UTILIZACIóN DE VALPROATO PARA EL TRATAMIENTO DEL MIEDO Y LA FOBIA EN SUJETOS CON LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de valproato para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del miedo y la fobia en sujetos que padecen la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por una pérdida de memoria progresiva y síntomas neuropsiquiátricos , tales como delirios, agitación, apatía, agresividad, ansiedad y fobia. La AD representa hoy en día una de las principales preocupaciones públicas mundiales ya que se ha convertido en la forma más común de enfermedad demente que aparece en una etapa tardía de la vida, que requiere una cantidad enorme de recursos humanos, médicos y económicos. La verdadera carga de esta enfermedad para las sociedades sólo está emergiendo ahora, considerando que la esperanza de vida está creciendo de forma constante y el número creciente de gente que alcanza una edad anciana (Alzheimer 's Disease: A Physician's Guide to Practical Management. Brigitte Zoeller ed. Lit. Richter, Ralph W. Richter) .

El miedo y la ansiedad son experiencias normales que los sujetos sanos pueden experimentar, pero cuando estas sensaciones se vuelven insoportables y desproporcionadas para la situación, pueden representar un trastorno de ansiedad. El sentimiento de aprensión y miedo aparecen, en la ansiedad, conjuntamente con síntomas físicos, tales como palpitaciones, sudoración y

sentimiento de estrés. A diferencia de la ansiedad breve y benigna provocada por un suceso estresante, tal como la presentación de un negocio o una primera cita, los trastornos de ansiedad son crónicos, implacables, y pueden ir progresivamente a peor si no son tratados. Los trastornos de ansiedad afectan al 35-50% de la gente con déficits cognitivos ligeros y AD (Ferretti et al., 2001; Moran et al . , 2004) .

Entre los trastornos de ansiedad se incluyen fobias, tales como fobia social (o trastorno de ansiedad social) y fobias específicas, trastorno del pánico, trastorno obsesivo-compulsivo, trastorno por estrés post- traumático, y trastorno de ansiedad generalizado.

Las fobias son el tipo más común de trastorno de ansiedad. Las fobias sociales implican miedos a realizar ciertos comportamientos ante otras personas, tales como hablar en público. Las fobias específicas están caracterizadas por miedos y la evasión de objetos o situaciones específicos, así como el reconocimiento de que los miedos no están justificados. Las fobias se pueden desarrollar de diferentes maneras: se pueden aprender por tener directamente una experiencia negativa con un objeto o situación; o indirectamente al observar a alguien mostrando miedo o al oír repetidos avisos . Los factores biológicos, tales como el tener un sistema nervioso simpático demasiado reactivo y lento para acostumbrarse a falsas señales del miedo, pueden incrementar la probabilidad de las personas para desarrollar un trastorno de ansiedad. Una vez las personas han desarrollado una fobia, su miedo se mantiene mediante un número de factores, incluyendo el alivio que sienten al evitar el objeto o situación temidos, y los prejuicios cognitivos que les provoca que se centren en amenazas e interpreten situaciones de la manera más amenazante.

El ácido valproico es un compuesto antiepiléptico descrito en el Physician Desk Reference, 52nd ed. , página 421 (1998) . Tras la ingestión oral en el tracto gastrointestinal, el grupo ácido se disocia para formar un grupo carboxilato, es decir, un ion valproato. También se utiliza como valproato sódico, la cual se describe en detalle en The Merck Index, 12th ed. , página 1691 (1996) . Se pueden encontrar descripciones más detalladas en el Physician Desk Reference, 52 ^a ed. , página 417 (1998) . También se han publicado documentos que estudian el efecto del valproato en el tratamiento del trastorno de la ansiedad con resultados variables.

Por un lado, se ha observado que este compuesto reduce los síntomas de ansiedad y psicosis que son inducidos tras la re-exposición a experiencias amenazantes para la vida en trastornos del pánico y por estrés post-traumático (PTSD) . (Davis et al., 2000. Comprehensive review of the psychiatric uses of valproate. J Clin Psychopharmacol 20, 1S-17S) . Primeau F. et al. (Can J Psychiatry. 1990 Apr; 35(3) : 248-50) también apoyan la hipótesis de que el valproato es útil en el tratamiento de trastornos del pánico. La misma aplicación del valproato en el tratamiento del trastorno del pánico se ha descrito también por Keck PE et al. (Biol Psychiatry. 1993 Apr 1 ; 33(7) : 542-6) .

Además, la efectividad del valproato en la fobia social se describió en in Kinrys G et al. (Int Clin Psychopharmacol. 2003 Mayo; 18(3) : 169-72); y en Townsend MH et al. (Compr Psychiatry. 2005 Sep-Oct; 46(5) : 368-70), donde los pacientes con trastornos psicóticos tratados con valproato tenían unos resultados de ansiedad, tensión y excitación de la escala BPRS (Brief Psychiatric Rating Scale) , así como los resultados totales de agitación de BPRS.

Por otro lado, la efectividad del valproato en el tratamiento de diferentes síntomas psiquiátricos en diferentes tipos de pacientes se ha matizado en los siguientes estudios. Woodman et al. (J Clin Psychiatry. 1994 Apr; 55(4) : 134-6) sugieren que el ácido valproico puede ser eficaz para el tratamiento del trastorno del pánico en pacientes diagnosticados con DSM-II-R primario (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 3rd ed. by the American Psychiatric Association) del trastorno del pánico; mientras que el efecto en la evasión fóbica no es significativa .

La revisión exhaustiva de los usos psiquiátricos de valproato de Davis et al. (J Clin Psychopharmacol . 2000 Feb; 20 (1 Suppl 1):1S-17S) concluye que el valproato muestra la eficacia más prometedora en el tratamiento de los trastornos de humor y de ansiedad, con una posible eficacia en el tratamiento de la agitación y la agresión impulsiva, y una respuesta terapéutica menos convincente en el tratamiento de la psicosis y el retraimiento o dependencia del alcohol .

Bowden CL. (Expert Rev Neurother. 2007 Jan; 7(1) : 9-16) indica un perfil más definido de la utilidad del valproato sódico en trastornos bipolares, principalmente para características básicas d4 la sintomatología maníaca (por ejemplo, impulsividad, hiperactividad e irritabilidad) , con poca evidencia de ventajas para la ansiedad o la psicosis. El valproato parece eficaz en otros trastornos de comportamiento incluidos en los dominios de trastornos bipolares, tales como la esquizofrenia..

Sin embargo, y para nuestro conocimiento, ninguno de estos estudios previos investigó la utilización del valproato en la reducción del miedo y la fobia en pacientes con AD. Sólo estudios pilotos preliminares

sugieren que el valproato mejora la tasa de agitación y reduce el comportamiento agresivo en pacientes dementes (Porsteinsson et al., 2003; Sival et al., 2004) . No es necesario decir que siendo la enfermedad de Alzheimer la causa más común de demencia, muchas otras enfermedades también pueden provocar demencia.

Es pertinente señalar que la selección de sujetos con AD como un grupo especifico de pacientes a estudiar para el tratamiento del miedo y la fobia se sostiene por el hecho de que las regiones cerebrales implicadas en la irrupción de la ansiedad en pacientes con AD en comparación con otros tipos de pacientes son diferentes (véase, por ejemplo, J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2006 FaIl, 18(4) : 521-8; Neurobiology of mental illness Charney and Nestler, Oxford University Press, Table 42:1, page 655; and J Neuropsychiatry Clin Neurosci. 2006 FaIl, 18(4) : 521-8) .

En un esfuerzo por elucidar los mecanismos neurales y patológicos que conducen a la ansiedad y el miedo en la AD, se ha observado sorprendentemente que el valproato reduce de manera eficaz las respuestas al miedo condicionados y no condicionado en modelos de ratones transgénicos de la enfermedad de Alzheimer, demostrando que un tratamiento a corto plazo con valproato tiene efectos ansiolíticos en sujetos con AD. En gran medida, se ha observado que mientras el valproato reducía de manera significativa las respuestas al miedo en sujetos con AD, no tenía efecto en los sujetos de control sometidos a las mismas condiciones experimentales y de estimulación, hallando de este modo y de manera inesperada una nueva utilidad terapéutica para el valproato en base al subgrupo de pacientes .

Descripción resumida de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de valproato para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con la enfermedad de Alzheimer. La presente invención también se refiere a un procedimiento para el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con la enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración a dicho sujeto con la enfermedad de Alzheimer de una cantidad eficaz de valproato.

En una realización, la presente invención se refiere a la utilización de valproato para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del miedo asociado con el trastorno de ansiedad en un sujeto con la enfermedad Alzheimer.

En otra realización, la presente invención se refiere a la utilización del valproato para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la fobia asociado con un trastorno de ansiedad en un sujeto con la enfermedad Alzheimer, en la que dicha fobia es una fobia específica o una fobia social.

En otra realización, la presente invención se refiere a las utilizaciones anteriores de valproato, en las que el sujeto con la enfermedad de Alzheimer se encuentra en una etapa inicial de dicha enfermedad de

Alzheimer .

En otra realización, la presente invención se refiere a las utilizaciones anteriores de valproato en las que el tratamiento de miedo o fobia comprende la profilaxis de dicho medio o fobia.

En otra realización, la presente invención se refiere a una pauta de dosificación en su utilización para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con enfermedad de Alzheimer, en particular para el tratamiento del miedo

condicionado o no condicionado, en el que dicho tratamiento comprende la administración diaria de dosis efectivas o terapéuticamente óptimas de 1 a 40 mg/kg de peso corporal total de valproato, de aproximadamente 20 a 30 mg/kg, de 10 a 20 mg/kg, o aproximadamente de 16, 17, 18 ó 19 mg/kg.

Descripción de las figuras

Figura 1. Aumento de la neofobia en ratones transgénicos APP y 3xTg-AD

El diseño experimental del comportamiento consistió en la manipulación durante tres días antes de una sesión de entrenamiento de la neofobia seguido del test de miedo condicionado al contexto (CFC) y el laberinto acuático de

Morris (MWM) tal y como se describe en Materiales y

Procedimientos (A) . Los ratones transgénicos APPi _n d (B) ,

APP _Sw , i _nd (C) , 3xTg-AD (D) y los ratones de tipo salvaje

(WT) de la misma carnada (n = 8-9) de 6 meses de vida se pusieron a prueba en un medio nuevo de luz brillante. El comportamiento a la congelación se valoró como una medida de la neofobia durante 3 minutos. Todos los grupos muestran niveles similares de congelación durante el primer minuto (Tl) . Sin embargo, los ratones APPi _nd , APP _Sw , m _d , y 3xTg-AD muestran una aumento significativo de la congelación durante el segundo (T2) y tercer (T3) minuto en comparación con los ratones de control (APP _Ind ; F (1,42) = 10,2, p<0,003; APP _Sw ,i _nd : F (1,48) = 13,7, p < 0,0005; 3xTg-AD: F (1, 42) = 10.1; p < 0,003) . * p < 0,05, ** p < 0,01.

Figura 2. Respuestas de miedo alteradas en el test de miedo condicionado al contexto en ratones APP y 3xTg-AD. Se evaluaron las respuestas a la congelación de ratones transgénicos APPi _nd (A) , APP _Sw , md (B) , 3xTg-AD (C) y sus ratones de control (WT) de la misma carnada de 6 meses de

vida en el test de miedo condicionado al contexto . Los tres grupos transgénicos muestras niveles crecientes de inmovilización inmediatamente después de recibir una descarga eléctrica (Inmediato) . Los ratones APPi _nd (n = 9) y de control (n=9) muestran niveles similares de inmovilización (aproximadamente el 40%) a las 24 horas, mientras que los ratones APP _Sw , m _d (n=9) y 3xTg-AD (n=8) muestran niveles significativamente más elevados de inmovilización (-60-80%) . *p<0,05, **p<0,005. Figura 3. Déficits de memoria espacial en ratones APP y 3xTg-AD de 6 meses de edad.

El laberinto acuático de Morris consistía en un entrenamiento de 5 días en la versión de plataforma escondida de la tarea (4 pruebas por día) seguida de una prueba (1 minuto) en el último día. (A, D, G) El análisis de las distancias recorridas (longitud de avance) revela diferencias estadísticamente significativas entre los ratones APP _Ind (n=7) (A), APP _Sw , _Ind (n=9) (D) y 3xTg-AD (n=8) (G) y los correspondientes ratones control no transgénicos de 6 meses de edad (p<0,001) . Estos datos indican que los ratones transgénicos APP _Ind , APPa,,^ y 3xTg-AD mostraron déficits de aprendizaje durante el entrenamiento MWM. (B, E, H) . Porcentaje de tiempo empleado en cada cuadrante durante la prueba realizada 2 horas después del último día en el laberinto acuático de Morris en ratones transgénicos

APPm _d (B) , APP _Sw , _Ind (E) y 3xTg-AD (H) . En las pruebas todos los grupos de control mostraron un nivel de ocupación significativamente más elevado del cuadrante diana (T) en comparación con otros cuadrantes (p<0,001), mientras que los ratones transgénicos APPi _nd , APP _Sw ,in _d y

3xTg-AD emplearon menos tiempo en la búsqueda de la plataforma diana virtual (p>0,05) . (C, F, I) . Número de cruces en cada punto de la plataforma virtual durante la prueba en el laberinto acuático de Morís en ratones transgénicos APPm _d (C) , APP _Sw ,i _nd (F) y 3xTg-AD (I) . Los

ratones transgénicos APPmd / APP _Sw ,ind y 3xTg-AD cruzan la plataforma diana con menos frecuencia que los ratones de control . El número de cruces de la plataforma diana respecto los cruces en las otras plataformas fue significativamente superior en ratones control (p<0,0001) en comparación con ratones APPi _n< a, APP _Sw ,ind Y 3xTg-AD. Estos datos indican que los ratones APP y 3xTg-AD de 6 meses muestran un déficit de memoria espacial. OP, cuadrante opuesto; AR, derecha adyacente; T, cuadrante diana; AL, adyacente izquierda. *p<0,005, **p<0, 001

Figura 4. Acumulación de Aβ intraneuronal en la amígdala de ratones transgénicos APP y 3xTg-AD. (A, B, C) La tinción de Nissl de secciones coronales muestra estructuras corticales y de amígdala (cajas) en ratones APPind/ APP _Sw ,ind y 3xTg-AD de 6 meses de edad. Barra de la escala: 200 μm

(D, E, F) Imágenes ampliadas de secciones de cerebro adyacentes de los paneles izquierdos (A, B y C) se tiñeron con una anticuerpo anti-Aβ (6ElO) para revelar la presencia de Aβ intraneuronal en la amígdala de ratones

APPmd/ APP _Sw ,ind y 3xTg-AD. Barra de la escala: 50 μm

(G, H, I) Imágenes ampliadas de la amígdala basolateral mostradas en los paneles izquierdos (D, E, F) . Las imágenes muestran la acumulación de Aβ como puntos pequeños en la soma y proyecciones de algunas neuronas (flecha) , pero estaba ausente en neuronas grandes piramidales (cabeza de flecha) en ratones APP _Ind y APP _SW/Ind . Sin embargo, en ratones 3xTg-AD, la Aβ intraneuronal se detectaba principalmente en la soma de neuronas de tipo piramidal

(flecha), mientras que estaba ausente en pequeñas interneuronas de la amígdala basolateral (cabeza de flecha) . Imagen capturada a 40 x. Barra de escala: 10 μm (J, K, L) Las secciones de cerebro coronales de ratones controles no transgénicos de la misma carnada se tiñeron

con anticuerpo anti-Aβ (6E10) . El análisis por microscopio reveló la ausencia de Aβ intraneuronal que tiñe las neuronas amigdalares en ratones control no transgénicos . Barra de escala: 10 μm (M, N) Las secciones de la amígdala de ratones APP _Sw ,i _nd y 3xTg-AD transgénicos se tiñeron con anticuerpo anti-Aβ40 (2G3) . El análisis por microscopio reveló la presencia de de Aβ40 intraneuronal en estos ratones transgénicos. Barra de escala: 10 μm Figura 5. Efectos del valproato en el comportamiento de inmovilización en ratones APP _Ind después de la exposición a estímulos suaves y aversivos.

(A) El porcentaje de tiempo de inmovilización en ratones de 6 meses de vida tratados con vehículo o valproato se determinó en la prueba de neofobia con luz brillante. Se administró vehículo o valproato (200 mg/kg) durante tres días consecutivos y 30 minutos antes del entrenamiento. Los ratones APPm _d (n=7) tratados con vehículo mostraron un aumento de los niveles de inmovilización en comparación con los ratones control (n=8) tratados con vehículo. Las administraciones diarias de valproato redujeron significativamente la inmovilización de los ratones APP _Ind (n=10) en comparación con ratones APPi _nd o ratones control tratados con vehículo. Los datos representan el porcentaje medio de inmovilización ± S. E. M. * p<0,02, ** p<0,005.

(B) Se ensayaron ratones control (WT) y APPm _d tratados con vehículo y valproato en una tarea de miedo condicionado a un estímulo acústico. Los ratones APP _Ind tratados con vehículo mostraron un aumento en los niveles de inmovilización inmediatamente después de la descarga eléctrica en comparación con los ratones control . El tratamiento con valproato redujo significativamente la inmovilización inmediata de ratones APP _Ind . No se observaron diferencias significativas entre los ratones control tratados con vehículo y los ratones control o

APPm _d tratados con valproato . Los datos representan el porcentaje medio de inmovilización ± S. E. M. * p<0,02.

(C) En la tarea de miedo condicionado a un estímulo acústico, los ratones APPma tratados con vehículo estuvieron más tiempo inmovilizados 24 horas después del entrenamiento durante el estímulo pre-condicionado (pre-

CS) en comparación con los ratones control. El valproato redujo significativamente la respuesta de inmovilización de los ratones control y APPi _nd durante el estímulo pre- CS. Cuando se expuso a CS, el tiempo de inmovilización de los ratones APPm _d tratados con valproato disminuyó significativamente con respecto a los ratones APPmd y control tratados con vehículo. * p<0,05, ** p<0,03.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de valproato para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. La presenten invención también se refiere a valproato para la utilización en el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. Estos usos del valproato comprenden la administración a un sujeto con enfermedad de Alzheimer de una cantidad eficaz para combatir el miedo o la fobia. La presente invención también se refiere a un procedimiento de tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración a dicho sujeto con enfermedad de Alzheimer de una cantidad eficaz de valproato. El valproato se refiere a la forma iónica del ácido valproico (ácido 2-propilpentanoico) en agua. El ácido valproico tiene la siguiente estructura:

El ion valproato se absorbe es absorbido y produce el efecto terapéutico. Como tal, cualquier referencia a "valproato" o "compuesto de valproato" debería interpretarse que incluye un compuesto que se disocia en el tracto gastrointestinal, o en el medio de disolución in vitro, para producir un ion valproato. Como tal, el valproato incluye, pero no se limita a, ácido valproico, cualquiera de las diversas sales de ácido valproico descritas a continuación, cualquiera de los profármacos de ácido valproico descritos a continuación, cualquier forma hidratada de los compuestos mencionados anteriormente, así como cualquier combinación de los mismos. El ácido valproico está disponible comercialmente en Abbott Laboratories de abbot Park, Hl, USA. Los procedimientos para su síntesis se describen en in Oberreit, Ber. 29, 1998 (1896) y Keil, Z. Physiol. Chem. 282, 137 (1947), el contenido de los cuales se incorpora en la presente invención por referencia.

Entre las sales por adición básica de ácido valproico adecuadas farmacéuticamente aceptables se incluyen, pero no se limitan a, cationes basados en metales alcalinos o alcalino térreos, tales como sales de litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio y similares y cationes de amina y amonio cuaternario, que incluyen amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, y similares. Entre otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales por adición de base se incluyen etilendiamina,

etanolamina, dietañolamina, piperidina, piperazina y similares .

El valproato sódico es una sal popular del ácido valproico. Los procedimientos para la preparación de valproato sódico puede encontrarse en las patentes US 4.988.731 y US 5.212.326, el contenidos de las cuales se incorporan en la presente invención por referencia. Como el ácido valproico, el valproato sódico también se disocia en el tracto gastrointestinal para formar un ion valproato.

Los compuestos que comprenden combinaciones de valproato sódico y ácido valproico (divalproex sódico, por ejemplo) son fuentes biodisponibles y terapéuticamente activas del valproato. El compuesto no estequiométrico conocido como divalproex sódico se describe en la patente US 4.988.731.

Además de los compuestos mencionados anteriormente, un experto en la materia entendería fácilmente que el grupo carboxílico del compuesto de valproato se puede funcionalizar de diferentes maneras. Esto incluye la formación de compuestos que se metabolizan fácilmente in vivo para producir valproato, tal como amida de valproato (valproimida) , así como otras amidas y esteres del ácido farmacéuticamente aceptables (es decir, profármacos) .

"Ester farmacéuticamente aceptable" se refiere a los esteres que mantienen, tras la hidrólisis del enlace éster, la eficacia biológica y propiedades del ácido carboxílico y no son biológicamente o en cualquier caso indeseables. Para una descripción de esteres farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, E., ed. , (1985) Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam. Estos esteres se forman habitualmente a partir del correspondiente ácido carboxílico y un alcohol. En general, la formación de

esteres se puede realizar mediante técnicas sintéticas convencionales (véase, por ejemplo, March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York p. 1157 (1985) y las referencias citadas en la misma, y Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York (1980)). El componente alcohólico del éster comprenderá generalmente (i) un alcohol lineal o ramificado alifático C2-1 ₂ con uno, dos o tres dobles enlaces; o (ii) un alcohol aromático o heteroaromático C ₇ - _I2 . La presente invención también contempla la utilización de aquellas composiciones que son esteres, tal y como se han descrito en la presente invención, y al mismo tiempo son sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .

"Amida farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas amidas que mantienen, tras la hidrólisis del enlace amida, la eficacia biológica y propiedades del ácido carboxílico y no son biológicamente o en cualquier caso indeseables . Para una descripción de amidas farmacéuticamente aceptables como profármacos, véase Bundgaard, E., ed. , (1985) Design of Prodrugs , Elsevier Science Publishers, Amsterdam.

Estas amidas se forman habitualmente a partir del correspondiente ácido carboxílico y una amina. En general, la formación de la amida se puede realizar mediante técnicas sintéticas convencionales (véase, por ejemplo,

March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. , John Wiley &

Sons, New York p. 1157 (1985) y Mark et al. Encyclopedia of Chemical Technology, John Wiley & Sons, New York

(1980)) . La presente invención también contempla la utilización de aquellas composiciones que son amidas, tal y como se han descrito en la presente invención, y al mismo tiempo son sales farmacéuticamente aceptables de las mismas .

En una realización, la presente invención se refiere a ala utilización de valproato para la fabricación

de un medicamento útil para el tratamiento del miedo asociado con un trastorno de ansiedad en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En una realización, el miedo se selecciona entre el miedo condicionado y no condicionado. En otra realización, la presente invención se refiere a la utilización de valproato para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de la fobia asociada con un trastorno de ansiedad en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En una realización, la fobia se selecciona ente fobia específica y fobia social.

El término "miedo" en la presente invención se refiere a una emoción inquietante causada por una señal de peligro real - ya sea daño, dolor y similares -, estando dicho peligro causado por una situación imaginaria o real. Una respuesta de miedo aparece mediante la exposición a una señal de peligro innata o no condicionada - o estímulo. Dicha señal de peligro innata/no condicionada o estímulo, que es un reflejo del miedo a morir, está fuertemente conectado en el cerebro e incluye: lo desconocido (que refleja el miedo a morir en circunstancias nuevas) , alturas (que refleja el miedo a morir por una caída) , espacios cerrados (que refleja el miedo a morir al estar atrapado) , espacios abiertos (que refleja el miedo a morir por no tener un lugar donde esconderse) , bichos repelentes (que refleja el miedo a morir por depredadores de la tierra) y algo que sale de nuestro campo visual (que refleja el miedo a morir por depredadores del aire)

En la ansiedad, la tensión mental y física es muy similar a los síntomas experimentados con el miedo, pero con una importante diferencia. Con la ansiedad, habitualmente no hay nada que realmente esté pasando justamente aquí o allí para desencadenar la tensión. La tensión proviene de la anticipación al peligro futuro o

algo malo que podría pasar - no existe un peligro que esté pasando ahora.

El término "fobia" en la presente invención se refiere a un miedo persistente, irracional y excesivo de objetos o situaciones. Es una respuesta de miedo inapropiada que no proporciona una ventaja evolutiva y provoca cambios fisiológicos que producen inquietud y disfunciones. Las fobias se aprenden y se desencadenan mediante diversos objetos o situaciones, es decir, estímulos condicionantes (CS), tales como bichos, colores, números, luz, oscuridad, puentes, túneles, ascensores, aviones , por nombrar algunos, que no llevan asociados consigo un peligro inminente.

Como tales , las fobias son fundamentalmente diferentes al miedo, en el hecho en el que éste último se desencadena mediante un estimulo del miedo innato o no condicionado (US) , y en cambio, llevan asociados consigo un peligro real inminente.

Un estímulo innato o no condicionado que conduce a una respuesta de miedo en presencia de otro objeto o situación - es decir, el estímulo condicionante, establece la etapa para la generación de la fobia. Por ejemplo, al viajar sobre un puente (que es el CS) ; alguien podría mirar hacia abajo y ver la altura (que es el US) . Es la altura la que provoca que una persona se vuelva miedosa de morir por la caída. Esto aparece a nivel del subconsciente; uno no es completamente consciente del porqué tiene miedo, sin embargo, se da cuenta conscientemente de que está sobre un puente, si el paisaje neural está "cebado", el puente entonces se asocia con la respuesta de miedo. De este modo, cuando una imagen de un puente se lleva a la conciencia, se produce una respuesta de miedo.

El sistema del miedo se ha explorado sistemáticamente utilizando el test de miedo

condicionamiento de Pavlov (Fanselow y LeDOux, Neuron, VoI. 23, 229-232, Junio 1999) . En este modelo de laboratorio para el estudio de fobias, respuestas del miedo, y sus tratamientos, los animales aprenden a temer un estímulo previamente neutro (es decir, el estímulo condicionado: CS) debido a su asociación con un estímulo aversivo (es decir, el estímulo no condicionado: US) , tal como una descarga eléctrica en el pie. El miedo condicionado requiere del aprendizaje y produce un comportamiento estereotípico de inmovilización, un periodo de inmovilidad en vigilancia que se puede medir y utilizar para fines de investigación. En este paradigma, las respuestas de inmovilización se puede desencadenar por dos tipos diferentes de CS, tono acústico y contexto, cada uno de los cuales requiere de sustratos neuroanatómicos diferentes (Kim, et al., 1992; Phillips, et al., 1992) . El condicionamiento a un estímulo acústico, en el que el CS es un tono, depende de la amígdala, y el condicionamiento contextual, en el que el CS es un ambiente nuevo, depende del hipocampo y la amígdala. Después . de varios emparejamientos de CS con la descarga, el animal reacciona con miedo al CS, al igual que el puente (CS) era capaz de producir miedo. Es la anticipación de la descarga (el CS) lo que produce el miedo, no la propia descarga. . (The Neurobiological Basis of Peripheral Sensory Stimulation for Modulation of Emotional Response by Ronald A. Ruden, MD, Ph. D. Marzo, 2005) .

Otra realización de la presente invención se refiere a los usos anteriores de valproato, en los que el sujeto con la enfermedad de Alzheimer se encuentra en una etapa temprana de inicio no complicada de AD, en un inicio temprano con ilusiones, en un inicio temprano con un humor depresivo, en un inicio tardío no complicado, en un inicio tardío con ilusiones, en un inicio tardío con un humor

depresivo. Particularmente, la presente invención se refiere a los usos mencionados anteriormente de valproato, en los que el sujeto con enfermedad de Alzheimer se encuentra en una etapa temprana de dicha enfermedad de Alzheimer.

Una realización adicional de la presente invención se refiere a los usos anteriores del valproato en los que el tratamiento de miedo o fobia comprende la profilaxis de dicho miedo o fobia. El término "tratamiento" del miedo o fobia se refiere a, entre otros, la reducción o alivio de uno o más síntomas en un sujeto, la prevención de uno o más síntomas de empeoramiento o progresión, la inducción para recuperación o mejora de la prognosis, y/o prevención de la enfermedad en un individuo que está libre de la misma, así como de la ralentización o reducción de la progresión de la enfermedad existente. Para un sujeto determinado, se pueden determinar la mejora de un síntoma, su empeoramiento, regresión, o progresión mediante una medición objetiva o subjetiva. La eficacia del tratamiento se puede medir como una mejora en la morbidad o la mortalidad (por ejemplo, el alargamiento de la curva de supervivencia para una población seleccionada) . Los procedimientos profilácticos (por ejemplo, prevención o reducción de la incidencia de recaída) también se consideran como tratamiento y son una realización particular de la presente invención.

En otra realización, la presente invención se refiere a los usos mencionados anteriormente de valproato, en los que el sujeto a tratar puede ser cualquier animal o humano. En particular, se pueden tratar modelos de enfermedad en mamíferos, especialmente seres humanos y modelos de roedores o primates. De este modo, se contemplan procedimientos tanto veterinarios como médicos .

En una realización adicional, la presente invención se refiere los usos mencionados anteriormente de valproato para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con enfermedad de Alzheimer, donde el valproato se formula en una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de valproato, y un portador farmacéuticamente aceptable. Una cantidad terapéuticamente aceptable en este contexto es una cantidad suficiente para actuar profilácticamente contra, para estabilizar o reducir los síntomas de miedo y fobia en sujetos con AD.

Por lo tanto, el valproato se puede formular en varias formas farmacéuticas para los objetivos de administración. Como composiciones apropiadas se pueden citar todas las composiciones utilizadas habitualmente para la administración sistemática de fármacos. Para preparar las composiciones farmacéuticas de la presente invención, una cantidad eficaz de valproato como principio activo se combina en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable, el cual puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la manera de preparación deseada para la administración. Estas composiciones farmacéuticas son deseables en forma de dosis unidad adecuadas, particularmente, para la administración mediante ruta oral, rectal, transdérmica, inhalación, o parenteral (es decir, subcutánea, intravenosa, intramucuslar o intraperitoneal ) . El valproato se puede administrar mediante la ruta oral en formas de dosificación sólidas, tales como comprimidos, cápsulas y polvos, o en formas de dosificación líquida, tales como elixires, jarabes y suspensiones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden determinar parenteralmente, en formas de dosificación líquidas estériles.

En la preparación de las composiciones en forma de dosificación oral, se puede utilizar cualquiera de los medios farmacéuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, y similares en el caso de preparaciones liquidas orales, tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y soluciones; o portadores sólidos, tales como almidone, azúcares, caolín, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares en el caso de polvos, pastillas, cápsulas y comprimidos. Debido a su facilidad en la administración, los comprimidos y las cápsulas representan las formas orales de dosis unidad más ventajosas, en cuyo caso se utilizan obviamente portadores farmacéuticos sólidos.

El valproato se puede administrar también en formas de dosificación oral controlada, sostenida o de liberación lenta, tales como los descritos en las patentes US2005276850, EP1219295, EP1216704 o US5589191.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas para inyección estéril isotónica. Las soluciones inyectables, por ejemplo, se pueden preparar de manera que el portador comprende solución salina, solución de glucosa o una mezcla de solución salina y solución de glucosa. Las suspensiones inyectables también se pueden preparar de manera que se pueden utilizar portadores líquidos apropiados, agentes de suspensión y similares. También se incluyen preparaciones en forma sólida que se pretenden convertir, poco antes de su utilización, en preparaciones de forma líquida. En las composiciones adecuadas para la administración percutánea, el portador comprende opcionalmente un agente potenciador de la penetración y/o un agente humectante adecuado, opcionalmente combinado con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones menores, cuyos aditivos no introducen un efecto perjudicial significativo

en la piel. Estos aditivos adecuados pueden ser antioxidantes, conservantes, agentes estabilizantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica y/o sustancias tampón. Es especialmente ventajoso la formulación de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente en forma de dosificación unidad para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de dosificación unidad tal y como se utiliza en la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. Entre los ejemplos de dichas formas de dosificación unidad están los comprimidos (incluyendo comprimidos rasurados o recubiertos), cápsulas, pastillas, supositorios, paquetes de polvos, obleas, soluciones o suspensiones inyectables y similares, y múltiples segregados de los mismos. En una realización adicional, la presente invención se refiere a una pauta de dosificación de valproato en su utilización para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con enfermedad de Alzheimer. En una realización, la pauta de dosificación de valproato proporcionada en la presente invención es particularmente útil para el tratamiento de miedo condicionado o no condicionado. Una dosificación oral diaria para el tratamiento del miedo o la fobia, en particular miedo condicionado o no condicionado, comprende la administración diaria de dosis efectivas o terapéuticamente óptimas de 1 a 40 mg/kg de peso corporal total de valproato, de aproximadamente 20 a 30 mg/kg, de 10 a 20 mg/kg, o aproximadamente de 16, 17, 18 ó 19 mg/kg. La duración de la administración del valproato sódico en el tratamiento de miedo condicionado y

no condicionado en un sujeto con enfermedad de Alzheimer puede variar de 1 a 10 días, preferiblemente de 2 a 7 días, más preferiblemente durante 4 días. Como tal, la presente invención proporciona un tratamiento agudo del miedo o la fobia con valproato en un sujeto con enfermedad de Alzheimer.

El valproato se puede utilizar como un agente terapéutico único o en combinación con otros agentes terapéuticos. Cuando se administra como una combinación, los agentes terapéuticos se pueden formular como composiciones separadas que se administran simultánea o secuencialmente en diferentes instantes, o los agentes terapéuticos se pueden administrar como una composición única. La coterapia o terapia de combinación en la definición de la utilización del valproato y otro agente farmacéutico, se pretende que comprenda la administración de cada fármaco en una manera secuencial en una pauta que proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos, y se pretende también que comprenda la coadministración de estos fármacos en una manera sustancialmente simultánea, tal como en una forma de dosificación única que tiene una proporción fija de estos fármacos activos o en formas de dosificación múltiples separadas para cada fármaco. Específicamente, la administración de valproato puede producirse conjuntamente con terapias adicionales conocidas para los expertos en la materia en el tratamiento de la AD, tal como, por ejemplo, galantamina, donepezil, rivastigmina, memantina y similares .

Por consiguiente, la presente invención se refiere a la utilización de valproato para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento del miedo o la fobia en un sujeto con AD, en la que dicho medicamento se utiliza en una terapia de combinación, comprendiendo dicha

terapia de combinación preferiblemente valproato y un fármaco anti-AD, tal como galantamina, donepezil, rivastigmina, memantina y similares.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes .

Ejemplos

Materiales y procedimientos Ratones transgénicos

Los ratones transgénicos APP _Ind (línea H6 ) y APP _Sw ,ind (línea J9) (C57BL/6) que expresan la isoforma APP695 humana mutante que comprende las mutaciones Indiana unida a FAD (V717F) o Sueca (K670N/M671L) /Indiana (V717F) bajo la expresión del promotor neuronal PDGFβ se han descrito previamente (Mucke et al., 2000) . Los ratones se obtuvieron mediante el cruce de APP _Ind o APP _Sw , _Ind heterozigóticos con ratones no transgénicos (WT) . Los ratones triple-transgénicos OxTg-Ad; 129/C57BL/6) que comprende las mutaciones en PSl (M146V) y que expresan APP humana mutante (KM670/671NL) y Tau (P301L) bajo el control del promotor Thyl .2 se describieron previamente (Oddo et al., 2003). En este estudio se utilizaron ratones 3xTg-AD homozigóticos y no transgénicos control (WT) . A menos que se indique lo contrario, los ratones transgénicos APP _In< a, APPs _w ,m _d y 3xTg-AD utilizados en este estudio eran machos y de la misma edad. Los ratones se guardaron y mantuvieron en un ciclo de 12 horas luz/oscuridad y se les proporcionó ad limitum acceso a comida y agua.

Miedo condicionado al contexto y al tono acústico

Los ratones utilizados para todas las pruebas de comportamiento eran de la misma carnada y tenían 6-7 meses de vida. El test de miedo condicionado se realizó tal y como se ha descrito anteriormente con algunas

modificaciones (Saura et al., 2005) . Los ratones se manejaron individualmente durante 3 minutos diarios durante 3 días antes de las pruebas de comportamiento. Para el condicionamiento de miedo contextual, se colocaron los ratones en una cámara de entrenamiento nueva (15,9 x 14 x 12,7 cm) equipada con una luz casera blanca y un suelo en rejilla de acero inoxidable (Med Associates Inc, St. Albans, VT) . La iluminación con luz blanca se había descrito previamente para tener efectos ansiogénicos en roedores (Walter y Davis, 1997a) . Los ratones se colocaron en la cámara durante 3 minutos y las respuestas de inmovilización espontánea de los ratones se grabaron en vídeo y se utilizaron como una medida del comportamiento de la neofobia. Inmediatamente después, los ratones recibieron una descarga eléctrica en el pie (estímulo no condicionado: US; 1 s/1 mA) . Después de la descarga, los ratones se dejaron en la cámara durante 2 minutos (inmovilización inmediata) y se devolvieron a sus jaulas. El condicionamiento de miedo se ensayó 24 horas después del entrenamiento durante 4 minutos en la misma cámara de condicionamiento. La inmovilización, que se definió como un cese completo de todo movimiento a excepción de la respiración, se valoró y se analizó automáticamente mediante el sistema Video Freeze Software (Med Associates, Inc.) . En el miedo condicionado a un estímulo acústico, se dejó que los ratones exploraran la cámara de entrenamiento de condicionamiento durante 3 minutos antes del inicio del tono acústico (estímulo condicionado: CS) (2.800 Hz y 80 dB; 30 s) . Se administró una descarga en el pie (0,8 mA, 2 s ) al final de la presentación del estímulo acústico y se midió la inmovilización durante 2 minutos inmediatamente después de la descarga (inmovilización inmediata) . El comportamiento de inmovilización se examinó 24 horas después del entrenamiento en una ambiente nuevo antes (pre-CS; 3 minutos) y durante la presentación del tono

(Cs; 4 min) . El medio nuevo consistía en la cámara de condicionamiento modificada con un suelo de Plexiglás blanco y dos láminas negras sobre las paredes . Además , las luces de la habitación se cambiaron por una iluminación roja y se añadió un olor nuevo. Las respuestas de inmovilización se midieron mediante el software Video Freeze Software (Med Associates , Inc . ) .

Laberinto acuático de Morris La prueba del laberinto acuático se realizó en una piscina circular (90 cm de diámetro) que contenía una plataforma escondida (6,5 cm de diámetro) (Saura et al., 2004) . Para cada prueba, los ratones se colocaron en la piscina en uno de los cuatro puntos de partida en un orden pseudoaleatorio . A cada ratón se le hicieron cuatro pruebas diarias (5 días) con una duración máxima de la prueba de 60 s. y un intervalo entre pruebas de 15 minutos. Se dejó que los ratones hallaran la plataforma sumergida, en caso contrario se les guió manualmente hasta la plataforma y permanecieron allí durante 10 segundos. Después de esto, los ratones se colocaron en una jaula hasta el inicio de la siguiente prueba. Se realizó una prueba de 1 minuto 2 horas después del entrenamiento en el día 5 para valorar la retención de memoria. La prueba de plataforma visible se realizó en la misma piscina pero sin las guías visibles y la plataforma se elevó sobre el agua y se marcó con una bandera. A cada ratón se le realizaron cuatro pruebas para cada localización de la plataforma, la cual se movió a las cuatro posiciones del cuadrante. El resultado de las versiones escondidas y visibles de la prueba del laberinto acuático se registró en vídeo y se analizó automáticamente mediante software SMART (PanLab S. L., Barcelona, España) .

Los experimentadores de las pruebas de comportamiento eran ciegos a los genotipos de los ratones.

Tratamientos con valproato

Los ratones transgénicos APP _Ind y de la misma carnada WT de 6 meses de vida se trataron (i.p.) con un vehículo (NaCl al 0,9%) o valproato (200 mg/kg; Sigma, St. Louis, MO) disueltos en solución salina. El valproato es una ácido graso saturado de cadena ramificada que penetra la barrera hemato-encefálica. La administración del fármaco se realizó diariamente durante 3 días y 30 minutos antes de las pruebas de comportamiento. En el día 4 todos los grupos se entrenaron en el test de miedo condicionado a un estímulo acústico como se ha descrito anteriormente. La pauta de dosificación de valproato de 200 mg/kg administrada a los roedores correspondientes a 16 mg/kg de peso corporal humano siguiendo los métodos de conversión descritos en "Ciencia y Tecnología en protección y experimentación animal", McGraw-Hill, Madrid (2001), Zuñiga, J. M, Tur, J. A., Milocco, S. N, y Piñeiro, R.; y en "Procedimientos experimentales en farmacología y toxicología", pp 489-512, Capítulo 18, por Giráldez- Dávila, A y Romero-Vidal, A.

Inmunohisto<iuímica e histología

Los cerebros diseccionados se fijaron rápidamente en formalina tamponada al 10% a 4°C durante 2 horas antes de englobarse en parafina. Las secciones cerebrales coronales o sagitales (5-10 μm) se desparafinaron en xileno, se rehidrataron y se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3%. Las secciones se incubaron en ácido fórmico al 60% durante 6 minutos para permitir la recuperación de antígenos, se lavaron en Tris HCl (0,1 M) y se incubaron a 4°C durante toda la noche con anticuerpo monoclonal anti-Aβ 6ElO (1:1.000; Signet, Dedham, MA) o anti-Aβ40 C-terminal 2G3 (1 : 1.000) . Las secciones se incubaron con anticuerpos secundario anti-ratón

biotinilado (1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se desarrollaron mediante la utilización del reactivo avidina-biotina peroxidasa y el kit Vectastain élite ABC (Vector Laboratories) (Saura et al., 2005) . Las secciones 5 se incubaron con una disolución de hematoxilina formulación de Harri, se aclararon en una disolución de agua de Scott y se deshidrataron en soluciones de etanol . Para las tinciones de doblemarcaje, las secciones desparafinadas se pretrataron con solución de citrato

10 para la recuperación de antigenos (Biogenex, San Ramón, CA) y se incubaron durante toda la noche (4°C) con anticuerpos monoclonales anti-Aβ 6E10 o CaMKIIa (a-1, 1:750; Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpos policlonales de ratón VGAT (1:200; Sigma) , p-CaMKI (Thr

15 286) (1:200; Santa Cruz Biotechnology), NMDARl (1:200; Chemicon, Temecula, CA) o GABAAbeta 3 (1:250; Abcam, Cambridge, UK) . Las secciones se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con anticuerpos secundarios de cabra Alexa Fluor 488 y Alexa Fluor 594 (Molecular Probes,

20 Eugene, OR) y Hoescht (Saura et al., 2005). Para la tinción de Nissl, las secciones desparafinadas se incubaron en solución de violeta de cresilo durante 12 minutos, se destiñeron en ácido acético diluido y se deshidrataron en soluciones de etanol . Las secciones se

25 montaron sobre portaobjetos y se analizaron con un microscopio Nikon Eclipse 9Oi.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando un 30 análisis de varianza de 1 ó 2 colas (ANOVA) . Las comparaciones entre los grupos se hicieron mediante un ANOVA seguido por una prueba post hoc de Scheffe utilizando el programa SuperANOVA. Los datos se presentaron como la media ± SEM. Para todas las pruebas,

las diferencias con p < 0,05 se consideraron significativas .

Resultados Alimento de la Neofobia en ratones transgénicos APP y 3x Tg-AD

Los síntomas de ansiedad , tales como el miedo y la fobia, son características neuropsiquiátricas características de la AD que se han descrito en varias líneas de ratones transgénicos de APP (Janus y Westaway, 2001) . Para estudiar el comportamiento neofóbico y determinar su asociación con los cambios neuropatológicos en la AD, se analizó en primer lugar el comportamiento innato (no aprendido) de inmovilidad asociado al miedo obtenido mediante un ambiente o contexto nuevo que consistía en una cámara de ensayo con luz brillante (ver, figura IA para el diseño experimental) . Este ensayo se ha utilizado previamente como paradigma para medir el miedo innato o no condicionado en roedores (Walker y Davis,

1997a) . A los 6 meses de edad, los ratones transgénicos

APPm _d y APP _SW/Ind y los correspondientes ratones control

(WT) no transgénicos mostraron un aumento dependiente del tiempo de las respuestas de inmovilización en el medio nuevo (figuras IB, C) . El análisis ANOVA de dos colas reveló un efecto principal significativo del genotipo (APP _Ind , F(1, 42) = 10,2, p < 0,003; APP _Sw , _Ind , F (1, 48) = 13,7, p < 0,0005) y tiempo (APPi _nd , F (2, 42) = 17, p < 0,0001; APP _Sw ,ind, F (2, 48) = 7,1 , p < 0,002), mientras que la interacción genotipo x tiempo no era significativa (p = 0,007) . En comparación con los ratones control, las respuestas de inmovilización total aumentaron significativamente en ratones APP _Ind (~ 2-veces; p < 0,0005) y APP _Sw ,md (~ 4-veces; p < 0,003) . Las respuestas del miedo parecen ser específicas y reflejan el

comportamiento neofóbico ya que la actividad locomotriz

(velocidad) y la motivación exploradora entre ratones

APPind/ APP _Sw ,md y control eran similares en el laberinto acuático de Morris (ver a continuación) . Para descartar la posibilidad de que el comportamiento de inmovilización en los ratones transgénicos APP podrían ser debido a una cepa específica (es decir, C57BL/6) , se examinaron los ratones

3xTg-AD (129/C57BL/6) a una edad similar utilizando nuestro paradigma de miedo no condicionado. El análisis estadístico de las respuestas de inmovilización reveló diferencias significativas entre los grupos (F (1, 42) = 10,1; p < 0,003) y un efecto del intervalo del tiempo (F (2, 42) = 4,27; p < 0,02) (Fig. ID) . Los ratones 3xTg-AD también mostraron un aumento significativo (~ 4-veces) de las respuestas de congelación total en comparación con los ratones control (p < 0,003) . Estos resultados concuerdan con los resultados previos que mostraban una cese transitorio de la actividad exploradora y un aumento de la neofobia en ratones transgénicos APP (Hsiao et al., 1995; Moechars et al., 1999) .

Ratones transgénicos APP y 3xTg-AD muestran respuestas de inmovilización alteradas en el miedo condicionado contextual Nuestros resultados previos sugirieron un aumento del miedo no condicionado o innato en ratones transgénicos APPmd, APP _Sw ,md y 3xTg-AD. Para determinar si se observaban respuestas de miedo similares cuando los ratones se exponían a un estímulo aversivo, se midió el comportamiento de inmovilización relacionado con el miedo en el test de miedo condicionado contextual, una tarea que depende de la amígdala y el hipocampo (Phillips and LeDoux, 1992) . En esta tarea, se dejó que los ratones exploraran una cámara de ensayo antes de liberar una única descarga eléctrica en el pie. Los ratones asocian el

contexto neutro (estímulo condicionado: CS) con el suceso aversivo (estímulo no condicionado: US), de manera que cuando se exponen al mismo ambiente más tarde, los animales muestran respuestas del miedo anticipadas (inmovilización) . El comportamiento de inmovilización obtenido inmediatamente después de la presentación de la descarga en el pie es una medida de la respuesta no condicionada, mientras que la congelación que se obtiene mediante el CS representa la respuesta condicionada (Rosen, 2004) . En comparación con los ratones control de la misma carnada, los ratones APP _Ind y APP _Sw ,in _d mostraron un aumento den los niveles de inmovilización inmediatamente después de la descarga en el pie (figuras 2A, 2B) . El análisis ANOVA de dos colas reveló un efecto principal significativo del genotipo (APP _Ind , F (1, 28) = 5,6, p <

0,02; APP _Sw , _Ind , F (1, 32) = 12,6, p < 0,001) y el tiempo

(APP _Ind , F (1, 28) = 32,7, p < 0,0001; APP _Sw , _Ind , F (1, 32) =

13.5, p < 0,001). Las comparaciones estadísticas planificadas revelaron un aumento de las respuestas de inmovilización inmediata en ratones APP _Sw ,ind (P < 0,01) y un aumento , pero no significativo, en ratones APPi _nd (p = 0,07). De manera similar, los ratones APP _Sw ,i _nd mostraron un aumento significativo de inmovilización en comparación con los ratones control a las 24 horas (p < 0,02), mientras que los ratones APPm _d no mostraron diferencias estadísticas (p =0,14) . De manera destacada, los ratones 3xTg-AD también mostraron un aumento de los niveles de congelación tanto inmediatamente como 24 horas después de la descarga en el pie (figura 2C) . El ANOVA de dos colas reveló un efecto principal significativo del genotipo (F (1,28) = 102; p < 0,0001), el tiempo (F (1,28) = 30,9; p < 0,0001) y de la interacción genotipo x tiempo (F (1,28) = 4,3; p < 0,05) . El análisis post hoc reveló diferencias significativas en las respuestas de inmovilización entre los ratones de control y 3xTg-AD inmediatamente y 24 horas

después del entrenamiento (p < 0,0001) . Juntos, estos resultados indican un aumento de las respuestas del miedo condicionado y no condicionado en ratones transgénicos APP y 3xTg-AD. 5

Déficits de memoria espacial en ratones transgénicos APP y 3xTg-AD

La ausencia de déficits de memoria a largo plazo en la prueba de miedo condicionado contextual, provocó la

10 investigación del comportamiento de nuestros ratones transgénicos en una tarea dependiente del hipocampo. Se ha observado que los ratones transgénicos APP muestran déficits de aprendizaje y memoria espacial relacionado con la edad en el laberinto acuático de Morris (Hsiao et al.,

15 1996; Saura et al., 2005; Westerman et al., 2002) . Por lo tanto, después del condicionamiento de miedo contextual, se ensayaron los ratones APP y 3xTg-AD y los respectivos ratones control de la misma carnada en el laberinto acuático de Morris. En la versión de la plataforma

20 escondida de la tarea, el rendimiento de APPmd, APP _Sw ,ind y sus controles no transgénicos mejoró significativamente durante los días de entrenamiento (día 1 versus día 5, p<0,001) (figura 3A,D), lo que sugiere que todos los grupos eran capaces de aprender la tarea. Sin embargo, el

25 ANOVA de dos colas reveló un efecto principal significativo del genotipo APPi _nd , F (1, 65) = 40, p < 0,0001; APP ₃ W, md, F (1, 80) = 12, p < 0,001) y el día de entrenamiento (APP _Ind , F (4, 65) =16,6, p < 0,0001; APP _Sw ,i _nd , F (4,80) = 22,2, p < 0,0001 ) . Los ratones APP _Ind

30 y APP _Sw ,ind mostraron distancias significativamente más largas (p<0.0001) y latencias (p<0.0001; no mostrado) en comparación con los controles, aunque su rendimiento mejoró con el entrenamiento extenso (figuras 3A,D) . Los ratones APP _Ind y APP _Sw ,m _d mostraron una velocidad de nado

35 similar a la de los grupos controles (H6, p >0.05; J9, p

>0.05) excluyendo la presencia de déficits motores en estos ratones. En la prueba posterior al entrenamiento, los ratones control mostraron una ocupación significativamente más elevada del cuadrante diana en relación con otros cuadrantes (p < 0,001), mientras que los ratones APPmd y APP _Sw ,ind no mostraron preferencia alguna (p >0,05) (Figuras 3B, E) . De manera destacada, el número de cruces de la plataforma diana por ratones APPmd (1,9 ± 0,5) y APP _Sw ,ind (2,9 ± 0,8) era significativamente inferior al de los controles (4,6 ± 0,4 para APPi _nd y 4,8 ± 0,9 para APP _SW/ i _nd ) (p<0,001; figuras 3C, F) . Los ratones control mostraron un número significativamente más elevado de cruces en la plataforma diana en relación con otras plataformas (p<0,0001), mientras que los ratones APPi _nd y APP _SW;Ind no mostraron una preferencia por la plataforma

(p>0,05) . Los déficits en la memoria espacial de los ratones APP parece reflejar un déficit de aprendizaje o adquisición en lugar de estar causados por alteraciones motrices o de motivación ya que no se hallaron diferencias significativas en las latencias y la velocidad de nado durante la tarea de plataforma visible (p>0,05; no mostrado) .

Se analizó a continuación el aprendizaje y la memoria espacial de ratones 3xTg-AD en la tarea de laberinto acuático de agua. Durante el entrenamiento, los ratones 3xTg-AD mostraron distancias significativamente más largas en comparación con los ratones control (F

(1,65) = 12.2, p < 0.001) (Fig. 3G) . El rendimiento de los ratones control mejoró significativamente durante el entrenamiento (día 1 versus día 5, p < 0,02), aunque, los ratones 3xTg-AD actuaron muy pobremente con distancias significativamente más largas (día 1 versus día 5, p < 0,87) . En las pruebas posteriores al entrenamiento, los ratones control mostraron una ocupación significativamente más elevada del cuadrante diana con respecto a otros

cuadrantes (p>0,0005), mientras que los ratones 3xTg-AD no mostraron dicha preferencia (p>0,05) (figura 3H) . El número de cruces por la plataforma diana de los ratones

3x-Tg-AD (3,4± 0,7) fue significativamente inferior a las de los ratones no transgénicos (5,1 ± 0,9; p < 0,04).

Además, el número de cruces por la plataforma diana en relación con las otras supuestas plataformas fue significativamente más elevada en ratones control

(p<0,005), mientras que los ratones 3xTg-AD no mostraron una preferencia de plataforma (p<0,05) (figura 31) . El rendimiento de los ratones control y 3x-Tg-AD en la tarea de la plataforma visible fue similar (datos no mostrados) , sugiriendo que los déficits de memoria espacial de ratones 3xTg-AD no eran debidas a alteraciones sensoriales o motrices. Juntos, estos resultados indican una memoria espacial dependiente del hipocampo dañada en APP y ratones transgénicos 3xTg-AD que muestran un fenotipo de ansiedad.

Acumulación de Aβ intracelular en la amígdala de ratones transgénicos APP y 3x-Tg-AD

Se ha observado la acumulación de formas solubles y oligoméricas de Aβ intracelular en cerebros de AD y ratones transgénicos (Gouras et al., 2000; Oakley et al., 2006; Oddo et al., 2003) . La acumulación intracelular de Aβ precede a la deposición de amiloides y otras características neuropatológicas típicas de AD, tales como respuestas inflamatorias y neuritas distróficas. Los déficits de memoria espacial y contextual a largo plazo en ratones 3xTg-AD se asociaron con la acumulación de Aβ intraneuronal en el hipocampo y la amígdala (Billings et al., 2005), dos regiones severamente afectadas por patología amiloide y patología de estructura neurofibrilar en AD (Hyman et al., 1990) . Dado que el hipocampo y la amígdala son regiones críticas que reciben y almacenan información de aprendizaje espacial y comportamiento

emocional relacionado con el miedo y la ansiedad (Fanselow y LeDoux, 1999; Rosen y Donley, 2006), respectivamente, se investigó si la acumulación de Aβ en esas regiones estaba asociada con respuestas emocionales del miedo y daños en la memoria en ratones APP y 3xTg-AD. El análisis inmunohistoquímico de las secciones cerebrales de los ratones se ensayados en las pruebas de comportamiento demostró la presencia de Aβ intracelular, pero no de placas amiloides, en el hipocampo y la amígdala de ratones transgénicos APP y 3xTg-AD (figura 4 y datos no mostrados) . La Aβ intracelular se detectó en las regiones

CAl y CA2/CA3 de la formación hipocampal en ratones transgénicos APPm _d , APP _Sw ,i _nd y 3xTg-AD de 6 meses de edad

(datos no mostrados) . De manera interesante, la Aβ y Ab40 intraneuronal se detectó principalmente, pero no en todas, las neuronas del complejo basólateral de la amígdala en ratones APP _Ind , APP _Sw _ _Ind y 3xTg-AD, mientras que parece estar ausente en otras regiones amigdaloides (Figs. 4D, E, F) . De este modo, mientras que Aβ y Ab40 se acumulaban principalmente en neuronas pequeñas en ratones APPm _d y APPsw.ind/ sólo las neuronas grandes se marcaron aparentemente con Aβ o Ab40 en ratones 3xTg-AD (Figs. 4G, H, I, M, N) . La inmunorreactividad de Aβ estaba ausente en el córtex, el hipocampo y la amígdala de los ratones de control, indicando una falta de acumulación de Aβ en estos ratones (Figs. 4J, K, L ). De forma similar al córtex, las neuronas de proyección de las amígdala basolateral son neuronas glutamatérgicas de tipo piramidal, mientras que las neuronas spine-sparse son interneuronas (GABA) érgicas de ácido γ-aminobutírico no piramidales (McDonald, 2003) . Para identificar las neuronas específicas afectadas por Aβ, se realizó un doble inmunomarcaj e en secciones cerebrales con un anticuerpo anti-Aβ (6E10) y marcadores para neuronas glutamatérgicas piramidales (CaMKIIa y p- CaMKIlα) e interneuronas (GABA) érgicas (V-GAT) utilizadas

previamente en estudios morfológicos en la amígdala

(McDonald y Mascagni, 1996; McDonald et al., 2002) . De manera destacada, el doble inmunomarcaj e de secciones cerebrales de APP _Ind y APP _Sw ,ind reveló una fuerte colocalización de Aβ con neuronas positivas a V-GAT, mientras que Aβ estaba aparentemente ausente en neuronas positivas a CaMKIIa. En cambio, la Aβ intraneuronal se colocalizó principalmente con neuronas piramidales que contienen p-CaMKIlα pero no con neuronas positivas de V- GAT en la amígdala basolateral de ratones 3xTg-AD. La Aβ humana no se detectó en neuronas de la amígdala en ratones controles no transgénicos . El análisis de cuantificación confirmó que la Aβ se acumulaba principalmente en las interneuronas (GABA) érgicas en la amígdala basolateral en ratones APP _Ind /APP _Sw ,i _n d transgénicos (APP _Ind : 93.4 ± 2.1%; APP _{Sw Ind} : 94,1 ± 2,2%) mientras que se acumulaba modestamente en neuronas excitatorias piramidales (APP _Ind : 4,5 ± 1,1%; APP _{Sw Ind} : 5,4 ± 1,7%) . Por otro lado, el Aβ se acumulaba en neuronas glutamatérgicas piramidales (91,7 ± 2,0%) pero no en interneuronas (1,9 ± 0,5%) en la amígdala basolateral en los ratones 3xTg-AD. Juntos, estos resultados indican la acumulación de Aβ en neuronas específicas del tipo de célula en la amígdala de ratones APPind/APP _Sw ,ind y 3xTg-AD. Además, estos datos sugieren una posible unión mecanística entre la acumulación de Aβ en neuronas de la amígdala y las respuestas del miedo y la ansiedad alteradas en ratones transgénicos de AD.

El valproato reduce el miedo condicionado y no condicionado en ratones transgénicos APPi _nd .

La inervación (GABA) érgica inhibidora de neuronas excitatorias piramidales en la amígdala basolateral es crítica para controlar la excitabilidad de las células piramidales durante el comportamiento emocional , y en condiciones patológicas, tales como depresión y ansiedad

(McDonald et al., 2002; Sah et al., 2003) . El papel de la disfunción de GABA en la ansiedad ha surgido ampliamente debido a los beneficios de los potenciadores farmacológicos de la función del receptor GABAA o la 5 síntesis de GABA o inhibidores de la degradación o recaptación de GABA (Nemeroff, 2003) . La acumulación de Aβ en interneuronas GABAérgicas de la amígdala basolateral de ratones transgénicos APPm _d y APP _SW;Ind sugirió que la Aβ podía reducir la entrada sináptica inhibidora GABAérgica

10 en las células piramidales. Para ensayar esta hipótesis, se ensayó si el tratamiento a corto plazo con valproato, un agente ansiolítico que actúa aumentando los niveles de GABA (Nemeroff, 2003), invertiría el comportamiento neofóbico observado en ratones transgénicos APPm _d . El

15 análisis de las respuestas de inmovilización de los grupos tratados con vehículo - y valproato - en la cámara de ensayo con luz brillante reveló diferencias significativas entre los grupos (F (3,26) = 3,7, p < 0,02). En concordancia con los resultados anteriores

20 (figura 1), los ratones APP _Ind tratados con vehículo mostraron un aumento de los niveles de inmovilización en comparación con los ratones de control tratados con vehículo (p<0,02) (Fig. 5A) . De manera interesante, la administración de valproato reducía significativamente los

25 niveles de inmovilización en ratones APP _Ind (p<0,05), que actuaban de forma similar a los ratones controles tratados tanto con vehículo como con valproato (p>0,05) (figura 5A) . Este resultado sugiere firmemente que el valproato reduce el miedo no condicionado en ratones APP _Ind . Para

30 examinar si el valproato también era capaz de invertir las respuestas del miedo dependientes de la amígdala en ratones APP _Ind , se evaluó el efecto del valproato en el test de miedo condicionado a un estímulo acústico, una tarea que depende de la amígdala (Phillips y LeDoux,

35 1992) . Durante el test de miedo condicionado a un estímulo

acústico, un estímulo condicionado neutro (CS; tono) se empareja con un estímulo no condicionado aversivo (US; descarga eléctrica en el pie) , de manera que el CS solo producirá una respuesta del miedo aprendido o emocional condicionado (inmovilización) . En concordancia con los resultados de miedo condicionado contextual (figura 2A), los ratones APP _Ind tratados con vehículo mostraron un aumento de las respuestas de inmovilización inmediatamente después de la descarga eléctrica en comparación con los ratones control tratados con vehículo (figura 5B)

(p<0,02) . El valproato no afectaba los niveles de inmovilización en ratones control (p>0,05 versus vehículo) , pero disminuyó significativamente los niveles de inmovilización en ratones APP _Ind (p<0,02 versus vehículo) , que eran similares a los de los ratones control tratados con vehículo y valproato (p>0,05) (figura 5B). Durante los estímulos pre-CS a las 24 horas, las respuestas de inmovilización de los ratones APP _Ind (32,4 ± 2,9%) aumentaron ligeramente pero no significativamente en comparación con los ratones control tratados con vehículo

(21,4 ±4,1%) (Figura 5C) . De manera destacada, el valproato redujo significativamente las respuestas de inmovilización de ratones APP _Ind durante pre-CS (p<0,02), mientras que no tenía efecto sobre los ratones control (p = 0,24) . De manera destacada, las respuestas de inmovilización de ratones APP _Ind tratados con valproato eran indistinguibles de los ratones control tratados con vehículo y valproato (p>0,05) . En presencia de CS, los ratones control y APP _Ind tratados con vehículo mostraron niveles similares de inmovilización (p = 0,27) . Sin embargo, mientras que el valproato no afectaba a la inmovilización en ratones control (p =0,36 versus vehículo) , sí reducía significativamente los niveles de inmovilización de ratones APPm _d (p < 0,03 versus vehículo) (figura 5C) . Estos resultados demuestran que el

tratamiento con valproato reduce de manera eficaz las respuestas del miedo condicionado y no condicionado en ratones transgénicos APP, demostrando de este modo que el tratamiento a corto plazo con valproato tiene efectos ansiolíticos en la AD.