Utilisation d'acide urique pour la culture de bactéries sensibles à la tension en oxygène

La présente invention concerne la culture en milieu acellulaire de bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène, notamment des bactéries qui tolèrent ma l des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air voire des bactéries anaérobies strictes pour lesquelles l'oxygène est toxique et qui doivent être cultivées en absence totale d'oxygène ou ne tolérant que de faibles concentrations d'oxygène.

On distingue donc parmi les bactéries sensibles à l'oxygène :

- les bactéries microaérophiles c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver sous une atmosphère comprenant la concentration d'oxygène ambiante qui est de environ 21%, notamment entre 1% et 20%, le plus communément à environ 2-2,5%, et

- les bactéries anaérobies strictes c'est-à-dire qu'elles ne sont pas capables de cultiver en présence d'oxygène ou dans des concentrations inférieures aux concentrations de microaérophilie, notam ment strictement inférieure à 1%, le plus comm unément inférieure à 0.1%, idéalement 0%. Pour cultiver les bactéries anaérobies strictes, il faut soit les cultiver dans des étuves ne comportant pas d'oxygène, soit dans des tubes qui ont été désoxygénés et elles ne poussent alors qu'au fond du tube. Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particulièrement les bactéries extracell ulaires, c'est à dire des bactéries qui ne peuvent vivre qu'à l'extérieur de cellules. Plus particulièrement, la présente invention concerne la culture de bactéries a naérobies et la culture de bactéries microaérophiles en atmosphère aérobie.

Dans WO 2014/064359, on propose d'améliorer et faciliter les conditions de croissance en culture acellulaire des bactéries dont la croissance est sensible à la tension en oxygène et notamment des bactéries qui tolèrent mal des tensions élevées d'oxygène et pour lesquelles une croissance optimale de la dite bactérie requière une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries suivantes :

- les bactéries anaérobies, y compris les bactéries anaérobies strictes, et

- les bactéries microaérophiles du type citées ci-dessus. On entend ici par «atmosphère microaérophile», de l'air appauvri en oxygène avec une proportion molaire en oxygène inférieure à 10%, de préférence 5%, de préférence encore inférieure à 2, 5% . Pour les bactéries anaérobies strictes, la teneur en oxygène doit être proche de 0%, notamment inférieu re à 0.1%, comme mentionné ci-dessus, la tolérance à de très faibles quantités d'oxygène étant variable selon les espèces de bactéries anaérobies.

Dans WO 2014/064359, on propose d'ajouter certains composés antioxydants à savoir l'acide ascorbique, le glutathion et l'hydrosulfure de sodium dans un milieu de culture acellulaire pouvait permettre de : - améliorer la croissance des dites bactéries en obtenant plus rapidement des bactéries en concentration suffisante pour être détectables après multiplication et/ou en augmentant la concentration en bactéries après un délai donné de culture, c'est-à-dire par unité de temps, et - cultiver avec au moins un même niveau de croissance voire à un niveau pl us élevé, des bactéries anaérobies strictes en présence de quantité plus élevées d'oxygène qu'en l'absence de composé antioxydant, c'est-à-dire en atmosphère microaérophile, notamment avec des teneurs en oxygène de 2 à 5%, mais aussi des teneurs en oxygène supérieures à 5%, voire en aérobie, c'est-à-dire en présence d'un taux d'oxygène équivalent à la tension en oxygène proche de l'air ambiant soit environ 21%, et

- cultiver avec au moins un même niveau de croissance, dans une atmosphère contenant des tensions d'oxygène pl us élevées, desdites bactéries intracellulaires microaérophiles, cultivables en l'absence de composé antioxydant, en atmosphère microaérophile, voire avec un niveau de croissance pl us élevé comme c'est le cas pour la bactérie Coxiella burnetii; et - cultiver avec un niveau de croissance plus élevé, en atmosphère microaérophile, des bactéries cultivables, en l'absence de composé antioxydant, dans une atmosphère contenant une tension d'oxygène plus élevée, mais inférieu re à la teneur en oxygène de l'air, comme c'est le cas pour la bactérie intracellulaire facultative Mycobacterium tuberculosis.

Dans WO 2014/ 064359, on fournit donc un procédé de culture in vitro de bactéries en milieu de culture acel l ulaire, de bactéries dont la croissance est sensible à la teneur en oxygène, la croissance optimale desdites bactéries exigeant une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite, voire nulle, par rapport à la teneur en oxygène de l'air, lesdites bactéries étant choisies parmi les bactéries anaérobies et les bactéries microaérophiles intracellulaires, caractérisé en ce que l'on ajoute dans le dit milieu de culture acel lulaire un composé antioxydant choisi parmi l'acide ascorbique, le gl utathion et l'hydrosulfure de sodium, et l'on cultive la dite bactérie dans ledit milieu de culture en présence d'oxygène. Dans WO 2014/ 064359, l'acide ascorbique et le gl utathion sont préférés car ils sont capables à des doses précises de permettre la culture à un niveau d'oxygène pl us élevé.

Dans WO 2014/064359, plus particulièrement encore, lesdits com posés antioxydants, sont mis en œuvre à une concentration de 0, 1 g/L à 2 g/L, ou concentration molaire de 10 ^"6 M à 10 ^"2 M .

D'autres composés antioxydants tels que l'hydrosulfure de sodium (NaHS) ou la cystéine sont moins efficaces et requièrent des concentrations plus élevées. L'ajout d'un composé antioxydant permet de tolérer une croissance en présence de teneur en oxygène relativement pl us élevée, voire en atmosphère d'air ambiant notamment pour les bactéries microaérophiles intracellulaires telles que Coxiella burnetii ou Helicobacter clnaedi et les bactéries anaérobies strictes telles que Bacteroides. Et, cet ajout permet a ussi pour certaines bactéries telles que Mycobacterium tuberculosis cultivables à des tensions d'oxygènes plus élevées en l'absence de composé antioxydant, d'améliorer leu r croissance à des tensions en oxygène diminuées en présence de composé antioxydant. Dans certaines conditions l'acide ascorbique apparaît toxique et/ou trop acide vis à vis de certaines bactéries et/ou pour certain milieux de culture à fortes doses. Ceci a été mis en évidence notam ment pour Mycobacterium tuberculosis (4) . D'autre pa rt, le glutathion est très onéreux. Selon la présente invention, les inventeurs ont découvert de façon fortuite qu'un effet équivalent sur la croissance des dites bactéries anaérobies ou sensibles à l'oxygène pouvait également être obtenu en ajoutant dans le dit milieu de culture de l'acide urique (7,9- dihydro- lH-purine-2,6,8(3H)-trione ou 2,6,8-trioxypurine) à la place des composés antioxydants décrits dans WO 2014/064259, l'acide urique étant mis en œuvre dans des concentrations si milaires ou inférieure à celles de l'acide ascorbique et du glutathion tel que décrit dans WO 2014/064359.

L'acide urique, bien qu'ayant dans certaines conditions des propriétés antioxydantes, n'est pas classiquement utilisé en microbiologie à titre de composé antioxydant car dans certaines conditions il présente au contraire des propriétés oxydantes (5).

Les inventeurs dans le cadre de travaux sur la maladie de Kwashiorkor, une forme de mal n utrition infantile, ont découvert l'importance de l'acide urique pour la croissance des bactéries anaérobies. Ils ont observé chez ces enfants une flore microbienne du tube digestif très particulière en ce qu'elle comporte très peu de bactéries anaérobies d'une part et une carence en acide urique d'autre part. Cette carence en acide uriq ue provient d'une ali mentation ne comportant pas de viande et peu de légume alors que l'acide urique provient de la dégradation des pu rines que l'on trouve en quantité importante dans les aliments carnés. Pour expliquer la spécificité de la flore de ces patients, ils ont voulu vérifier si l'acide urique suffirait à permettre la culture en aérobiose des bactéries théoriquement anaérobies ce qui les a conduit à découvrir que des doses faibles d'acide urique présent normalement dans le tube digestif permet effectivement de rétablir la croissance des bactéries anaérobioses absentes chez ces patients déficients en acide urique.

Cette découverte est particulièrement importante et avantageuse car l'acide urique est moins acide et moins toxique que l'acide ascorbique et beaucoup moins onéreux que le glutathion à savoir environ 1 Euros /g pour l'acide urique, au lieu de 100 Euros /g pour le glutathion .

La présente invention a donc pour objet un procédé de culture in vitro en milieu de culture acellula ire, de bactérie choisie parmi les bactéries anaérobies et les bactéries microaérophiles intracellulaires, dans lequel on cultive la dite bactérie dans ledit milieu de culture en présence d'oxygène, caractérisé en ce que l'on ajoute da ns le dit milieu de culture de l'acide urique à une concentration d'au moins 0, 1 g/L.

Les dites bactéries sont des bactéries dont la croissance est sensible à la teneur en oxygène, la croissance optimale de la dite bactérie exigeant une atmosphère d'incubation à teneur en oxygène relativement réduite par rapport à la teneur en oxygène de l'air.

Plus particulièrement, l'acide urique est mis en œuvre à une concentration d'au moins 0,2 g/L, de préférence de 0.4 à 2g/L, notamment de 0.2 à 0.5g/L, pour obtenir u n effet équivalent voire supérieur sur la croissance des dites bactéries sensibles à l'oxygène, en atmosphère aérobie et à des concentrations inférieures ou égales à celles de l'acide ascorbique et du glutathion seuls ou en mélange permettant un effet semblable sur la croissance des dites bactéries dans les mêmes atmosphères ambia ntes aérobies.

L'acide urique peut être mis en œuvre en mélange avec l'acide ascorbique et/ou le glutathion mais l'acide urique peut être mis en œuvre sans composé antioxydant additionnel dans le dit milieu de culture. Comme illustré dans les exemples de réalisation de la description détaillée ci-après:

- de très nombreuses bactéries anaérobies et microaérophiles ont une croissance améliorée en atmosphère aérobie avec l'acide urique en combinaison avec l'acide ascorbique et glutathion, et - pour certaines bactéries, les résultats de croissance avec de l'acide urique étaient supérieurs à ceux obtenus avec un mélange d'acide ascorbique et gl utathion, et

- certaines bactéries anaérobies et microaérophiles ont une croissance améliorée en atmosphère aérobie avec l'acide urique seul ou en combinaison avec l'acide ascorbique mais pas de croissance améliorée avec l'acide ascorbique seul .

De préférence, l'acide urique est mis en œuvre en combinaison avec l'acide ascorbique, de préférence encore avec l'acide ascorbique et le glutathion .

Plus particulièrement, ledit milieu de culture comprend les composants que l'on retrouve dans les milieux de base de culture aptes à cultiver une bactérie anaérobie, comprenant au moins:

- plusieurs sources de carbone, - une source de phosphore, de préférence un sel de phosphate,

- une source d'azote, de préférence un sel d'ammonium,

- au moins un sel de métaux choisi parmi K, Mg, Na, Ca, de préférence NaCI .

Plus particulièrement, ledit milieu culture est un milieu acellulaire est choisi parmi un milieu axénique constitué de substances chimiques ou biologiques défini qualitativement et quantitativement, et un milieu acel l ulaire comprenant un extrait de broyât ou lysat de tissu pluricellulaire. De préférence, ledit milieu comprend une substance tampon régulateur de pH pour ajuster le pH de 7 à 7,5. Plus particulièrement, ledit milieu de culture est un milieu acellulaire conventionnel de bactérie microaérophile ou anaérobie, de préférence un milieu comprenant des composant choisis parmi u n extrait de broyât ou lysat de tissu pluricellulaire, un digestat enzymatique, notam ment un digestat enzymatique de caséine, soja et/ou de tissu animal, une peptone, un extrait de levure, un sucre tel que dextrose ou gl ucose, un sel NaCI et/ou Na2P04.

Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture est un filtrat de dit broyât ou lysat, notamment de tissu sanguin ou tissu de cœur et/ou poumon, lorsque ladite bactérie est une bactérie extracellulaire tel que les milieux dits bouillon de type cœur-cervelle, milieux Columbia à 5% de sang de mouton ou milieu Schaedier tels que décrits ci-après. D'autres milieux conventionnels appropriés sont les milieux Brucella ou Wilkins-Chagren . De tels milieux de culture acellulaires sont bien connus de l'homme de l'a rt. Ces milieux sont utilisables avec agar (solide ou semi-solide) ou sans agar (liquide) .

On peut utiliser en particulier des milieux de culture polyvalents pour microorganismes anaérobies, notamment le milieu de Schaedier. De tels milieux de culture acellulaires qu'ils soient liquides, solides ou biphasiques sont bien connus de l'homme de l'art. Plus particulièrement, le dit milieu de cu lture de bactéries anaérobies peut se trouver sous forme liquide ou solide ou semi-solide, notamment gélosé ou semi gélosé, gélosé ou semi gélosé. Plus particulièrement, on cultive la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène supérieure à la tension maximale tolérée en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant pour un même niveau de croissance dans une même durée de culture. En pratique, pl us particulièrement encore, on cultive la dite bactérie dans une dite atmosphère d'incubation comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure ou égale à 20%.

Plus particulièrement encore, on cultive lesdites bactéries selon la présente invention dans une atmosphère comprenant une teneu r en oxygène supérieure à 5%, notamment dans de l'air contenant 5% de C0 ₂ (soit une teneur en oxygène i nférieure à 16%), voire dans une atmosphère aérobie d'air ambiant.

Plus particulièrement encore, dans certains cas, com me explicité ci-après, on cultive la dite bactérie microaérophile intracellulaire da ns une dite atmosphère d'incubation microaérophile comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à 5%, de préférence de 2 à 5%, de préférence encore 2,5% .

Plus particulièrement, l'acide urique est mis en œuvre avec un composé antioxydant choisi de préférence parmi l'acide ascorbique et le glutathion (γ-L-Glutamyl-L-cystei nylglycine) voire l'hydrosulfure de sodium . L'acide ascorbique et le g lutathion sont préférés car ils sont capables à des doses précises de permettre la culture à un niveau d'oxygène plus élevé. Plus particulièrement encore, le dit composé antioxydant est mis en œuvre à une concentration de 1 mg/l à 2 g/1, de préférence au moins 100 mg/l .

De préférence, le dit composé antioxydant est l'acide ascorbique et/ou le gl utathion, de préférence à une concentration d'au moins 100 mg/l .

Plus particulièrement, la dite bactérie est une bactérie cultivable dans un dit milieu de culture en l'absence d'acide u rique ou de dit composé oxydant sous une atmosphère comprenant une proportion molaire en oxygène inférieure à la proportion molaire d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, et on cultive la dite bactérie en présence de dit acide urique dans le dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation comprenant une teneur en oxygène inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air, de préférence inférieure à 20%, de préférence encore supérieure à 5%.

Selon un premier mode de réalisation, la dite bactérie est une bactérie anaérobie extracellulaire cultivable en atmosphère anaérobie en l'absence de dit acide urique ou de dit composé antioxydant, et l'on obtient une croissance de la dite bactérie en présence d'oxygène avec une proportion molaire inférieure ou égale à la proportion d'oxygène dans l'air.

Les bactéries anaérobies peuvent être des bactéries anaérobies strictes ou bactéries anaérobies facultatives aussi dénom mées aéro anaérobies c'est-à-dire des bactéries anaérobies qui tolèrent de l'oxygène mais n'en n'ont pas besoin pour croître ou bactéries aérobies qui supportent l'absence d'oxygène pour croître.

Parmi les bactéries anaérobies strictes, on cite plus particul ièrement les bactéries appartenant aux genres Acidaminococcus, Alistipes, Anaerococcus, Anaerosalibacter, Amazonia, Atopobium, Bifidobacterium, Blautia, Bacteroides, Barnesiella, Clostridium, Collinsella, Dielma, Eggerthella, Finegoldia, Flavonifractor, Fusobacterium, Gordonibacter, Guyana, Holdemania, Odoribacter, Parabacteroides, Parvimonas, Prevotella, Peptostreptococcus, Peptoniphilus, Porphyromonas, Prevotella, Solobacterium, Tissierella, Turicibacter, Ruminococcus et Veillonella.

Parmi les bactéries anaérobies facultatives, on cite plus particulièrement les bactéries appartenant aux genres Actinomyces, Aerococcus, Aeromonas, Aneurinibacillus, Bacillus, Bartonella, Cède ce a, Citrobacter, Corynebacterium, Derambacter, Eikenella, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Gardnerella, Gemella, Granulicatella, Hafnia, Haemophilus Kingella, Klebsellia, Lactobacillus, Lactococcus, Lysinibacillus, Morganella, Paenibacillus, Pasteurella, Pediococcus, Propionibacterium, Proteus, Providencia, Serra tia, Raoultella, Rothia, Staphylococcus, Streptococcus et Weissella.

Selon ce premier mode de réalisation plus particulier, on cultive une bactérie extracellulaire anaérobie notamment une bactérie du tube digestif chez l'homme ou l'animal dans un dit milieu acellulaire en présence d'u ne proportion molaire d'oxygène inférieure ou égale à celle de l'air et en présence de dit acide urique, de préférence en atmosphère d'air am biant.

Ce premier mode de réa lisation est ill ustré dans l'exemple ci- après par la culture aérobie de Bacteroides thetaiotaomicron en présence d'acide urique. II s'agit de bactéries anaérobies strictes du tube digestif, qui normalement ne se cultivent que dans des conditions strictement anaérobies. Ceci se traduit quand on inocule une dite bactérie dans un tube désoxygéné par le fait qu'un voile de culture n'apparaît que dans la partie basse du tube, tandis que la partie haute reste vierge de culture. Si on ajoute, de l'acide urique selon la présente invention à 200pg/ml, la culture se fait pratiquement jusqu'à la surface, voire complètement jusqu'à la surface à la concentration de 500pg/ml et encore mieux à 1 g/1 avec l'acide urique comme avec un mélange d'acide ascorbique à 500pg/ml et de gluthation à 500pg/m l . La bactérie produit en 24h des colonies après ensemencement en gélose. Dans un autre mode de réalisation, la dite bactérie est une bactérie microaérophile intracellulaire a pte à être cultivée dans un dit milieu de culture acell ulaire, sous atmosphère microaérophile avec une proportion molaire en oxygène de pas plus de 5%, de préférence pas plus de 2,5% dans l'atmosphère d'incubation, en l'absence d'acide urique ou de composé antioxydant, et on cultive la dite bactérie en présence d'acide urique dans un dit milieu de culture sous une atmosphère d'incubation microaérophile comprenant une proportion molaire en oxygène entre 2,5% et 20%, de préférence entre 5% et 16%, notamment de l'air éventuellement enrichi à 5% de C0 ₂ . La présente invention s'applique plus particulièrement aux bactéries microaérophiles du fait, entre autres, de l'ajout dudit acide urique.

Parmi les bactéries microaérophiles intracellulaires, on cite plus particulièrement les bactéries des genres Coxiella, Mycobacterium, Helicobacter, Campylobacter et Vagococcus.

Ce mode de réalisation est illustré par la culture aérobie de la bactérie Mycobacterium tuberculosis et Helicobacter cinaedi cultivé à l'air ambiant.

D'autres espèces de bactéries microaérophiles, bactéries anaérobies strictes et des bactéries anaérobies facultatives citées à l'exemple 3 soit environ 250 espèces, ont été testées avec des croissances améliorées obtenues en aérobies dans des milieux de culture polyvalent additivés d'acide u rique.

D'autre caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la l umière de la description détai llée des exem ples de réalisations suivants.

Exemple 1 ; Culture de Bacteroides thetaiotaomicron avec un milieu Schaedler.

Une souche de bactérie anaérobie Bacteroides thetaiotaomicron a été obten ue au travers de l'étude "culturomics" des inventeurs (2) aussi accessible dans divers collections de dépôt (CSUR P766 aussi déposée selon le Traité de Budapest à la col lection de dépôt de microorganismes DSMZ (Allemagne) le 19 mai 2014 sous le numéro DSM 28808, d'autres souches sont aussi accessibles dans divers collections de dépôt telles que les souches DSM 2079, ATCC 29148 et NCTC 10582). Pour leur production en quantité suffisante, B. thetaiotaomicron a été cultivée en atmosphère anaérobie à 37°C dans u n milieu de culture polyvalent. On a testé le milieu de Schaedler (Référence 42098 ; BioMérieux, La Balmes-les-Grottes, France) approprié aussi pour la culture de bactéries anaérobies.

Le milieu Schaedler (commercialisé par Biomerïeux l'étoile, France) présentait la composition suivante pour 1 litre

- Digestat enzymatique de caséine 5.6 g

- Digestat enzymatique de tourteau de soja 1 9

- Digestat enzymatique de tissus animal 5 g

- Extrait de levure 5 g

- NaCI 1.7 g

- Phosphate de potassium 0.82 g

- Dextrose 5.82 g

- Tris (hydroxymethyl) Aminomethane 3 g

- Hemine 0.01 g - L-cysteine 0.4g

Ce milieu Schaedler a été com plémenté par l'ajout des composés hydrocarbonés à savoir de 1 g/L d'amidon de riz et de 1 g/L de glucose (Sigma-AIdrich, Saint-Quentin Fal lavier, France) et l 'ajout d'acide urique et composés anti-oxydants à savoir complémenté par l'ajout de :

- soit 0.1 g/L d'acide ascorbique (VWR International, Louvain, Belgique), 0, 1 g/L d'acide urique et 0, 1 g/L de gl utathion (Sigma- AIdrich, Saint-Quentin Fallavier, Fra nce),

- soit.0. 1 ; 0.2 ou 0.3 g/L d 'acide urique seul comme composé antioxydant.

L'ajout de composés hydrocarbonés amidon et gl ucose visait ici à pour produite H2 pour contrôler la croissance de la bactérie.

La résazurine est mise en œuvre com me un i ndicateur d'oxydo- réduction à une concentration de 0, lmg/mL pour contrôler la présence d'oxygène (la résazurine oxydée a u ne couleur rose, et devient transparente en l'absence d'oxygène) .

La culture aérobie en air ambiant B. thetaiotaomicron a été effectuée par l'inoculation de 10 ⁵ organismes/m L dans un récipient incubé à 37°C contenant le milieu de culture complémenté par l'ajout de composés anti-oxydants et composés source de carbone. Le pH a été ajusté à 7,5 par ajout de KOH 10M .

La souche a été cultivée pa rallèlement en condition aérobie et par l'inoculation de 10 ⁵ organismes/m L avec le milieu de culture complémenté selon la présente invention et avec le milieu Schaedler complémenté par les composés hydrocarbonés mentionnés ci-dessus mais en revanche sans composés anti-oxydants.

Le milieu de culture supplémenté en ajoutant 1 g/L d'amidon de riz et de 1 g/L de glucose inoculé en anaérobie par 10 ⁸ cel lules/L de B. thetaiotaomicron a été introduit com me témoi n positif et pour vérifier la production de H2 par B. thetaiotaomicron en culture anaérobie. Ces contrôles ont été effectués en parallèle en atmosphère ambiante (aérobie) . Le milieu de culture non-inoculé a été introduit comme contrôle négatif.

La croissance de B. thetaiotaomicron a été évaluée quotidiennement par la production d'hydrogène. La mesure d'hydrogène a été réalisée l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse GC-8A (Shimadzu, Champs-sur-Marne, France) équipé d'un détecteur de conductivité thermique et une Chromosorb WAW 80/100 mail les colonne SP100 (Alltech, Carquefou, France) . L'azote N2 à une pression de 100 kPa a été utilisé comme gaz porteur. Le détecteur et les températures de l'injecteur étaient de 200°C et la température de la colonne était de 150°C. Les contrôles négatifs sont restés négatifs sans croissance survenant après une semaine d'incubation indiquant que les résultats rapportés ici ne sont pas simplement le résultat d'une contamination par d'autres microorganismes.

Les contrôles positifs étaient positifs une production d'hydrogène observée dans la culture anaérobie B. thetaiotaomicron. La culture de B. thetaiotaomicron inoculée en aérobie sans composés antioxydants est restée négative et l'hydrogène n'a pas été produit.

Après une incubation de 24 heures à 37°C en air ambiant (dans des conditions aérobies), u n milieu de culture sans composés anti- oxydants a conservé sa couleur rose indiquant la présence d'oxygène et la culture est restée négative pour la souche testée. Le milieu de culture aérobie avec l'acide urique ou les dits composés anti-oxydants est devenu transparent indiquant l'a bsence d'oxygène.

Les cultures de B. thetaiotaomicron réalisées dans des conditions aérobies avec l'acide urique ou les dits composés anti-oxydants donnaient toutes une culture positive pour B. thetaiotaomicron avec production d'hydrogène après une incubation de 24 heures.

Les résultats de croissance avec de l'acide urique sans dit composé antioxydant étaient équivalents à ceux obtenus avec un mélange d'acide urique avec d'acide ascorbique et de glutathion lorsque la concentration en acide urique seul était d'au moins 0.2 g/L et supérieur avec 0.3g/L d'acide urique seul .

Ces résultats indiquent qu'i l est possible de cultiver à l'air ambiant (condition aérobie) des bactéries réputées strictement anaérobies, dans un milieu approprié contenant un mélange approprié d'antioxydants et en particulier avec de l'acide uriq ue seul sans antioxydant.

La procédure de culture est réalisée sur des tubes de milieu de culture du type Schaedler avec 0,2% d'agar (Biomerieux, Marcy l'étoile, France) .

Le milieu Schaedler présentait la composition suivante pour 1 litre :

- Digestat enzymatique de caséine 5.6 g

- Digestat enzymatique de tourteau de soja i g

- Digestat enzymatique de tissus animal 5 g

- Extrait de levure 5 g

- NaCI 1.7 g

- Phosphate de potassium 0.82 g

- Dextrose 5.82 g

- Tris (hydroxymethyl) Aminomethane 3 g

- Hemine 0.01 g

- L-cysteine 0.4g

- Agar (milieu semi-solide) 0.2%

Pour chaque bactérie on inocule 2 tubes, un tube régénéré sans acide urique et un tube régénéré dans lequel on ajoute 500pg/ml ou lmg/ml d'acide urique. Pour régénérer le tube, on le place au bain marie à 100°C jusqu'à ce que toutes les bulles de gaz visibles dans le milieu aient disparu . Ensuite, pour le tube avec acide urique, on attend le refroidissement du tube à 50°C (schématiquement jusqu'à pouvoir le tenir dans la main sans se brûler) et on ajoute la suspension d'acide urique. On homogénéise ensuite par retournement (3-4 pour assurer un bon mélange) . Pour chaque bactérie un inoculum de 10 ⁷ bactéries /m l a été inoculé sur toute la hauteur des tubes Schaedler 0,2%, un normal et un complémenté en acide urique. Les tubes ont été incubés à 37°C dans une étuve anaérobie stricte durant 24-48 heures.

Dans ces conditions, il a été observé une croissance habituel le des bactéries depuis le fond du tube jusqu'à 1, 5 cm en dessous de la surface du milieu en absence d'acide urique témoignant du caractère anaérobie de cette bactérie, et une croissance jusqu'à la surface en présence de 500 Mg/ml (28 X 10 ^"4 M ) d'acide urique indiquant une croissance en présence d'une tension d'oxygène plus grande qu'en l'absence d'acide urique.

Des tests en tous points identiques ont été réalisés soit avec du gluthation ou de l'acide ascorbique à 500pg/ml . Avec l'acide urique seul, la croissance est identique à ce qui est observé avec l'acide ascorbique.

Enfin, afin de valider définitivement la capacité de ce composé acide urique à autoriser la croissance de bactéries anaérobies strictes en présence d'oxygène, on a préparé des milieux solides constitués de milieu Columbia avec 5% de sang de sang de mouton dans lesquels ont été ajouté de l'acide urique à 500pg/ml ou lmg/m l, ou un mélange gluthation à 500 g/m l + acide ascorbique à 500pg/m l ou de l'acide ascorbique à lmg/ml . Ces géloses inoculées de bactéries anaérobies ont été incubées soit en air ambiant soit en air ambiant enrichi de 5% de C02. La meilleure pousse ayant été obtenue avec de l'acide urique ou l'acide ascorbique à lmg/ml indifféremment.

Ces tests ont été réalisés avec un milieu Col umbia 5% de de mouton présentant la composition suivante pour 1 litre:

-Digestat enzymatique de caséine 5 g -Digestat enzymatique de tissus animal 8 g

-Peptone enrichie de levure 10 g

-Amidon de maïs 1 g

-NaCI 5 g

-Agar (si milieu gélosé) 14 g -Sang de mouton 5%

Exemple 2 : Effet de l'acide urique sur la culture Helicobactex cinaedi.

On a utilisé une souche DSMZ 5359 cultivée da ns le même milieu de culture Schaedler que décrit à l'exemple 1 et dans les mêmes conditions opératoires d'aérobiose aux mêmes concentrations d'acide urique excepté que l'on n'a pas complémenté le milieu de culture par l'ajout de composés hydrocarbonés amidon et glucose.

La bactérie a été établie en culture en 24h et confirmée par spectrométrie de masse de type Maldi tof.

Exemple 3 : Effet de l'acide urique sur la croissance de Mycobacterium tuberculosis.

Dans cet exemple, les inventeurs ont com paré la croissance de la mycobactérie Mycobacterium tuberculosis, agent de la tuberculose humaine et animale, sur trois milieux solides, dans des conditions identiques de température (37°C) et d'atmosphère (5% C02) . La souche type M. tuberculosis H37Rv calibrée à 10 ⁷ unités formant colonies (CFU) et quatre souches cliniques de M. tuberculosis calibrées à 10 ⁵ CFU ou 10 ⁶ CFU ont été inoculées da ns des boîtes de Pétri stériles dans un milieu MOD4 décrit ci-après enrichi en acide ascorbique à 100 mg/L (MOD5), ou en acide urique à 100 mg/L (MOD6) ou en acide urique à 200 mg/L (MOD7). Cinq boîtes ont été ensemencées pour chaque condition .

Les résultats des temps de détection à l'œil nu de colonies en jours sont présentés dans le tableau ci-après.

Ces résultats montrent qu'il n'y a une amélioration de croissance significative par ajout d'acide urique ou acide ascorbique et pas de différence significative dans la croissance de M. tuberculosis entre l'acide ascorbique et l'acide urique, montrant la possibilité d'utiliser l'acide urique com me antioxydant pour la culture en atmosphère aérobie des mycobactéries, à une concentration au moins égale à 100 mg/L.

Patient 1 : 10 ^? UFC/mL MOD 5 MOD 6 MOD 7 j

Moyenne

4 4,25 3,25

(jours)

Écart-type 0,81649658 1,25830574 1,89296945

Patient 2 : 10 UFC/mL MOD 5 MOD 6 MOD 7

Moyenne

6,5 4,5 5,25 (jours)

Écart-type 1,29099445 1,29099445 0,5

i

Patient 3 : ÎO UFC/mL MOD 5 MOD 6 MOD 7

Moyenne

2,25 2,75 4,75 (jours)

Ecrat-type

0,95742711 0,95742711 1,5

Patient 4 ; 10 ⁵ UFC/mL MOD 5 MOD 6 MOD 7

Moyenne

5,75 0,5 3,75 (jours)

r

Écart-type 1,5 0,57735027 1,5

j

Les résultats permettent de conclure à une détection plus rapide des colonies par ordre décroissant avec une détection à :

- t= environ en moyenne 3 à 5 jours pour un milieu MOD6 ou MOD 7 (acide urique) ou MOD 5 (acide ascorbique) indifféremment, et - t= environ 8.5 à 10 jours (10 ⁷ cfu/mL) pourMOD4. Tableau A : composition de Milieu MOD4

Composants Quantité

Sulfate de magnésium 0.05g/L

Citrate d'ammonium ferrique 0.04 g/L

Citrate de sodium 0.4 g/L

Sulfate d'ammonium 0.5 g/L

Glutamate de monosodium 0.5 g/L

Phosphate de disodium 1.5 g/L

Phosphate de monopotassium 1.5 g/L

Tween 80 5 g/L

Pyridoxine 1.0 mg/L

Sulfate de zinc 1.0 mg/L

Sulfate de cuivre 1.0 mg/L

Biotine 0.5 mg/L

Chlorure de calcium 0.5 mg/L

OADC 100.0 ml/L

Glycérol 5.0 ml/L

Sang de mouton 50 ml/L

Sérum de veau feotal décomplémenté 150 ml/L

Lecithine d'œuf 5g/L

Extrait de levure 1.0 g/L digestat de caséine pancréatique 1.0 g/L

Glucose 2.0 g/L

Albumine de sérum bovin 1.65 g/L

Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) 22 g/L

Vinylpyrrolidine Copolymère 2 ml/L

Acide citrique 101 mg/L

Hémine 330 pg/L

Agar 13 g/L Exemple 4 : Effet de l'acide urique dans un milieu solide Shaedler sur la croissance d'un panel de bactéries.

1) Les bactérie anaérobies et microaérophiles suivantes ont été cultivées en aérobie (sous atmosphère d'air ambiant) à 37°C avec des 5 croissances améliorées dans un milieu de culture solide consistant en un milieu Schaedler à 0.2% agar (Sigma-AIdrich, Saint-Quentin Fallavier, France) décrit à l'exemple 1 supplémenté avec lg/L acide ascorbique (VWR, Leuven, Belgium) + 100 mg/L de gl utathion (Sigma, Quentin Fallavier, France) + 400 mg/L d'acide urique (Sigma, Quentin 10 Fallavier, France).

Le pH était ajusté à 7.5 avec 10M KOH avant passage dans l'autoclave. Les composés antioxydants étaient dissous dans 10 mL d'eau distil lée, filtré avec un microfiltre de 0.2 pm puis ajouté dans le milieu autoclavé à 50°C pour être stérîlé avant d'être refroidi sous 15 forme solide en gélose.

Dans les tableaux ci-après les temps de croissance correspondent à l'apparition des premières colonies visibles à l'œil nu .

Tableau 1A: bactéries anaérobies strictes (82 espèces et 145 souches).

Nombre de Temps de

Phylum Genre espèces

souches testées Croissance

Actinobacteria Bifidobacterium Bifidobacterium adolescentis 1 72H

Bifidobacterium brevis 1 72H

Bifidobacterium catenulatum 1 72H

Bifidobacterium longum 1 72H

Bifidobacterium pseudocatenulatum 1 72H

Collinsella Collinsella aerofaciens 1 96H

Collinsella massilioamazoniensis 2 72H

Collinsella tanakaei 2 96H

Eggerthella Eggerthella lenta 2 48H

Gordonibacter Gordonibacter pamelaeae 1 72H

Bacteroidetes Alistipes A listipes finegoldii 2 96H

Alistipes indistinctus 4 96H

Alistipes putredinis 1 96H

Alistipes shahii 2 96H Bacteroides Bacteroides caccae 6 7211

Bacteroides fragilis 2 48H

Bacteroides intestnalis 5 48H

Bacteroides nordii 1 48H

Bacteroides ovatus 3 48H

Bacteroides stercoris 1 48H

Bacteroides thetaiotaomicron 1 48H

Bacteroides timonensis 1 72H

Bacteroides uniformis 1 48H

Bacteroides vulgatus 1 48H

Barnesiella Barnesiella intestinihominis 2 48H

Odoribacter Odoribacter splanchnicus 1 48H

Parabacteroides Parabacteroides distasonis 1 48H

Parabacteroides johnsonii 1 48H

Parabacteroides merdae 1 48H

Porphyromonas Porphyromonas asaccharolityca 1 72H Prevotella Prevotella buccalis 1 72H

Firmicutes Acidaminococcus Acidaminococcus intestini 2 48H

Amazonia Amazonia massiliensis 1 48H

Anaerococcus Anaerococcus vaginalis 7 72H

Anaerosalibacter Anaerosalibacter bizertensis 2 72H

Anaerosalibacter massiliensis 3 72H

Blautia Blautia coccoides 1 96H

Clostridium Clostridium amazonitimonense 1 72H

Clostridium amylolyticum 1 72H

Clostridium anorexicamassiliensis 2 72H

Clostridium anorexicus 3 72H

Clostridium baratii 1 72H

Clostridium bartlettii 1 72H

Clostridium bifermentans 1 72H

Clostridium bolteae 1 72H

Clostridium butyricum 4 72H

Clostridium clostridioforme 2 72H

Clostridium cochlearium 1 72H

Clostridium dakarense 1 72H

Clostridium difficile 1 96H

Clostridium glycolicum 3 72H

Clostridium hathewayi 3 48H

Clostridium jeddahense 2 72H

Clostridium lituseburense 1 72H

Clostridium paraputrificum 3 72H

Clostridium perfringens 2 72H

Clostridium ramosum 1 72H Clostridi m rubiinfantis 1 72H

Clostridi m sartagoforme 1 72H

Clostridium sénégalaise 4 72H

Clostridium sordellii 4 48H

Clostridium sporogenes 3 72H

Clostridium subterminale 3 72H

Clostridium symbiosum 1 72H

Clostridium tertium 2 48H

Diel a Dielma fastidiosa 1 48H

Finegoldia Finegoldia magna 1 48H

Flavonifractor Flavonifractor plautii 2 48H

Guyana Guyana massiliensis 1 72H

Holdemania Holdemania massiliensis 1 72H

Parvimonas Parvimonas micra 1 72H

Peptoniphilus Peptoniphilus asaccharolyticus 3 72H

Peptoniphilus harei 1 72H

Peptoniphilus senegalensis 2 72H

Peptostreptococcus asaccharolyticus 1 72H

Ruminococcus Ruminococcus gnavus 1 48H

Tissierella Tissierella praeacuta 1 72H

Turicibacter Turicibacter sanguinis 1 72H

Veillonella Veillonella dispar 2 48H

Veillonella parvula 1 48H

Fusobacteria Fusobacterium Fusobacterium necrophorum 2 48H

Fusobacterium nucleatum 1 48H

Tableau 1B: bactéries microaéroph i les (7 espèces, 7 souches testées)

Temps de

Phylum Genres espèces Nombre de souches croissance

Actinobacteria Mycobacterium Mycobacterium smegmatis 1 96H

Proteobacteria Campylobacter Campylobacter coli 1 48H

Campylobacter concisus 1 48H

Campylobacter cuniculorum 1 48H

Campylobacter fétus 1 48H

Campy lobacter je juni 1 48H

Firmicutes Vagococcus Vagococcus fluvialis 1 48H Tableau 1C: bactéries anaérobies facultatives (154 espèces, 421 souches)

Nombre de Temps de

Phylum Genres espèces

souches croissance

Actinobacteria Actinomyces Actinomyces neuii 2 48H

Actinomyces oris 4 48H

Actinomyces radingae 1 48H

Actinomyces urogenitalis 1 48H

Corynebacteriuin Corynebacterium accolens 2 48H

Corynebacteriuin afermentans 5 48H

Corynebacterium amycolatum 3 48H

Corynebacteriuin aurimucosum 1 48H

Corynebacterium efficiens 1 48H

Corynebacteriu jeikeiuin 2 48H

Corvnebacterium minutissimum 1 48H

Corynebacterium propinquum 1 48H

Corynebacterium pseudodiphtheriticum 4 48H

Corynebacterium simulans 2 48H

Corynebacterium striatum 2 48H

Corynebacterium suicordis 1 48H

Corynebacterium urealyticum 2 48H

Corynebacterium ihumii 1 48H

Coi nebacterium tuberculosteariciim 3 48H

Corynebacterium ureicelerivorans 1 48H

Dermabacter Dermabacter hominis 2 48H

Gardnerella Gardnerella vaginalis 2 24H

Propionibacterium Propionibacterium acnés 4 24H

Propionibacterium avidum 2 24H

Rothia Rothia aeria 1 48H

Rothia dentocariosa 2 24H

Firmicutes Aerococcus Aerococcus urinae 2 48H

Aerococcus viridans 2 48H

Aneurinibacillus Aneurin ibacillus migulanus 1 24H

Bacillus Bacillus amyloliquefaciens 2 36H

Bacillus aquimaris 1 48H

Bacillus arsenicus 1 24H

Bacillus badins 1 24H

Bacillus bataviensis 1 24H

Bacillus cereus 7 24H

Bacillus circulons 3 24H

Bacillus clausii 1 24H

Bacillus coagulons 1 24H

Bacillus firmus 2 24H

Bacillus flexus 4 24H Bacillus koreensis 1 24H

Bacillus lentus 1 24H

Bacillus liqueniformis 4 24H

Bacillus massilioamazoniensis 1 24H

Bacillus megaterium 1 24H

Bacillus oleronius 1 24H

Bacillus pumilus 3 24H

Bacillus rubiinfantis 1 24H

Bacillus siralis 4 24H

Bacillus subtilis 6 24H

Bacillus thermoamylovorans 3 24H

Bacillus vallismortis 1 24H

Enterococcous Enterococcus avium 9 24H

Enterococcus casseliflavus 3 24H

Enterococcus cecorum 1 24H

Enterococcus dispar 2 24H

Enterococcus durons 9 24H

Enterococcus faecalis 13 24H

Enterococcus faecium 10 24H

Enterococcus gallinarum 10 24H

Enterococcus hirae 8 24H

Enterococcus malodoratus 2 24H

Enterococcus phoeniculicola 1 24H

Enterococcus pseudoavium 1 24H

Enterococcus raffinosus 1 24H

Eubacterium Eubacterium limosum 2 24H

Eubacterium tenue 3 24H

Gemella Gemella morbillorum 2 24H

Granulicatella Granulicatella elegans 1 72H

Lactobacillus Lactobacillus agilis 3 24H

Lactobacillus fermentum 3 24H

Lactobacillus gasseri 2 24H

Lactobacillus johnsonii 1 24H

Lactobacillus kalixensis 1 24H

Lactobacillus mucosae 2 24H

Lactobacillus paracasei 2 24H

Lactobacillus plantarum 2 24H

Lactobacillus reuteri 3 24H

Lactobacillus sakei 4 24H

Lactococcus Lactococcus garvieae 1 24H

Lactococcus lactis 1 24H

Lysinibacillus Lysinibacillus boronitolerans 2 24H

Lysinibacillus fusiformis 1 24H Lysinibacillus meyeri 1 2 I I

Lysinibacillus sphaericus 2 2411

Paenibacillus Paenibacill s lactis 2 48 H

Pediococcus Pediococcus acidilactici 1 48 H

Pediococcus pentosaceus 2 48 H

Staphylococcus Staphylococcus aureus 4 24H

Staphylococcus capitis 6 2411

Staphylococcus caprae 4 24H

Staphylococcus colviii 7 2411

Staphylococcus epidermidis 2 24H

Staphylococcus faecalis 2 24 H

Staphylococcus haemolyticus 6 24 H

Staphylococcus hominis 3 24H

Staphylococcus intermedius 3 2411

Staphylococcus lugdunensis 6 24 H

Staphylococcus pasteuri 3 24H

Staphylococcus pettenkoferi 2 2411

Staphylococcus saprophyticus 3 24H

Staphylococcus schleiferi 2 24H

Staphylococcus simulons 5 2411

Staphylococcus warneri 4 24 H

Streptococcus Streptococcus agalactiae 3 24 H

Streptococcus anginosus 4 2411

Streptococcus constellatus 2 2411

Streptococcus cristatus 3 24H

Streptococcus dysgalactiae 5 24H

Streptococcus equinus 4 2411

Streptococcus gallolyticus 2 2411

Streptococcus gordonii 2 24 H Streptococcus intermedius 3 2411 Streptococcus lutetiensis 7 24 H

Streptococcus mitis 5 24 H

Streptococcus oralis 5 24H

Streptococcus parasanguinis 4 24H

Streptococcus pneumoniae 3 24ΙΊ

Streptococcus pyogenes 1 24 H

Streptococcus salivarius 3 2411

Streptococcus sanguinis 2 48H Weissella Weissella cibaria 2 48H

Proteobacteria Aeromonas Aeromonas urinae 2 48H

Aeromonas hydrophila 1 48H

Bartonella Bartonella henselae* 1 120H

Cedecea Cedecea lapagei 1 2411 Cedecea neteri 1 24H

Citrobacter Citrobacter braakii 4 24H

Citrobacter freundii 2 24H

Citrobacter koseri 3 24H

Citrobacter sedlakii 1 24H

Enterobacter Enterobacter aerogenes 4 24H

Enterobacter asburiae 2 24H

Enterobacter cloacae 5 24H

Enterobacter kobei 2 24H

Eikenella Eikenella corrodens 1 48H

Escherichia Escherichia coli 10 24H

Hafnia Hafnia alvei 2 48H

Haemophilus Haemophilus influenzae* 3 48H

Haemophilus parainfluenzae* 3 48H

Kingella Kingella kingae 1 24H

Klebsiella Klebsiella oxytoca 2 24H

Klebsiella pneumoniae 3 24H

Morganella Morganella morganii 2 48H

Pasteurella Pasteurella multocida 3 48H

Prote s Proteus mirabilis 2 24H

Proteus vulgaris 3 24H

Providentiel Providencia heimbachae 1 24H

Providencia rettgeri 2 24H

Providencia stuartii 2 24H

Serratia Serratia liquefaciens 2 24H

Serratia marcescens 3 24H

Serratia ureilytica 1 24H

Raoultella Raoultella ornithinolytica 1 48H

2) 13 bactéries anaérobies et 1 bactérie microaérophile (Campylobacter) ont été testée comparativement cultivées en aérobie (sous atmosphère d'air ambiant) à 37°C avec des croissances améliorées dans un milieu de culture solide consistant en un milieu Schaedier à 0.2% agar non supplémenté ou supplémenté avec :

- soit lg/L acide ascorbique,

- soit 400 mg/L d'acide urique, et - soit lg/L acide ascorbique + 400 mg/L d'acide urique.

Les bactéries testées étaient : Bacteroides ovatus, Clostidium massilioamazoniensis, Anaerosalibacter bizertensis, Clostrididum paraperfringens, Clostridium sporogenes, Peptoniphilus harei, Finegoldia magna, Turicibacter sanguinis, Propionibacterium acnés, Bacteroides timonensis, Eikenella corrodens, Clostridium gtycolicum, Bifidobacterium b revis, Campylobacter ureolyticus.

Les résultats rapportés au tableau 2 montrent que 5 bactéries soit environ 1/3 des bactéries n'ont une croissance améliorée qu'avec l'acide urique (AU) seul ou en combinaison avec l'acide ascorbique (AA) et pas avec l'acide ascorbique seul .

Dans le tableau 2 : - «o» signifie: aucune colonie détectée à l'œil nu à t=96h, et -« positive » signifie: colonies détectée à l'œil nu à t=96h . Tableau 2

Exem ple 5 : Effet de l'acide uriq ue da ns un milieu liq uide d'hémoculture sur la croissance de bactéries anaérobies.

On a réalisé des hémocultures de bactéries anaérobies strictes inoculée à 10 ⁵ cfu/m L sur milieu de culture : BD BACTEC™ Plus Aerobic/F. comprenant 25 ml de bouillon Trypticase soja enrichi, avec résines (Référence : 442192) à 37°C en atmosphère aérobie avec acide urique à 400mg/L et sans acide urique et en atmosphère anaérobie sans acide urique. La détection de la croissance se faisait par détection de production de C02 avec le dispositif BD BACTEC™ 9000 Séries Instrumented Blood Culture Systems.

Les résultats comparatifs de croissance rapportés au tableau B ci-après établissent que la détection de croissance est légèrement plus rapide en atmosphère aérobie avec acide urique (« AU » dans le tableau B) à 400mg/L qu'en atmosphère anaérobie et considérablement plus rapide qu'en aérobie sans acide urique.

Tableau B

Temps de Temps de Temps de

croissance croissance croissance Moyennes écart types

Clostridium Aérobie

tertium avec AU 4h 5h 4h 4,33333333 0,57735027

Clostridium Aérobie

tertium Sans AU 96h 96h 96h 96 0

Clostridium Anaérobie

tertium Sans AU 6h 4h 6h 5,33333333 1,15470054

Clostridium Aérobie

perfringens avec AU 7h 5h 6h 6 1

Clostridium Aérobie

perfringens Sans AU 96h 96h 96h 96 0

Clostridium Anaérobie

perfringens Sans AU 5,5h 4h 4,5h 4,66666667 0,76376262

Clostridium Aérobie

butirycum avec AU 8h 6h 6h 6,66666667 1,15470054

Clostridium Aérobie

butirycum Sans AU 96h 96h 96h 96 0

Clostridium Anaérobie

butirycum Sans AU 4h 6h 5h 5 1 Références bibliographiques

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