技术领域

本发明涉及食物过敏原和食物过敏原抗体在 IgA 肾病方面的应用， 即食物 过敏原和食物过敏原抗体在制备 IgA肾病病因检测试剂中的应用，以及检测 IgA 肾病病因的方法。

背景技术

IgA肾病（IgA nephropathy , IgAN)是一组以 IgA或 IgA为主的免疫复合物 在肾小球系膜区沉积为主要特征， 病因不明的免疫复合物肾小球肾炎， 是世界 范围内最常见的肾小球疾病， 占肾小球疾病的 30%〜40%， 即使在 IgA肾病发病 率较低的美国， 20岁〜 39岁的成人中， IgA肾病仍占肾小球病的首位。 IgA肾 病也是我国慢性肾脏病的主要类型， 约占我国肾小球疾病的 40%左右。现已明确 IgA肾病是进展性疾病， 发病后每 10年约有 20%的患者进展到慢性肾功能衰竭， 目前认为本病约 40%的病人最终进展为终末期肾衰 （ESRD)。 故 IgA肾病严重危 害患者的健康和生活质量， 同时， 也给患者、 家庭和社会造成巨大的经济负担。 目前， IgA肾病确切的病因和发病机制尚未明了， 亦无统一、 有效的治疗方法。 发明内容

本发明基于一个新的研究发现， 本发明的发明人通过实验研究发现： IgA肾 病的发生与食物过敏原有直接关系， 食物过敏原可能介导了 IgA 肾病的发生。 因此， 通过检测样本中食物过敏原或食物过敏原抗体 的存在情况， 能够准确判 断 IgA 肾病的病因， 为后续的治疗提供思路。 本发明还提供了食物过敏原和食 物过敏原抗体的新用途， 即在制备 IgA 肾病检测试剂中的应用； 此外， 本发明 还提供了检测 IgA肾病病因的方法。

食物过敏原抗体在制备 IgA肾病病因检测试剂中的应用。

优选的， 所述的食物过敏原为花生过敏原、 坚果类过敏原、 鱼类过敏原、 甲壳类过敏原 （如虾、 蟹等）、 乳类过敏原、 榛子过敏原、 大豆过敏原和蛋类过 敏原中的至少一种。 上述八种食物过敏原为最常见的 8类食物过敏原。

优选的， 所述食物过敏原抗体为牛奶 β _乳球蛋白单克隆抗体、 鸡蛋卵粘蛋 白 0VM单克隆抗体、鱼小清蛋白单克隆抗体、虾肌 球蛋白单克隆抗体、花生 Arahl 蛋白单克隆抗体、 榛子 Corhl蛋白单克隆抗体、 大豆 Gly mBd单克隆抗体和蟹 原肌球蛋白单克隆抗体中的至少一种。 牛奶 β _乳球蛋白、 鸡蛋卵粘蛋白 0VM、 鱼小清蛋白、 虾肌球蛋白、 花生 Arahl蛋白、 榛子 Corhl蛋白、 大豆 Gly mBd, 蟹原肌球蛋白分别为各自类别食物过敏原中引 起过敏反应的主要蛋白。

优选的， 所述食物过敏原抗体为多克隆抗体、 单克隆抗体中的至少一种。 更优选的， 所述食物过敏原抗体为单克隆抗体， 以降低检测试剂在实际检测过 程中的假阳性率。

优选的， 所述食物过敏原抗体为荧光标记抗体、 酶标抗体或生物素标记抗 体。 使得检测试剂在实际检测过程中更为灵敏， 检测的实验结果易于观察， 且 准确性高。

优选的， 所述食物过敏原抗体为异硫氰酸荧光素 （FITC ) 标记抗体、 四甲 基异氰酸罗达明 （TRITC ) 标记抗体、 罗丹明红 （RRX) 标记抗体、 德克萨斯红 (TR) 标记抗体、 青类染料 （Cy2， Cy3， Cy5 ) 标记抗体、 藻红蛋白或藻胆色素 蛋白 （PE) 标记抗体或醋酸 （AMCA) 标记抗体。

FITC在冷暗干燥处可保存多年， 是目前应用最广泛的荧光素。 FITC荧光二 抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感， 通常切片标本中的绿色荧光少于红色。

TRITC 为罗丹明的衍生物， 呈紫红色粉末， 较稳定。 最大吸收光波长为 550nm, 最大发射光波长为 620nm， 呈现橙红色荧光， 与 FITC的绿色荧光对比鲜 明， 可配合用于双重标记或对比染色。 因其荧光淬灭慢， 也可用于单独标记染 色。

RRX和 TR是罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收� ��长 （570， 596nm) 和最大发射波长 （590， 620nm)。 使用 RRX和 TR可以得到更好的颜色区分。

Cy2比 FITC在光下更稳定， Cy3和 Cy5比其他的荧光团探针要更亮， 更稳 定， 背景更弱。

藻红蛋白 PE的吸收波长范围较广， 最大的吸收波长为 566nm， 最大的发射 波长为 574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点� �� 首先具有强的长波长激 发和发射荧光， 可避免来自其他生物 材料荧光的干扰； 并且具有极高的发射量 子产率； 另外 PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合� ��材料的多位点稳 定交联。

AMCA的信号相对较弱， 单标实验中不推荐使用隠。 AMCA和荧光素的荧光 波长只有很小的重叠范围， 而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有 极少 的重叠， 因此它最常用于多标记实验中， 比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。

本发明还提供了食物过敏原的新用途， 即在制备 IgA 肾病病因检测试剂中 的应用。

优选的， 所述食物过敏原为花生过敏原、 坚果类过敏原、 鱼类过敏原、 甲 壳类过敏原、 乳类过敏原、 榛子过敏原、 大豆过敏原和蛋类过敏原中的至少一 种。

优选的， 所述食物过敏原为牛奶 β _乳球蛋白、 鸡蛋卵粘蛋白 0VM、 鱼小清 蛋白、 虾肌球蛋白、 花生 Arahl蛋白、 榛子 Corhl蛋白、 大豆 Gly mBd、 蟹原肌 球蛋白中的至少一种。

优选的， 所述食物过敏原带有标记分子。 使得利用上述的检测试剂进行检 测的检测结果更易于观察， 且准确性高。

优选的， 所述标记分子为酶标记分子。

本发明还提供了一种检测 IgA 肾病病因的方法， 利用食物过敏原抗体， 采 用免疫组化法检测样本中的食物过敏原， 若检测出某种或多种食物过敏原， 则 说明该种食物过敏原或该多种食物过敏原为该 IgA肾病患者患者的病因。

优选的， 所述的食物过敏原为花生过敏原、 坚果类过敏原、 鱼类过敏原、 甲壳类过敏原、 乳类过敏原、 榛子过敏原、 大豆过敏原和蛋类过敏原中的至少 一种。

优选的， 所述食物过敏原抗体为牛奶 β _乳球蛋白单克隆抗体、 鸡蛋卵粘蛋 白 0VM单克隆抗体、鱼小清蛋白单克隆抗体、虾肌 球蛋白单克隆抗体、花生 Arahl 蛋白单克隆抗体、 榛子 Corhl蛋白单克隆抗体、 大豆 Gly mBd单克隆抗体、 蟹 原肌球蛋白单克隆抗体中的至少一种。

优选的， 所述食物过敏原抗体为多克隆抗体、 单克隆抗体中的至少一种。 优选的， 所述食物过敏原抗体为荧光标记抗体、 酶标抗体或生物素标记抗 体。

更优选的， 所述食物过敏原抗体为异硫氰酸荧光素 （FITC) 标记抗体、 四 甲基异氰酸罗达明 （TRITC) 标记抗体、 罗丹明红 （RRX) 标记抗体、 德克萨斯 红 （TR) 标记抗体、 青类染料 （Cy2， Cy3， Cy5 ) 标记抗体、 藻红蛋白或藻胆色 素蛋白 （PE) 标记抗体或醋酸 （AMCA) 标记抗体。

上述任一方案中更优选的， 所述样本为组织石蜡切片、 组织冰冻切片中的 至少一种。

更优选的， 所述样本为肾组织石蜡切片， 包括以下步骤：

A. 肾组织石蜡切片脱蜡至水；

B. 去除肾组织石蜡切片样本的内源性过氧化物酶 ；

C. 抗原修复， 然后封闭非特异性位点；

D. 加入荧光标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光 显微镜观察结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然 后加入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观 察检测结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然后加 入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤， 加入信号分子标记的 IgG二抗， 孵 育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观察检测结果。

组织石蜡切片对抗原的定位效果较好， 且利于长期保存， 因此， 选用肾石 蜡切片， 使得实验结果对于食物过敏原的定位更为准确 ， 对需保存时间较长的 样本来说， 选用上述方法， 检测结果更为准确。

优选的， 所述样本为肾组织冰冻切片， 包括以下步骤：

A . 去除肾组织冰冻切片样本的内源性过氧化物酶 ；

B. 抗原修复， 然后封闭非特异性位点；

C. 加入荧光标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光 显微镜观察结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然 后加入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观 察检测结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然后加 入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤， 加入信号分子标记的 IgG二抗， 孵 育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观察检测结果。

冰冻切片对食物过敏原的保真效果更好， 而石蜡切片在组织固定， 脱水、 透明、 浸蜡、 包埋、 脱蜡等过程中可能会对抗原的性质造成影响。 此外， 使用 冰冻切片使得上述方法更为简单， 而石蜡切片要求脱蜡入水、 抗原修复等过程， 比较繁琐， 同时冰冻切片还可以避免石蜡自发荧光的干扰 ； 但是冰冻切片在制 备好后只能保存较短的时间， 不利于大量样本的同时检测。 因此， 使用肾组织 石蜡切片和肾组织冰冻切片各有优缺点。

本发明还提供了另外一种检测 IgA 肾病病因的方法， 利用食物过敏原， 通 过 ELISA技术检测样本中的食物过敏原抗体， 若检测出某种或多种食物过敏原 抗体， 则说明该种食物过敏原或该多种食物过敏原为 该 IgA 肾病患者患者的病 因。

优选的， 所述的食物过敏原为花生过敏原、 坚果类过敏原、 鱼类过敏原、 甲壳类过敏原、 乳类过敏原、 榛子过敏原、 大豆过敏原和蛋类过敏原中的至少 一种。

优选的， 所述食物过敏原抗体为牛奶 β _乳球蛋白、 鸡蛋卵粘蛋白 0VM、 鱼 小清蛋白、 虾肌球蛋白、 花生 Arahl蛋白、 榛子 Corhl蛋白、 大豆 Gly mBd、 蟹 原肌球蛋白中的至少一种。

优选的， 所述食物过敏原带有标记分子。

更优选的， 所述标记分子为酶标记分子。

优选的， 所述样本为血清、 血浆、 全血和组织液中的至少一种。

优选的， 所述样本为血清样本， 包括以下步骤： A. 在预包被有食物过敏原的 96孔板中加入封闭液， 封闭非特异性位点， 孵育；

B. 洗涤， 然后加入待检测的血清样本， 孵育；

C. 洗涤， 加入酶标记 IgA二抗， 孵育；

D. 洗涤后加入显色液， 在避光条件下显色， 然后加入终止液， 利用酶标仪读取 96孔板中各孔的吸光值。

优选的， 所述酶标记 IgA二抗的酶标记分子可选用辣根过氧化物酶 （HRP)、 碱性磷酸酶 （AKP) 或葡萄糖氧化酶 （G0D)。

当酶标记 IgA二抗为羊抗鼠 HRP-IgA二抗时， 显色液为 TMB显色液， 酶标 仪读取的吸光值为 96孔板中各孔在 450nm处的吸光值。

利用上述方法进行检测对仪器的要求较低， 在基层医疗机构和普通实验室 中也能进行， 使得对普通人群进行 IgA肾病筛查成为可能， 也有利于 IgA肾病 的早期预警， 具有良好的临床应用前景。

上述利用食物过敏原进行 IgA 肾病病因检测的方法可以和利用食物过敏原 抗体进行肾病病因检测的方法联合使用， 使得 IgA肾病病因检测结果更为准确。

与现有技术相比， 本发明提出了食物过敏原和食物过敏原抗体的 新用途， 即在制备 IgA肾病检测试剂中的应用， 使得方便、 快捷、 准确的确定 IgA肾病 病因成为现实， 从而为 IgA 肾病的治疗提供新思路。 另外， 本方面提供的检测 IgA肾病病因的方法简单、 高效， 检测结果准确。

附图说明

图 1为 8类食物过敏原基因片段 PCR扩增 DNA电泳图；

图 2为 8类食物过敏原的表达蛋白的 SDS-PAGE电泳图；

图 3为 8类食物过敏原的单克隆抗体鉴定 western-blot图；

图 4A和图 4B为部分 IgA肾病患者肾组织切片 8类食物过敏原免疫荧光图； 图 5为 ELISA检测已确诊 IgA肾病患者血清中总抗体（总 IgA和总 IgG)及 食物过敏原特异性抗体柱形图；

图 6为 ELISA检测已确诊 IgA肾病患者血清中常见食物抗原特异性抗体柱 形图。

具体实施方式

一、 食物过敏原与 IgA肾病直接相关证明实验。

1.八种食物过敏原的基因的克隆和表达。

参照 NCBI序列： 牛奶主要过敏原 BLG基因 (GeneBank ID EU883598) (表 达牛奶 β -乳球蛋白）， 鸡蛋卵粘蛋白 OVM (GeneBank ID FJ227543 ), 鱼小清蛋 白 （GeneBank ID EF591789), 虾肌球蛋白 （GeneBank ID EF584510), 花生 Ara hi蛋白 (GeneBank ID AF432231)、 榛子 Corhl蛋白 (GeneBank ID EU195058), 大豆 GlymBd (GeneBank EU883600)和蟹原肌球蛋白 Tropomyosin (GeneBank ID EF143836), 分别设计了 8对引物， 见表 1。

表 1

1.1 RT- PCR。

分别取 lOOmg上述 8类食物过敏原的组织，用 RNasy mini kit (购自于 Qiagen 公司） 产品说明的操作规程提取总 RNA， 并对 RNA进行定量和质量鉴定。

逆转录反应是使用 BBI公司的讀逆转录酶体系，将 ΐμ _§ 的总 RNA与 0.5μ _§ 的 OligodT混合， 70°C加热 5分钟， 迅速冷却至 0°C。 按产品说明加入缓冲液， 42°C孵育 1小时。 分别取逆转录反应后的 cDNA 4μΐ, 分别作为 PCR反应的模板 扩增上述 8种食物过敏原的基因。

PCR反应体系为， 95°C 3min然后用 Touchdown方式进行扩增， 第一个循环 为 94°C 45S, 65 °C 45S, 72 °C 2min， 此后每个循环的退火温度下降 1°C， 当退 火温度下降到 57°C时， 则以 94°C 45s, 57 °C 45s, 72 °C 2min运行 35个循环， 再于 72°C延伸 lOmin后结束反应。 将 PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

结果如图 1所示， 8类食物过敏原基因扩增片段在预测位置有明� �的条带， 说明 RT-PCR扩增成功。 图中 A-H分别表示： A: 牛奶 β-乳球蛋白 530bp; B: 鸡蛋卵粘蛋白 627bp; C: 鱼小清蛋白 230bp; D: 虾肌球蛋白 850bp; E: 花生 Arahl 130bp， F: 榛子 Corhl 432bp _; G: 大豆 Gly mBd 450bp _; H: 蟹原肌球蛋 白 855bp ₀

1. 2 重组质粒的构建。

使用 TaKaRa胶回试剂盒回收 PCR产物， 按照产品说明操作规程进行回收。 将 1. 1回收的 PCR产物分别使用 TaKaRa pMD18_T载体试剂盒进行连接。 连接产 物转化感受态细胞大肠杆菌， 涂板 37°C过夜培养， 分别采用 PCR扩增和双酶切 鉴定的方式筛选阳性克隆质粒。操作方法参照 第三版《分子克隆》第一章 96-99 页。 将鉴定的阳性菌落由上海生工生物工程有限公 司进行序列分析。 将测序正 确的质粒与原核表达载体 pET-28a分别进行双酶切。 使用 T4 DNA连接酶， 将酶 切所获基因片段与原核表达载体 pET-28a (购自 Qiagen公司） 的酶切产物相互 连接。 再将连接产物转化至感受态大肠杆菌， 菌落 PCR及质粒双酶切鉴定准确 无误后转化高效表达菌大肠杆菌 BL21 (DE3 ) 和 E. coli Rosetta (DE3 ), 得表 达菌， 用于诱导表达。

1. 3重组食物过敏原蛋白的诱导表达。

将 1. 2转化后的表达菌挑取单菌落至 20mL LB (含卡那霉素 40 g/mL) 试管 中， 37°C， 200 rpm摇床过夜。 按 1 ： 50接种量， 将 20mL培养物接种到 1L LB培 养基 (含卡那霉素 40 g/mL) 中。 37°C， 200 rpm摇床培养， 待细菌生长处于对 数生长期 （A600nm=0. 6-0. 8) 时， 加入终浓度为 1匪 ol/L的 IPTG, 诱导蛋白表 达。 4h后取 lmL菌液， 制备样品进行 SDS-PAGE凝胶电泳来检测表达情况。在上 述表达产物中，重悬于 20mM Tris_HCl (pH7. 5)。三次冻融后超声波（300W, 20min， 冰浴） 破菌。 4°C ， 15000rpm离心 15min， 分别取上清与沉淀进行 15% SDS-PAGE 电泳分析。

结果如图 2所示重组 8类食物过敏原蛋白在理论分子量处有外源蛋� �条带 出现， 重组蛋白可在大肠杆菌表达系统大量表达。 图中 A-H分别表示 8种重组 食物过敏原的表达情况， A: 牛奶 β _乳球蛋白 26kD; B: 鸡蛋卵粘蛋白 21kD; C: 鱼小清蛋白 42kD; D：虾肌球蛋白 36kD; E:花生 Arahl 38kD， F:榛子 Corhl 15. 8kD; G: 大豆 Gly mBd 16. 5kD _; H: 蟹原肌球蛋白 38kD。

1. 4重组蛋白的分离纯化。

装好 Ni-NTA柱 （购自 Pharmacia Biotech公司）， 检测密封性。 清洗， 具 体清洗过程程序按 Ni-NTA (说明书操作进行。 用 Ni-NTA裝柱， 1. 6 X 20cm， 柱 体积为 10mL， 用缓冲液 1平衡 2-5个柱床体积， 流速为 2mL/min; 将 20mL细胞 破碎液（50mM PBS, pH7. 4， 0. 5mM NaCl ) 0. 45uM滤膜过滤，上样，流速为 lmL/min; 用缓冲液 1再洗 2-5个柱床体积， 流速为 2mL/min _; 再用分别含 20mM、 50mM、 100mM、 200mM、 300mM、 400mM 的咪唑洗脱， 流速为 2mL/min， 收集洗脱峰尖和 峰液， 进行 SDS-PAGE电泳， 并对含目标蛋白的洗脱组分分别进行透析并冻 干保 存， 得重组蛋白： 牛奶 β _乳球蛋白、鸡蛋卵粘蛋白、鱼小清蛋白、虾� �球蛋白、 花生 Arahl、 榛子 Corhl 15、 大豆 Gly mBd、 蟹原肌球蛋白。

1. 5 免疫学特性鉴定。

将 1. 4纯化的重组蛋白进行 15%SDS-PAGE电泳分离， 电压 80至 100V, 时 间 90至 120min， 然后进行免疫印迹， 操作步骤见《分子克隆》， 将 SDS-PAGE胶 上蛋白电转到硝酸纤维素膜上， 电转条件为： 300mA/板； 350mA/2板， 60min。 取下膜， TBA洗膜， 5minx3。 将膜置于封闭液中缓慢摇动 30min。 4°C封闭过夜。 将 NC膜裁剪成小片条并放入血清池孵育槽， 分别与已稀释的 25例含有相应特 异性 IgE的过敏患者血清（一抗） 37°C孵育 2h。 回收血清。 TBST洗膜， 5minx3。 加入用二抗 buffer稀释 （1 : 3000) 的生物素标记的羊抗人 IgE抗体 （二抗）， 37°C孵育 2h。 TBST洗膜， 5minx3。 加入经 HRP标记链霉亲和素 buffer稀释 ( 1 : 1000) 的辣根过氧化物酶 （HRP)标记的链霉亲和素。 37°C孵育 1. 5h。 TBST 洗膜， 5min 3次。 TBS洗膜， 5min 3次。 在膜表面滴加 DAB显色液， 双蒸水洗 涤终止显色反应。

2.八种食物过敏原的单克隆抗体的制备。

2. 1 杂交瘤细胞的制备。

将 1. 4制备所得的鸡蛋卵粘蛋白溶解， 取 lmL 0. 25g/L与等体积的弗氏完 全佐剂 （购于 Sigma公司） 充分乳化后皮下注射于 5只 Balb/c小鼠 （购自于广 东省医学实验动物中心）。 每间隔 3周加强免疫 1次， 加强免疫时改用弗氏不完 全佐剂， 抗原量及注射途径不变。 第 2次加强免疫后 7d取尾血测效价。 融合前 3d, 经尾静脉注射同等剂量的抗原 PBS溶液再加强免疫 1次。 分别收集免疫小 鼠脾细胞和 NS-1细胞以约 1 : 5的比例在 50%PEG作用下按常规方法融合。 融合 后的细胞沉淀用 2. 5mL完全培养液轻悬加入 22. 5mL半固体培养基 Medium D混 匀后倒入直径 3. 5cm的平皿中， 每个平皿约 2mL， 37°C， 5%C02培养。 一周后肉 眼可见平皿的培养基表面有白色斑点， 显微镜下即为细胞克隆团。 无菌条件下 将平皿中分散的、 单个的细胞团吸起放入 96孔板培养液中， 继续培养。 96孔板 中细胞长满后间接 ELISA法进行检测， 阳性孔用有限稀释法进行亚克隆。

另外七类食物过敏原的杂交瘤细胞的制备可参 照上述方法进行。

2. 2单克隆抗体生产和效价测定。

对己经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在 BALB/c小鼠体内诱生小鼠腹水生 产单克隆抗体。 取 8周龄的 BALB/c小鼠， 腹腔注射液体石蜡 0. 5mL/只， 7天后 腹腔注射杂交瘤细胞 5 X 10 ⁵ -5 X 107只， 7-10天后抽取小鼠腹水， 1200r/min离 心 lOmin取上清， 用间接 ELISA测定效价。 将腹水按 1 : 100、 1： 200、 1： 400、 1： 800、 等倍比稀释后， 将重组蛋白包被， 测定其 A450nm值， 用免疫前小鼠血 清做平行阴性对照试验，以与重组蛋白靶抗原 发生反应的单克隆抗体的最大稀 释度即为其效价， P/N 2. 1 为阳性。 8类食物过敏原的单克隆抗体效价结果如 表 2所示， 8株抗体效价在 1. 3 X 10— ⁴ 至 10— ⁸ 以上。抗体纯化参照 HiTrap protein A亲和层析说明书进行抗体纯化， HiTrap protein A购自 Amersham公司。

表 2

2. 3单克隆抗体的鉴定。

先将 1. 4制备得到的重组蛋白进行 12% SDS-PAGE电泳， 以蛋白质电泳转移 仪将凝胶上的蛋白质转至固定好的硝酸纤维素 膜上 (300mA， 50min) , 用丽春红 染液对膜进行染色后剪膜， 再用超纯水、 TBST (10™ol/L Tris， 150匪 ol/L NaCl， 0. 2%Tween-20, pH8. 0)洗去丽春红。加用 TBST配制的 2%BSA 4°C封闭过夜， TBST 摇洗后， 分别加入此单克隆抗体室温孵育 lh， 以免疫前鼠血清作为阴性对照； 用 HRP标记的羊抗鼠 IgG的抗体为二抗， 室温孵育 lh， TBST洗膜后， 用 DAB试 剂显色。

Western blotting分析表明， 多株单抗均能特异性与 8类食物过敏原蛋白 结合结果如图 3所示。 从而鉴定出此 8株单抗具有抗 8类食物过敏原蛋白的活 性。 图中 A-H分别表明纯化后的 8类食物过敏原蛋白均能与鼠抗食物过敏原蛋 白单克隆抗体 IgG相互作用，均具有良好的免疫原性。 A:牛奶 β _乳球蛋白 26kD; B: 鸡蛋卵粘蛋白 21kD; C: 鱼小清蛋白 42kD; D: 虾肌球蛋白 36kD; E: 花生 Arahl 38kD， F: 榛子 Corhl 15. 8kD; G: 大豆 Gly mBd 16. 5kD; H: 蟹原肌球 蛋白 38kD。

2. 4单克隆抗体的标记。

单克隆抗体标记生物素可参照 Sulfo-丽 S-Biotin试剂盒 （购自于 Thermo 公司） 说明书进行操作。 如： 将 Sulfo-NHS-Biotin放置室温平衡 10min。 抗体 浓度调整至 3mg/ L，置于 30KD超滤离心柱内， 10000转 /min，离心 5min，将 Buffer 置换为 PBS缓冲液。 将 10mM Sulfo-NHS-Biotin溶解于 50(^L超纯水中。 加入 预先计算好的体积量的 Sulfo-NHS-Biotin 溶液到抗体溶液中。 室温避光孵育 30min。 将反应物至于超滤离心柱中， lOOOg离心 2min， 去下清， 将滤膜放回离 心管。 加入 lOC^L PBS于滤膜上， lOOOg离心 2min， 弃下清， 重复 3次。 将滤 膜倒置于新离心管中， lOOOg离心 2min， 收集滤液， 滤液为纯化的抗体溶液。 -20 °C保存抗体。

3. 1 总蛋白抗原的制备

用液氮研磨花生成粉末， 按 1 : 15的比例用丙酮浸泡去脂 48h， 放在 4°C冰箱， 每 12h换液 1次，搅拌 2次。去丙酮，干燥后称重，每 5g样品加 30mL提取液（8mmol/L Tri s-HCl , 25mmol/L Tricine , pH8. 6 ) 4°C过夜， 11000转 /min， 离心 30min， 收集上清。 取上清进行不连续 SDS - PAGE分析粗提液中蛋白质组分并测定分子

3. 2 多克隆抗体的制备。

体重 3kg的雄性新西兰兔 1只， 免疫前 Id耳缘静脉取血， 4°C静置 lh后分离血 清作为阴性对照。 初次免疫时， 每只新西兰兔背部皮下多点注射 2mL弗氏佐剂乳 化的花生总蛋白抗原 （蛋白浓度为 0. 5mg/mL ) 。 2周后以不完全弗氏佐剂乳化的 融合蛋白纯品进行第二次免疫， 方法同前。 隔 2周后重复免疫 1次， 剂量、 方法 均与第二次免疫相同。 免疫 3次后， 耳缘静脉采血作多克隆抗体 ELISA法效价分 析。 效价符合要求 （ELISA法效价〉1： 1280000 ) 后， 加强免疫 1次。 加强免疫 后 3d, 颈总动脉插管法放血， 离心收集血清， 放入 -80°C保存备用。

3. 3 多克隆抗体测定。

包被花生总蛋白， 蛋白至终浓度为 25 g/mL， 每孔 100 常规包被 96孔板 (留 1个孔作空白对照） ， 37°C孵育 2 h， 洗板机洗板 3次， 每次 3min， PBST-5% BSA每孔加 ΙΟΟ μ Ι , 37 °C封闭 2h。 重复洗板后以 PBS稀释多克隆抗体 （1 : 5000、 1： 20000、 1： 80000、 1： 320000、 1： 1280000 ) ， 37°C孵育 2h， 同时选择 1个 复孔作为阴性对照。每个浓度选择 3个复孔做对比，洗板 3次，每孔加入 lOO Ll： 5000 TBST-5% BSA稀释的 HRP标记羊抗兔 IgG， 37°C孵育 40min。 同样方法洗板 3 次后加底物 TMB 50 μ L显色 5 min， lmol/L H ₂ S04终止液终止反应， 酶标仪 490 nm 单波长紫外光检测。 花生多克隆抗体效价测定的 ELISA法分析免疫后第 1次与第 2 次抗体效价 3次测量均值与免疫前 3次测量均值比较， 结果均大于 2. 1倍， 证明花 生多克隆抗体效价〉 1： 128 000。 血清 -20°C保存。

3. 4多克隆抗体的纯化

将制备的多抗的抗血清用结合缓冲液（lmol/L Tri s/HCl、 pH9. 0、 20mmol/L Na ₃ P04 ) 稀释后， 经 0. 45 μ πι的滤膜过滤， 加样到 HiTrapTM ProteinG HP的纯化 柱上（购自 Amersham公司），按说明书进行抗体纯化。用洗� ��缓冲液（100匪 ol/L 甘氨酸 -HC1 , pH2. 7 ) 洗脱后， 收集洗脱峰。 Western blotting鉴定抗花生多克 隆抗体。

4.标记食物过敏原多克隆抗体。

多克隆抗体的标记可参考 2. 4单克隆抗体标记。

5.肾组织荧光免疫组化检测。

1 ) 已确诊的 IgA肾病患者的肾组织石蜡切片 167例常规脱蜡至水；

2 ) 滴加 3%H ₂ 0 ₂ 孵育 20min， 去除内源性过氧化物酶， pH 7. 4 0. Olmol/LPBS 漂洗 3次。 滴加 0. 25%胰酶 （购于加拿大 invitrogen公司） 于石蜡切片上， 置 于湿盒中， 37°C孵育 15分钟进行抗原修复。 PBST浸洗 3次， 5分钟 /次。 滴加 5%BSA (购于武汉博士德生物公司）于石蜡切片上，� �于湿盒中， 37°C孵育 1小时。 甩掉石蜡切片上的封闭液， 将 2. 2制备所得的 8种不同的食物过敏原的小鼠单 克隆抗体按照所测得的效价（见表 2 )分别稀释成不同的工作液， 分别滴加到石 蜡切片上， 每张切片约 50 μ 1， 以全部覆盖组织为准。 置于湿盒中， 4 过夜。 PBST 浸洗 3 次， 5 分钟 /次。 在避光情况下吸干组织周围液体， 滴加羊抗人 IgA-TRITC二抗 ( 1 : 3000， 购于美国 SouthernBiotech公司）， 每块组织块约 50 L, 37°C， 45分钟。 PBST浸洗 3次， 5分钟 /次。 吸干组织周围液体， 滴加兔抗 小鼠 IgG-FITC二抗 （1 : 1000， 购于美国 SouthernBiotech公司）， 每块组织块 约 50 L， 37°C， 45分钟。 PBST洗 5次， 5分钟 /次。 擦干组织周围液体， 甘油 封片， 荧光显微镜下观察结果，并对观察到的实验结 果进行统计分析， 结果见表 3、 图 4A和图 4B。 各组检测的抗原 牛奶 BLG 鸡蛋卵粘蛋 鱼小清蛋白 虾肌球蛋白 花生 Am hi 类型 白 0VM 蛋白 阳性 9 8 4 14 8 阴性 6 3 7 4 9 总和 15 11 11 18 17 阳性率 （％) 60 72. 2 36. 4 72. 2 47 各组检测的抗原 榛子 Corhl蛋 大豆 Gly Bd 蟹原肌球蛋 混合 总计 类型 白 白

阳性 13 6 16 27 105 阴性 8 10 8 7 62 总和 21 16 24 34 167 阳性率 （％) 61. 9 37. 5 66. 7 80 62. 8 表 3所述混合， 是指将上述 8类食物过敏原的单克隆抗体混合起来， 制备 成 8类食物抗原的混合抗体。 图 4A和图 4B所示 A-H分别表示用 2. 2制备所得 的 8类不同的食物过敏原的小鼠单克隆抗体进行� �检测组： A: 牛奶 BLG单克隆 抗体； B: 鸡蛋卵粘蛋白 0VM单克隆抗体； C: 鱼小清蛋白单克隆抗体； D: 虾肌 球蛋白单克隆抗体； E: 花生 Ara hi蛋白单克隆抗体； F: 榛子 Corhl蛋白单克 隆抗体； G: 大豆 Gly Bd单克隆抗体； H: 蟹原肌球蛋白单克隆抗体； I： 混合 组 （包括上述 8类单克隆抗体的）； J: 空白对照。

图 4A和 4B中可观察到， IgA肾病患者肾组织切片检测结果呈阳性， 且食物 过敏原主要分布于肾小球和肾小管内皮细胞， 而正常人对照组则呈阴性。 被检 测的所有 IgA肾病患者肾组织切片中，食物过敏原的免疫 荧光总阳性率为 62. 8%。 其中， IgA肾病患者的肾组织切片的鸡蛋、 牛奶、 小麦、 甲壳类（虾、 蟹）食物 过敏原的免疫荧光定位阳性率超过 50%; 而 IgA肾病患者的肾组织切片的大豆、 花生、 鱼食物过敏原的免疫荧光定位阳性率较低 （小于 50%)。 上述食物过敏原 检测阳性的 IgA 肾病患者在禁食相对应的阳性过敏原食物后， 病情明显好转， 说明该阳性的食物过敏原在肾小球或肾小管的 沉积是 IgA肾病的病因。

6. ELISA检测 IgA肾病病人血清中食物过敏原抗体

在近一个月内收集 150例临床确诊 IgA肾病患者血清， 采用 ELISA对患者 血清中 8类食物过敏原的特异性抗体进行检测。 将一定量的 1. 4制备的 8种重 组食物过敏原分别稀释到 PH9. 6的包被液中， 至终浓度为 10 g/mL， 加入到 96 孔板中， 100 μ ΐ7孔， 4°C过夜。 用 PBST洗液（含 0. 5%吐温 20)洗板 5次， 加入 封闭液， 100 μ ΐ7孔， 37°C孵育 2h。 再用 PBST洗液洗板 5次， 用含有 1%小牛血 清的 PBST按 1 : 3000病人血清， 然后加入到分别已包被的 96孔酶标检测板孔 中， 100 μ ΐ7孔， 37°C孵育 2h。 PBST洗液洗板 5次， 每孔加入 100 μ L已稀释的 羊抗鼠 HRP-IgA (l： 4000)， 37°C孵育 2h。 PBST洗板 5次， 加入 50 L显色液 A 和 50 L显色液 B， 37°C避光条件下显色 15min， 加 50 μ L 2M H ₂ S0 ₄ .终止反应， 读取吸光值 （A450值）。

结果见图 5和图 6。 如图 5所示： IgA肾病患者血清里总 IgA ( tlgA) 较自 身血清总 IgG ( tlgG)和正常人血清对照组 tlgA均显著增高；患者血清中总 tlgG 较正常人血清中 tlgG均明显降低； IgA肾病患者血清里常见的八类混合食物特 异性 IgA ( slgA) 显著升高； IgA肾病患者血清中 slgA较患者自身 slgG有显著 性差异 （P〈0. 01 )， IgA肾病患者血清中 slgA较正常人血清对照组中 slgA有显 著性差异（P〈0. 01 )。 如图 6所示（1 : 牛奶 β _乳球蛋白； 2 : 鸡蛋卵粘蛋白； 3 : 鱼小清蛋白； 4 : 虾肌球蛋白； 5 : 花生 Arahl蛋白； 6 : 榛子 Corhl蛋白； 7 : 大豆 Gly mBd蛋白； 8: 蟹原肌球蛋白； 9: 空白对照）， IgA肾病患者血清中， 常见食物过敏原 slgA均显著性升高， 而常见食物抗原 slgG差异不明显 （除了 虾过敏原 slgG); 其中， 鸡蛋、 牛奶、 小麦、 甲壳类 （虾、 蟹） 的 slgA相对较 高， 与食物特异性过敏原荧光定位检测结果一致。

上述食物过敏原抗体检测阳性的 IgA 肾病患者在禁食相对应的阳性过敏原 食物后， 病情明显好转， 说明该阳性的食物过敏原是 IgA肾病的病因。

综上， 食物过敏原和食物过敏原抗体与 IgA 肾病的发生密切相关， 食物过 敏原是部分 IgA 肾病的病因， 因此， 可以通过检测样本 （如肾组织石蜡切片、 肾组织冰冻切片、 血清、 全血、 血浆和 /或组织液等） 中食物过敏原或食物过敏 原抗体的情况来确定 IgA肾病的病因。

二、 利用食物过敏原或食物过敏原抗体进行 IgA肾病病因检测。

1.样本为 IgA肾病患者的肾组织石蜡切片。

A. 肾组织石蜡切片脱蜡至水；

B. 去除肾组织石蜡切片样本的内源性过氧化物酶 ；

C. 抗原修复， 然后封闭非特异性位点；

D. 加入荧光标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光 显微镜观察结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然 后加入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观 察检测结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然后加 入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤， 加入信号分子标记的 IgG二抗， 孵 育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观察检测结果。

优选的， 具体步骤如下；

A. 肾组织石蜡切片脱蜡至水；

B. 去除肾组织石蜡切片样本的内源性过氧化物酶 ： 滴加 3%双氧水 （甲醇配置） 于切片上， 置于湿盒中， 室温孵育 20分钟；

C. 抗原修复，然后封闭非特异性位点：滴加 0. 25%胰酶（购于加拿大 invitrogen 公司）于切片上， 置于湿盒中， 37°C孵育 15分钟； 滴加 5%BSA (购于武汉博士德 生物公司）于切片上， 至于湿盒中， 37°C孵育 1小时；

D1.加一抗： 将切片上的封闭液倒去， 勿洗； 将 2. 2制备的八种不同的小鼠食物 过敏原单抗， 分别滴加到切片中的组织上， 每张切片约 50 L， 以全部覆盖组织 为准； 至于湿盒中， 4°C过夜；

D2.加二抗： （以下流程均需避光） 吸干组织周围液体， 滴加羊抗人 IgA-TRITC 二抗 （购于美国 SouthernBiotech公司）， 每张切片约 50 L， 37°C孵育， 45分 钟；

D3.加另一二抗： 吸干组织周围液体， 滴加兔抗小鼠 IgG-FITC二抗 （购于美国

SouthernBiotech公司）， 每张切片约 50 L， 37°C孵育， 45分钟；

D4.擦干组织周围液体， 甘油封片， 指甲油封边； 然后在荧光显微镜下观察结果。

2.样本为 IgA肾病患者的肾组织冰冻切片。

A . 去除肾组织冰冻切片样本的内源性过氧化物酶 ；

B. 抗原修复， 然后封闭非特异性位点；

C. 加入荧光标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光 显微镜观察结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然 后加入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观 察检测结果； 或者加入无标记的食物过敏原单克隆抗体， 孵育， 洗涤， 然后加 入信号分子标记的 IgA二抗， 孵育、 洗涤， 加入信号分子标记的 IgG二抗， 孵 育、 洗涤、 封片， 然后通过荧光显微镜观察检测结果。

优选的， 具体步骤如下；

A. 去除肾组织冰冻切片样本的内源性过氧化物酶 ： 冰冻切片制备好后， 室温放 置 30分钟； 然后在 4°C丙酮溶液中固定 10分钟； 然后用 PBS溶液洗涤 3次； 然 后再用过氧化氢孵育 5-10分钟， 消除内源性过氧化物酶的活性；

B. 抗原修复，然后封闭非特异性位点：滴加 0. 25%胰酶（购于加拿大 invitrogen 公司）于切片上， 置于湿盒中， 37°C孵育 15分钟； 滴加 5%BSA (购于武汉博士德 生物公司）于切片上， 至于湿盒中， 37°C孵育 1小时；

C1.加一抗： 将切片上的封闭液倒去， 勿洗； 将 2. 2制备的八种不同的小鼠食物 过敏原单抗， 分别滴加到切片中的组织上， 每张切片约 50 L， 以全部覆盖组织 为准； 至于湿盒中， 4°C过夜；

C2.加二抗： （以下流程均需避光） 吸干组织周围液体， 滴加羊抗人 IgA-TRITC 二抗 （购于美国 SouthernBiotech公司）， 每张切片约 50 L， 37°C孵育， 45分 钟；

C3.加另一二抗： 吸干组织周围液体， 滴加兔抗小鼠 IgG-FITC二抗 （购于美国

SouthernBiotech公司）， 每张切片约 50 L， 37°C孵育， 45分钟；

C4.擦干组织周围液体， 甘油封片， 指甲油封边； 然后在荧光显微镜下观察结果。

3. 样本为血清。

A. 在预包被有食物过敏原的 96孔板中加入封闭液， 孵育；

B. 洗涤， 然后加入待检测的血清样本， 孵育； C. 洗涤， 加入酶标记 IgA二抗， 孵育；

D. 洗涤后加入显色液， 在避光条件下显色， 然后加入终止液， 利用酶标仪读取 96孔板中各孔的吸光值。

优选的， 所述酶标记 IgA二抗的酶标记分子可选用辣根过氧化物酶 （HRP)、 碱性磷酸酶 （AKP) 或葡萄糖氧化酶 （G0D)。

当酶标记 IgA二抗为羊抗鼠 HRP-IgA二抗时， 显色液为 TMB显色液， 酶标 仪读取的吸光值为 96孔板中各孔在 450nm处的吸光值。

具体步骤如下：

A. 食物过敏原的预包被： 将一定量的 1. 4制备的 8种重组食物过敏原分别稀释 到 PH9. 6的包被液中，至终浓度为 10 g/mL，加入到 96孔板中， 100 μ ΐ7孔， 4°C 过夜；

B.用 PBST洗液（含 0. 5%吐温 20)洗板 5次， 加入封闭液， 100 μ ΐ7孔， 37°C孵育 2h _;

C. 再用 PBST洗液洗板 5次， 用含有 1%小牛血清的 PBST按 1 : 3000病人血清， 然后加入到分别已包被的 96孔酶标检测板孔中， 100 μ ΐ7孔， 37°C孵育 2h;

D. PBST洗液洗板 5次， 每孔加入 100 μ L已稀释的羊抗鼠 HRP_IgA (l： 4000)， 37°C孵育 2h;

E. PBST洗板 5次， 加入 50 μ L显色液 Α禾卩 50 μ L显色液 Β (此处的显色液 Α、 Β 分别是什么？请确认）， 37°C避光条件下显色 15min， 加 50 μ L 2Μ H ₂ S0 ₄ ， 终止 反应， 读取吸光值 （A450值）。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明 所作的进一步详细说明， 不 能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通 技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替 换， 都应当视为属于本发明的保护范围。