La présente invention concerne un procédé de préparation de l ¹ interféron γ humain.

L'interféron γ (ci-après IFN-γ) est une glycoprotéi dotée in vitro d'une action anti-tumorale marquée. Il fait l'objet de nombreuses recherches au niveau pharmaceutique. Pour assurer le développement de ce produit, il convient de pouvoir le préparer en quantité importante afin d'en diminue le prix. »

En mettant en oeuvre des techniques de génies géné- tiques on a pu décrire la préparation de l'IFN-γ par fermen¬ tation bactérienne notamment dans la demande de brevet Européen 0077670.

Toutefois il ne semble pas que les rendements obtenu soient particulièrement intéressants, ainsi dans le brevet mentionné précédemment l'activité du milieu fermenté est de 2,5 x 10 U IFN-γ/1 ce qui est faible au niveau du rendement.

La présente invention a pour objet d'accroître le rendement de la fermentation par un facteur de 10 000 à 20 0 la quantité d'IFN-γ produit atteignant 20 % (du poids total) des protéines bactériennes produites.

Pour ce faire la présente invention propose des nouveaux vecteurs.

Il s'agit de vecteur d'expression de la protéine mature de l'interféron γ dans les bactéries du type compor¬ tant le gêne codant pour la protéine mature de l'interféron γ humain et les éléments plasmidiques assurant l'expression de ce gêne caractérisé en ce que l'extrémité 5' de la séquence codant pour la protéine mature est la suivante :

5' ÂTG TGC TAC TGT CAG GAT CCC 3' TAC ACG ATG ACA GTC CTA GGG Met Cys Tyr Cys Gin Asp Pro

Le début de la séquence originale et naturelle de IFN γ est la suivante (moins le codon ATG de départ) :

ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA en la comparant avgc la séquence proposée : ÂT TGC TAC TGT CAG GAT CCC on note quatre changements de nucléotides qui conservent la composition de la protéine. Dans les exemples qui suivent on démontrera que ces change¬ ments permettent de multiplier par environ 10 000 le rendemen en IFN-γ en particulier lorsque l'on utilise des vecteurs tels qu'ils seront décrits ci-après.

Les vecteurs selon la présente invention comportent outre le gêne codant pour ÏFN avec une extrémité 5' comme indiquée précédemment :

- l'origine de réplication d'un plasmide bactérien;

- un promoteur, en particulier tout ou partie d*un promoteur du bactér±όphage λ : P_ , P_ ou P'_, - une région codant pour l'initiation de la traduc¬ tion incorporant l'ATG de l'extrémité 5' du gêne de IFN-γ.

La présence d'une origine de réplication pour un plasmide est essentielle pour permettre la réplication du vecteur dans les cellules bactériennes correspondantes,

en particulier dans le cas de E. coli on utilisera, de préférence, l'origine de réplication du plasmide pBR322. Le plasmide pBR322 présente, en effet, l'avantage de donner un grand nombre de copies et ainsi d'augmenter la quantité de plas ides produisant la protéine désirée.

Parmi les promoteurs du bactériophage λ, on utilisera de préférence, le promoteur principal de gauche noté λP _L . P- est un promoteur puissant responsable de la transcription précoce de λ. II est également possible d'utiliser d'autres pro¬ moteurs du bactériophage λ, notamment le promoteur de droite, P_ ou le second promoteur de droite, P'-.

Bien qu'il soit possible d'utiliser de ^r s séquences d'initiation de la traduction très variées, on préfère utiliser celle de la protéine cil du bactériophage λ qui sera nommée ci-après λcllrbs.

Comme cela sera démontré il est également possible d'utiliser de telles séquences synthétiques en particulier out ou partie de la séquence :

ATAACACAGGAACAGATCTÂTG.

Le vecteur en cause comporte, en outre, de préférence une fonction d'antiterminaison de transcription codée par ex. le gêne N de λ noté λN. En présence du produit de transcripti du gêne N la transcription à partir de P se poursuit au-delà de la plupart des signaux stop.

Ceci écarteles problèmes posés par un arrêt prématuré de la transcription qui peuvent se produire lorsque les gènes étrangers clones présentent de tels signaux stop. En outre, il a été démontré que l'expression à partir de P.. est amélior dans un environnement N .

Afin d* carter les problèmes de toxicité et d'instabilité du système hôte-vecteur en cas de production en continu de grandes quantités d'une protéine étrangère, il est nécessaire de prévoir le contrôle de l'activité du promoteur en lui adjoignant tout ou partie d'un système d'expression inductible, en particulier thermo- inductible.

De préférence, le contrôle par la température de la synthèse de la protéine étrangère est effectué au niveau de la transcription au moyen d'un répresseur thermosensible codé dans la bactérie hôte, par exemple CI857, qui réprime l'activité de P _L à 28 ^β C mais qui est inactivé è .42 ^β C. Le répresseur agit sur l'opérateur Cv qui est adjacent au promoteur P-. Bien que dans le cas précédent une partie du système d'expression thermo- inductible soit partie intégrante de la bactérie hôte, il est possible de prévoir que ce système fasse partie du vecteur lui-même.

Le vecteur en cause peut également comporter un gène de résistance à un antibiotique, par exemple l'ampicilline dans le cas de pBR322, mais d'autres gènes de résistance peuvent être utilisés, résistance à la tétracycline (Tet ^r ) ou au chloramphénicol (Cm ^r ) .

L'incorporation d'un tel marqueur est nécessaire pour la sélection des bactéries contenant les trans¬ formants porteurs du plasmide selon l'invention pendant les expériences de clonage.

L'incorporation d'un gène de résistance permet d'augmenter la stabilité du plasmide en im- posant une pression de sélection lors de la fermentation, et en outre facilite l'isolement des transformants.

Pour le clonage il est intéressant de disposer d'un système er ettant de détecter l'insertion dans un plasmide d'un ADN étranger. λ titre d'exemple, il est possible de prévoir dans la sone de clonage le fragment N-terminal de la β-galactosidase de E. coli (lacZ') en le fusionnant avec la région d'initiation de traduction dérivée de λcll, ce qui met la traduction du fragment α sous le contrôle des séquences de cil. Le fragment α est complémenté par l'expression du fragment ω C-terminal codé dans l'hôte, ceci conduit à une activité 8-galactosidase dans ^" les cellules. Cette activité B-galactosidase produit des colonies bleues en présence d'un substrat chromophorique, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase.

A 28°C, le promoteur P _L est ihactivé, le fragment α n'est pas synthétisé et les ^* colonies demeurent blanches. Lorsque la température est amenée à 42°C, le promoteur P. est activé, le fragment α est synthétisé et les colonies virent au bleu.

L'insertion d'ADN étrangers dans les sites de clonage situés dans ce système de détection empêche la synthèse de la β-galactosidase et conduit donc à des colonies blanches aussi bien à 28°C qu'à 42°C. II est également possible de remplacer le gène lacZ'par d'autres gènes permettant une détection.

OMPI

La présente invention concerne en outre les bactéries notamment les souches de E. coli transformées par les vecteur selon l'invention par des techniques connues et dont certaine seront rappelées dans les exemples. Enfin l'invention concerne un procédé de préparation de IFN-γ humain dans lequel on cultive sur un milieu de culture des bactéries transformées comme décrit précédemment et dans lequel on récupère ensuite l'IFN-γ formé.

Les milieux de culture mis en oeuvre sont connus de l'homme de métier et devront être adaptés à chaque souche cultivée. La culture sera de préférence effectuée en présence de l'antibiotique à l'encontre duquel la souche transformée est devenue résistante. '

IFN-γ est séparé après éclatement des cellules par des techniques connues comme la séparation sur cclonne d'affinité ou la chromatographie d'exclusion.

La présente invention comporte ^" , bien entendu, d'autre aspects, notamment certains plasmides qui seront décrits dans les exemples ainsi que leurs mutants et dérivés et de façon générale les procédés de fermentation des bactéries trans¬ formées ainsi que l'IFN-γ ainsi obtenu.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture des exemples ci-après et des dessins ci-annexés sur lesquels : - la figure 1 représente la stratégie permettant de préparer le plasmide pTG907,

- la figure 2 représente la stratégie permettant de préparer le phage M13tg910,

- la figure 3 représente la structure du phage M13tg910, - la figure 4 représente la stratégie permettant de préparer le plasmide pTG908,

- la figure 5 représente la séquence complète du gène codant pour IFN-γ isolé à partir de la banque,

- la figure 6 représente la stratégie de préparation de pTG909,

- la figure 7 représente la stratégie de préparation de pTG94l,

- la figure 8 représente la stratégie de préparation de pTG951. II convient de remarquer que les différentes séquence de nucléotides figurant dans les dessins doivent être considérées comme faisant explicitement partie de la présente description, ces séquences n'ont pas été reproduites dans le corps du texte afin de ne pas l'alourdir inutilement. 1) Procédés généraux a) Souches_baçteriennes

Les souches bactériennes utilisées dans le cadre de la présente invention sont les suivantes ^' :'

. TGE900 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : su~F~his ilv bio (λcI857ΔBamΔHI) . N6437, souche de E. coli ayant les caractéris¬ tiques suivantes : F~his ilv gai ΔδproC : tn10 lacΔm15 (λcl857ΔBamΔHI) .

. Jm103 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : Δ(lac-pro) sup thi endA sbcB15 sttA rK~ nK ⁺ / F ¹ traD36 proAB ⁺ laci ^a lacZΔm15. Les souches mentionnées précédemment ont été utilisées parce qu'elles étaient disponibles, mais il est bien entendu qu'il est possible d'utiliser d'autres souches dans la mesure où elles présentent certaines caractéristiques essentielles qui sont rappelées dans le cours de la description détaillée. b) PréEaration_des_ADN

Des mini-préparations d'ADN de plasmides ou de phages M13 sont effectuées comme cela est décrit par Ish-Horowitz (référence 1) ^" à la seule différence que l'ADN est précipité une seconde fois avec de l'éthanol avant d'être utilisé.

Les maxi-préparations sont effectuées comme cela est décrit dans la publication précédente, avec une purification complémentaire par un gradient de densité CsCl/bromure d'éthidium. c) eçhnigueε_de_çlgnageε

Le traitement des ADN avec des enzymes de restriction est effectué, sauf indications contraires, en utilisant les conditions indiquées par le fabricant (New England Biolabs, Bethesda Research Laboratories et Boehringer Mannheim) .

Lorsque cela est nécessaire, les phosphates des extrémités 5' sont éliminés en utilisant, soit une phosphatase alcaline bactérienne, soit une phosphatase d'intestin de veau, pendant 30 minutes à 37 ^β C dans le tampon d'enzyme de restriction.

La réparation des extrémités cohésives utilisant la polymérase de Klenow (Boehringer Mannheim) est effectuée à 25 ^β C pendant 15 minutes dans un mélange de 50 mK>l. Tris HC1, pH 7,8, 5 mMol. MgCl ₂ , 10 mMoli de β-mercaptoéthanol, 0,4 mMol. de dNTPs avec l'enzyme et 10 à 200 μg/ml d'ADN.

La nucléase S.. (Miles) est utilisée à 2 u/μg d'ADN à 25°C pendant 30 minutes dans un milieu 0,3 Mol. NaCl, 0,03 Mol. NaOAc, pH 4,8, 0,003 Mol. ZnCl ₂ . Bal31 est utilisée selon le procédé de Panayotatos et al. (référence 2) . Les ligations sont effectuées à 15°C (sauf lorsque cela est indiqué différemment) pendant 4 à 24 heures en utilisant de l'ADN ligase T.

(Boehringer Mannheim) avec 100 mMol. de NaCl, 66 mMol. de Tris HC1, pH 7,5, 10 mMol. de MgCl ₂ , 0,5 mMol. de spermidine, 0,2 mMol. de EDTA, 2 mMol. de DTT, 1 mMol. d'ATP, 0,1 mg/ l de BSA et 5 è 50 μg/ml d'ADN. Pour la ligation d'extrémités cohésives, on utilise environ 30 unités/ml de ligase. Pour la ligation des extrémités franches on utilise environ 100 unités/ml de ligase.

Entre les différentes réactions enzymatiques, des échantillons d'ADN sont extraits avec un mélange phénol/chloroforme puis précipités à l'éthanol. Lorsque cela est nécessaire, du tARN de E. coli ou de levures est utilisé comme entraîneur. Les adaptateurs moléculaires (Collaborative Research, Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs) sont préhybridés et utilisés en excès molaire de 10 à 50 fois pour les extrémités franches d'ADN utilisant les conditions de tampon décrites précédemment avec 100 unités/ml de ligase T. à 4°C pendant 15 heures. Lorsque l'on utilise des adaptateurs non phosphorylés, les. adaptateurs qui n'ont pas réagi sont éliminés directement après ligation par précipitation avec le tétrachlorhydrate de sper ine (Hoopes et al. - référence 3) .

Lorsque l'on utilise des adaptateurs phosphorylés, le mélange de ligation est tout d'abord extrait avec un mélange phénol/chloroforme puis précipité avec de l'éthanol avant coupure spécifique avec les enzymes de restriction appropriées puis précipitation avec le tétrachlorhydrate de spermine. Les cellules bactériennes compétentes sont préparéespuistransformées avec les plasmides ou transfectées par l'ADN de M13 selon les procédés décrits par Dagert et Ehrlich (référence 4) .

O PI

EXEMPLE 1

La préparation du pTG908 implique tout d'abord la préparation d'un plasmide comportant :

- l'origine de réplication de pBR322,

5 - le gène de résistance à l'ampicilline de ce même plasmide(amp ) , - le promoteur P_ et le gène λN.

1) Suppression du site PstI dans pBR322

Le plasmide de base utilisé est le plasmide pBR322 l'O toutefois, celui-ci présente l'inconvénient d'avoir à l'intérieur du gène amp un site de restriction PstI, car un site de même nature sera utilisé par la suite dans la z de clonage comme site unique de restriction. Il convient donc de faire disparaître ce site de restriction PstI en

15 utilisant un mutant du plasmide pBR322, le plasmide pUC8, lequel le gène de résistance à l'ampicilline ne présente pas de site de restriction PstI (ce site a été éliminé par mutation in vitro) . pBR322 est commercialisé notamment par Bethesda Research Laboratories et pUC8 est décrit dans

20 l'article référencé 5.

OMPI

Pour ce faire, on échange le fragment Pvul/Pvull de 1 669 bp de pBR322 avec le fragment analogue Pvul/Pvull du plasmide pUC8. Afin de réaliser cet échange les plasmides pBR322 et pUCβ sont traités successivement par Pvul, PvuII, puis circularisés par section d'une ligase.

On obtient ainsi le plasmide pTG902 qui ne présente plus de site de restriction PstI et qui a également perdu le site de restriction Ndel orésent à l'origine sur pBR322 (non représenté sur la fig. 1).

En outre, le plasmide pTG902 porte un fragment de 50 bp correspondant à la séquence laci' dans lequel se trouve le site PvuII. 2) Insertion du promoteur P- et du gène λN et préparation du plasmide de pTG907

Le promoteur P _L et le gène λN sont isolés du plasmide. pKC30 pour être insérés dans pTG902, le segment prélevé contient également l'opérateur O _τ la sur lequel agira le répresseur thermosensible cI850, comme cela sera décrit dans les essais. En outre, le procédé permet de supprimer les sites EcoRI et Hindlll tout en conservant un site unique Ba HI en aval du gène N pour pouvoir ensuite insérer λcllrbs. Le plasmide de pKC30 est décrit dans la référence 6.

pTG902 est coupé en son site de restriction unique EcoRI et les extrémités 5' sortantes sont éliminées par traitement à la nucléase S... Après une digestion avec BamHI, le fragment le plus important est purifié sur gel.

Le fragment portant le promoteur P _L et le gène λN est préparé de la même façon a partir de ρKC30 en traitant successivement le plasmide par Pvul, la nucléase S., et BamHI. Les fragments,après purification sur gel, sont soumis à l'action de la ligase, ce qui conduit à la fusion EcoRI/Pvul et à la reconstitution du site BamHI.

Le mélange de ligation est utilisé pour transformer des cellules hôtes compétentes, TGΞ900, à 30 ^β C. Cette souche contient le prophage λ délété, λcI857ΔBamΔHI, qui fournit le répresseur de λ thermo¬ sensible,cI857, qui est nécessaire pour bloquer la transcription à partir de P _L .

Ceci est important car l'activité de P _τ dans un milieu N est léthale compte tenu de la fonction d'antiterminaison de N.

Après analyse par enzymes de restriction, les clones fcontiennent des plasmides de structure correcte,et sont ensuite testés pour leur manque de viabilité à 42°C. L'un des plasmides obtenus, pTG906, est traité de façon à éliminer le segment PvuII-SalI de manière à supprimer les sites de restriction compris sur ce segment et afin de faire disparaître également les deux sites de restriction extrêmes. Pour ce faire, pTG906 est traité successivement avec Sali, la nucléase S-, PvuII et la ligase.

On obtient ainsi le plasmide pTG907 qui comporte l'ensemble des éléments évoqués au début de cette étape et, en outre, qui est Pst~ Eco ^" Hind ^" Sal~ Ava ^" Nde ^" Pvull ^" . La synthèse de ce plasmide est représentée sur la figure 1.

3) Clonaoe de la région λcllrbs

La seconde phase importante de la synthèse consiste è insérer la régionλcllrbs sous forme d'un fragment Aval/Taql dans le début du gène lacZ' (fragment α de la β-galactosidase) lequel a été clone dans le phage Ml3 nommé M13tg110. Cette stratégie permet un test fonctionnel simple pour rbs, è savoir la production de la protéine lacZ' et, par conséquent, d'obtenir des plaques bleues en présence d'IPTG et de Xgal ; ceci permet également un εéquenςage rapide de la construction en utilisant la méthode dite du didéoxy.

Dans le cours des expériences, différents dérivés du phage Ml3 seront mentionnés. Précédemment on a mentionné le phage M13tg110 et dans la suite de la description on utilisera d'autres phages du même type dont la construction va être rappelée ci-après.

La construction de ces vecteurs 'est indiquée dans le tableau I ci-après sur lequel figurent les références du phage de départ, la nature de l'enzyme de restriction avec laquelle il a été découpé, le traitement particulier qu'ont subi les fragments ainsi obtenus et la nature de l'insert qui a été fixé dans les sites ainsi révélés. Le phage M13mp7 est commercialisé notamment par la société Bethesda Research Laboratories.

M13mp701 est obtenu à partir de M13mp7 par remplacement du fragment PstI/EcoRI à droite (CTG CAG ... GAA TTC) par la séquence : CTG CAG CAA TTC. Le principe de la construction est décrit dans le schéma suivant :

ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CCG G GGAAT CCG TCG ACC TGC AGC AAT TCA CTG 6CC M13mp70l

ATGACCATGATTACGAATTCCCCG GATCCGTCGACCTGCAGCAATTCACTGGCC

TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAG GCAGCTGGACGTCGTTAAGTGACCGG .

DNA po Ilymerase

ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATC GATCCGTCGACCTGCAGCAATTCACTGGCC

TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAG CTAGGCAGCT GGACGTCGT TAAGTGACCGG

Lin er I HindiII

ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCCA lAGCTTGG CCAAGCTTGGGATCCGTCGACCTGCAGCAATTCACTGGCC TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAGGGTTCGAACC GGTTCGAACCCTAGGCAGCTGGACGTCGTIAA6TGACCGG

HindIII

ATGACCATGATTACGAATTCCCCGGATCCCA AGCTTGGGATCCGTCGACCTGCAGCλATTCACTGGCC

TACTGGTACTAATGCTTAAGGGGCCTAGGGTTCGA ACCCTAGGCAGCTGGACGTCGTTAAGTGACCGG

1

T . DNA ligase y

ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCC CCG GAT CCC AAG CTT GGG ATC CGT CGA CCT GCA GCA ATT CAC TGG

Eco RI Bam HI HixdlII Bam HI Sal I PstI

OMPI

TABLEAU I

Phage Site de Phase Phase Phase Compléw

Nom parental clivage Traitement Insert de de de tation

HiïϋïlII BamHI PstI Tâcô

M13mp701 M13mp7 Construction D.R. Bentley

ADN séquence

M13tg102 M13mp701 AccI polymérase HindlII(a)

M13tg110 M13mp701 AccI S nucléase séquence ^b ₁ nuc ⁱ ease HindlII(a) ^{ι τι} II

M13tg115 M13tg110 EcoRI S ₁ nucléase, II III

(a) Adaptateur de séquence HindlII phosphorylé CCAAGCTTGG

Les protocoles d'utilisation des enzymes (restriction, ADN polymérase, T.A N ligase) sont ceux indiqués dans les notices des fournisseurs. Le "linker" HindlII est un oligonucléotide synthétique de séquence

5' 3' p CCAAGCTTGG (Collaborative Research Inc., altham,

Mass 02154, E.U.A.) .

La région cllrbs est isolée à partir d'un plasmide pOGll (réf qui contient un fragment de λHaeIII/Sau3A qui s'étend du milieu du gène cro jusqu'au milieu de la région codant pour cil (cro et cil étant impliqués notamment dans la régulation de la lysogénie _. .du bacté¬ riophage λ) .

On prélève dans pOG11 le fragment Aval/Taql de 186 bp contenant la région clIrbs et on le traite avec la polymérase Klenow. D'autre part, on traite le phage M13tg110 par BamHI puis par la polymérase de Klenow suivi d'un traitement à la phosphatase intestinale de veau. Les fragments obtenus sont soumis à l'action de la ligase T.. Un examen des séquences du fragment de pOG11 comportant la régionclIrbs et du phage M13tg110 permet de prévoir que l'insertion du fragment portant cllrbs dans le site BamHI de M13tgll0 doit conduire à l'obten¬ tion de plaques bleues après fermentation des bactéries transfectées compte tenu du fait que le gène lacZ' est en phase pour la traduction à partir de AUG du gène de cil, tandis que les plaques correspondant à la souche parentale M13tgll0 sont blanches.

Les plaques bleues sent «relevées puis les colonies sont sélection nées par analyse de restriction enzymatique des mini¬ préparations et l'on vérifie ensuite par séquençage que la construction obtenue est correcte. On obtient ainsi un clone résultant M13tg910 dont la structure globale est représentée è la partie inférieure de la Figure 2 et la structure détaillée est représentée à la figure 3.

On constate que l'insertion du fragment cllrbs reconstruit en amont les sites BamHI et Aval et en aval le site BamHI.

La traduction à partir de AUG de cil ^' conduit à la fusion des 13 aminoacides terminaux de cil aux 8 a inoacides du NH- terminal de la protéine lacZ'. 4) Insertion du fragment λcllrbs dans le plasmide pTG907 •La troisième étape de cette synthèse consiste à transférer le fragment clIrbs/lacZ' du phage M13tg910 sur le plasmide vecteur pTG907 préparé précédemment. Pour ce faire, il convient tout d'abord d'éliminer les sites EcoRI, BamHI et Aval en amont de cllrbs puis d'insérer un site BglII.

Dans ces conditions, cllrbs peut être prélevé sous forme d'un fragment BglII-BglII et placé dans le site BamHI en aval du promoteur P _L et du gène λN de pTG907.

Le phage M13tg910 est digéré avec EcoRI puis traité avec Bal31 puis ensuite par la polymérase de Klenow. Les fragments obtenus sont alors soumis à l'action de la ligase en présence d'adaptateurs BglII non phosphorylés. Le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes JM103.

OMH

On sélectionne alors les plages bleues. Ces clones sont ensuite analysés afin de vérifier qu'ils contiennent le site BglII et qu'ils ne présentent plus de site EcoRI ou BamHI en amont. On obtient ainsi des clones tels que M13tg912 dont la structure est représentée sur la figure 4.

Le traitement par Bal31 a produit une délétion de 101 bp éliminant les sites EcoRI, BamHI et Aval ; ainsi que les séquences de lac ATG et lac Shine/Dalgarno. Le site BglII introduit se trouve placé enrion 100 bp en amont de l'ATG de cil et 10 bp en aval de P _lac -

Le fragment BamHI/Sphl de pTG907, le fragment BglII/ Hgal portant cllrbs et lacZ' et l'adaptateur- hosphorylé ont été préhybridés dans un rapport molaire de 1:2:1 puis traités avec la ligase T.. Des aliquots sont utilisés pour transforme les cellules compétentes de la souche 6150 à 30°C.

Les cellules intéressantes sont identifiées en sélectionnant les transformants avec un fragment clIrbs/lacZ' marqué au P 32 et la construction obtenue est confirmée par une étude de restriction enzymatique. Afin d'avoir une première indication montrant que les différents éléments du système d'expression se conduisent comme cela est désiré, le plasmide obtenu, pTG908, est trans¬ féré dans une souche hôte N6437 qui possède à la fois cl857 e le fragment ω de la β-galactosidase complementant le fragment α qui est codé par le plasmide.

Les transformants obtenus placés sur une boîte contenant IPTG + Xgal sont blancs à 28°C puis virent au bleu environ 30 minutes après lorsqu'on les transfère à 42°C.

EXEMPLE 2 : Sélection du clone de cDNA de IFN-γ humain

On réalise selon les procédés connus une banque de cDNA à partir des mARN de lymphocytes induits par des agents mitogènes.

Puis on sélectionne un clone comportant la séquence codant pour IFN-γ complet (figure 5) ce clone est dénommé pTGll.

IFN-γ est synthétisé sous forme d'un prépeptide dont la séquence signal de 20 amino-acides est scindée pour donne le polypeptide mature qui débute par la séquence cys-tyr-cys et couvre les amino-acides 21 à 166.

L'analyse de la séquence des nucléotides pour les sites de restriction révèle un site EcoRII à 8 bp en aval du départ de la protéine mature et un site Sau3A à 285 bp en av du codon stop, ce qui permet d'isoler pratiquement toute la séquence codant pour la protéine mature sur un fragment EcoR Sau3A.

EXEMPLE 3 : Construction de pTG909 plasmide expirant faiblement IFN-γ humain

La figure 6 schématise la préparation de pTG909. On utilise tout d'abord une molécule d'adaptation synthétique qui permet : a) d'effectuer la jonction entre les extrémités EcoR et Ndel, b) d'introduire les 8 bp manquantes par rapport à la séquence codant pour IFTï-γ mature et, c) de reconstituer le codon de départ ATG de cllrbs de façon que la séquence codant pour la protéine IFN-γ matur soit traduite sans amino-acides fusionnés à l'exception de l'initiateur F-met.

OMPI

Cet adaptateur est synthétisé chimiquement et sa constitution est représentée sur la figure 2. pTGll est mis en digestion avec EcoRII et Sau3A et pTG908 avec Ndel et BamHI. Les fragments appropriés sont purifiés sur gel, mélangés avec une quantité équimolaire de l'adaptateur, préhybridés et liges. Le mélange est utilisé pour transformer des cellules compétentes TGE900 et les transformants sont sélectionnés en hybridant un insert PstI de pTGll "nick- traduit" et marqué au p 32 avec les-transfornants.

13 clones sont sélectionnés et contrôlés par carto¬ graphie et l'un d'eux pTG909 est vérifié par séquençage.

La mise enculture du clone de.TG?06 transformé par TG9 effectuée sur un milieu L3 avec 50 yg/ml Ampicilline jusqu'à

Q une densité optique DO _g g ₀ = 0,3 (~ 10 cellules/ml) et induit pendant 1 heure à 42°C. Les extraits sont préparés pour teste leur activité IFN-γ selon des procédés connus :

Les résultats montrent une activité de 10 unité/1 de culture en IFN-γ. Le poids moléculaire de la protéine d'environ 17000 dalton est en bon accord avec ce que l'on sa de IFN-γ.

Mais cette activité correspond à environ C,001 % du contenu total en protéine de la cellule.

C'est ce résultat qui a amené à rêëtudier la structur fine des bases au voisinage de codon de départ et à proposer des mutations ponctuelles conservatrices permettant d'amélior le rendement en IFN-γ.

OMPI

EXEMPLE 4 : Construction du vecteur pTG941

pTG909 contient 2 sites Ndel, l'un au codon de départ de IFN-γ et l'autre 22 bp plus tard dans la séquence IFN-γ (voir figure 7) . La région entre ces sites qui est la région codant po les 7 premiers amino-acides de IFN-γ a été éliminée par traitement avec Ndel et remplacée par un oligonucléotide synthétique qui est représenté sur la figure 7.

Cette réaction détruit le site Ndel aval et reconsti- tue le site Ndel amont tout en introduisant un site BamHI qui est unique. -'• e

Ce changement de base est conservateur, c'est-à-dire que la séquence d'amino-acide n'est pas altérée.

Les extraits obtenus dans les mêmes conditions que précédemment à partir de souche transf-ormée par le plasmide α pTG941, contiennent 2 x 10 U/l IFN-γ.

Ce résultat est 10 000 fois supérieur aux résultats obtenus avec pTG909 et correspond à 10 % du poids total des protéines cellulaires produites.

EXEMPLE 5 : Construction de pTG951

La figure 8 schématise la construction de pTG95l qui est un dérivé de pTG941 dans lequel un fragment contenant le cllrbs a été remplacé par une séquence synthétique sur la base de la séquence de la région d'initiation de la traduction de l'opéron E_ _j _ coli lac noté E^ coli lac opéron rbs. Cet oligonucléotide synthétique a été inséré entre le site unique Ndel du codon de départ de la séquence codant pour IFN-γ et le site Clal qui a été inséré au niveau du site Hgal dans le gène N. De ce fait par traitement avec Ndel et Clal le plasmide pTG951 ne contient plus qu'un gène N tronqué (un codon s ep en phase avec la traduction du gène N est placé immédiatement en amont du nouveau site rbs) et est dépourvu des terminateurs de

de transcription tLl et tRl présents dans pTG909 et pTG941.

Les extraits bactériens obtenus à l'aide de bactéries transformées par pTG951 conduisent à une o production de 5 x 10 IFN-γ U/l de culture, ce qui correspond à 25 % du poids total des protéines cellulaires produites.

Le site rbs synthétique de pTG951 contient un site BglII unique immédiatement avant le codon de départ, il est donc possible de faire des dérivés de pTG951 par scission avec BglII suivi par diverses manipulations utilisant soit l'ADN polymérase I ou la nucléase SI.

Ces dérivés présentent des variations dans la distance et les séquences entre la séquence de Shine/Dalgarno et l'ATG. Mais aucun des plasmides ainsi préparé ne présente une activité supérieure au pTG951 lui-même.

Les principaux résultats sont rappelés dans le tableau ci-après :

_ OMPI

NOM PROMOTEUR RBS SEQUENCE DE RBS ET JONCTION AVEC LA SEQUENCE IFN UIFNγ/1 % PROTEINE fmet cys tyr cys gin asp pro tyr pTG909 PL Cil TAAGGAAGTACTTACATATG TGT TAT TGC CAG GAC CCA TAT

% 10 ⁵ U NON

DETECTE fmet cys tyr cys gin asp pro tyr pTG94l PL cil TAAGGAAGTACTTACATATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC TAT 2 x 10 ⁹ U >10 %

fmet cys tyr cys gin asp pro tyr pTG951 PL SYNTH CACAGGAACAGAGATCTATG TGC TAC TGT CAG GAT CCC TAT 5 x 10 ⁹ U >10 % (lac)

BglII

TABLEAU

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Bibliographie

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OMPI Wfcs _WlPO