Die Clonierung und Isolierung von Genen, die für wertvolle Produkte codieren sowie die Expression dieser Gene ist durch die in den letzten Jahren entwickelten Methoden der DNA-Rekombination möglich geworden.

Wenn vom Genprodukt, nämlich dem Protein, bereits Primär¬ strukturdaten in Form von Aminosäure-Teilseσuenzen oder so¬ gar gesamten Aminosäureseσuenzen vorliegen, werden in der Regel Oligonucleotid-Sondenmoleküle, die für einige der er¬ kannten Aminosäuren des gewünschten Genproduktes codieren, synthetisiert. Diese Oligonucleotid-Sondenmoleküle können dann zur Suche nach dem für das Protein codierenden Gen in Genbanken verwendet werden. Sofern in diesen Genbanken die genetische Information für das gewünschte Protein in geeig¬ neter Weise expri iert wird, können für das Absuchen dieses Genbanken auch Antikörper verwendet werden.

Es wurden Methoden entwickelt, die RNA (Boten-RNA, messenger RNA) aus Zellen zu clonieren, die das gewünschte Protein herstellen. Da diese mRNA jedoch nicht direkt clo- niert werden kann, muß sie zunächst in ihre entsprechende cDNA umgeschrieben werden. Bei diesem Umschreibungsprozeß wird ein Tumorvirus-Enzym verwendet, das als reverse Trans- kriptase bezeichnet wird. Unter Verwendung dieses Enzyms gelangt man schließlich in mehreren Verfahrensstufen zu

einer Reihe von rekombinanten Vektoren, die cDNA-Bereiche enthalten, die mRNA-Molekülen entsprechen. Diese Reihe von rekombinanten,cDNA enthaltenden Vektoren bezeichnet man als cDNA-Genbank.

Ein bereits als klassisches Verfahren zu bezeichnendes Ver¬ fahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken ist in Figur 7 dargestellt. Bei diesem Verfahren wird zunächst mRNA aus bestimmten Zellen isoliert (1) und dann in mehreren Ver- fahrensstufen mit verschiedenen Enzymen und Alkali behan¬ delt (Schritte (2) bis (6)). Parallel zu diesen Verfah¬ rensschritten wird ein Vektor- hier DNA des Plas ids pBR322 aus E. coli-vorbehandelt , um den Einbau der synthe¬ tisierten cDNA-Moleküle zu gestatten. Nachdem die cDNA- Moleküle mit den vorbehandelten Vektor-Molekülen kombi¬ niert worden sind, werden geeignete Wirtsorganismen, beispielsweise E. coli K12-Stämme,damit transformiert und auf 'geeigneten Substraten ausplattiert und inkubiert. Die Gesamtheit der auf diese Weise gewonnenen Kolonien von Transformanten stellt die vorstehend erwähnte cDNA-Genbank dar.

Dieses Verfahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken hat je¬ doch den Nachteil, daß die aus den Zellen isolierte mRNA mehreren Verfahrensstufen (1) bis (6) unterworfen werden muß. Da die mRNA ein verhältnismäßig empfindliches Molekül ist, treten dabei häufig Strangbrüche auf. Als Folge dieser Strangbrüche enthält die letztlich hergestellte cDNA-Gen- bank meistens nur verhältnismäßig kleine cDNA-Insertionen in der Größenordnung von etwa 300 bis 1000 Nucleotiden. Folglich lassen sich die Erbinformationen von großen Pro¬ teinen, die mehr als etwa 300 Aminosäuren enthalten, aus solchen cDNA-Genbanken nur selten vollständig isolieren. Ein weiterer Nachteil des in Figur 7 dargestellten Ver¬ fahrens besteht darin, daß die Richtung, in der die cDNA in den Vektor eingebaut wird, nicht vorbestimmt werden kann. Bei der Suche mit Antikörpern können in falscher

Orientierung eingebaute cDNA-Moleküle nicht identifiziert werden.

Nach dem Verfahren von H. Okayama und B. Berg (Mol. Cell. Biol. 2 (1982), S. 161 - 170) ist der gerichtete Einbau von cDNA-Kopien der aus Zellen isolierten mRNA-Moleküle möglich. Dieses Verfahren ist in Figur 8 zusammengefaßt. Bei diesem Verfahren wird zunächst der Vektor gespalten und mit oligo (dT)-bereichen unter Verwendung des Enzyms termi- nale Transferase versehen. Dabei entsteht ein lineares Vektormolekül, das an beiden 3'-Enden oligo (dT)- Bereiche trägt. Einer dieser oligo (dT)-Bereiche wird mit Hilfe der Restriktionsendonuclease Hpal abgespalten. An den nunmehr nur noch an einem Ende einen oligo (dT)-Be- reich tragenden Vektor wird nachfolgend die mRNA über ihren polyA-Bereich angelagert. Da die mRNA nur an ihrem 3'-Ende einen polyA-Bereich trägt und auch der manipulierte Vektor nur noch an einem seiner Enden einen oligo (dT)-Be¬ reich trägt, ist die Anlagerung der mRNA nur in einer Rich- tung möglich. In den weiteren Schritten dieses Verfahrens wird mit Hilfe verschiedener Enzyme (siehe Figur 8) der entsprechende cDNA-Bereich hergestellt und schließlich ein zirkuläres, rekombinantes Vektormolekül gewonnen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß das Anhängen von oligo (dC)-Bereichen (siehe Figur 8) erschwert ist, weil der an der mRNA synthetisierte erste cDNA-Strang meistens unvollständig ist und damit ein "eingezogenes Ende" vor¬ liegt. Die Folge dieser Schwierigkeit beim Anhängen von oligo (dC)- Bereichen ist eine niedrige Ausbeute an Endprodukten, d.h. an rekombinanten, cDNA enthaltenden Vektoren. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges eine Spaltung mit der Restriktionsendonuclease Hindlll durchgeführt wer- den muß. Bei dieser Spaltung werden auch die im Molekül enthaltenen DNA/RNA-Hybridbereiche mit einer gewissen Hau-

figkeit gespalten, sofern sie die Erkennungsseσuenz für die Restriktionsendonuclease Hind III aufweisen. Auf diese Weise gespaltene DNA/RNA-Hybridbereiche können nicht zu Endpro¬ dukten weiter verarbeitet werden, da dabei die oligo(dC)- Bereiche am ersten cDNA-Strang mit abgespalten werden. So¬ mit wird in folge dieser SpaltungsVorgänge die Endausbeute verringert.

Schließlich besteht ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens darin, daß beim Einsetzen des oligo (dG)-verlängerten Hindlll- inkers ein Konzentrationseffekt auftritt. Wenn nicht die richtige Konzentration dieses Linkers (Figur 8) gewählt wird, so ist die Ausbeute an rekombinanten.cDNA enthaltenden Vektoren bei diesem Verfahren niedrig.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Vektoren und Verfahren bereitzustellen, mit deren Hilfe cDNA-Gen- banken mit hoher Ausbeute konstruiert werden können, die rekombinante Vektoren enthalten, deren cDNA-Insertiohen möglichst groß sind und in einer vorbestimmten Richtung i ⁿ den Vektor integriert sind.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine linearisierter Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er an einem 3'-Ende einen oligo (dT)-Bereich und an dem anderen 3'-Ende einen oligo (dC)- oder oligo (dG) -Bereich mit einem termina- len Didesoxynucleotid-Rest trägt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieses linearisierten Vektors, das da- durch gekennzeichnet ist, daß man einen einen Polylinker enthaltenden Vektor mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die 3 '-Enden mit oligo (dC)- oder oligo (dG)- Bereichen versieht, an die Enden der oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereiche einen Didesoxynucleotid-Rest anhängt, den oligo(dC)- oder oligo (dG)-Bereich an einem 3 '-Ende mit einer anderen Restriktionsendonuclease abspaltet,

und das erhaltene freie 3'-Ende mit einem oligo (dT)-Be¬ reich versieht.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Her- Stellung einer cDNA-Genbank, bei dem linearisierte Vektor¬ moleküle über einen oligo (dT)-3ereich an einem ihrer 3'- Enden jeweils an das polyA-Ende eines RNA-Moleküls einer mRNA Population hybridisiert werden und anschließend in enzymatischen Reaktionen ausgehend vom RNA-Molekül als Matrize jeweils eine doppelsträngige cDNA synthetisiert wird und die Vektoren rezirkularisiert werden, ^as dadurch gekennzeichnet ist, aß manlinearisierte Vektormoleküle verwen¬ det, deren zweites 3'-Ξnde einen oligo (dC)- oder oligo (dG)- Bereich mit einem ter inalen Didesoxynucleotid-Rest trägt.

Spezielle Beispiele für einen Polylinker enthaltende Vek¬ toren zur Herstellung der- linearisierten Vektoren der Er¬ findung und zur Clonierung von cDNA gemäß dem erfindungs¬ gemäßen Verfahren sind der 'Vektor pUC931 und die entsprechen- den Vektoren p0M1 , pOt ψ ^' pOW sowie der Vektor püC830 und die entsprechenden Vektoren p0M2, pOM4 und pOM8.

Allgemein werden als Polylinker kurze DNA-Sequenzen be¬ zeichnet, die mindestens zwei ErkennungsSequenzen für Restriktionsendonucleasen aufweisen, die im Polylinker nur einmal vorliegen und ansonsten im Vektor nicht enthal¬ ten sind.

Um eine möglichst große Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren zu erhalten, können Polylinker verwendet werden, die mindestens zwei Spaltstellen für Restriktionsendo¬ nucleasen enthalten, die keine eingezogenen 3 '-Enden bil¬ den. Es müssen nämlich zwei aufeinanderfolgende Verfahrens- schritte ausgeführt werden, bei denen Desoxynucleotidbe- reiche angehängt werden.

1 Das Konstruktionsprinzip der Vektoren pUC931 und pOM1 ist in Figur 1 schematisch dargestellt.

Zunächst wird der Vektor pUC9 (hinterlegt bei der Deut ^¬ schen Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen, Bundesre- 5 publik Deutschland, unter der Hinterlegungs-Nummer

DSM 3421 ) mit der Restriktionsendonuclease Hindlll gespal¬ ten, für die dieser Vektor nur eine einzige Spaltstelle aufweist. Die überstehenden Enden werden anschließend mit der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zu glatten Enden _Q - aufgefüllt. Durch die Auffüllreaktion entsteht im Lese¬ raster des in diesem Bereich des Vektors befindlichen ß-Ga- lactosidase-Gens eine Verschiebung um ein Basenpaar. Der so behandelte Vektor wird mit der 4 DNA-Ligase rezirkula- risiert. Es wird das Plasmid pUC9 (H ) erhalten. Nachfol¬ ge gend wird dieses Plasmid mit den Restriktionsendonucle- asen Pst I sowie Eco RI gespalten. In einem parallelen Spaltungsansätz wird der Vektor M13 tg 131 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Hin¬ terlegungs-Nr. DSM3494) ebenfalls mit den Restriktions- 20 endonucleasen Pst I und Eco RI gespalten. Auf diese Weise wird aus dem Plasmid M13 tg 131 der Polylinker herausge¬ trennt, der ErkennungsSequenzen für die Restriktionsendo- nucleasen Pst I, Sal I, BamH I, Hind III, Xba I, Kpn I, Sph I, Eco R V, Sac I, Sma I, Xma I, EcoR I und 25 für die Isoschizomere dieser Restriktionsendonucleasen enthält. Der so erhaltene ^" Polylinker aus M13 tg 131 wird nachfolgend in das Pst I/EcoR I gespaltene Plasmid pUC 9 (H ) eingesetzt, wobei der Rasterschub korrigiert wird. Nach kovalenter Verknüpfung mit der T4-DNA-Ligase gθ wird das Plasmid pUC 931 erhalten.

Im wesentlichen nach dem gleichen Konstruktionsschema wird das erfindungsgemäße Plasmid pOM 1 erhalten. Es wird je¬ doch nach der anfänglichen Hind III Spaltung und der nach¬ folgenden Auffüllreaktion mit der DNA-Polymerase I 35 (Klenow-Fragment) ein Xho I-Linker eingesetzt. Dieser Xho I-Linker ist in an sich bekannter Weise synthetisch her¬ stellbar und hat die Sequenz 5'CTCGAG.

Der wesentliche Unterschied der erfindungsgemäßen Vektoren pUC 931 sowie pOM 1, pOM3 und p0M9 besteht darin, daß der Vektor pUC 931 im Bereich der ursprünglich aufgefüllten Hind III-Spalt- stelle ein Stopcodon enthält, wogegen die erfindungsgemäßen Vek- toren pOM1 , p0M3 und pOM9 dieses Stopcodon (infolge des Einsetzens des Xho I-Linkers) nicht aufweisen (Figur 2) . Demzufolge ist die Expression der in den Vektor pUC 931 eingesetzten genetischen Information nur in Suppressor-Wirtsorganismen möglich, die dahingehend mutiert sind, daß sie eine tRNA (Transfer-RNA) herstellen können, deren Anticodon komplementär zum im Vek¬ tor pUC 931 enthaltenen Stopcodon ist.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Vektoren pUC 830.-sowie p0M2, pQM4 und pCM8 erfolgt im wesentlichen nach dem in Figur 1 abgebil- deten Kons ruktionsSchema. Die Ausgangsprodukte sind in diesem Falle das Plasmid pUC8 (hinterlegt bei der Deut¬ schen Sammlung für Mikroorganismen unter der Hinterlegungs- Nr. DSM 3420) sowie der Vektor Ml3tg 131 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Hin- terlegungs-Nr. DSM 3494) . Im Vergleich zu den Vektoren pUC 931 und pOM 1 enthalten die Vektoren pUC 830 sowie p0M2, p0M4 und p0M8 den Polylinker aus M13tg 131 in umgekehrter Orientierung. pUC 830, p0M2, p0M4 und.pOMδ enthalten kein Stopcodon (Figuren 2 und 3) .

Am Beispiel der genannten erfindungsgemäßen Vektoren wird die Konstruktion von cDNA-Genbanken erläutert,die aus rekombinanten DNA-Molekülen bestehen, welche gerichtete, lange cDNA-Insertionen enthalten. Erfindungsgemäß werden bei der Herstellung der cDNA-Genbanken hohe Ausbeuten er¬ zielt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken ist in den Figuren 4 und 5 schematisch dar¬ gestellt. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Plasmide pUC 931 oder pOM 1 wird die Herstellung einer cDNA-Genbank durch Spaltung dieser Vektoren mit der Restriktionsendo¬ nuclease Kpn I eingeleitet (Figuren 4 und 5, I und II).

Das so erhaltene linearisierte Plasmid wird mit dem Enzym terminale Transferase in einer Ausführungsform mit einem oligo(dC)-Bereich an den 3'-Enden der doppelsträngigen DNA versehen (Zugabe von dCTP) . Entsprechend kann es auch mit einem .oligo(dG)-Bereich versehen werden. Anschließend wird jeweils ein Didesoxycytidin-Rest ange¬ hängt. Durch diesen Didesoxycytidinrest, der an seiner 3'- Position ein Wasserstoffatom anstelle einer OH-Gruppe trägt, ist eine weitere Kettenverlängerung des oligo(dC)- Bereichs nicht möglich (Figuren 4 und 5, II) . Erfindungsgemäß sind auch andere Didesoxynucleotide zur Blockierung der verlängerten 3'-Enden geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl der Cytidinreste 12 bis 20 (in den Figuren 4 und 5 ent¬ spricht dies: n = 10 bis 18). Die Länge der angehängten oligo(dC)-Bereiche ist überprüfbar durch Zugabe von

32 P-markiertem dCTP während der Reaktion der terminalen

Transferase, Spaltung mit einer Restriktionsnuclease deren Erkennungssequenz im Polylinker liegt und anschließender Auf rennung der Spaltprodukte auf einem Polyacrylamidgel, wobei zur Bestimmung der Größe geeignete Standardmole¬ küle auf dem Gel mit aufgetragen werden.

Im nächsten erfindungsgemäßen Verfahrensschritt wird der erhaltene, mit oligo(dC)-Bereichen versehene Vektor mit ei- ner Restriktionsnuclease gespalten, die ein asymmetrisches Molekül erzeugt, das lediglich an einem 3'-Ende der doppelsträngigen DNA einen oligo(dC)- Bereich trägt. An dieses Molekül wird an das freie 3'-Ende mit dem Enzym terminale Transferase ein oligo(dT)-Bereich unter Verwendung von dTTP angehängt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt dieser Bereich ungefähr 60 bis 100 DesoxγÜιymidin-Reste (in den Figuren 4 und 5 ist die An¬ zahl dieser Reste mit m bezeichnet) . Das Anhängen vonDesoxy- thymidinresten kann im erfindungsgemäßen Verfahren nur an das durch die Nachspaltung entstandene 3'-Ende erfolgen, da am durch den oligo(dC)-Bereich gebildeten 3'-Ende keine

für die weitere Verlängerung erforderliche OH-Gruppe in 3 ' -Stellung vorliegt.

Im nächsten Verfahrensschritt (Figuren 4 und 5 IV) wird eine jπPNA aus einer aus den gewünschten Zellen isolierten mFNA-Population über ihren poly A-Bereich an den oligo (dT) -Bereich des wie vorstehend er¬ haltenen asymmetrischen linearisierten Vektors angelagert . In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens (Figur 4) wird im nächsten Schritt mit dem Enzym reverse Transkriptase unter Zugabe der entsprechenden Nucleotide der zur mRNA komplementäre erste cDNA-Strang synthetisiert. Anschließend wird der neusynthetisierte cDNA-Strang mit terminaler Transferase und dGTP mit oligo (dG) -Bereichen versehen . Gegenüber dem bislang bekannten Verfahren be¬ steht der Vorteil bei diesem erfindungsgemäßen Verfahrens- schritt darin, daß sich an eingezogene 3 ' -Enden des ersten cDNA-Stranges Guanosin-Reste leichter anhängen lassen als Cytosin- Reste (Figuren 4 und 8) . Danach werden die oligo (dC) - Bereiche des Vektors und die oligo (dG) -Bereiche des cDNA-St_anges aneinander gelagert. Schließlich werden erfindungsgemäß rekαifoinante doppelsträngige cDNA-enthaltende Vektoren mit den Enzymen DNA-Polymerase I , RNaseH und E . coli DNA-Ligase erhalten . In einer weiteren Ausführungs form wird zuerst der zweite cDNA-Strang synthetisiert und dann der oligo (dG) -Bereich angehängt (Figur 5) . Da bei dieser Verfahrensweise über- stehende 3 ' -Enden generiert werden, können auch oligo

(dC) -Bereiche in hoher Ausbeute angehängt werden. Für die spätere Rezirkularisierung des Vektors ist es dann jedoch erforderlich, zu Beginn des Verfahrens den Vektor nicht mit oligo (dC) - , sondern mit oligo (dG) -Bereichen zu ver- längern.

Der Unterschied der beiden in den Figuren 4 und 5 abgebil¬ deten und vorstehend beschriebenen Ausführungsformen be¬ steht somit lediglich darin, daß die letzten Verfahrens¬ stufen in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden.

Mit den vorstehend beschriebenen Verfahren werden erfin¬ dungsgemäß ausgehend von einer zellulären mRNA-Population jeweils verschiedene rekombinante, cDNA-enthaltende Plas¬ mide erhalten. Diese Plasmide werden nachfolgend zur Trans- formation geeigneter Wirtsorganismen, beispielsweise von E. coli K12 JM83, E. coli K12 DH1 oder E. coli K12 JM109 eingesetzt. Diese E. coli-Stämme sind bei der American Type Culture, Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., bzw. bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen, Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt unter der Nr. ATCC 35607, ATCC 33849 und DSM 3423. Durch Ausplattieren der Transformanten wird schließlich eine cDNA-Genbank erhalten.

Die erfindungsgemäßen cDNA-Genbanken können durch Absuchen nach entsprechenden Ξxpressionsprodukten analysiert werden. Je nach verwendetem E. coli-Ξtamm wird in diesem Fall Iso- propyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) beim Ausplattieren der cDNA-Genbank zugesetzt. IPTG induziert in den trans- formierten Wirtsorganismen die Expression des ß-Galactosi- daseoperons.. Infolgedessen werden bei der Expression der rekombinanten, cDNA enthaltenden Vektoren der Genbank Fusionsproteine gebildet. Diese Fusionsproteine bestehen aus einem N-terminalen ß-Galactosidase-Bereich und einem daran anschließenden Bereich, der von durch die cDNA codier¬ ten Aminosäuren gebildet wird.

Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren pUC 830 und pOM 2 zur Herstellung der erfindungsgemäßen cDNA-Genbanken wird im wesentlichen nach dem in den Figuren 4 und 5 be¬ schriebenen Verfahren vorgegangen. Der einzige Unter¬ schied besteht darin, daß wegen der umgekehrten Polarität des in diesen erfindungsgemäßen Vektoren enthaltenen Po- lylinkers die erste Restriktionsspaltung mit dem Enzym Sac I durchgeführt wird und nicht mit Kpn I.

Zusammenfassend sind die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von cDNA-Genbanken unter Ver¬ wendung der erfindungsgemäßen Vektoren die folgenden: Bei dem in Figur 4 beschriebenen Verfahren werden oligo (dG)-Bereiche anstelle der im Stand der Technik verwende¬ ten oligo(dC)-Bereiche mit der terminalen Transferase angehängt (vgl. Verfahren von Okayama und Berg (a.a.O., Figur 8). Das Anhängen von oligo(dG)-Bereichen an einge¬ zogenen 3'-Enden erfolgt in höherer Ausbeute. Beim in Figur 5 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von cDNA enthaltenden rekombinanten Vektoren werden die oligo(dG) -Bereiche an überstehende 3'-Enden angehängt. Dies erfolgt auch für dCTP mit hoher Ausbeute. Da somit bei den erfindungsgemäßen Verfahren die Verfah- rensstufe des Anhängens von oligo(dG)-Bereichen mit höherer Ausbeute als im Stand der Technik erfolgt, ist auch die Ausbeute an cDNA-Clonen beim erfindungsgemäßen Verfahren höher als bei dem aus dem Stand der Technik bekannten Ver¬ fahren. • Außerdem werden beim erfindungsgemäßen Verfahren im Gegen¬ satz zu dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren alle Manipulationen mit Restriktionsendonucleasen durch¬ geführt, bevor die mRNA in das Verfahren eingebracht wird. Da somit die mRNA nicht in Form von DNA/RNA-Hybriden durch die Restriktionsendonucleasen gespalten werden kann, ergeben sich beim erfindungsgemäßen Verfahren lange cDNA-Clone, die auch die genetische Information für große Proteine vollständig repräsentieren können. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren be- steht darin, daß weniger Verfahrensschritte erforderlich sind, z.B. muß kein besonderer oligo (dG)-verlängerter Hind III-Linker, wie im Verfahren von Okayama und Berg (Figur 8) verwendet werden. Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß konstruierten cDNA-Clone besteht darin., daß der cDNA-Bereich im rekombi¬ nanten Plasmid innerhalb des aus dem Vektor M 13tg 131 ge-

¹ wonnenen Polylinkers lokalisiert ist. Da somit die Inser¬ tion von mehreren Restriktionsspaltstellen für übliche Re¬ striktionsenzyme umgeben ist, kann sie in einfacher Weise wiedergewonnen werden. Die Wiedergewinnung der cDNA-Inser- ° tion ist bei nach herkömmlichen Verfahren gewonnenen cDNA- Clonen schwierig oder sogar unmöglich, da entwe¬ der keine oder nur wenige Spaltstellen in Nachbarschaft der cDNA-Insertion vorlagen. Auch für die Erstellung von Restriktionskarten der cDNA-Insertion ist die Vielzahl der

^ umgebenden Restriktionsendonuclease-Spaltstellen günstig. Schließlich können die erfindungsgemäß konstruierten cDNA-Clone vom 5'-Ende der Insertion her direkt unter Ver¬ wendung üblicher "Reverse sequencing primer" sequenziert werden (E.Y. Chen und P.H. Seeburg, DNA 4 (1985) , Seiten

15 165 bis 170) . Mit dem nach dem Verfahren von Okayama und Berg (a.a.O.) hergestellten cDNA-Clonen ist eine solche direkte Sequenzierung nicht möglich, da sie keine zu den üblichen "Reverse sequencing primern" komplementären DNA- Sequenzen am 5'-Ende der cDNA-Insertion aufweisen.

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Figur : Konstruktionsschema der Vektoren pUC 931 und pOM 1.

Figur 2: Sequenz des Polylinker-Bereichs von pUC 931, ⁵ pOM 1, pOM 3 und pOM 9.

Figur 3: Sequenz des Polylinker-Bereichs von pUC 830, pOM 2, pOM 4 und pOM 8.

Figur 4: Konstruktionsschema einer cDNA-Genbank.

Figur 5: Konstruktionsschema einer cDNA-Genbank.

Figur 6: Größenvergleich von cDNA-Clonen aus herkömmli- 5 chen und erfindungsgemäßen cDNA-Genbanke .

Figur 7: Konstruktionsschema von cDNA-Genbanken, bei dem die cDNA direkt an freier mRNA synthetisiert wird.

Figur 8: KonstruktionsSchema von cDNA-Genbanken nach Okayama und Berg.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die in den folgenden Beispielen verwendeten Enzyme wur¬ den bezogen von den Firmen Boehringer Mannheim, Mannheim, Bundesrepublik Deutschland; Pharmacia, Freiburg, Bundes¬ republik Deutschland oder New England Biolabs, Bad Schwalbach, Bundesrepublik Deutschland. Die reverse Transkriptase wurde von Life Science, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika bezogen.

Die Enzymreaktionen wurden unter den von den einzelnen Herstellern jeweils empfohlenen Bedingungen durchgeführt ^' und sind außerdem in T. Maniatis, E.F. Frisch und

J. Sambrook, "Molecular Cloning,A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour, 1982, New York, beschrieben.

B e i s p i e l 1 Konstruktion des Vektors pUC 931

2 μg DNA des Plasmids pUC 9 (DSM 3421) werden mit 10 U Hind III gespalten. Beide überstehenden Enden werden mit 2 U DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt und mit 2 U T4 DNA-Ligase religiert. Dabei ergibt sich ein Raster- schub von +1.

Nach Transformation von E. coli K12 J ^" M 109 (DSM 3423) mit den Ligierungsprodukten und Ausplattieren unter Zugabe von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galactopyranosid (X-Gal) und IPTG werden weiße Kolonien isoliert. Die Plasmid-DNA

dieser isolierten Kolonien wird nach Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7 (1979), Seiten 1513 bis 1522) isoliert. Es wird das Plasmid pUC (H~) erhalten.

2 μg des Plasmids pUC 9 (H~) werden mit 10 U Pst I und 10 U Eco RI gespalten und über eine Sephacryl-300 (Pharmacia)-Säule in einer 1 ml Spritze zentrifugiert, um das anfallende Polylinker-Fragment zu entfernen. Die Säu¬ lenchromatographie wird gemäß der Vorschrift von T. Maniatis et al. (a.a.O.) für zentrifugierte G 50-Säulen- chromatographien durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 2 Mi¬ nuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute in einer Minifuge 2 von Christ, Osterode, Bundesrepublik Deutschland zentri¬ fugiert wird.

In einem weiteren Ansatz werden 2 μg doppelsträngige DNA von M 13 tg 131 (DSM 3494) mit 10 ü Pst I und 10 U Eco RI gespalten. Ein Zehntel des Spaltansatzes wird mit 10 U Polynucleotid-Kinase markiert, dem gesamten Ansatz wieder zugesetzt und auf einem 5prozentigen Polyacrylamidgel mit Tris-Borat-Puffer aufgetrennt (siehe auch T. Maniatis et al. a.a.O.). Anschließend wird der Polylinker von M 13 tg 131 aus dem Polyacrylamidgel durch Ξlektroelution der entsprechenden ausgeschnittenen Bande in einem Dialyse- schlauch isoliert.

Der so erhaltene Polylinker wird in das wie vorstehend vorbereitete, mit Pst I und Eco RI geschnittene Plasmid pUC9 (H~) mit T4 DNA-Ligase eingesetzt. o _er Einbau des Polylinkers aus M13 tg131 in pUC9 (H~) be¬ wirkt eine Verschiebung des Leserasters um -1 , so daß das ursprüngliche Leseraster für den die ß-Galactosidase-co- dierenden Bereich wieder hergestellt ist. Durch die wie vorstehend beschrieben aufgefüllte Hind III- Spaltstelle entsteht ein Stop-Codon (TAG) im Leseraster des ß-Galactosidase-codierenden Bereichs. Deshalb sind zur

Expression der in pUC 931 inserierten genetischen Informa¬ tion in Form eines ß-Galactosidase-Fusionsproteins Bak¬ terien mit der Supressormutation supE und/oder supF er¬ forderlich. Der E. coli-Stamm JM 109 trägt die supE-Muta- tion.

Anschließend werden E. coli K12 JM109 Bakterien (DSM 3423) mit den. Ligierungsprodukten transformiert und zusammen mit X-Gal und IPTG auf YT-Platten enthaltend 100 μg/ l Ampi- cillin ausplattiert (vgl. Maniatis et al., a.a.O.). Aus einer .blaßblauen Kolonie wird nach der Methode von Birnboim und Doly (a.a.O.) das Plasmid pUC 931 isoliert.

Das Konstruktionsprinzip des Vektors pUC 931 ist in Figur 1 schematisch zusammengefaßt.

B e i s p i e l 2_ Konstruktion des Vektors pOM 1

In an sich bekannter Weise wird nach der Phosphoamidid-Me- thode ein Xhol-Linker mit der DNA-Sequenz CTCGAG syntheti¬ siert . In einem weiteren Ansatz wird . wie in Beispiel 1 beschrieben, das Plasmid pUC 9 mit dem Restriktionsenzym Hind III gespalten und die Enden des so linearisierten Plasmids werden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt . An das so erhaltene lineare Zwischenprodukt werden die nicht phos- phorylierten Stränge des Xho I-Linkers ligiert ( R. Lathe et al . , DNA 3 ⁽ 1 984 ) , Seiten 1 73 bis 1 82 ; _A . seth, 'Gene- Anal. Techn. 1 (1984) , Seiten 99 - 103) . Dabei werden nur die 3 '-Enden des? I_ aR__? a&6 _< äa» iiήearisiεϊrtär Plasmid .ferbunden. Für diesen Ligierungs- prozeß wird die T4 DNA-Ligase verwendet (vgl. T. Maniatis et al.) .

Erfindungsgemäß eignen sich für den Einbau alle Linker mit 3 oder n x 3 Basen, da keine Verschiebung im Leseraster er- zeugt werden darf. Vorzugsweise werden dabei Linker für Re¬ striktionsenzyme verwendet, für die keine Erkennungssequenz im nachfolgend einzusetzenden Polylinker aus M13 tg 131 ent¬ halten ist und welche den Vektor nicht schneiden.

Die weiteren Verfahrensschritte zur Herstellung des Plas- mids pOM 1 werden wie in Eeispiel 1 und Figur 1 beschrie¬ ben durchgeführt. Daraus folgt, daß sich der so konstru¬ ierte Vektor pOM 1 vom Vektor pUC 931 lediglich durch eine zusätzliche Xho I-Erkennungsstelle in der aufgefüllten Hind III-Erkennungssequenz- des Plasmids pUC 931 unter¬ scheidet (siehe Figur 1 und Figur 2).

Durch das Einfügen der Xho I-Erkennungssequenz wird die Bildung eines Stop-Codcn im Leseraster des ß-Galactosidase- codierenden Bereichs verhindert. Damit ist die Expression der in diesem Plasmid enthaltenen genetischen Information auch in Wirtsorganismen ohne Supressor-Mutationen möglich.

E e i s p i e l 2b

Konstruktion des Vektors pOM 3

2 μg DNA des Plasmids pUC 9 (DSM 3421) werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit dem Restriktionsenzym Hind III gespalten. Die 5' überstehenden Enden werden mit 5 U Mung Bean Nuclease verdaut, so daß glatte Enden entstehen. Daran werden, wie in Beispiel 2a beschrieben, die nichtphosphorylierten Enden eines 8 Easen langen Cla I Linkers ligiert. Dieser Linker ist mit der Sequenz CÄTCGATG käuflich erhältlich oder kann in an sich bekannter Weise nach der Phosphoamidid-Methode synthetisiert werden.

Erfindungsgemäß eignen sich für den Einbau alle Linker mit 8 Easen, da durch das abspalten der 4 überstehenden Basen auf beiden Seiten der geschnittenen Hind III Stelle und durch Einsetzen des 8 Basen langen Linkers ebenfalls wie in Beispiel 1 ein Rasterschub von +1 erzeugt wird. Vorzugsweise-werden dabei Linker für Restriktionsenzyme verwendet, für die keine Erkennungs¬ sequenz im nachfolgend einzusetzenden Polylinker aus M13 tg 131 enthalten ist und welche den Vektor nicht schneiden. Die weiteren Verfahrensschritte zur Herstellung des Plasmids pOM 3 werden wie in Eeispiel 1 und Figur 1 beschrieben durch¬ geführt. Der so konstruierte Vektor pOM 3 unterscheidet sich

vom Vektor pUC 931 durch eine zusätzliche Cla I Stelle. Durch das Einfügen des Cla I Linkers nach Abspaltung der über¬ stehenden Hind III Enden bleibt das Leseraster für den für das lac z-Fragment der . -Galactosidase codierenden Bereich erhalten. Außerdem wird ein weiteres Codon ATG in einem anderen Leseraster eingeführt, welches als internes Startcσdon für die Expression von in den Polylinker eingefügter cD dienen könnte.

Nach Transformation des Konstrukts mit dem eingesetzten Cla I Linker wurde nur ein Plasmid erhalten, bei dem rechts vom Linker nur die erste Base des überstehenden Endes der Hind III Stelle entfernt worden war. Die drei Basen, die auf diese Weise zusätzlich zum Cla I Linker eingeführt wurden, stören das Leseraster nicht. Sie sind in Fig. 2 überstrichen.

B e i s p i e l 2c

Konstruktion des Vektors pOM 9

Das Plasmid pUC 9 wird wie in den vorigen Beispielen mit Hind III gespalten. Bei beiden überstehenden Enden wird mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) nur eine Base (dA) aufgefüllt. Die restlichen drei überstehenden Basen werden ^• auf beiden Seiten wie in Beispiel 2b mit Mung Eean Nuclease abgebaut und die entstehenden glatten Enden religiert. Auch bei dieser Konstruktion ergibt sich ein Rasterschub von +1. Außerdem entsteht eine neue palindromische Sequenz CAATTG, für die allerdings bisher noch kein Restriktions¬ enzym bekannt ist. Diese Sequenz ist in pUC 9 und im Poly¬ linker von M13 tg 131 nicht vorhanden und wäre damit auch eine einzigartige Restriktionsstelle.

Die weiteren Verfahrensschritte zur Herstellung des Plasmids pOM 9 erfolgen wie in Beispiel 1 und Figur 1 beschrieben. Das Leseraster des für das lac z-Fragment der ß-Galaktosidase codierenden Bereichs bleibt erhalten.

B e i s p i e l 3

Konstruktion der Vektoren pUC 830 und pOM 2

Ausgehend von 2 μg DNA des Plasmids pUC 8 ⁽ DSM 3420 ⁾ wird nach _d er in Beispiel 1 erläuterten Verfahrensweise der Vektor pUC 830 konstruiert.

Der Vektor pUC 830 unterscheidet sich somit vom Vektor pUC 931 durch die umgekehrte Orientierung des aus dem Vektor M 13 tg 131 abgeleiteten Polylinkers.

Beginnend mit je 2 μg DNA des Plasmids pUC 8 werden gemäß Beispiel 2a, b, c die Vektoren pOM 2, pOM 4 und pOM 8 herge¬ stellt. Alle diese Vektoren (Figur 3) enthalten kein Stop- Codon und das Leseraster des für das lac z-Fragment der ß-Ga- lactosidase codierenden Bereichs bleibt erhalten.

Auch bei pOM 4 war auf einer Seite (links) vom eingesetzten Cla I Linker nur eine Base von dem überstehenden Ende der Hind III Stelle abgebaut, so daß auch hier, wie bei pOM 3, zusätzlich drei weitere Basen in den Polylinker ^' eingeführt wurden. Außerdem war die letzte Base dG des Cla I Linkers zu einem dT mutiert, so daß kein zusätzliches Start-Codon ATG existiert, welches nach dem Polylinker sowieso bei der Ex- ression von inserierter cDNA stören könnte. Die drei zusätz¬ lichen Basen und die mutierte Base sind in Abb. 3 durch einen Strich gekennzeichnet.

B e i s p i e l 4

Herstellung eines linearisierten Vektors

400 μg DNA des Vektors pUC 931 werden mit 200 U Kpn I linearisiert und mit dCTP sowie 200 U terminaler Transfe¬ rase behandelt (Figur 2) . Die Länge der so angehängten oligo (dC)-Bereiche wird auf 1Oprozentigen Polyacryla id- gelen nach Abspaltung dieser Bereiche mit den Restriktions- nucleasen Barn H I durch Vergleich mit Oligonucleotiden be ^¬ kannter Länge ermittelt.

Auf diese Weise werden die Reaktionsbedingungen so einge¬ stellt, daß die Anzahl der Cytosin-Reste in den oligo (dC)- Bereichen 10 bis 20 beträgt. Vektormoleküle mit oligo (dC)-Bereichen der genannten Länge werden anschließend mit Didesoxynucleosid-triphosphat-Derivaten und terminaler Transferase behandelt. Bei Verwendung von ddCTP weist das Produkt dieser Reaktion an seinen beiden 3 '-Enden oligo (dC)-Bereiche mit einem terminalen Didesoxycytidin-Rest ^• auf. Dadurch können diese Bereiche in weiteren Reaktionen mit terminaler Transferase nicht zusätzlich verlängert wer¬ den.

Der oligo (dC)-Bereich am nicht codierenden Strang wird mit 100 U Sac I abespalten. Es entsteht ein asymmetrisches Produkt ⁽ siehe Figur 4), das durch eine Chromatographie an ^(d l ⁾ -cellulose (Pharmacia) gereinigt werden kann.

Das asymmetrische Reaktionsprodukt wird mit dTTP und termi¬ naler Transferase behandelt. Dabei wird an das 3 *-Ende des nicht codierenden Stranges ein oligo (dT)-Bereich ange¬ hängt. Die Reaktionsbedingungen werden so gewählt, da _ß dieser Bereich 60 bis 100 Thymidin-Reste aufweist. Nach _¬ folgen ^d kann das erhaltene Reaktionsprodukt durch Chromato _¬ graphie mit oligo (dA)-Cellulose (Pharmacia) gereinigt werden.

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B e i s p i e l 5

Konstruktion einer cDNA-Genbank mit dem linearisierten 5 Vektor

DNA des gemäß Beispiel 4 erhaltenen linearisierten und - asymmetrischen Vektors (Figur 4) wird mit in an sich be¬ kannter Weise isolierter mRNA vermischt, beispielsweise

10 mit 1 bis 2 μg poly A RNA isoliert aus PYS-Zellen (Maus) pro μg Vektor-DNA. Das Gemisch wird 10 Minuten auf 57°C erwärmt (150 mM KC1, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3). Beim Abkühlen ent¬ steht ein Gemisch linearer Vektormoleküle, an deren oligo (dT)-Bereich jeweils ein mRNA-Molekül hybridisiert ist.

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Anschließend erfolgt die Synthese des zur mRNA komplemen¬ tären cDNA-Strangs in einer Umsetzung mit 25 U reverser Transkriptase und dATP, dTTP, dGTP sowie dCTP.

20 Nachfolgend wird der neu synthetisierte cDNA-Strang mit terminaler Transferase unter Zugabe von dGTP mit einem 15 bis 20 Desoxyguanosinreste enthaltenden oligo (dG)- Bereich versehen. Unter Standardbedingungen werden dann die oligo (dC)-Bereiche des Vektors mit den oligo (dG)-

25 Bereichen der cDNA hybridisiert (T. Maniatis et al. , a.a. 0. ) . Es entstehen doppelsträngige rekombinante Vektormole¬ küle, die einen hybriden DNA/RNA-Bereich aufweisen.

In einer weiteren Reaktion wird der im Molekül enthaltene 30 mRNA-Strang durch den zweiten cDNA-Strang ersetzt. Dazu werden die Enzyme DNA-Polymerase I, RNase H und E. Coli

Ligase sowie dATP, dTTP, dCTP und dGTP verwendet

(U. Gubler und B.J. Hoffmann, Gene 25 (1983), S. 283 bis

286). 35

Das Ergebnis der vorstehend beschriebenen Reaktionsschritte (Figur 4) ist eine Reihe rekombinanter doppelsträngiger

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Vektoren, die einen doppelsträngigen cDNA-Bereich enthalten. An der Stelle, an der in diesem rekombinanten Vektor das Didesoxyderivat von Cytosin enthalten ist, sind die DNA- Stränge nicht kovalent miteinander verknüpft. Diese Lücke wird später bei der Replikation im Wirtsorganismis in den Tochtermolekülen geschlossen.

Dieses Gemisch von rekombinanten, cDNA-enthaltenden Vek¬ toren, wird bevorzugt in einen recA ^~ -Stamm, wie E. coli K 12 DH 1 (ATCC 33849) oder E. coli K 12 JM 109 (DSM 3423) 0 in an sich bekannter Weise durch Transformation einge¬ bracht (T. Maniates et al., a.a.O.). Die Transformanten werden anschließend in an sich bekannter Weise auf Nitro- cellulosefilter ausplattiert (Schleicher & Schüll, Bundes¬ republik Deutschland), die auf YT-Platten (100 μg Ampicil- 5 lin/ml) aufgelegt werden. Die Platten werden anschließend über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

Es werden Kolonien erhalten, die jeweils eine Transformante eines rekombinanten cDNA-enthaltenden Vektors repräsentie- 0 ren. Die Gesamtheit dieser Kolonien wird als cDNA-Genbank bezeichnet.

Zur Aufbewahrung dieser cDNA-Genbank können die Kolonien von den Filtern abgewaschen und mit 15 % Glycerin als 5 a plifizierte Bakteriensuspension eingefroren werden. Je nach Bedarf werden dann Teile dieser Suspension aufgetaut und neu ausplattiert.

Zur Sequenzierung positiver Clone werden aus der wie vor¬ 0 stehend hergestellten cDNA-Genbank einzelne Kolonien ent¬ nommen und jeweils vermehrt. Anschließend wird aus diesen Bakteriensuspensionen die Plasmid-DNA nach Birnboim und Doly (a.a.O.) isoliert. Die DNA-Sequenz der so erhaltenen

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Plasmid-DN _A kann durch Maxam und Gilbert-Sequenzierung nach

¹ Rüther et al. (Nucleic Acids Res., 9 (1981 ⁾ , Seiten 4087 bis 4097 ₎ o _d er unter Verwendung von üblichen Primern nach

F. Sanger et al. (J. Mol. Biol. 143 (1980 ⁾ , Seiten 161 bis 178) ^" ermittelt werden. 5

Als Vorstufe zur Sequenzierung ist auch eine Subclonierung der cDNA-Insertion in andere Vektoren möglich.

B e i s p i e l 6 0 Konstruktion weiterer cDNA-Genbanken mit dem Vektor pUC 931

Mit dem Vektor pUC 931 und mRNA aus der Mauszellinie PYS-2 werden die cDNA-Genbanken cl und eil gemäß den Beispielen 5 4 und 5 konstruiert.

150 μg poly A-RNA werden auf einem Saccharose-Gradienten von 10 % bis 36 % Saccharose in einer Beckmann Ultra-Zentrifuge L 8-70 im SW 28-Rotor 21 Stunden bei 26 000 Upm zentrifu- 0 giert. Es werden ^' Fraktionen zu 1,2 ml gesammelt. Die poly A-RNA der Fraktionen wird gefällt und in RNase-freiem, sterilem H^O bidest. wieder aufgenommen. Ein Zehntel der vereinigten Fraktionen 20 bis 25 wird zur Herstellung der cDNA-Genbank cl verwendet und ein Zehntel der vereinigten 5 Fraktionen 26 bis 32 zur Herstellung der cDNA-Genbank eil. Es werden jeweils 0,3 μg DNA des Vektors pUC 931 eingesetzt. Als Wirtsorganismus für die Rekombinanten, cDNA-enthaltenden Plasmide wird E. coli K 12 DH 1 verwendet.

0 Die ausplattierte cDNA-Genbank wird mit einem synthetischen Oligonucleotid wie beschrieben in I. Oberbäumer et al. (Eur. J. Biochem. 147 (1985), Seiten 217 bis 224) abge¬ sucht.

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Aus der cDNA-Genbank cl wird der Clon pA 14 isoliert. Er enthält eine cDNA-Insertion mit einer Länge von 1,6 kb. Aus der cDNA-Genbank eil wird der Clon pA 15 isoliert. Er enthält eine cDNA-Insertion einer Lange von etwa 2,6 kb (vgl. Figur 6) .

Durch eine Sequenzierung nach Sanger gemäß Beispiel 5 wer¬ den die 5 '-Enden der isolierten Clone charakterisiert.Die Clone pA 14 und pA 15 codieren demzufolge für die Of.-Kette vo Typ IV Kollagen. Der Clon pA 15 enthält den gesamten nicht-translatierten Bereich, den für die NC1-Domäne co¬ dierenden Bereich und den C-terminalen Bereich der Tripel- Helix.

Alle bisher für &. Typ IV-Kollagen bekannten Clone enden bereits innerhalb von 200 Basenpaaren des Tripel-Helix- codierenden Bereichs. Viele der Clone überstreichen jedoch lediglich den nicht translatierten Bereich. cDNA-Clone, die eine vergleichbare Größe erreichen, konnten bislang nur mit 0 Größen-fraktionierter cDNA und hoch angereicherter mRNA konstruiert und isoliert werden (H. Lehrach et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (1978), Seite 5417 bis 5412; T. Pihlajaniemi et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), Seiten 7681 bis 7687). Der längste bisher für die IX.-Kette vom 5 Kollagen Typ IV codierende cDNA-Clon, der nach der Okayama und Berg-Methode (a.a.O.) isoliert werden konnte, enthielt eine Insertion von lediglich 1,3 kb (Y. Yamada, pers. Mitt.) (vgl. Figur 6) .

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