La présente invention concerne essentiellement l'utilisa- tion de la peau non pigmentée de poisson, en particulier de poisson plat, comme nouvelle source industrielle de collagène, un procédé d'extraction de collagène, ainsi que du collagène et un biomatériau ainsi obtenus.

Le collagène protéine de soutien des tissus conjonctifs de l'être vivant trouve des applications de plus en plus larges dans les domaines cosmétiques et pharmaceutiques.

Les propriétés principales sont les suivantes :

- bonnes propriétés mécaniques,

- action sur le développement cellulaire et par là sur la régénération tissulaire,

- pouvoir hémostatique,

- très bonne biocompatibilité,

- biodégradabi lité,

- support naturel conférant une meilleure biodisponibi- lité à de nombreux actifs.

Cette protéine, du fait de ses remarquables qualités a conduit à la réalisation de nombreux biomatériaux dont le marché est en expansion continue.

Parmi les nombreuses préparations à base de collagène, les principales paraissent être les suivantes :

- solution pour les produits cosmétiques,

- solution pour la réalisation de peaux artificielles,

- éponge hémostatique,

- pansement cicatrisant, - matériau de reconstruction osseuse,

- capsules por la protection d'acitfs et l'amélioration de leur biodisponibilité,

- biomatériaux sous forme solide ou liquide pour le com¬ blement des tissus mous.

A la lecture de la liste précédente qui est loin d'être exhaustive, il est possible de se rendre compte que le collagène va devenir une substance d'une grande importance industrielle.

Le développement des matériaux collagéniques s'effectuera d'autant plus rapidement que leur coût sera plus faible.

C'est pourquoi les inventeurs ont cherché à exploiter de nouvelle sources de collagène permettant de remplir les procédés industriels, d'améliorer les rendements, et par là même d'abaisser les coûts de préparation de la protéine. A l'heure actuelle, le principal tissu utilisé pour l'obtention de collagène est la peau de veau.

L'exploitation de cette matière première se heurte à deux difficultés.

D'une part, la collecte de la peau ne s'effectue pas en général dans des conditions sanitaires parfaites, ce qui entraîne l'obligation d'utiliser la peau dans les plus brefs délais après l'abattage de l'animal.

D'autre part, un important traitement de la peau est nécessaire pour éliminer les poils et Les tissus sous-cutanés. Ce travail est réalisé grâce à des installations de tannerie impliquant la construction d'un atelier indépendant du site de transformation du collagène en biomatériau. Une telle infra¬ structure nécessite des investissements relativement lourds qui se répercuteront sur le coût du collagène obtenu. De plus, la peau de veau bien qu'étant un tissu d'animal jeune fournit des quantités de collagène acido soluble relativement faibles, environ 12 g de protéine sèche pour 1 kilo de peau fraîche.

Pour éviter en grande partie le traitement de la peau et pour obtenir de meilleurs rendements d'extraction, les inventeurs ont eu l'idée d'utiliser la peau non pigmentée de poisson.

Il a en effet été observé par les inventeurs que la peau de poisson pigmentée n'est pas utilisable car le pigment est très difficilement éliminé au cours du procédé de préparation du colla- gène. La protéine ainsi obtenue conduit alors à des biomatériaux pigmentés impurs.

De ce fait, les inventeurs se sont tournés vers des poissons dont la peau n'est pas pigmentée et qui est disponible en grande quantité. Les espèces entrant dans cette catégorie sont les poissons plats, en particulier ceux qui sont péchés de façon indus- trielle comme par exemple la sole, la limande, le turbot, barbue, et dont la préparation des filets implique un dépeçage. La peau ventrale de ces poissons est non pigmentée, elle est disponible écaillée en quantités importantes.

Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisation de la peau non pigmentée de poisson comme nouvelle source industrielle de collagène. De préférence, cette peau non pigmentée est une peau de poisson plat, en particulier une peau ventrale. Cette peau non pigmentée est avantageusement obtenue après dépeçage du poisson frais qui est congelé immédiatement après Le dépeçage, ce qui garantit une très bonne qualité de la matière première tant sur Le plan bactériologique que sur ceLui du carac¬ tère natif de La protéine.

Par ailleurs, un avantage inattendu réside dans le fait que la peau ainsi récupérée et congelée est utilisable immédiate- ment pour l'extraction de collagène sans travail de tannerie préa¬ lable. Egalement, il s'est avéré que la quantité de collagène extraite à partir de cette matière première est environ trois fois supérieure à celle obtenue à partir de la peau de veau.

De ce fait, la mise en oeuvre de cette nouvelle source de collagène conduira à l'obtention d'une protéine d'un coût moins élevé avec des propriétés natives préservées de façon reproduc¬ tible.

Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne aussi un procédé d'extraction de collagène natif, caractérisé en ce qu'on utilise de la peau non pigmentée de poisson que l'on soumet à une extraction du collagène.

Selon une variante de réalisation de ce procédé, la peau non pigmentée est une peau de poisson plat, en particulier une peau ventrale. Avantageusement, cette peau est une peau obtenue après dépeçage du poisson frais qui est congelé immédiatement après dépe¬ çage.

Cette peau est également utilisée pour l'extraction de collagène sans travail de tannerie préalable.

Selon une variante de réalisation particulière, on uti¬ lise de la peau non pigmentée de poisson plat péché de façon indus- trielle tel que par exemple la sole, la limande, le turbot, le barbue.

Selon une variante de réalisation particulière, on extrait du collagène acido soluble à l'état natif par extraction dans une solution acide, comme cela est bien connu à l'homme de l'art. On sépare ensuite le collagène natif par précipitation à partir du surnageant, par addition d'un agent de précipitation, par exemple du chlorure de sodium. Si cela est souhaité, on peut procéder à une déréticulation de ce collagène natif.

L'invention concerne aussi le collagène natif obtenu à partir de la peau non pigmentée de poisson, et tout biomatériau fabriqué en totalité, ou en partie, avec un tel collagène.

L'invention sera maintenant décrite en référence à un exemple d'extraction de collagène mettant en oeuvre le procédé d'extraction selon l'invention, donné simplement à titre d'illus- tration et qui ne saurait donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Exemple

Préparation de collagène acido soluble à partir de 40 kg de peaux de sole congelées 1. Broyage de la peau

Les peaux ventrales de sole pêchées industriellement sont livrées congelées en blocs de 20 kg. Ceux-ci sont découpés en blocs de 2 kg à l'aide d'une scie à ruban. Les morceaux récupérés sont alors broyés et décongelés grâce à un broyeur à couteau muni d'une cuve étanche de 40 l. 39 kg de broyât sont obtenus. 2. Lavage du broyât

Le broyât est lavé par deux bains successifs de tampon phosphate (21,7 g/l NA-, HP0, et 0,78 g/L de KH-, P0 . La concentra¬ tion en broyât étant de 1 kg pour 5 l de bain et le temps de con- tact de 1 h. Le broyât est séparé du tampon par centrifugation grâce à une décanteuse en continu tournant à 4000 tr/min. Le phos-

phate est ensuite éliminé dans les mêmes conditions par deux lavages successifs à l'eau permutée stérile.

3. Extraction acide Le broyât obtenu est alors placé dans une solution d'acide acétique 0,25 M à une concentration de 1 kg pour 10 l de bain. L'ensemble est agité pendant 15 min et le surnageant est récupéré par centπ ^' fugation en continu dans les mêmes conditions que précédemment.

Cette opération d'extraction est réalisée deux fois. Les surnageants sont réunis et le collagène qu'ils renferment est pré¬ cipité par addition de chlorure de sodium à une concentration de 7 %. Les fibres obtenues sont dialysées contre l'eau permutée jusqu'à élimination complète des sels. Le collagène obtenu peut être soit remis en solution acide, soit lyophilisé .

A partir de 40 kg de peaux de sole fraîche, 1,6 kg de collagène sec sosnt obtenus. Le rendement d'extraction est plus de trois fois supérieur à celui de la peau de veau. Voici les caractéristiques d'une solution de collagène acido soluble de peau de sole dans un milieu à 0,1 % d'acide sor- bique.

Analyses chimiques

Matières sèches 0,46

Matières minérales 0,08

Azote total 0,075

Protéines totales (d'après azote) 0,40

Hydroxyproline 0,03

Collagène d'après hydroxyproline 0,40

Acidité (en acide sorbique) 0,10

Analyses physiques

- Electrophorèse

- sous unités /> ⁽ 200 000 daltons) 56 % < (100 000 daltons) 44 %

- pas de sous-unités inférieures à 100 000 daltons.

- Calorimétrie différentielle programmée :

- température de début de dénaturation en C : 28

- température de fin de dénaturation en C : 37 p

- enthalpie de dénaturation (J/mg collagène) : 5 x 10

- Diffraction des rayons X

- présence de la structure hélicoïdale.

Il a également été déterminé la composition en acides aminés du collagène acido soluble obtenu à l'exemple précédent et qui a été extrait de la peau ventrale de sole.

COMPOSITION EN ACICDES AMINES

Acides aminés Nombre de résidus pour 1 000 résidus totaux

Acide cystéique 0,00 Hydroxyproline 59,58

Acide aspartique 56,74

Thréonine 20,76

Serine 27,87

Acide glutamique 85,11 Proline 59,58

Glycine 326,64

Alanine 126,09

Cystine 0,00

Valine 27,59 Méthionine 2,27

Isoleucine 12,68 Leucine 29,60 Tyrosine 0,00 Phenylalanine 15,47 Histidine 8,96

Hydroxylysine 4,15 Lysine 34,34 Tryptophane 0,00 Arginine 46,81