガロース、デキスト ラン、キトサン、ポリスチレン、ポリアクリ ルアミド、ポリエステル、ポリカーボネート 、ポリアミド、ポリプロピレン、ナイロン、 ポリジビニリデンジフルオライド、ラテック ス、シリカ、ガラス、ガラス繊維、金、白金 、銀、銅、鉄、ステンレススチール、フェラ イト、シリコンウエハ、ポリエチレン、ポリ エチレンイミン、ポリ乳酸、樹脂、多糖類、 タンパク(アルブミン等)、炭素またはそれら� ��組合せ、などを含むがこれらに限定されな� ��。

 固体担体の形状は、ビーズ、磁性ビーズ� ��薄膜、微細管、フィルター、プレート、マ� ��クロプレート、カーボンナノチューブ、セ� ��サーチップなどを含むがこれらに限定され� ��い。薄膜やプレートなどの平坦な固体担体� ��、当該技術分野で知られているように、ピ� ��ト、溝、フィルター底部などを設けてもよ� ��。

 本発明の一態様において、磁性ビーズは� ��約25nm~約1mmの範囲の球体直径を有しうる。� �ましい態様では、磁性ビーズは約50nm~約10μm� ��範囲の直径を有する。磁性ビーズのサイズ� ��特定の適用に応じて選択されうる。いくら� ��の細菌スポアは約1μmのオーダーのサイズを 有するので、かかるスポアを捕捉するための 好ましいビーズは1μmよりも大きい直径を有� �る。

 本発明の一態様において、セファロース� ��どの高架橋球形アガロースからなるビーズ� ��、約24μm~約165μmの範囲の直径を有しうる。� ��ましい態様では、高架橋球形アガロースビ� ��ズは約24μm~約44μmの範囲の直径を有する。� �架橋球形アガロースビーズのサイズは特定� �適用に応じて選択されうる。

 疎水性表面を有する固体担体の例には、P olysciences, Warrington, PA または Spherotech, Liber ville, IL から市販されているものなどのポリ スチレンラテックスビーズが挙げられる。

 シリカ(SiO ₂ )-処理またはシリカ(SiO ₂ )ベースの固体担体の例には、Polysciences, Warri ngton, PAから入手可能な、超常磁性シリカビ� �ズ等が挙げられ、これは、核酸(例えばDNA)を 捕捉するために使用されうる。あるいは、Dyn al Biotechから市販されているM-280等も使用さ� �うる。

 親水性表面を有する磁性ビーズは、増殖� ��の細菌細胞、核酸および他の成分を捕捉す� ��ために使用されうる。かかる磁性ビーズの� ��としては、Biomag(登録商標)カルボキシルの� �称でPolysciences, Warrington, PAから市販されて� �るビーズまたはBangs Laboratory, Inc., Fishers, I N の名称MC02N/2928を有するビーズが挙げられ� �。あるいは、Dynal Biotechから市販されている M-270等が使用されうる。

 耐熱性ビオチン結合性タンパク質と固体� ��体の連結は、当業者に公知のタンパク質と� ��体担体のカップリング法を用いて行うこと� ��できる。例えば、固体担体表面をカルボキ� ��ル基が露出するよう修飾し、当該カルボキ� ��ル基とタンパク質のアミノ基を、架橋試薬� ��ある1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)� ��ルボジイミド(EDC)の存在下でカップリング� �応させることにより、タンパク質と固体担� �を連結することができる。または、例えば� �固体担体表面のカルボキシル基がN-ヒドロキ シスクシンイミド(NHS)により活性エステル化� ��れた固体担体とタンパク質とを一級アミノ� ��を含まないpH6.5~9の緩衝液中で混和すること により、固体担体表面のカルボキシル基とタ ンパク質のアミノ基を結びつけることができ る。

 あるいは、架橋試薬BS3(ビス[スルホスク� �ンイミジル]スベレート) やDSS(ジスクシンイ ミジルスベレート)を用いて、固体担体表面� �アミノ基とタンパク質のアミノ基を、ある� �は架橋試薬SPDP(N-スクシンイミジル 3-[2-ピリ ジルジチオ]プロピオネート)やGMBS(N-(4-マレイ ミドブチリルオキシ)スクシンイミド)を用い� ��、固体担体表面のアミノ基とタンパク質の� ��オール基を結びつけることができる。

 本発明の固体担体に連結される耐熱性ビ� ��チン結合性タンパク質は、高温域でのタン� ��ク質安定性およびビオチン結合性を保持す� ��。このため、本発明の固体担体は、従来最� ��使用されていたストレプトアビジンよりも� ��い温度で、ビオチン結合能を保持したまま� ��理することができる。本発明の固体担体は� ��70℃ないし90℃、好ましくは75℃ないし90℃� �80℃ないし90℃、85℃ないし90℃、70℃ないし8 5℃、70℃ないし80℃、75℃ないし80℃、75℃な� ��し85℃、75℃ないし87.5℃、の加熱条件下に� �露する処理を受けた場合にも、ビオチン結� �能を保持したまま使用することができる。� �のことは、例えば、より高い温度での核酸� �イブリッド形成やその後の洗浄を行うこと� �できる、即ち、より高いストリンジェンシ� �でのハイブリダイゼーションが可能となる� �とを意味する。本発明の固体担体の使用に� �り、非特異的なハイブリッド形成を極力抑� �することが可能なアッセイ系を構築するこ� �が可能である。あるいは、例えば、固体担� �にタマビジンを連結させる際に、高温の処� �が必須の方法を選択することも可能となる� �さらには、タマビジンに耐熱性タンパク、� �素、または蛍光色素などを結合させる際、� �るいは結合後ビオチン修飾物と反応させる� �に、高温を用いて、より特異的な反応をさ� �ることも可能である。

 また、本発明の固体担体に連結する耐熱� ��ビオチン結合性タンパク質は、DNAに対する� ��特異結合がほとんどないため、当該技術分� ��に公知の卵白由来のアビジンにおいて問題� ��なっているDNAに対する非特異結合性の問題� ��回避することもできる。

  耐熱性ビオチン結合性タンパク質 を用いた、ビオチンと連結した物質の分離、 濃縮、精製、検出および/または捕捉方法
 本発明は、ビオチンと連結した物質の分離� ��濃縮、捕捉、精製、および/または検出方法 であって、以下の工程:
 1)本発明のタマビジンを連結した固体担体� �、ビオチンと連結した物質を接触させて、� �該固体担体にビオチンと連結した物質を結� �させ;
 2)当該固体担体に結合しなかった夾雑物を� �浄し;そして
 3)当該固体担体に結合したビオチンと連結� �た物質を回収することにより当該物質を分� �、濃縮、捕捉もしくは精製し、および/また� ��、当該物質を検出する;
を含んでなる、前記方法を提供する。好まし い態様において、本発明の方法における上述 した工程の少なくとも1つは70℃ないし90℃の� ��熱条件下で行う、より好ましくは、75℃な� �し90℃、80℃ないし90℃、85℃ないし90℃、70� �ないし85℃、70℃ないし80℃、75℃ないし80℃� ��75℃ないし85℃、75℃ないし87.5℃、の加熱条 件下で行うことを含む。

 本発明の方法において、ビオチンと連結� ��た物質とは、ビオチンと直接的または間接� ��に連結した物質の双方をいう。ビオチンと� ��質の直接的な連結は、共有結合による連結� ��よって達成される。ビオチンと物質の間接� ��な連結は、ビオチンと共有結合により連結� ��たリガンドに対して、さらに物質が、共有� ��合、イオン結合、水素結合、または疎水性� ��互作用により連結することによって達成さ� ��る。間接的な連結の具体的な例には、ビオ� ��ン化抗体を用いる場合の抗原抗体反応によ� ��抗原分子の連結や、ビオチン化核酸プロー� ��を用いる場合の核酸のハイブリダイゼーシ� ��ンによる相補的な核酸の連結などが挙げら� ��る。

 好ましい態様において、本発明の方法に� ��ける少なくとも1つの工程は70℃ないし90℃� �加熱条件下で行われるので、ビオチンと物� �の間接的な連結は、本発明の方法において� �用する温度条件下において連結が保持され� �ことが好ましい。例えば、ビオチンと物質� �間接的な連結として核酸のハイブリダイゼ� �ションを用いる場合は、ハイブリダイズす� �ヌクレオチドの長さは、少なくとも20ヌクレ オチド以上、好ましくは、少なくとも25ヌク� ��オチド以上、30ヌクレオチド以上、35ヌクレ オチド以上、40ヌクレオチド以上、50ヌクレ� �チド以上、100ヌクレオチド以上、であって� �い。

 本発明の方法において使用するタマビジ� ��を連結された固体担体を構成する材質およ� ��その形状は、分離、濃縮、精製、検出およ� ��/または捕捉したい物質の特性に応じて選択 されうる。

 また、本発明の方法の各工程に用いる、� ��衝液の組成、適用する温度などは、分離し� ��い物質の性質等を考慮して、当業者が適宜� ��定することができる。本発明の方法により� ��離、濃縮、捕捉、および/または精製した物 質の検出方法は、当該物質の性質に応じて、 当業者が適宜選択することができる。

 本発明の方法は、これらに限定されるわ� ��ではないが、例えば、核酸の検出(特開2003-1 25800)、サンプルから核酸を単離するための装 置および方法(ボートリンら、WO2004/005553)、核 酸増幅法:ハイブリダイゼーションシグナル� �幅法(HSAM)(ザンら、WO1998/004745)、あるいはウ� �ルスやウイルスゲノムの濃縮等(玉造, 2004,  BIO INDUSTRY, 21(8): 39-47)に倣った方法であって よい。あるいは、細胞や微生物の検出・捕捉 ・濃縮に用いることもできる。

 例えば、体液中のウイルスを濃縮する場� ��、まず、検体を適当な緩衝液中で、ウイル� ��表層抗原に特異的に結合する抗体をビオチ� ��化したものとインキュベートする。抗体の� ��オチン化は例えばPierce等から市販されてい� ��キットを用いて行うことができる。次に、� ��発明のタマビジンを連結した固体担体、例� ��ば磁性ビーズ、を加え、混合する。最後に� ��石を用いて、ウイルス-抗体-ビオチン-タマ� ��ジン-磁性ビーズの複合体を凝集させ、上清 を除去し、適当な緩衝液で数回の洗浄を行っ た後、磁石をはずし、所望の緩衝液に懸濁し 、ウイルスの濃縮を完了する。

 あるいは、体液中のウイルスゲノムDNAを� ��縮する場合、まず検体を、ウイルス粒子を� ��壊する適当な溶液中に入れ、ウイルスから� ��ノムDNAを抽出せしめる。さらに必要であれ� ��、このゲノムを一本鎖化するステップを入� ��る。続いて、ウイルスゲノムの一部分に相� ��的な数十ないし数百塩基の一本鎖オリゴDNA� ��ビオチン化したもの、あるいはウイルスゲ� ��ムの一部分に相補的な鎖を有する数十ない� ��数百塩基の二本鎖DNAをビオチン化し熱変性� ��せたもの、とインキュベートし、ビオチン� ��オリゴDNAとウイルスゲノムをハイブリダイ� ��ーションさせる。本発明のタマビジンを連� ��した固体担体を用いる場合、従来のアビジ� ��またはストレプトアビジンを連結した固体� ��体を用いる場合よりも高い温度、例えば、7 0℃ないし90℃、好ましくは75℃ないし90℃、80 ℃ないし90℃、85℃ないし90℃、70℃ないし85� �、70℃ないし80℃、または75℃ないし80℃、75� ��ないし85℃、75℃ないし87.5℃、の温度範囲� �適用可能である。ハイブリダイゼーション� �度に上記のような高い温度を適用すること� �より、非特異的なDNAの結合が抑制され、所� �のウイルスゲノム以外のDNAが極力混入しな� �、より特異性の高いウイルスゲノムの濃縮� �可能となる。次に、本発明のタマビジンを� �結した固体担体、例えば磁性ビーズ、を高� �状態のサンプル(ビオチン化オリゴDNAが特異� ��にウイルスゲノムを捕捉している状態)に加 え、混合する。最後に磁石を用いて、ウイル スゲノム-オリゴDNA-ビオチン-タマビジン-磁� �ビーズの複合体を凝集させ、上清を除去し� �適当な緩衝液で数回の洗浄を行った後、磁� �をはずし、所望の緩衝液に懸濁し、ウイル� �ゲノムの濃縮を完了する。この後、ウイル� �ゲノムの検出は、例えばPCR(Saiki et al. (1985)  Science 230: 1350-1354)等を用いて行うことがで きる。タマビジンは、従来のアビジン、スト レプトアビジンよりも、ビオチン非存在下に おける耐熱性が高く、しかもDNAに対する非特 異的な結合がほとんどない。従って、例えば 上記のような方法によるDNAの特異的な濃縮に 好適である。