La présente invention a pour objet l'utilisation de composés oligosaccharides dérivés du xanthane ainsi que leur sel pharmaceutiquement acceptable pour leur effet énergisant.

Les cellules ont besoin d'énergie pour vivre et assurer leurs fonctions biologiques. Dans le concept moléculaire de l'état vivant, les cellules peuvent être vues comme des machines chimiques capables de fonctionner dans des conditions où la température, la pression et le volume demeurent constants. Comme les machines inventées par l'homme, tous les organismes vivants peuvent tirer leur énergie du milieu environnant. Les organismes photosynthétiques utilisent l'énergie radiante du soleil, alors que les organismes hétérotrophes utilisent l'énergie liée à la structure des molécules de nutriments organiques qu'elles se procurent dans l'environnement. Ces différentes formes d'énergie sont transformées au sein des cellules en énergie chimique sous forme d'adénosine triphosphate (ATP) qui joue aussi le rôle de transporteur d'énergie. L'ATP fonctionne de manière cyclique comme transporteur de l'énergie chimique à partir de réactions de dégradation (catabolisme) qui fournissent de l'énergie chimique vers des processus cellulaires demandeurs d'énergie (biosynthèse de molécules, transport actif d'ions, de minéraux, de nutriments, contraction musculaire, etc.). L'ATP est formée à partir de l'adénosine diphosphate (ADP) par des réactions de phosphorylation liées à l'énergie engendrée par la dégradation des molécules de combustibles cellulaires. L'ATP ainsi formé va pouvoir être hydrolysé en ADP ou en AMP (adénosine monophosphate) réalisant ainsi une réaction exergonique produisant de l'énergie qui pourra être utilisée par différentes fonctions endergoniques dans la cellule. L'ADP et l'AMP ainsi formés vont être rephosphorylés en ATP aux dépens de réactions d'oxydation fournissant de l'énergie. Un cycle énergétique cellulaire est ainsi formé. Dans tous les tissus le métabolisme énergétique est commandé par un facteur principal : le taux d'ATP (adénosine triphosphate), ou plus précisément la charge énergétique du coenzyme ATP/ ADP.

Tous les organismes hétérotrophes tirent leur énergie (production d'ATP) de réactions d'oxydoréduction, c'est à dire de réactions où les électrons sont transférés d'un donneur d'électrons (ou agent réducteur) vers un accepteur d'électrons (ou agent oxydant). Chez l'homme, ΓΑΤΡ est principalement produit par la respiration cellulaire qui peut être définie comme l'oxydation des combustibles organiques par l'oxygène moléculaire. L'oxygène sert ainsi d'accepteur final d'électrons. La respiration cellulaire a lieu au sein d'un organite spécialisé : la mitochondrie. La respiration cellulaire est donc un mode de production de liaisons riches en énergie (sous forme d'ATP) se caractérisant par des oxydations phosphorylantes actives au sein d'une membrane riche en cytochromes, dont l'accepteur final d'électrons est l'oxygène et dont l'intermédiaire entre oxydation et phosphorylation (couplage) est un potentiel de membrane. La première partie de la respiration a lieu dans le cytosol et enrichit en électrons les molécules de NADH. De façon simplifiée, le glucose joue le rôle de combustible. La glycolyse est le phénomène de son morcellement en molécules plus simples, sous l'action de multiples enzymes. Des molécules secondaires (NADH) se chargent en électrons arrachés au glucose au cours des réactions enzymatiques et seront recyclées dans les mitochondries. La seconde partie de la respiration a lieu dans la mitochondrie où les électrons portés par ces molécules sont converties en gradient de protons au sein de la chaîne respiratoire. C'est à ce niveau que le dioxygène, jouant le rôle d'accepteur final d'électrons, capte des électrons et est transformé en eau, produit final de dégradation. La dissipation du gradient de protons à travers les protéines membranaires ATP-synthases (ou ATP-synthétases) permet de créer de ΑΤΡ à partir d'ADP (adénosine diphosphate) et de phosphate inorganique (Pi).

Les variations de concentration d'ATP et d'ADP ont un effet sur la chaîne respiratoire mitochondriale : il est ainsi connu qu'au repos, la concentration d'ATP est très supérieure à celle de Γ ADP et le flux d'ADP entrant dans la mitochondrie est faible. Dans ce cas la chaîne respiratoire est ralentie. Au contraire, en période d'activité, le rapport ATP/ADP diminue et le flux d'ADP entrant dans la mitochondrie augmente. La chaîne respiratoire est alors accélérée. Un principe général important du métabolisme est que les voies de biosynthèse et de dégradation sont presque distinctes et équilibrées. De nombreuses réactions métaboliques sont contrôlées par l'état énergétique de la cellule. Un index énergétique est la charge énergétique. La charge énergétique d'une cellule peut être définie comme étant proportionnelle à la fraction molaire de ΓΑΤΡ plus la moitié de la fraction molaire de l'ADP, étant donné que ΓΑΤΡ contient deux liaisons anhydride alors que l'ADP n'en contient qu'une. Ainsi, la charge énergétique d'une cellule peut être définie (et calculée) comme correspondant à :

[ATP] + ½ [ADP]

[ATP] + [ADP] + [AMP] (Atkinson DE., The energy charge of adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction with feedback modifiers, Biochemistry, 1968, Nov. ; 7(11) : 4030-4034)

Le vieillissement cellulaire est la conséquence d'un déséquilibre entre le processus de dégradation (catabolisme) et le processus de synthèse (anabolisme). Le maintien d'une charge énergétique stable permet d'équilibrer ces deux processus, retardant d'autant le vieillissement cellulaire.

Dans le domaine de la cosmétologie, des compositions ayant un effet dit « énergisant », c'est-à-dire permettant une stimulation du métabolisme énergétique cellulaire, peuvent être utilisées dans le cadre de la prévention et/ou du traitement des signes de vieillissement cutané et/ou capillaire intrinsèques et/ou extrinsèques, notamment l'altération des structures et des fonctions cutanées et/ou capillaires, l'altération de la régénération tissulaire, le relâchement tissulaire, l'altération de la microcirculation cutanée et/ou capillaire, l'altération de la détoxification cutanée, la perte de l'uniformité, de l' éclat et de la brillance de la teinte (cutanée et/ou capillaire), l'altération de la texture de surface cutanée (apparition de rides, de poches, sécheresse cutanée, etc.) et/ou capillaire (cheveux cassant), l'altération de l'architecture cutanée et/ou capillaire (induisant notamment la chute des cheveux). Le xanthane (ou gomme de xanthane) est un polyoside ramifié de haut poids moléculaire constitué d'une combinaison de quatre composés : le glucose, le mannose, l'acide glucuronique et l'acide pyruvique. Il est obtenu par fermentation d'un substrat hydrocarboné tel que l'amidon de maïs, le glucose ou le sucrose par une bactérie, la Xanthomonas campestris. La gomme de xanthane est fréquemment utilisée comme additif alimentaire pour ses propriétés épaississantes et gélifiantes. Elle est également fréquemment utilisée comme adjuvant de formulation, dans le domaine cosmétique mais également pharmacologique. La dégradation du xanthane en polysaccharides ou en oligosaccharides a été décrite dans la littérature.

Ainsi, dans un article intitulé « Dégradation of double-stranded xanthan by hydrogen peroxide in the présence of ferrous ions : comparison to acid hydrolysis », Carbohydrates research, vol.280, 1996 ; pages 85 à 99, Bjorn E. Christensen et al. décrivent un procédé de dégradation de la gomme de xanthane par le peroxyde d'hydrogène en présence d'ions ferriques. Dans cet article, il n'est précisé si le procédé permet d'obtenir des polysaccharides ou des oligosaccharides. D'autre part, aucune utilisation des composés obtenus à la suite de cette dégradation n'est décrite ni suggérée.

La demande de brevet internationale WO-A-2004/082380 décrit quant à elle un procédé de dégradation enzymatique de xanthane permettant d'obtenir des oligomères présentant un degré de polymérisation compris entre 1 (5 unités saccharidiques) et 30 (150 unités saccharidiques). L'utilisation des oligomères ainsi obtenus pour stimuler les mécanismes de défenses naturelles des plantes est également décrite.

Or, il a maintenant été découvert de façon toute à fait surprenante que certains oligosaccharides de faible poids moléculaire issus de l'hydrolyse radicalaire contrôlée du xanthane permettait une stimulation du métabolisme énergétique cellulaire.

La présente invention a donc pour obj et l'utilisation cosmétique comme agent énergisant d'un ou plusieurs oligosaccharide(s) de formule générale (I)

dans laquelle :

R ¹ , R ³ , R ⁴ et R ⁶ à R ¹⁴ sont choisis indépendamment les uns des autres comme étant un atome d'hydrogène ; ou un groupe hydroxy, alkyloxy, alkoxycarbonyl, acyloxy, sulfate ou phosphate; ou un groupement -OCH ₂ R ^a , dans lequel R ^a représente un groupe hydroxy, alkyloxy, acyloxy, sulfate ou phosphate;

R ² et R ⁵ sont choisis indépendamment les uns des autres comme étant un atome d'hydrogène ; ou un groupe alkyl, alkylcarbonyl, acyl sulfate ou phosphate; ou un groupement -CH ₂ R ^a , dans lequel R ^a représente un groupe hydroxy, alkyloxy, acyloxy, sulfate ou phosphate; et

- n est choisi de manière à ce que le poids moléculaire soit majoritairement inférieur ou égal à 100.000 Daltons ;

ainsi que son sel pharmaceutiquement acceptable.

Les oligosaccharides selon la présente invention n'ont jamais été décrits comme ayant un éventuel effet énergisant. Or, ces composés permettent une stimulation du métabolisme énergétique cellulaire. Ces composés peuvent donc être incorporés dans des compositions cosmétiques utiles pour leur effet énergisant dans le cadre de la prévention et/ou du traitement des signes de vieillissement cutané et/ou capillaire intrinsèques et/ou extrinsèques, notamment l'altération des structures et des fonctions cutanées et/ou capillaires, l'altération de la régénération tissulaire, le relâchement tissulaire, l'altération de la micro circulation cutanée et/ou capillaire, l'altération de la détoxifïcation cutanée, la perte de l'uniformité, de l'éclat et de la brillance de la teinte (cutanée et/ou capillaire), l'altération de la texture de surface cutanée (apparition de rides, de poches, sécheresse cutanée, etc.) et/ou capillaire (cheveux cassant), l'altération de l'architecture cutanée et/ou capillaire (induisant notamment la chute des cheveux)..

Dans le cadre de la présente invention :

- l'expression « poids moléculaire » se réfère indifféremment à la molécule seule ou au mélange de molécules et représente alors dans ce cas une valeur moyenne ;

- on entend par « sel pharmaceutiquement acceptable » tout sel d'addition avec un acide minéral ou organique par action d'un tel acide au sein d'un solvant organique ou aqueux tel qu'un alcool, une cétone, un éther ou un solvant chloré, et qui soit acceptable d'un point de vue pharmaceutique. A titre d'exemple de tels sels, on peut citer les sels suivants : benzènesulfonate, bromhydrate, chlorhydrate, citrate, éthanesulfonate, fumarate, gluconate, iodate, iséthionate, maléate, méthanesulfonate, méthylène-bis-b-oxynaphtoate, nitrate, oxalate, palmoate, phosphate, salicylate, sulfate, tartrate, théophyllinacétate et p-toluènesulfonate ;

- on entend par un groupe alkyle, une chaîne hydrocarbonée saturée, monovalente, linéaire ou ramifiée, comportant de 1 à 6 atomes de carbone, tels que les groupes suivants : méthyle, éthyle, n-propyle, iso-propyle, n-butyle, sec-butyle, iso-butyle, tert- butyle, pentyle, hexyle.

- le terme « alkyle » tel que défini ci-dessus conserve la même définition quand il intègre le nom d'un groupe, par exemple dans le groupe alkyloxy. Ainsi, parmi les groupes alkyloxy, on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy, n-propoxy, iso-propoxy, n-butoxy, iso-butoxy, sec-butoxy, tert-butoxy, pentyloxy ;

- on entend par « effet énergisant » l'activation du métabolisme énergétique cellulaire basai et mitochondrial (synthèse d'ATP, d'ADP et d'AMP) tout en maintenant une charge énergétique constante permettant l'équilibre entre les processus de dégradation (catabolisme) et de synthèse (anabolisme) ; et

- on entend par « agent énergisant » tout produit permettant d'obtenir un effet énergisant.

De façon préférée, la présente invention a pour objet l'utilisation cosmétique comme agent énergisant d'un ou plusieurs oligosaccharide(s) de formule générale (I-a) :

(I-a) dans laquelle :

R ¹⁵ à R ²⁸ sont choisis indépendamment les uns des autres comme étant un atome d'hydrogène ; ou un groupe, alkyl, acyl, sulfate ou phosphate ; ou un groupement -CH ₂ R ^a , dans lequel R ^a représente un groupe hydroxy, alkyloxy, acyloxy, sulfate ou phosphate ; et

n est choisi de manière à ce que le poids moléculaire soit majoritairement inférieur ou égal à 100.000 Daltons ;

ainsi que son sel pharmaceutiquement acceptable.

De façon toute à fait préférée, la présente invention a pour objet l'utilisation cosmétique comme agent énergisant d'un ou plusieurs oligosaccharide(s) de formule général

dans laquelle :

- Ac désigne un groupe acétyle ; et

- n est choisi de manière à ce que le poids moléculaire soit inférieur ou égal 100.000 Daltons ;

ainsi que son sel pharmaceutiquement acceptable.

Les oligosaccharides de formule générale (I), (I-a) et (I-b) ont un poids moléculaire inférieur ou égal à 100.000 Daltons. Préférentiellement, la présente invention a pour objet un oligosaccharide de formule générale (I), (I-a) ou (I-b) dans laquelle n est choisi de manière à ce que le poids moléculaire soit supérieur ou égal à 5.000 Daltons et inférieur ou égal à 100.000 Daltons. De préférence encore, n est choisi de manière à ce que le poids moléculaire soit supérieur ou égal à 5.000 Daltons et inférieur ou égal à 50.000 Daltons. De façon toute à fait préférée, n est choisi de manière à ce que le poids moléculaire soit supérieur ou égal à 5.000 Daltons et inférieur ou égal à 10.000 Daltons. Les oligosaccharides selon la présente invention peuvent être préparés selon des procédés bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple de tels procédés, on peut citer le procédé de dégradation radicalaire de xanthane comprenant les étapes suivantes :

a) dissolution de la gomme Xanthane dans l'eau à une température allant de 20°C à 100°C, le pH de la solution allant de 6 à 8.

De préférence la dissolution s'effectue sous agitation à une vitesse allant de 500 à 2.500 tours/minute, de préférence allant de 1.000 à 2.000 tours/minute. La concentration en polysaccharides dans l'eau après dissolution pourra varier en fonction des besoins de l'homme du métier et du matériel utilisé. Préférentiellement, la concentration en polysaccharides pourra être de 1 à 1.000 g/1, de préférence encore de 1 à 100 g/1, de façon toute à fait préférée de 10 à 50 g/1. La dissolution s'effectue à une température allant de 20°C à 100°C, de préférence à une température allant de 40°C à 80°C, de préférence encore à une température allant de 50 à 70°C ;

b) ajout progressif de peroxyde d'hydrogène (H ₂ 0 ₂ ), la température de la solution allant de 20°C à 100°C, le pH de la solution allant de 6 à 8.

De préférence, le rapport massique entre la gomme Xanthane et le peroxyde d'hydrogène ajouté est de 1/1. Le peroxyde d'hydrogène ajouté sera préférentiellement choisi comme étant du H ₂ 0 ₂ à 30%. L'ajout de peroxyde d'hydrogène s'effectue de façon progressive. De préférence, l'ajout de peroxyde d'hydrogène se fera de façon continue sur une période allant de 30 minutes à 3 heures.

c) maintient sous agitation, la température de la solution allant de 20°C à 100°C, le pH de la solution allant de 6 à 8 ;

d) fïltration ou centrifugation à température ambiante ;

e) concentration sous pression réduite ;

f) précipitation des oligosaccharides de faible poids moléculaire ; et

g) fïltration, lavage et séchage du précipitât obtenu.

Le procédé de dégradation selon la présente invention permet l ' obtention d'oligosaccharides de faible poids moléculaire avec un rendement de production élevé, de l'ordre de 60% à 70%.

Les oligosaccharides selon la présente invention peuvent donc être utilisés en cosmétique comme agent énergisant c'est-à-dire pour stimuler le métabolisme énergétique cellulaire ce qui permet de limiter le vieillissement des cellules. De préférence, la présente invention a pour obj et l'utilisation d'un ou plusieurs oligosaccharide(s) tel(s) que défïni(s) précédemment dans le cadre de la prévention et/ou du traitement des signes de vieillissement cutané et/ou capillaire intrinsèques et/ou extrinsèques, notamment l'altération des structures et des fonctions cutanées et/ou capillaires, l' altération de la régénération tissulaire, le relâchement tissulaire, l' altération de la microcirculation cutanée et/ou capillaire, l' altération de la détoxifïcation cutanée, la perte de l'uniformité, de l'éclat et de la brillance de la teinte (cutanée et/ou capillaire), l'altération de la texture de surface cutanée (apparition de rides, de poches, sécheresse cutanée, etc.) et/ou capillaire (cheveux cassant), l'altération de l'architecture cutanée et/ou capillaire (induisant notamment la chute des cheveux).

Les oligosaccharides décrits précédemment peuvent donc être utilisés dans une composition cosmétique. De telles compositions cosmétiques peuvent être formulées sous toute forme galénique appropriée à leur administration. Ces compositions peuvent ainsi être formulées sous forme de crème, gel, lotion, lait, émulsion huile dans eau ou eau dans huile, solution, onguent, pulvérisateur, huile corporelle, lotion après-rasage, savon, bâton protecteur des lèvres, bâton et crayon pour maquillage.

Des plus, de telles compositions contiennent un ou plusieurs oligosaccharides tels que décrits précédemment à des teneurs allant de 0,005% à 75% en poids total de la composition, préférentiellement de 0,01% à 25%, préférentiellement encore de 0,1 % à 5%.

Pour la préparation de ces compositions, un ou plusieurs oligosaccharides de faible poids moléculaires selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont mélangés aux excipients généralement employés dans la technique cosmétique.

Ces compositions peuvent prendre la forme d'une crème dans laquelle un ou plusieurs oligosaccharides de faible poids moléculaires selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont associés aux excipients couramment utilisés dans la cosmétologie.

Ces compositions peuvent prendre la forme de gels dans les excipients appropriés tels que les esters de cellulose ou d'autres agents gélifiants, tels que le carbopol, le sepinov (polyacrylate), la gomme guar, etc.

Ces compositions peuvent aussi prendre la forme d'une lotion ou d'une solution dans lesquelles un ou plusieurs oligosaccharides de faible poids moléculaires selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables sont sous forme encapsulée.

Ces microsphères peuvent par exemple être constituées de corps gras, d'agar et d'eau. Un ou plusieurs oligosaccharides de faible poids moléculaires selon la présente invention ou un ou plusieurs de leurs sels pharmaceutiquement acceptables peuvent être incorporés dans des vecteurs de type liposomes, glycosphères, cyclodextrines, dans des chylomicrons, des macro-, micro-, nano-particules ainsi que les macro-, micro- et nanocapsules et aussi être absorbés sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites et autres supports minéraux.

Ces émulsions jouissent d'une bonne stabilité et peuvent être conservées pendant le temps nécessaire pour l'utilisation à des températures comprises entre 0 et 50°C sans qu'il y ait sédimentation des constituants ou séparation des phases.

Ces compositions peuvent aussi contenir des additifs ou des adjuvants usuels en cosmétologies, comme par exemple des agents antimicrobiens ou des parfums mais aussi des lipides d'extraction ou de synthèse, des polymères gélifiants et viscosifïants, des tensio-actifs et des émulsifiants, des principes actifs hydro- ou liposolubles, des extraits de plantes, des extraits tissulaires, des extraits marins, des actifs de synthèse.

De plus, ces compositions peuvent aussi comprendre d'autres principes actifs complémentaires choisis pour leur action, par exemple pour l'effet amincissant, l'effet anti-cellulite, l'effet raffermissant, l' effet hydratant, l'activité antimicrobienne, l'activité anti-oxydante, l'activité antiradicalaire, l'effet cicatrisant, l'effet tenseur, l'effet anti-ride, l'activité chélatante, l'activité complexante et séquestrante, l'effet apaisant, l'effet anti-cernes, l'effet anti-rougeurs, l'activité émolliente, l'effet démêlant capillaire, l'activité anti-pelliculaire, l'effet stimulant de la repousse du cheveu, l'effet inhibant la chute du cheveu, l'effet gainant capillaire, l'activité épilatoire, l'activité limitant la repousse du poil, l'activité participant au renouvellement cellulaire, l'activité modulant la réponse inflammatoire, l'activité participant au maintien de l'ovale du visage, mais également la protection solaire, l'activité anti- irritante, la nutrition cellulaire, la respiration cellulaire, les traitements anti-séborrhéiques, la tonicité cutanée, la protection du cheveu.

Lorsque les compositions selon la présente invention contiennent des principes actifs complémentaires, ceux-ci sont généralement présents dans la composition à une concentration suffisamment élevée pour qu'ils puissent exercer leur activité. De telles compositions sont de préférence à utiliser quotidiennement en les appliquant une ou plusieurs fois par jour. Elles sont très bien tolérées, elles ne présentent aucune toxicité et leur application sur la peau, pour des périodes de temps prolongées, n'implique aucun effet systématique.

La présente invention est illustrée de manière non limitative par les exemples suivants.

Exemple 1 - Procédé de préparation d'un oligosaccharide selon la présente invention a) Préparation d'oligoXanthane de faibles poids moléculaires

50 g de Xanthane sont dissous dans 1 litre d'eau (80 °C, pH 7.8) sous vive agitation (1.500 tr/min). On ajoute 167 ml d'une solution d' H2O2 à 30% pendant 1 heure à un débit de 2,80 ml/min à 80°C et en maintenant à pH 7,8 par ajout continu de NaOH (5M).

Après ajout complet de ΓΗ2Ο2, l'agitation est maintenue durant lh supplémentaire (500tr/min) à 80°C en maintenant le pH à 7,8 par ajout de NaOH (5M).

On laisse le milieu revenir à 25 °C et on filtre sur diatomée (ou centrifuger à 10000g, 10 minutes, 25°C) pour éliminer les insolubles.

Le filtrat est ensuite concentré sous pression réduite à 40 °C jusqu'à un volume correspondant à 1/5 du volume initial.

Le concentrât est alors précipité dans 5 volumes d'éthanol 96%> à 4°C sous agitation (500 tr/min) pendant 1 heure.

Le précipitât est récupéré par fïltration sur verre Fritté 2 (porosité <100 microns), puis lavé avec 50 ml d'éthanol pendant 30 minutes puis filtré sur verre Fritté 2. Finalement, le précipitât est séché à l'étuve (40°C, 1 nuit) puis broyé en fine poudre.

Le rendement de production des oligosaccharides de faibles poids moléculaires est de 60-70%. b) Analyse des oligosaccharides préparés Analyse des sucres constitutifs

On hydrolyse des oligosaccharides au TFA IN et on procède aux analyses des sucres constitutifs par chromatographie ionique (HPAEC) en se référant à des bases de données monosaccharides pour l'identification. Détermination du poids moléculaire

Analyse par chromato graphie d'exclusion stérique (SEC MALLS) avec l'utilisation de 2 colonnes de chromatographie OHPAK SB 804 et 806 HQ (Shodex).

Composition (rapport molaire) Poids

moléculaires (majoritaires)

Glc Man GlcA

Oligosaccharides 2 2 1 <10kDa

Exemple 2 - Activité sur le métabolisme énergétique

Une étude in-vitro a été réalisée sur des préadipocytes 3T3-L1 en culture en absence (condition témoin) ou en présence de 0,5% (en poids) d'oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention (condition traité). Cette étude s'est déroulée en deux étapes :

Étape 1 : recherche de l'effet des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention sur la vitesse de respiration (consommation d'oxygène) des préadipocytes 3T3-L1 humains en culture,

Étape 2 : recherche de l'effet des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention sur le métabolisme énergétique des cellules en culture. Dosage des nucléotides adényliques cellulaires (ATP, ADP, AMP) et calcul de la charge énergétique des cellules traitées pendant 5 jours avec 0,5% d'oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention.

L'étape 1 a été réalisée selon deux conditions différentes : effet sur la vitesse de respiration basale cellulaire au niveau des cellules non perméabilisées et en présence de glucose et l ' effet sur la vitesse de respiration mitochondriale des cellules perméabilisées en présence du substrat respiratoire pyruvate-malate.

L'étude a été réalisée sur des préadipocytes en culture (10 millions de cellules par millilitre) dans du milieu HBSS à 30°C contenant soit du glucose (respiration basale) soit du pyruvate-malate (respiration mitochondriale). La respiration a été suivie en temps réel et exprimée en picoatomes d'oxygène consommés par minute et par million de cellules. L'addition de différentes quantités du produit dans la cuve de l'oxy graphe met en évidence une éventuelle stimulation ou inhibition de la respiration.

La quantité d'oxygène dissous dans un milieu d'incubation a été déterminée à l'aide d'une électrode de Clark. L'oxygène qui diffuse à travers un film de téfion est réduit au niveau de la cathode de platine polarisée à -0,8 Volt. Dans ces conditions, le courant passant entre cette cathode et l'anode d'argent est proportionnel à la concentration en oxygène dans la solution. Le pont ionique est assuré par une solution de KO demie saturée. L'acquisition et le traitement des mesures sont faits sur un micro -ordinateur. L'essai a été conduit en triplicate, après 20 minutes de contact des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention à 0,5% (en poids) avec les cellules.

Pour réaliser l'étape 2, les préadipocytes ont été mis en culture durant 5 jours en absence et en présence des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention (1 million de cellules par mesure). Un fois trypsinisées, les cellules ont été récoltées et les concentrations des nucléotides adényliques (ATP, ADP et AMP) ont été déterminées par HPLC.

L'essai a été conduit en triplicate, après 5 jours de contact des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention à 0,5% (en poids) avec les cellules.

Résultats Étape 1

Recherche de l'effet des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention sur la vitesse de respiration (consommation d'oxygène) des préadipocytes 3T3-L1 humains en culture.

Les résultats, exprimés en picoatomes d'oxygène par million de cellules et par minute, sont présentés dans le tableau ci-dessous :

Les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention (0,5% en poids) ont induits un effet significatif (p<0, 05 test de Wilcoxon Rank Sum) sur la vitesse de consommation d'oxygène. La stimulation des respirations basale et mitochondriale se traduit par des augmentations de la vitesse de consommation d'oxygène respectivement de 27% et de 22%.

Étape 2

Recherche de l'effet des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention sur le métabolisme énergétique des cellules en culture. Dosage des nucléotides adényliques cellulaires (ATP, ADP, AMP) et calcul de la charge énergétique des cellules traitées pendant 5 jours avec 0,5% d'oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention, exprimé en nanomoles de nucléotides adényliques par milligramme de protéines. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous :

Les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention incubés à la concentration de 0,5% (en poids) avec les cellules ont induits une augmentation significative (p<0,05) de la synthèse des nucléotides adényliques (ATP, ADP, AMP) traduisant ainsi une augmentation de l'activité métabolique des cellules. Par ailleurs, la charge énergétique reste constante, traduisant ainsi un équilibre énergétique stable entre les nucléotides adényliques.

Le maintien d'une charge énergétique stable permet d'équilibrer les processus de catabolisme et d'anabolisme, retardant ainsi d'autant le vieillissement cellulaire.

Exemple 3 - Activité sur le métabolisme énergétique et physiologique

L'activité des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention sur le métabolisme cellulaire et respiratoire a été évaluée par la métabolisation du glucose par les cellules de l'épiderme dans des conditions d'hypoxie. En effet, les conditions d'hypoxie in-vitro entraînent des altérations profondes des fonctions électromécaniques cellulaires, accompagnées d'une augmentation de la production de lactate, d'une chute des teneurs en ATP et ADP, d'une fuite de LDH (lactate deshydrogénase). La réoxygénation des cellules hypoxiées (stade réversible) normalise la perte de lactate, entraîne une resynthèse d' ATP et une atténuation de la libération de LDH. La diminution de l'activité superoxyde dismutase et glutathion peroxydase est atténuée. Pour démontrer ces effets au niveau de l'épiderme, la respiration et la viabilité des cellules ont été évaluées par le dosage du relargage du ¹⁴ C0 ₂ . Cette étude est réalisée sur des épidermes reconstitués. L'activité des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention sur le métabolisme cellulaire et celle sur son pouvoir oxygénant ont été évaluées par le métabolisme du D-[ ¹⁴ C]- glucose-6-phosphate (288 mCi/mmol, NEN, France) et le dosage du ¹⁴ C0 ₂ .

L'asphyxie des épidermes a été réalisée par une privation de l'oxygène 24 heures avant le traitement par les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention.

L'essai est conduit en duplicate après 24 heures de contact des oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention avec les épidermes.

Les épidermes reconstitués sont divisés en 6 lots :

• Lot 1 : épidermes témoins négatifs ne recevant aucun produit

• Lot 2 : épidermes traités avec les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention à 0,1% (en poids)

• Lot 3 : épidermes traités avec les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention à 0,5% (en poids)

• Lot 4 : épidermes témoins ne recevant aucun oligosaccharide de faible poids moléculaire selon la présente invention (Asphyxie 24 heures)

• Lo t 5 : épidermes traités recevant les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention à 0,1 % (en poids) (Asphyxie 24 heures)

• Lo t 6 : épidermes traités recevant les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention à 0,5%> (en poids) (Asphyxie 24 heures) Le ¹⁴ C0 ₂ libéré à partir du métabolisme du D-[ ¹⁴ C]-glucose-6-phosphate a été évalué par la capture du ¹⁴ C0 ₂ sur des filtres placés au-dessus des épidermes. Le D-[ ¹⁴ C]- glucose-6-phosphate est mis au contact des épidermes pendant toute la durée du traitement par les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention (24 heures). A la fin du temps du traitement les filtres sont récupérés puis la radioactivité comptée à l'aide d'un compteur à scintillation. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous :

Significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05)

Significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention (0,1 % et 0,5%>) augmentent la libération du ¹⁴ C0 ₂ respectivement de 15% et 18% dans les conditions physiologiques et de 23% et 24% dans les conditions d'asphyxie. Ce résultat montre que les oligosaccharides de faible poids moléculaire selon la présente invention stimulent le métabolisme cellulaire en métabolisant le glucose.