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Title:
USE OF TRICHOMONACIDAL MOLECULES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/065807
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention relates to new chemical compounds of formula (I) with a structure different from nitroimidazoles, and to equally novel uses thereof for the treatment of trichomoniasis, making said compounds useful for application by means of pharmaceutical compositions. Also, the administration of said compounds does not cause adverse side effects in comparison with compounds widely known in the field, such as metronidazole.

Inventors:
BENITEZ CARDOZA CLAUDIA GUADALUPE (MX)
VIQUE SÁNCHEZ JOSÉ LUIS (MX)
ARROYO VERÁSTEGUI ROSSANA (MX)
ORTEGA LÓPEZ JAIME (MX)
BRIEBA DE CASTRO LUIS GABRIEL (MX)
ROJO DOMÍNGUEZ ARTURO (MX)
GARCÍA GUTIERREZ PONCIANO (MX)
Application Number:
PCT/IB2016/056001
Publication Date:
April 12, 2018
Filing Date:
October 07, 2016
Export Citation:
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Assignee:
INST POLITECNICO NACIONAL (MX)
CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITECNICO NAC (MX)
UNIV AUTONOMA METROPOLITANA (MX)
International Classes:
C07D311/56; A61K31/352
Foreign References:
CN104529986A2015-04-22
Other References:
E FIGUEROA-ANGULO ET AL.: "Cellular and biochemical characterization of two closely related triosaphosphate isomerases from Trichomonas vaginalis", PARASITOLOGY, vol. 139, 2012, pages 1729 - 1738
J LI ET AL.: "Synthesis of biscoumarin and dihydropyran derivatives and evaluation of their antibacterial activity", MOLECULES, vol. 20, no. 9, 2015, pages 17469 - 17482, XP055476818
S MURATOVIC ET AL.: "Synthesis of biscoumarin derivatives as antimicrobial agents", ASIAN JOURNAL OF PHARMACEUTICAL AND CLINICAL RESEARCH 2013, vol. 6, no. 3, 2013, pages 131 - 134, XP055476831
N HAMDI ET AL.: "Synthesis, structure, antimicrobial and antioxidants investigations of dicoumarol and related compounds", EUROPEAN JOURNAL MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 43, no. 11, 2008, pages 2541 - 2548, XP025571386
Attorney, Agent or Firm:
CARREÑO SÁNCHEZ, Luis Antonio (MX)
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Claims:
Reivindicaciones.

1. Un compuesto con actividad tricomonicida, caracterizado porque tiene la estructura de la fórmula I

en donde: R2

R1 se selecciona de:

Rb

donde Ra, Rb, Re, Rd y Re se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical,

R2 se selecciona de:

donde R8 y Rg se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical; y

R3, R4, R5, R6 y R7 se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical.

2. El compuesto de la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto de fórmula I tiene la fórmula específica II:

3. Una composición farmacéutica para el t Oratamiento de la tricomoniasis, caracterizada porque comprende el compuesto de la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. Una composición farmacéutica para el tratamiento de la tricomoniasis, caracterizada porque comprende el compuesto de la reivindicación 2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

5. La composición de la reivindicación 3 o 4, caracterizada porque el compuesto se encuentra en una concentración de 10 a 100 μΜ.

6. La composición de la reivindicación 3 o 4, para usarse en el tratamiento de tricomoniasis.

7. El uso de la composición de la reivindicación 3 o 4, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la tricomoniasis.

8. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, para usarse en el tratamiento de tricomoniasis. 9. El uso del compuesto de la reivindicación 1 o 2, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la tricomoniasis.

10. Un método para el tratamiento de la tricomoniasis, que comprende la administración de la composición de la reivindicación 3 o 4 en un paciente que lo requiera.

1 1. Un método para seleccionar compuestos con actividad tricomonicida, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) Seleccionar compuestos con alto potencial de unión a la proteína triosa fosfato isomerasa de Trichomonas vaginalis y con baja probabilidad de interacción con la triosa fosfato isomerasa de humano, y

b) Seleccionar, a partir de los compuestos seleccionados en la etapa a), aquellos compuestos con efecto inhibitorio en la actividad enzimática de isoformas de la proteína triosa fosfato isomerasa de Trichomonas vaginalis, y con efecto inhibitorio en el crecimiento y viabilidad de Trichomonas vaginalis.

12. El método de la reivindicación 11 , caracterizado porque las isoformas de la proteína triosa fosfato isomerasa se seleccionan de TvTIMI o TvTIM2.

Description:
Uso de moléculas tricomonicidas

Campo de la invención.

La presente invención está relacionada con nuevos compuestos químicos y sus usos igualmente novedosos para el tratamiento de enfermedades parasitarias, más específicamente con nuevos compuestos químicos con estructura diferente a los nitroimidazoles, útiles para el tratamiento de la tricomoniasis y que no causan efectos secundarios adversos por su administración. Antecedentes de la invención.

T. vaginalis es el agente causal de la tricomoniasis, una infección vaginal en la mujer y urogenital en el hombre. Esta infección comprende una gran variedad de síntomas que van desde un estado casi asintomático, hasta inflamación e irritación severa del tejido vaginal, acompañado de prurito y flujo amarillo-verdoso maloliente en la mujer y flujo proveniente de la uretra, así como necesidad de orinar con frecuencia, a menudo con dolor y ardor en el hombre.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó en 2011 más de 230 millones de casos a nivel mundial y en México se calcula que son alrededor de 200,000 casos cada año (OMS, 2013). Esta cifra es aún más alarmante si se considera que al menos el 50% de los casos son asintomáticos y por lo tanto no son detectados ni tratados, favoreciendo así la diseminación de la infección (Mhlongo S, et al. 2010), demostrando la necesidad de campañas de prevención. La tricomoniasis es una infección crónica no mortal, pero con serias consecuencias tales como partos prematuros, infecciones respiratorias en el recién nacido y en adultos inmuno-comprometidos (Catterall, R. D 1972). De igual modo, se ha reportado que la infección por T. vaginalis puede aumentar la predisposición de los individuos a la infección por virus de inmunodeficiencia humana y de papiloma humano (Cameron DW 1990, Mhlongo S, et al. 2010).

El tratamiento de la tricomoniasis ha consistido principalmente en el suministro de derivados de nitroimidazoles, sin embargo, se ha observado ineficacia terapéutica en muchos casos (Carlton S., et a/.2007, DGSP México 2008). Por lo que es necesario proponer nuevos esquemas terapéuticos contra esta enfermedad.

En la presente invención, se utilizó información estructural de una enzima clave del metabolismo del carbono y en el proceso de patogénesis del parásito: la triosa fosfato isomerasa (TIM). Se realizó una búsqueda racional de compuestos que interaccionan con la triosa fosfato isomerasa extracelular de Trichomonas vaginalis. Se encontraron nuevas moléculas tricomonicidas capaces de alterar el crecimiento y viabilidad de cultivos de

i Trichomonas vaginalis. Se determinó además que no presentan efectos mutagénicos, citotóxicos y carcinogénicos y por lo tanto pueden ser usados como tratamiento terapéutico contra la tricomoniasis.

La tricomoniasis se puede propagar de una persona infectada que transmite el parásito a otra persona que no tenga la infección durante las relaciones sexuales. En las mujeres, el área del cuerpo infectada con más frecuencia es la parte baja del aparato genital (la vulva, la vagina o la uretra) y en los hombres la parte interna del pene (uretra). Durante las relaciones sexuales, el parásito por lo general se transmite del pene a la vagina o de la vagina al pene, pero también se puede transmitir de una vagina a otra. No es frecuente que el parásito infecte otras partes del cuerpo, como las manos, la boca o el ano. Las personas infectadas, con o sin síntomas pueden transmitir la infección a otras personas (Workowski KA, Berman S 2010).

Aproximadamente el 70% de las personas infectadas no presentan signos ni síntomas.

Cuando la tricomoniasis causa síntomas, éstos pueden variar entre irritación leve e inflamación grave. Algunas personas presentan los síntomas durante los 5 a 28 días después de haberse infectado, pero otras los presentan mucho más tarde.

Los síntomas en mujeres comprenden flujo espumoso y a menudo con mal olor, manchas de sangre en el flujo, picazón en el área genital, inflamación en la ingle, y necesidad de orinar con frecuencia, a menudo con dolor y ardor, mientras que los síntomas en hombres comprenden flujo proveniente de la uretra, y necesidad de orinar con frecuencia, a menudo con dolor y ardor.

Tener tricomoniasis puede provocar molestias al tener relaciones sexuales y si no se trata, la infección puede durar meses y hasta años. La infección por tricomoniasis puede aumentar el riesgo de partos prematuros en las mujeres y de contraer o propagar otras infecciones de transmisión sexual. Por ejemplo, puede causar inflamación genital que hace más fácil infectarse con el virus del VIH o Virus de papiloma.

Epidemiología.

La OMS ha estimado que 230 millones de personas se infectan anualmente en el mundo. En EUA se infectan cada año un estimado de 5-8 millones de personas y de ellos un 50% de casos son asintomáticos. En Nigeria el 37% de las estudiantes femeninas de un Instituto de Educación Superior, fue reportado recientemente con tricomoniasis, lo cual fue comparable con los datos de los estudios en América (Ojeda Luna MC, Martínez Vásquez MA 2004). En la zona rural de Sudáfrica, el 65% de las mujeres embarazadas atendidas en consultas prenatales padecían tricomoniasis en el año 1981 , mientras que en estudios más recientes esta cifra oscila sobre el 41 % (Lossic JS 1989). En México, la tricomoniasis ha ocupado un lugar preponderante entre las primeras causas de morbilidad en los últimos diez años. Las cifras de frecuencia para la tricomoniasis presentan fluctuaciones en su incidencia que va desde una tasa en población general de 1 18.08 por cada 100,000 habitantes en 1994, hasta 170.59 en el 2008 (DGSP México 2010)

Tratamientos conocidos.

El fármaco que más se ha utilizado para el tratamiento de la enfermedad es el metronidazol, (1-(p-hidroxietil)-2-metil-5-nitroimidazol) descubierto en la década de los 50 ' s, (US5536743). Este fármaco y sus derivados han demostrado ser útiles en la mayoría de los casos de tratamiento de tricomoniasis. Sin embargo, se ha encontrado que el tratamiento no es eficaz entre un 5 al 20 % de los casos (Vázquez Valdés et al. 2010). La resistencia al Metronidazol no es un problema alarmante, pero si puede ser preocupante, ya que los fármacos más comunes para su tratamiento son derivados 5-nitroimidazoles con el mismo mecanismo de acción. Se ha reportado la dosis promedio de susceptibilidad y a Metronidazol para 10,000 parásitos en 28-32 μΜ con un límite hasta 300μΜ en cultivo a 24hrs. Los aislados que requieren concentraciones mayores a 300μΜ se consideran resistentes a este medicamento (Sariego, Lazara 2011 ).

Además, metronidazol presenta varios efectos colaterales como: cefalea, náuseas, sequedad de la mucosa oral y sabor metálico. Ocasionalmente se presentan vómitos, diarrea y malestar abdominal. Glositis y estomatitis pueden ocurrir durante el tratamiento y se asocian con una superinfección por Candida albicans en la vagina. También se han observado efectos neurotóxicos por el Metronidazol. Tiene además un efecto similar al Disulfiram (rash cutáneo, taquicardia, respiración entrecortada, náuseas y vómitos) por lo que está contraindicado el consumo de alcohol (Goodman & Gilman's 2010).

El metronidazol es carcinogénico en roedores después de dosis altas y prolongadas (500 mg/Kg en ratones), también es mutagénico para bacterias. Más aún, la actividad mutagénica está asociada con el principio activo y con varios de sus metabolitos, los que se encuentran en la orina de pacientes tratados con dosis terapéuticas. Este medicamento atraviesa la placenta y también se detecta en leche materna a concentraciones equivalentes a las del suero (Goodman & Gilman's 2010). De ahí la preocupación de su uso generalizado en mujeres con T. vaginalis y particularmente está contraindicado en embarazadas, principalmente en el primer trimestre.

Actualmente existen pocas opciones terapéuticas en pacientes cuando hay resistencia o efectos secundarios al Metronidazol (Goodman & Gilman's 2010, Botero, D. & Restrepo 1992, Rosenstein, E. 2000, Nyirjesy P., et al. 1998, tabla 1 ). En referencia al estado de la técnica de la invención, se pueden citar las siguientes patentes referentes a métodos de tratamiento de la tricomoniasis:

Las patentes US4321267 y US4321274, así como las solicitudes US20070276020 y US20110189321 describen un compuesto químico con actividad anti Trichomonas vaginalis, mientras que el número de solicitudes de patente estadounidenses relacionadas con compuestos químicos con actividad anti Trichomonas vaginalis es de 13.

Las enzimas glucolíticas se han utilizado como blancos para el diseño de fármacos contra diversas infecciones como las tripanosomiasis, amebiasis, malaria y la tuberculosis (A. Gómez Puyou, et al. 1995, Olivares Miaña V, et al 2006, Vanesa Olivares-lliana, et.al. 2009). En esta invención se eligió como blanco terapéutico a una enzima clave de la glucólisis: la triosa fosfato isomerasa (TIM) (Olivares Miaña V, et al 2006, Vanesa Olivares- lliana, et.al. 2009).

Tabla 1. Tratamientos actualmente utilizados para la tricomoniasis

Triosa fosfato isomerasa (TIM).

La TIM es una enzima dimérica que participa en la glucólisis y en la gluconeogénesis realizando la interconversión entre el gliceraldehído-3-fosfato y la dihidroxiacetona fosfato (Harris T., er a/ 1998). La triosa fosfato isomerasa de T. vaginalis.

En el genoma de T. vaginalis, se han identificado dos genes que codifican para el mismo número de isoformas de TIM denominadas TvTIMI y TvTIM2. Las secuencias de aminoácidos son idénticas en un 98.4% y sólo cambian en 4 aminoácidos entre ambas TvTIM (E/Q18, ΙΛ/24, I/V45 y P/A239. Ambas isoformas de TvTIM se expresan en el parásito y tiene actividad enzimática comparable (Figueroa et al. 2012). Se analizó la estabilidad de TvTIMI y TvTIM2 y se encontró que TvTIM2 es más inestable y más fácilmente disociable en sus monómeros que TvTIMI (Lara González, et al 2014). También se analizó la localización celular de ambas enzimas. Lo comúnmente esperado es encontrar a la triosa fosfato isomerasa en el citoplasma de las células, por ser una enzima glucolítica. Sin embargo, a través de ensayos de inmunolocalización se encontró a TvTIM en la superficie celular de T. vaginalis, determinándose que TvTIM se une a las proteínas de la matriz extracelular laminina y fibronectina, identificándose así una nuevo factor de virulencia del parásito (Miranda-Ozuna et al 2016). Estas características de localización extracelular y función de unión a proteínas de matriz extracelular del epitelio vaginal humano de al menos una de las isoformas de triosa fosfato isomerasa representan una estrategia para el tratamiento de la tricomoniasis con mecanismo de acción distinto a los fármacos hasta el momento conocidos con acción tricomonicida.

Por lo anterior, es necesario proponer nuevos esquemas terapéuticos efectivos contra la tricomoniasis, utilizando alternativas terapéuticas que permitan un mejor tratamiento de la enfermedad y que no posean los efectos adversos de los medicamentos conocidos en el arte.

Objetivos de la invención.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar compuestos químicos diferentes estructuralmente y en mecanismo de acción a los nitroimidazoles, que tengan actividad biológica contra el parásito Trichomonas vaginalis.

Otro de los objetivos es lograr el objetivo anterior con moléculas químicas que no tengan efectos nocivos contra los usuarios.

Aún otro objetivo es sentar las bases para un medicamento alternativo contra Trichomonas vaginalis.

Otro de los objetivos de la invención, es proporcionar nuevos usos farmacéuticos de los compuestos descritos aquí.

Breve descripción de la invención.

Para la selección de los compuestos descritos en la presente invención, primeramente se eligió como diana terapéutica a la triosa fosfato isomerasa de Trichomonas vaginalis. En el parásito existen dos isoformas de esta proteína TvTIMI y TvTIM2. Se ha demostrado que en Trichomonas vaginalis, al menos una de estas proteínas presenta dos funciones distintas en el parásito: una de sus funciones, la lleva a cabo en el citoplasma de la célula del parásito y es la interconversión reversible entre el griceraldehido-3-fosfato a fosfato de dihidroxiacetona en la glucólisis y gluconeogénesis, es decir es una enzima clave en el metabolismo central de Trichomonas vaginalis. La otra función corresponde a la unión con las proteínas de la matriz extracelular laminina y fibronectina en el exterior de la célula de Trichomonas vaginalis, lo que facilita la interacción con las células del epitelio vaginal. Esto representa un nuevo factor de virulencia del parásito para el establecimiento de la infección. Esta función distintiva de al menos una de las isoformas de triosa fosfato isomerasa en el parásito, implica que esta proteína es un blanco novedoso para el diseño de fármacos contra Trichomonas vaginalis, con mecanismo de acción terapéutica diferente a lo planteado hasta el momento en fármacos tricomonicidas y parasitarios.

Las isoformas de triosa fosfato isomerasa de Trichomonas vaginalis fueron caracterizadas exhaustivamente. Posteriormente, haciendo uso de la información estructural, bioquímica y biofísica de dicha enzima, y con herramientas computacionales se realizó un tamizaje virtual a partir cerca de 100 millones de estructuras tridimensionales de moléculas con potencial farmacológico (provenientes de bases de datos) en busca de candidatos a unirse a la proteína blanco. Después, se evaluó el efecto de los compuestos con mayor potencial tricomonicida en la actividad enzimática de la diana terapéutica y en cultivos in vitro de los parásitos. Los resultados permitieron definir a la molécula 3,3'-{[4-(4- morfolinil)fenil]metilen}bis(4-hidroxi-2H-cromen-2-ona) (en adelante, compuesto A4), sus derivados químicos y pre-fármacos como moléculas capaces de inhibir vías del metabolismo central y/o del proceso de patogenicidad de T. vaginalis. Se comprobó que estos compuestos frenan la viabilidad y la replicación de cultivos de aislados de parásitos de Trichomonas vaginalis. Estas pruebas se realizaron en 51 aislados de parásitos provenientes de pacientes infectadas. Los parásitos de los distintos aislados difieren en su patogenicidad, tamaño y movilidad, sin encontrar cambios en el efecto terapéutico del compuesto A4. Así mismo, se realizaron ensayos de inhibición del crecimiento de células de epitelio vaginal humano, sin encontrar efecto nocivo de los posibles fármacos sobre las células humanas. Se ha determinado el sitio de interacción con la proteína blanco, el mecanismo de acción del compuesto A4 y la concentración mínima inhibitoria para dichos compuestos. Se han realizado las pruebas de toxicidad aguda, así como pruebas de carcinogenicidad y genotoxicidad, en modelos de cultivos de células y modelos murinos, requeridas por agencias nacionales e internacionales de fármaco vigilancia. Los resultados obtenidos indican que el compuesto A4 de la presente invención es seguro para su utilización en el tratamiento de la tricomoniasis, sin presentar efectos carcinogénicos, mutagénicos, genotóxicos y con parámetros de toxicidad aguda aceptable para el uso de fármacos en el ser humano.

Fueron seleccionados los siguientes compuestos debido a los valores de la probable interacción determinada en la simulación del docking (tabla 2).

Tabla 2

Por lo que se seleccionó la molécula con una estructura química general y los radicales propuestos.

La presente invención está relacionada con nuevos compuestos químicos con actividad tricomonicida, más específicamente con compuestos de fórmula I:

en donde:

R1 se selecciona de:

donde Ra, Rb, Re, Rd y Re se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical,

R2 se selecciona de:

donde R 8 y Rg se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical; y

R3, R4, R5, R6 y R7 se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical. En una de sus modalidades preferidas, el compuesto de la invención está relacionado con el compuesto químico de fórmula

con el nombre químico 3,3'-{[4-(4-morfolinil)fenil]metilen}bis(4-hidroxi-2H-cromen -2-ona) o llamado en adelante indistintamente compuesto A4, y derivados de los mismos seleccionados del grupo que consiste en sales farmacéuticamente aceptables, profármacos, formas deuteradas, formas marcadas radioactivamente, estereoisómeros, solvatos y combinaciones de los mismos. Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Se muestra el cambio en el CME en el resultado del compuesto A4, lo que indica un efecto que altera la conformación de los aminoácidos aromáticos.

Figura 2. Se muestra el cultivo in vitro de 50,000 parásitos con 1 % DMSO, donde a las 24 h se encuentran viables y con movilidad.

Figura 3. Se muestra el cultivo de 50,000 parásitos con 200-400 μΜ del compuesto A4 (1-

4% DMSO) a las 24 h. Se observa que no es viable el cultivo, hay nula movilidad de parásitos y pedacería en el medio.

Figura 4. Se muestran las concentraciones requeridas del compuesto A4 para obtener efecto inhibitorio en T. vaginalis.

Figura 5. Se muestra el tiempo en horas donde se determina cuando se presenta el efecto tricomonicida con el porcentaje (%) de los parásitos que son viables. Se observa DMSO (1 %), metronidazol (90 μΜ) y compuesto A4 (230 μΜ).

Figura 6. Se muestran los resultados de la prueba de Ames para el compuesto A4. La línea punteada indica el número máximo de colonias a considerar para un compuesto como seguro o sin efecto mutagénico. Se observa que las barras correspondientes al compuesto A4 están por debajo de dicha línea. También se muestran los controles negativos y positivos.

Figura 7. Se muestra el ensayo de micronúcleos. Porcentaje de reticulocitos (RET%), porcentaje de reticulocitos micronúcleos (MN-RET%) y el porcentaje de eritrocitos micronucleated normochromatic (MN-NCE%) después de 48 h de tratamiento. CP (ciclofosfamida); DMSO (dimetilsulfóxido); A4 (compuesto A4);* P < 0.05 diferencia estadísticamente significativa en comparación con el control negativo (DMSO). El análisis de varianza (ANOVA) seguido por el test post hoc de Dunnett.

Figura 8. Se muestra la viabilidad de los cultivos a las 24 h y 48 h. La concentración del compuesto A4 para tener un efecto citotóxico se determina a 600 μΜ.

Descripción detalla de la invención.

La presente invención está relacionada con nuevos compuestos químicos con una nueva actividad tricomonicida determinada mediante la presente invención, más específicamente con compuestos de fórmula I:

en donde:

R1 se selecciona de:

donde Ra, Rb, Re, Rd y Re se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical,

R2 se selecciona de:

donde R 8 y Rg se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical; y

R3, R4, R5, R6 y R7 se seleccionan de metilo, amino, hidroxilo, carbonilo, carboxilo, hidrógeno o ningún radical.

En una de sus modalidades preferidas, el compuesto de la invención está relacionado con el compuesto químico de fórmula II :

con el nombre químico 3,3'-{[4-(4-morfolinil)fenil]metilen}bis(4-hidroxi-2H-chrome n-2-one) o llamado en adelante indistintamente compuesto A4, y derivados de los mismos seleccionados del grupo que consiste en sales farmacéuticamente aceptables, profármacos, formas deuteradas, formas marcadas radioactivamente, estereoisómeros, solvatos y combinaciones de los mismos.

Para efectos de la presente invención, la cantidad preferida en la que se encuentran dichos compuestos como principio activo en composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de tricomoniasis, son de 10 a 100 μΜ, aunque diferentes concentraciones de dichos compuestos en diferentes proporciones y que exhiban el mismo efecto terapéutico, pueden ser utilizadas también. En una de las modalidades de la presente invención, concentraciones del orden de 25 a 100 μΜ son preferidas, más preferentemente aquellas concentraciones que provocan una disminución de al menos el 70% en la viabilidad de Trichomonas vaginalis, y aún más preferentemente aquellas que provocan una disminución de al menos el 50% o más en dicha viabilidad.

Por otra parte, los compuestos descritos aquí mostraron no ser tóxicos y sin efectos secundarios adversos, característica que les da mayor ventaja y eficiencia en comparación con compuestos conocidos en el arte y que se utilizan comúnmente en el tratamiento de la tricomoniasis.

Así estos efectos secundarios, no estarían presentes al administrar composiciones que contengan los compuestos descritos aquí, por la diferencia en composición química, concentraciones, mecanismo de acción y blanco terapéutico, entre otros.

Las compuestos de fórmula I pueden formar parte de composiciones farmacéuticas destinadas al tratamiento de tricomoniasis, las cuales pueden obtenerse formulando con excipientes adecuados y conocidos en el arte para aplicación tópica, a nivel de genitales externos e internos, en crema, pomada, ungüento, gel, óvulo, óvulo vaginal, polvo, atomizador y otras formas farmacéuticas que resulten convenientes para su aplicación.

Otra modalidad de la invención se refiere al uso de las composiciones de la invención en combinación con otros fármacos antiparasitarios y pueden formularse de manera separada, aplicándose en la zona afectada por tricomoniasis.

Los posibles excipientes son aquellos conocidos en el campo farmacéutico para las formas farmacéuticas adecuadas para aplicación tópica y se utilizan componentes no irritantes para mucosas y/o para piel sensible.

Así mismo, la aplicación y régimen terapéutico de composiciones farmacéuticas que contengan los compuestos de fórmula I, dependerá de las características del paciente (peso, edad, sexo, etc.) y de la condición y evolución de la enfermedad, características que una persona versada en el arte considerará para dicha aplicación y terapia. Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos para poder evaluar la invención o llevarla a cabo y no son limitativos de su alcance.

Ejemplo 1. Preselección del compuesto A4 y derivados.

Para la selección de estos compuestos primeramente se eligió a la triosa fosfato isomerasa por ser una proteína clave en el metabolismo central y en los mecanismos de patogenicidad de Trichomonas vaginalis como diana terapéutica, y se caracterizó exhaustivamente. Haciendo uso de la información funcional, estructural, bioquímica y biofísica de dicha proteína y con herramientas computacionales, se realizó un tamizaje virtual a partir de cerca de 100 millones de estructuras tridimensionales de moléculas con potencial farmacológico (provenientes de bases de datos) en busca de candidatos a unirse a la proteína blanco.

A menos que se indique lo contrario, todas las tareas de modelado molecular, búsqueda de sitios potenciales de unión de ligandos sobre la estructura de TvTIMI y TvTIM2, así como la búsqueda de confórmeros, y los cálculos de la simulación de la interacción molecular entre TvTIMI y TvTIM2 con los fármacos potenciales se realizaron haciendo uso del software bioinformático MOE, versión 2008 (Jones, G., et al 1997, Wang, R., et.al. 1998). Tomando como punto de partida dos quimiotecas de dos empresas de compuestos con potencial farmacológico, Enamine y Chembridge (www.enamine.net y www.chembridge.com), se simularon alrededor de 950,000 compuestos en sitios potenciales de unión distribuidos en toda la superficie de las proteínas TvTIMI y TvTIM2. Para llevar a cabo esto, se utilizaron las coordenadas de las estructuras cristalográficas de TvTIMI , TvTIM2 (archivos PDB: 3QST y 3QSR, uniprot.com). Así mismo, para fines comparativos, se analizó también la posible interacción de los potenciales fármacos con la triosa fosfato isomerasa de humano (HsTIM, archivo PDB: 2JK2). A los archivos de coordenadas cristalográficas se les realizó minimización de energía, adición de cargas eléctricas e hidrógenos polares. Usando el campo de fuerzas CHARMM27. También se realizó el cálculo de sitios potenciales de unión que fueran diferenciales entre las isoformas de la proteína blanco de Trichomonas vaginalis y su ortóloga en humano, utilizando el software MOE que toma en cuenta cavidades y aminoácidos hidrofóbicos que faciliten una probable interacción con el ligando (Jones, G., et al 1997, Wang, R., et.al. 1998).

El término "conformación" se refiere a cada uno de los diferentes arreglos tridimensionales no superponibles que son interconvertibles solamente por rotaciones de los enlaces (hasta 3 kJ), sin necesidad de romper enlaces covalentes ni cambiar la quiralidad de los átomos que de lo contrario producirían distintas configuraciones. Antes de construir los confórmeros, se adicionaron hidrógenos y cargas eléctricas a los átomos, posteriormente se realizó la minimización de la energía usando el campo de fuerzas MMFF94x (parametrizado para moléculas pequeñas, Morris, G. M., et al. 1998, Kollman, P. A., et al 2000).

Teniendo disponible las dos quimiotecas y habiendo adicionado hidrógenos y cargas a todos los átomos, se realizó la construcción de confórmeros tridimensionales para cada compuesto, seleccionándose hasta 100 diferentes construcciones para cada compuesto. Así, se simuló la interacción de los 95,000,000 de confórmeros de los fármacos potenciales con las estructuras cristalográficas de las proteínas blanco y se calculó la energética de la posible interacción.

Los compuestos, que de acuerdo al cálculo de la energía de interacción ligando-proteína tuvieran alto potencial de unión con las isoformas de la triosa fosfato isomerasa de Trichomonas vaginalis y baja probabilidad de interacción con la triosa fosfato isomerasa de humano se seleccionaron y se ensayó su efecto inhibitorio en la actividad enzimática de TvTIMI y TvTIM2, se comprobó su interacción y se probó su efecto en el crecimiento y viabilidad de Trichomonas vaginalis.

En este caso, se seleccionó el compuesto de fórmula I, siendo adquirido el compuesto de fórmula II (compuesto A4) a través de la compañía ChemBridge Online Chemical Store (www.hit2lead.com), únicamente con el fin de ilustrar la presente invención sin que implique limitaciones en su alcance.

Ejemplo 2. Interacción del compuesto A4 y derivados con TvTIMI y TvTIM2.

Para determinar el efecto de la presencia del compuesto A4, sus derivados químicos y pre- fármacos en la estructura terciaria de TvTIMI y TvTIM2, se obtuvieron espectros de emisión de fluorescencia intrínseca. En pruebas de fluorescencia se incubaron las muestras de proteína-compuesto a 37°C por 24 h a concentraciones de 10 a 400 μΜ de cada compuesto con la TvTIMI y TvTIM2 a una concentración de 15 pg/mL en un volumen total de 1 mL. Se obtuvieron los espectros de emisión de fluorescencia inmediatamente después de la adición de cada compuesto y después de 24 h de incubación con los mismos.

Los experimentos de espectroscopia de fluorescencia se llevaron a cabo en un espectrofluorómetro Perkin Elmer LS55. Este instrumento está equipado con un portaceldas con camisa de circulación de agua. Para la obtención de espectros, las muestras se excitaron a 280 nm y 295 nm la emisión se detectó de 310 a 400 nm.

Para el análisis de los espectros de emisión de fluorescencia fue utilizada la ecuación de CME, con la que se calculó el Centro de Masas Espectral (CME, Bustos Jaimes 2004):

CME=∑>* /∑i ¾ donde Ι λ es la intensidad de fluorescencia registrada a una longitud de onda dada y λ es la longitud de onda en nm. Un desplazamiento en el CME, hacia longitudes de onda mayores, indica cambios en el ambiente hidrofóbico de los residuos de triptófano de la proteína, esto es que la estructura terciaria de la triosa fosfato isomerasa está cambiando por efecto de la interacción con el compuesto A4 (figura 1).

Ejemplo 3. Cultivos de T. vaginalis.

Para hacer crecer un cultivo, se sembró él inoculo (muestra de T. vaginalis) descongelado a 5 ml_ de medio TYM (Figueroa A. et.al, 2012) y 10% de suero de caballo en condiciones estériles. Se incubó a 37°C por 24 h y se determinó la viabilidad; en esta primera incubación, se observaron parásitos muertos y una viabilidad del 60-70%. Para una segunda siembra, se inoculó 1 ml_ en 5 ml_ de medio y 10% de suero de caballo por 24 h, obteniendo una viabilidad aproximada del 90% con aproximadamente 1 x10 6 parásitos en el medio, donde es posible tomar los inóculos para nuestras pruebas de inhibición en volúmenes de 200 μΙ (Sariego, Lazara 201 1). Bajo estas condiciones T. vaginalis se replica cada 8 h a 37°C (figura 2).

Se realizaron pruebas de inhibición de cultivos de T. vaginalis de aislados de 51 pacientes provenientes de diferentes hospitales de México, tales como por ejemplo el Centro Nacional de Clínicas de Displasia del Hospital General de México, el Hospital Juárez de México y Clínicas del Estado de Jalisco, entre otras. Estos aislados presentaron diferentes características de patogenicidad, tales como su movilidad, tamaño, formación de grupos, proteasas, adhesinas, etc. (Figueroa A. et.al, 2011 ), donde para todos los aislados se siguió el protocolo que a continuación se describe.

El conteo de trichomonas se realizó en el hematocímetro, multiplicándose el resultado por el factor 104 para determinar la cantidad de parásitos en 1 mL. Para determinar el porcentaje de viabilidad, se realizó una tinción con azul de tripano y se colocó la muestra en el hematocímetro, donde el porcentaje de viabilidad es inverso al porcentaje de células teñidas (Mansilla Barrado, Sylvia 2005). Ejemplo 4. Efecto terapéutico en cultivos de T. vaginalis.

Se utilizaron placas de 96 pozos de 300 L de capacidad cada uno, donde se sembraron 5,000, 10,000, 50,000 y 100,000 parásitos para probar el compuesto A4, sus derivados químicos y pre-fármacos, en concentraciones desde 10 μΜ y hasta 400 μΜ, incubando la placa a 37°C por 24 h. Los controles contenían únicamente DMSO desde 0.5 hasta 4% v/v, realizándose todas las pruebas por triplicado. Esta metodología es similar a la reportada en la literatura para evaluar la resistencia de T. vaginalis al metronidazol (Rain MF, Muller M. 1900, Sariego, Lazara 201 1 ); se determinó el número final de los parásitos con un hematocímetro y la concentración inhibitoria 50% (CI50) se calculó por el software Graph Pad Prism (figura 3).

Después del recuento de parásitos se observó su movilidad y se realizó tinción con azul de tripano para determinar la integridad de la membrana del parásito, esto para comparar la viabilidad de los cultivos de los grupos experimentales con los controles.

Como se mencionó anteriormente, la replicación de T. vaginalis, bajo las condiciones de cultivo utilizadas, se llevó a cabo cada 8 h, por lo tanto se esperan en promedio 3 replicaciones en 24 h, criterio que se toma para evaluar el efecto del compuesto A4 con potencial farmacológico en el cultivo de T. vaginalis.

Se realizaron pruebas control para determinar que el vehículo donde se encontraban los compuestos (DMSO) no afectaba el comportamiento o viabilidad del cultivo de T. vaginalis, utilizando una concentración máxima de 4% de DMSO, donde se observó que afectaba en un 10% la replicación en el cultivo. Se utilizó para nuestras pruebas concentraciones hasta de 1.5% de DMSO con una alteración del 5% en la replicación, por lo que se determinó que el DMSO no tiene un efecto relevante para el cultivo de T. vaginalis.

Se realizó, por ejemplo, el ensayo de viabilidad de cultivo in vitro con el compuesto A4, haciendo una prueba inicial a 400 μΜ; posteriormente se utilizaron diferentes concentraciones desde 10 μΜ y hasta 400 μΜ para determinar la cantidad mínima que se requiere para logar el efecto tricomonicida observado con metronidazol por cada 10,000 parásitos.

Se determinó que el compuesto A4 tiene un efecto inhibitorio a las 24 h en el cultivo de T. vaginalis. Se determinó que su constante de inhibición está en un intervalo de entre 10-400 μΜ por cada 10,000, que frena la replicación, así como la movilidad de los parásitos, siendo estos resultados comparables con el uso de metronidazol en las mismas condiciones (tabla 3). La concentración requerida para 10,000 y 50,000 parásitos se muestra en la tabla 3.

Se observó que a las 24 h aproximadamente el compuesto A4 frena la replicación de los parásitos, teniendo un promedio de 1 .4 replicaciones (promedio de los 51 aislados, el control obtenido es de 3 replicaciones) además que pierden totalmente la movilidad, la formación de pequeños grupos y se pierde la tendencia a poblar la periferia o adhesión a la pared del pozo (figura 8, observado con microscopio de luz inversa con lente de 100x). A las 24 h en las pruebas de la integridad de membrana, solo un 5% de los parásitos se tiñen con la prueba de "azul de tripano" (ruptura de la membrana), mientras que a las 48 h se observa disminución del número de parásitos, además se observan lisados en el medio y un 50% de tinción en la prueba de "azul de tripano" y aquellos que no están lisados, han perdido movilidad, por lo tanto perdida de la viabilidad del cultivo.

Tabla 3. Concentraciones requeridas para obtener efecto inhibitorio en T. vaginalis

Ejemplo 5. CI50 del compuesto A4 en T. vaginalis.

El ensayo de determinar la concentración inhibitoria del cultivo al 50% de los 51 aislados (CI50 del compuesto A4 y metronidazol), fue utilizando concentraciones entre 10 a 400 μΜ por 10,000 parásitos, donde se determinó la viabilidad del 50% del cultivo a las 24 h. Los resultados se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Cl 50 . Concentraciones requeridas del compuesto A4 para efecto

tricomonicida en T. vaginalis a las 24 h

Usando el software Graph Pad Prism se determinó la Cl 50 del compuesto A4, así como las combinaciones que se utilizaron para dicho compuesto (figura 4). Conforme a la presente invención, determinamos para el compuesto A4 una Cl 50 de 47 μΜ.

Ejemplo 6. Cinética del efecto tricomonicida del compuesto A4.

Se incubaron muestras en placas de 96 pozos a 37°C durante 6, 12, 24 o 48 h. Las placas fueron examinadas con un microscopio de contraste de fases invertido (Nikon; distribuido por Ehrenreich Photo-Optical Industries, Garden City, N.Y.). Se registró la concentración más baja del compuesto A4 que inhibe completamente toda la movilidad de Trichomonas vaginalis (Rain MF, Muller M 1990, Vázquez, F., García et al. 2001) para cada aislado en cada período de tiempo, realizando al menos tres veces la prueba.

Con la determinación de la viabilidad del cultivo in vitro de los parásitos, así como con la replicación, la movilidad y la integridad de la membrana, se determinó cuando se presenta el efecto tricomonicida. Se midió cada 30 minutos desde que se coloca el compuesto A4 y metronidazol, evaluando los cultivos después de 3, 6, 12, 24 y 48 h de incubación. Observamos que el porcentaje de viabilidad disminuye después de 3 h de incubación con el compuesto A4 con 100 μΜ por 20,000 parásitos, mientras que para el metronidazol se observa la misma disminución de la viabilidad después de 4 a 6 horas en 90 μΜ por 20,000 parásitos (figura 5). Ejemplo 7. Pruebas de toxicidad.

Se demostró la seguridad del uso del compuesto A4, sus derivados químicos y pre- fármacos en los seres humanos. Se realizaron ensayos de mutagenicidad, genotoxicidad, citotoxicidad y la determinación de la dosis letal al 50% (DL 50 ) en un modelo murino.

Prueba de Ames.

Las pruebas de mutagénesis son ensayos biológicos utilizados para evaluar el potencial mutagénico de compuestos químicos (Marón, D.M., Ames, B.N., 1983). Esta prueba consiste en el uso de cepas de la bacteria Salmonella typhimurium alteradas genéticamente para presentar mutaciones en los genes implicados en la síntesis de histidina. A causa de dichas mutaciones, estas bacterias requieren de un suministro externo de histidina para su crecimiento. El ensayo evalúa la capacidad del compuesto ensayado para provocar una alteración genética en las bacterias que permita el retorno al crecimiento en un soporte libre de histidina (crecimiento de colonias revertantes). Es decir el potencial mutagénico del compuesto ensayado es directamente proporcional al número de colonias revertantes observadas.

Se realizó la prueba de Ames en cepas de Salmonella typhimurium auxótrofas a histidina TA100 (hisG46), que pueden detectar mutaciones de sustitución de pares de bases TA98 (hisD3502), que puede detectar mutaciones de desplazamiento de marco de lectura y TA102 (hisG428), y que pueden detectar daño del ADN inducido por especies reactivas de oxígeno. Como ejemplo, se evaluó la mutagenicidad del compuesto A4 en estas tres cepas, con o sin Aroclor 1254 inducida por homogeneizado de hígado de rata (mezcla S9), con un método de incorporación como se ha descrito por Marón y Ames (1983). Como ejemplo, se probaron cinco concentraciones del compuesto A4 (1 1 , 22, 50, 100 y 200 g / placa) en presencia o ausencia de 500 μΙ de la mezcla S9. El compuesto A4 se disolvió en DMSO a las concentraciones indicadas y se mezcló con 100 μΙ de cultivo de bacterias (1 -2 x 10 9 CFU / mi) en 2 mi de agar fundido que se añadió posteriormente al agar mínimo de placas de Vogel Bonner con 0.5 mM histi-comer / biotina. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C y las colonias revertantes formadas se contaron. Para obtener un resultado positivo de la prueba Ames, la sustancia de ensayo debe inducir el doble de revertantes del que se obtienen por reversión espontánea. Los controles positivos usados en esta prueba fueron ácido picrolónico (PA) a 50 g / placa, N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NMNG) a 10 g / placa, mitomicina C (Mit C) AT 10 ng / placa, 2- aminoantraceno (2AA) a 10 g / placa, y ciclofosfamida (CP) a 500 g / placa.

El compuesto A4 no fue mutagénico en cualquiera de las tres cepas utilizadas (TA98, TA100 y TA102) a 11 , 22, 50 y 100 g/placa, en comparación con todos los controles positivos empleados (PA, NMNG, Mit C, 2AA, y CP) con o sin mezcla S9. Todas las tasas de mutación de los controles positivos fueron varias veces más altas que la reversión espontánea de control (DMSO; figura 6). Nuestros resultados indicaron que en las dosis ensayadas, el compuesto A4 no es mutagénico.

Ensayo de mutaqenicidad (micronúcleos) in vivo.

Las pruebas de micronúcleos detectan cromosomas que no fueron retirados al polo correspondiente del husillo debido a que faltan unos fragmentos centrómeros cromosómicos y/o que no fueron incorporados en los núcleos de células hija en la mitosis (Schmid, W., 1975). Para esta prueba, se utilizaron ratones machos CD1 (25-30 g). Los ratones fueron mantenidos de acuerdo con la oficina mexicana de regulaciones para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio (NOM-062-ZOO-1999) y el protocolo aprobado por el Comité de Ética de la Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía de México (Registro No. ENMH-CB-010 a 201 1). Los ratones se mantuvieron en una sala de animales a 25 ± 2°C, 50 ± 5% de humedad, y en virtud de un ciclo de luz-oscuridad de 12 h: 12 h. Los ratones fueron alimentados con una dieta estándar (Purina, Cuautitlán, México) y agua.

El compuesto A4 se disolvió en DMSO con ajuste de la concentración (2,000 o 300 mg / Kg) a un volumen de administración de 0.1 mi por ratón, por vía intragástrica (i.g.v.); antes de la administración, los animales se mantuvieron en ayunas durante 8 h. Se observaron los animales 2 h después del tratamiento, y después de 48 h, tomándose muestras de sangre para la determinación de micronúcleos. Cada grupo se evaluó por triplicado y se utilizó como control del vehículo DMSO (0.1 mi / ratón) como control positivo y ciclofosfamida (50 mg / Kg por vía intraperitoneal (Díaz Barriga, S et al. 1995)).

La presencia de reticulocitos de micronúcleos (MN-TER) y de micronúcleos en la población de eritrocitos maduros normocromático (MN-NCE) en muestras de sangre periférica fueron analizados. Las células de interés (RET y NCE) se marcaron con anticuerpo conjugado con FITC dirigido contra un antígeno de superficie celular (CD71 receptor de la transferrina). Se detectaron células micronucleadas basado en la fluorescencia producida después de la tinción con yoduro de propidio y se cuantificaron utilizando un flujo FACSAria™ citómetro (BD Biosciences, San José, CA).

Para evaluar la actividad genotóxica del compuesto A4 en un modelo in vivo, se utilizó la determinación de la presencia de eritrocitos policromáticos micronucleados (MNPCE), de acuerdo con criterios previamente publicados (Fenech, 2000). La capacidad del compuesto A4 para inducir MNPCE se muestra en la figura 7, donde se observa que sólo los ratones tratados con el control positivo (Mit C) tenían aumentos estadísticamente significativos en el número de MNPCE a 48 h con respecto de los ratones tratados con el vehículo (DMSO). Por lo general, es posible observar efectos mutagénicos iniciales de agentes inductores de micronúcleos a las 24 h; la cantidad más alta de micronúcleos se observó a las 48 h. Esto se observó con nuestro control positivo Mit C, pero no con el compuesto A4 (figura 3). Todos los grupos tratados con el compuesto A4 tenían un número similar de MNPCE tanto antes (0 h) y después del tratamiento (24 y 48 h), con valores medios que van desde 1.6 hasta 3.4, y no se observaron diferencias significativas entre los grupos o con respecto a la de control.

Estos resultados sugieren que el compuesto A4 no tiene propiedades mutagénicas (tabla 5).

Tabla 5

* P < 0,05 diferencia estadísticamente significativa en comparación con el control negativo (DMSO). El análisis de varianza (ANOVA) seguido por el test post hoc de Dunnett. Así mismo, el compuesto A4 resultó no ser citotóxico ni genotóxico en eritrocitos de sangre periférica de ratones evaluados con el ensayo de micronúcleos.

Citotoxicidad del compuesto A4 en células HeLa.

Se probó el compuesto A4, que tuvo efecto tricomonicida en cultivos in vitro de T. vaginalis en células HeLa, para tener una prueba de compatibilidad con estas células de origen humano, en placas de 96 pozos (300 μΙ c/u) usando el medio reportado y 40,000 células, a las cuales se les adicionó la cantidad suficiente del compuesto para alcanzar concentraciones finales entre 10 y 400 μΜ; lo anterior para evaluar la formación de la monocapa a las 24 h de células HeLa.

Por ejemplo, se probó el compuesto A4 en células HeLa y no se observó afectación alguna en dichas células, además las células HeLa son capaces de formar la monocapa característica de este tipo de células en la presencia del compuesto A4, incluso a la mayor concentración de 600 μΜ (figura 8). Las células HeLa fueron capaces de formar la monocapa de manera similar al control negativo con DMSO (figura 3). Interacción del compuesto A4 en células HeLa e integridad de mitocondrias (ensayo de MTT).

La citotoxicidad se determinó con un ensayo MTT estándar tal como se describe por Mosmann (1983). Este ensayo se basa en la reducción de MTT amarillo (3-(4,5- dimetitiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) a formazán por la succinato deshidrogenasa mitocondrial en células vivas. Los cristales de formazán púrpura resultantes se disuelven en DMSO y posteriormente se mide la absorbancia y se relacionan con el valor de absorbancia de formazán producido por las células no tratadas. El valor de la absorbancia de formazán es directamente proporcional al número de células viables (Cory, A.H et al. 1991).

Brevemente, las células HeLa que habían sido sembradas en la placa de 96 pozos fueron tratadas durante 24 h con diferentes concentraciones del compuesto A4, (10 a 600 m). Cisplatino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) a las mismas concentraciones se utilizó como control positivo, además de 1 % de DMSO se utilizó como control negativo. Las células HeLa se trataron durante 48 h. Después del tratamiento, el medio se aspiró de los pocilios y se reemplazó con medio que contenía MTT (1 mg / mi), y se incubaron las células durante 4 h adicionales a 37°C. Después de la incubación y la eliminación del medio y MTT, los cristales de formazán se disolvieron con DMSO y se leyeron las placas en un lector de microplacas (ELx808, Bio-Tek, Winooski, VT, EE.UU.) a 570 nm. Todos los tratamientos se realizaron al menos tres veces por triplicado. Los valores de control se obtuvieron y utilizaron para calcular la viabilidad por ciento de acuerdo con la fórmula: % de viabilidad = (media de las células tratadas OD x 100) / medio células de control OD. Los valores de concentración que causaron una inhibición del crecimiento celular del 50% (IC 50 ) se calcularon a partir de la relación dosis-efecto de cada línea celular por regresión no lineal con software Prism 5.0 (GraphPad, La Jolla, CA, EE.UU.).

Ejemplo 8. DL 50 de los compuestos de fórmula I.

Este experimento se realizó de acuerdo con el método OCD TG 423 (anexo V BCE). A grupos de 3 animales machos se les administró una dosis única por v.i.g. a partir de 2,000 mg / Kg y poco a poco se redujo a 300, 50 y 5 mg / Kg en caso de muerte de 2 o más animales de cada dosis. Se observó el estado general de salud de los animales después de 1 , 2, 4 y 6 horas y una vez al día durante 14 días. Los animales fueron observados después del tratamiento de los signos de toxicidad o la muerte. Al final del período de observación se sacrificaron los animales en una cámara de CO 2 . Posteriormente, los órganos (pulmón, riñon, corazón, estómago, intestinos, bazo e hígado) se retiraron y se hicieron observaciones macroscópicas en busca de lesiones patológicas. El valor de la DI_5o se determinó de acuerdo con el Sistema Globalmente Armonizado de clasificación (GHS) y de acuerdo con lo descrito en la literatura (OCDE TG 423).

La administración del compuesto A4 a una dosis de 2,000 mg/Kg no mostró signos de toxicidad durante las primeras 24 h de tratamiento, sin embargo uno de los animales murió en el segundo día de administración y dos ratones murieron después de cuatro días. Todos los animales mostraron piloerección y alteraciones en la actividad motora durante las 12 horas anteriores a su muerte. Cuando se realizó una observación macroscópica de los órganos, se encontró que mostraron una reducción en el tamaño del bazo y una consistencia gelatinosa.

De acuerdo con el diagrama del procedimiento 1 D TG 423, la dosis del compuesto A4 se redujo a 300 mg/Kg. A esta dosis no se encontraron signos o síntomas de toxicidad (tales como piloerección, irritación de mucosas o alteraciones en la actividad motora) o muertes en los grupos tratados durante 14 días después de la administración del compuesto. Los pesos de los ratones tratados no mostraron cambios estadísticamente significativos en comparación con los animales sanos durante el período de tratamiento (tabla 6). Los órganos (pulmones, los ríñones, el corazón, el estómago, los intestinos, bazo e hígado) no mostraron ninguna lesión morfológica.

Tabla 6. Peso de ratones CD-1 (g).

Día 1 Día 14 Peso ganado al día 14

Control Á4 Control Á4 Control A4

Peso 22.3 ± 1 .8 19.3 ± 0.9 35.7 ± 1 .5 30.1 ± 0.7 13.3 ± 0.3 1 1 .3 ± 0.3 Los valores se expresan como promedio ± Error Estándar de 3 animales por grupo. Análisis de Varianza de una vía (ANOVA) seguida de una prueba pos hoc de Bonferroni. Se utilizó el software

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Inc.) para realizar el análisis estadístico. Control: Animales administrados con DMSO.

La DL 50 del compuesto A4 es mayor que 500 mg/Kg y menos de 2,000 mg/Kg por i.g.v. en ratones macho CD-1 cepa TG 423 mediante el procedimiento y, por tanto, está en la categoría 4 de la SGA.

La administración de 300 mg/Kg del compuesto A4 no afectó el crecimiento de los ratones durante el periodo de tratamiento. Referencias.

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