BIRNAVIRUS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a composiciones inmunogénicas útiles para inducir una respuesta inmune hacia una infección por birnavirus mediante el uso de regiones antigénicas del polipéptido VP2 de birnavirus así como al uso de conjugados que comprenden dicho polipéptido VP2 y una molécula coestimuladora inmune.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La bursitis infecciosa (IBD, por sus siglas en inglés) o enfermedad de Gumboro, es una enfermedad vírica de curso agudo que principalmente afecta a pollos industrialmente engordados (broiler) en fase de crecimiento (3-8 semanas). Esta enfermedad está producida por el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), también conocido como el virus de la enfermedad de Gumboro, que tiene un tropismo muy pronunciado por las células linfoides localizadas en la bolsa de Fabricio, lo que da lugar a la eliminación selectiva de los precursores de linfocitos B presentes en la bolsa de Fabricio, lo que produce una inmunosupresión de los animales afectados. La gravedad de la enfermedad depende tanto del grado de virulencia de la cepa vírica como del estado inmunológico del animal infectado y sus consecuencias clínicas varían entre el establecimiento de una inmunosupresión transitoria, que esencialmente significa una reducción en índices de crecimiento y un descenso en la capacidad de respuesta contra infección y vacunación contra otros patógenos aviares, y una inmunosupresión grave que produce la muerte de un gran porcentaje de los animales infectados. Por tanto, la infección por IBDV produce tasas de mortalidad altas debido a dos causas: i) el ciclo infectivo del IBDV mismo, y ii) las infecciones oportunistas de otros patógenos que afectan a animales inmunodeprimidos. El efecto inmunosupresor del IBDV también disminuye la respuesta de los animales a vacunas contra otros patógenos aviares.

La importancia económica de la enfermedad está principalmente en estos dos aspectos: por una parte, la alta mortalidad producida por varias cepas de IBDV en pollos de 3 semanas de edad o incluso más y, por otra parte, la segunda indicación clínica de la enfermedad que consiste en una inmunosupresión prolongada de las aves infectadas en edades tempranas. Los principales efectos posteriores asociados a dicha inmunosupresión son: dermatitis gangrenosa, síndrome anemia-hepatitis con cuerpos de inclusión, infecciones de E. coli y fallos en la eficacia de otras vacunaciones tales como esas contra la enfermedad de Newcastle y bronquitis infecciosa.

El virus se transmite por el agua, alimento o excrementos, pero no hay transmisión vertical por los huevos y no hay portadores crónicos de esta enfermedad. Por tanto, el éxito en el control de la IBD está en la aplicación de higiene estricta y programas de desinfección de las instalaciones junto con la vacunación preventiva de los reproductores y descendientes. La inmunización de las aves reproductoras es especialmente importante para la transmisión de inmunidad pasiva a la descendencia; sin embargo, la presencia de dicha inmunidad pasiva puede interferir en la eficacia de la vacunación de la descendencia.

Los programas de vacunación contra el IBDV implican una doble acción: i) vacunación de gallinas ponedoras, y ii) vacunación de pollos de engorde. Las gallinas ponedoras reciben una dosis de vacuna inactivada a las 16 a 20 semanas de edad, seguido por una o más vacunaciones con una vacuna viva atenuada a diferentes intervalos de tiempo. El fin básico de esta vacunación es la transmisión a los descendientes de anticuerpos maternos capaces de neutralizar la infectividad del virus durante las primeras 3-4 semanas de la vida del pollo a través del saco vitelino. Desde las dos semanas de vida en adelante, los pollos se vacunan (con una o varias dosis) mediante la administración de vacuna viva atenuada en el agua de beber.

El IBDV es el prototipo del género Avabirnavirus de la familia Birnaviridae, un virus de ARN bicatenario (ARNbc). Los viriones de IBDV tienen un tamaño de aproximadamente 70 nm (60-65 nm), no tienen recubrimiento lipídico y tienen una simetría icosaédrica. El genoma tiene una capacidad de codificación para cinco proteínas VP1 , VP2, VP3, VP4 y VP5. La cápside está formada por la proteína VP2 mientras que los polipéptidos VP3 y VP1 (el último tiene actividad ARN polimerasa) se encuentran asociados al ARN del virión.

La respuesta sero lógica al virus está dirigida principalmente a la proteína VP2. De hecho, la mayoría de los anticuerpos monoclonales capaces de neutralizar la infectividad de IBDV reconocen epítopos conformacionales en la proteína VP2 y por tanto son anticuerpos neutralizantes. Se han descrito vacunas que contienen IBDV vivos atenuados (documento US 5.632.989) y vacunas con IBDV inactivados capaces de producir protección contra cepas silvestres.

Sin embargo, la administración de vacunas de birnavirus vivos puede producir la replicación de los virus de la vacuna en los huéspedes vacunados, lo que afecta a la maduración natural de su sistema inmunológico y reduce su capacidad de responder a otras vacunas. Además, la replicación de los virus de la vacuna en animales vacunados produce la liberación de grandes cantidades de virus infecciosos al medio ambiente y podría fomentar el establecimiento de infecciones persistentes en especímenes vacunados y, por último, la respuesta inmune generada por estas vacunas no permite la discriminación entre animales infectados y vacunados.

El uso de vacunas que contienen virus recombinantes vivos también genera preocupaciones de bioseguridad. La más importante concierne al surgimiento y la liberación medioambiental de nuevas cepas de virus generadas por recombinación entre los genomas de virus de vacuna y silvestres o por mutaciones en el genoma del virus recombinante.

Las VLP constituyen una alternativa al uso de vacunas vivas atenuadas y de vacunas recombinantes de subunidades. Las VLP se obtienen por autoensamblaje de las subunidades que forman la cápside vírica e imitan la estructura y propiedades antigénicas del virión nativo aunque carecen de material genético de modo que son incapaces de replicarse. Se han descrito vacunas recombinantes de subunidades que contienen la proteína VP2 de IBDV expresada en varios sistemas, por ejemplo, bacterias, levadura, virus, etc., normalmente en forma de proteínas de fusión (US 5.605.792, US 5.605.827). Por otra parte, se conoce la posibilidad de que VP2 forme VLP en combinación con todo o parte de VP3 de IBDV (US 5.788.970, Hu et al, 1999, Biotechnology and Bioengineering, 63(6), 721-729; Wang et al, 2000, Biotechnology and Bioengineering, 67(1), 104-111; Martinez-Torrecuadrada et al, 2000a, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 7 (4): 645-651; Martinez-Torrecuadrada et al, 2000b, Virology 278:322-331; Cheng et al, 2001 Biotechnol. Prog., 17, 318-325). Asimismo, se han descrito la obtención y uso de VLP de IBDV como vacunas, véase, por ejemplo, la patente de EE UU 5.788.970, publicaciones de patente WO2004087900, WO2005/071068, WO2005/071069 y WO2005/105834, solicitud española de patente P200501733, etc. Sin embargo, las vacunas basadas en VLP requieren sistemas de producción caros; muestran mala estabilidad a largo plazo y normalmente requieren la presencia de adyuvantes para que sean eficaces. Esto no solo aumenta los costes de la vacuna sino que también podría producir efectos secundarios citotóxicos e inflamatorios no deseados.

Se han obtenido composiciones inmunogénicas capaces de inducir una respuesta inmune hacia IBDV formando un complejo inmune mezclando una cierta cantidad de anticuerpos específicos obtenidos del suero de pollos hiperinmunizados con virus de vacuna de bursitis infecciosa vivo (IBDV) (Jeurissen et al, 1998, Immunology, 95:494- 500). Sin embargo, estos tipos de vacunas generan preocupaciones de bioseguridad debido, en particular, al surgimiento y liberación medioambiental de nuevas cepas de virus generadas por recombinación entre los genomas de virus de vacuna y silvestres o por mutación en el genoma del virus recombinante. Además, las vacunas basadas en complejos inmunes son caras de producir y su formulación plantea problemas técnicos especialmente los que conciernen a la reproducibilidad entre lotes.

Por tanto, todavía hay una necesidad para vacunas específicamente dirigidas hacia el antígeno vírico inmunodominante y que superen las desventajas de las vacunas conocidas hasta ahora.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Se ha observado ahora que, sorprendentemente, un conjugado que comprende el dominio PD de VP2 de IBDV y que carece de la región horquilla AA' del dominio PD, opcionalmente acoplado a una región capaz de dirigir dicho dominio PD de VP2 a células del sistema inmune, permite la producción de una vacuna capaz de inducir respuestas inmunes innatas y adaptativas, lo que produce respuestas inmunes exclusivamente enfocadas a un dominio crítico de proteína vírica (VP2-PD) , evitando de esta manera el efecto de dominancia inmune de polipéptidos víricos o dominios de polipéptidos irrelevantes. Este conjugado es adecuado para el desarrollo de vacunas que no son infecciosas, no requieren adyuvantes, requieren costes más bajos para su producción, muestran menos efectos secundarios de vacuna adversos y es manejable para liofilización, lo que proporciona así estabilidad de la vacuna a largo plazo. LEYENDAS DE LAS FIGURAS

La figura 1 es una representación de la topología de VP2 (izquierda) y del dominio de proyección de VP2 (derecha). Las flechas indican láminas β y las cintas indican hélices α. P, S y B indican, respectivamente, el dominio de proyección, el dominio de cubierta y el dominio base.

Figura 2: Esquema de los modelos antigénicos que incluyen el dominio P de VP2 de IBDV y diferentes elementos estimuladores de la respuesta inmune.

Figura 3 A: SDS-PAGE de P HT mAV purificada teñida con coomassie. B: Inmunotransferencia de la proteína purificada detectada con anticuerpo policlonal anti- avidina de conejo (1 : 1000) seguido por anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa (1 :5000). Carril 1 : marcadores de peso molecular; carril 2 : proteína purificada.

Figura 4: Electroforesis nativa de conjugados formados por combinación de P HT mAV y CpG biotinilado a diferentes relaciones en un gel de agarosa al 0,7% transferido a nitrocelulosa. La proteína nativa se detectó con anticuerpo policlonal de conejo anti-VP2 (1 : 1000) y anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado a peroxidasa (1 : 10000).

Figura 5: A: SDS-PAGE de la proteína FlagA HT P purificada, teñido con azul de coomassie. B: Western-blot de la proteína purificada detectada con suero de conejo Anti-VP2 (1 : 1000) y revelado con un anticuerpo conjugado a peroxidasa "anti- rabbit" (1 :5000).

Figura 6: A: SDS-PAGE de la proteína IgYFc2-4_HT_P purificada, teñido con azul de coomassie. B: Western-blot de la proteína purificada detectada con suero de conejo Anti-VP2 (1 : 1000) y revelado con un anticuerpo conjugado a peroxidasa "anti- rabbit" (1 :5000).

Figura 7: A: SDS-PAGE de la proteína IgY-Fcu3-4_HT_P purificada, teñido con azul de coomassie. B: Western-blot de la proteína purificada detectada con suero de conejo Anti-VP2 (1 : 1000) y revelado con un anticuerpo conjugado a peroxidasa "anti- rabbit" (1 :5000).

Figura 8: A: SDS-PAGE de la proteína Pgm97_mAV_HT purificada, teñido con azul de coomassie. B: Western-blot de la proteína purificada detectada con suero de conejo Anti-avidina (1 : 1000) y revelado con un anticuerpo conjugado a peroxidasa "anti-rabbit" (1 :5000).

Figura 9: Ensayo de protección de pollos infectados por IBDV por la administración de P HT mAV (VP2-P) o VP2-P acoplada a CpG-ODN biotinilado (VP2-P).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

1. Polipéptidos de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que contiene un dominio P de VP2 de birnavirus que carece de la región horquilla AA'.

Como se usa aquí, el término "polipéptido" se refiere a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y están unidos a través de enlaces peptídicos o disulfuro.

Como se usa aquí, el término "birnavirus" se refiere a cualquier virus que pertenece a la familia Birnaviridae que son virus de tipo III en la clasificación de Baltimore, lo que significa que tienen un genoma de ARN bicatenario. La familia Birnaviridae incluye los géneros Aquabirnavirus (por ejemplo, virus de la necrosis pancreática infecciosa); el Avibirnavirus (por ejemplo, virus de la bursitis infecciosa); el Blosnavirus (por ejemplo, el virus cabeza de serpiente moteado) y el Entomobirnavirus (por ejemplo, virus X de Drosophila).

En una forma de realización preferida, el birnavirus es un avibirnavirus. En una forma de realización aún más preferida, el avibirnavirus es IBDV. El término "virus de la bursitis infecciosa" (IBDV), como se usa aquí, abarca todas las cepas de IBDV y todos los serotipos y variantes de los mismos, incluyendo formas vivas, atenuadas, muertas o inactivadas de otra manera, que pertenecen a cualquiera de los serotipos conocidos (1 o 2) [a modo de ilustración véase la revisión por van den Berg TP et al. (2000)].

En otra forma de realización preferida, el birnavirus es un aquabirnavirus. En una forma de realización aún más preferida, el aquabirnavirus es IPNV. El término "virus de la necrosis pancreática infecciosa" (IPNV), como se usa aquí, abarca todas las cepas de IPNV y todos los serotipos y variantes de los mismos, incluyendo formas vivas, atenuadas, muertas o inactivadas de otra manera que pertenecen a cualquiera de los sero tipos conocidos.

Como se usa aquí, el término "VP2 de birnavirus (o pVP2)" en general se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos comprende o está formada por la secuencia de aminoácidos de VP2 de birnavirus de cualquier birnavirus así como proteínas que son sustancialmente homologas a dichas proteínas pVP2 de IBDV, es decir, proteínas que tienen un buen alineamiento con la secuencia de cierta pVP2 de IBDV, por ejemplo, proteínas cuya secuencia de aminoácidos tiene un grado de libertad con respecto a dichas proteínas de IBDV pVP2 de al menos el 60%, preferiblemente de a l menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90% e incluso más preferiblemente de al menos el 95%. Las secuencias que son homologas a secuencias de la proteína pVP2 de birnavirus las puede identificar fácilmente un experto en la materia con ayuda de un programa informático adecuado para comparar secuencias, por ejemplo, el programa BLAST (Altschul et al. (1997)). En una forma de realización particular, la proteína pVP2 de IBDV es la proteína pVP2 de IBDV de la cepa Soroa cuya secuencia de aminoácidos, longitud completa, está depositada en el NCBI con el número de acceso AAD30136. Se ha descrito que las proteínas VP2 encontradas en diferentes cepas de IBDV presentan una homología de secuencia de proteína de más del 80 por ciento. Las proteínas VP2 de otros birnavirus comparten homologías con IBDV del 40 por ciento para birnavirus acuáticos y del 30 por ciento para birnavirus de Drosophila [Coulibaly F. et al, Cell, 2005, 120:761-772]. La preproteína VP2 de IBDV comprende los aminoácidos 1-5 12 de la poliproteína VP2-3-4 como se define en el número de acceso de UniProt Q82635 (versión 47 del 1 1 de enero de 201 1 ). La VP2 madura comprende los aminoácidos 1-441 de la poliproteína VP2-3-4 como se define en el número de acceso de UniProt Q82635 (versión 47 del 1 1 de enero de 201 1).

El término "dominio P", usado aquí indistintamente con "dominio de proyección" o "PD" se refiere a un barril β con topología de tipo remolino y que comprende las hélices β B, C, D, E, F, G, H e I (véase la figura 1). En una forma de realización preferida, el dominio P comprende la secuencia de hélices α B, C, D, E, F y G y los bucles de interconexión BC, CD, DE, EF y FG. Preferiblemente, el polipéptido de la invención carece del dominio de cubierta (S) de VP2 y/o del dominio base (B) de VP2 (véase, la figura 1). En una forma preferida de realización, el polipéptido que contiene un dominio P de VP2 de birnavirus y que carece de la región horquilla AA' no es el fragmento de VP2 de la cepa NN050057 de IBDV que se muestra en la secuencia descrita en la base de datos UniProt con número de acceso Q0Z9Y2 IBVB (versión de Mayo de 2006).

En una forma preferida de realización, el polipéptido que contiene un dominio P de VP2 de birnavirus y que carece de la región horquilla AA' no es el fragmento de VP2 de la cepa YY2 de IBDV que se muestra en la secuencia descrita en la base de datos UniProt con número de acceso Q0Z9X7 IBDV (versión del 22 de agosto de 2006).

En una forma de realización más preferida, el dominio P es de IBDV y comprende la secuencia:

1 SDRPRVY IT AADDYQFSSQ YQPGGVTITL FSANIDAITS LSVGGELVFR

51 TSVHGLVLGA TIYLIGFDGT TVITRAVAAN NGLTTGTDNL MPFNLVIPTN

101 EITQPITSIK LEIVTSKSGG QAGDQMSWSA RGSLAVTIHG G (SEQ ID NO: 1 o la secuencia

1 SDRPRVYTIT AADDYQFSSQ YQPGGVTITL FSANIDAITS LSVGGELVFR

51 TSVHGLVLGA TIYLIGFDGT TVITRAVAAN NGLTTGTDNL MPFNLVIPTN

101 EITQPITSIK LEIVTSKSGG QAGDQMSWSA RGSLAVTIH (SEQ ID NO:2) en donde la regiones subrayadas corresponden, respectivamente desde el extremo N al C, a las hélices β B, C, D, E, F, G, H e I.

Las secuencias correspondientes al dominio P en las proteínas VP2 de los virus de la familia Birnaviridae se pueden determinar identificando regiones que muestran sustancial similitud de secuencia con las secuencias del dominio P en VP2 de IBDV usando cualquier herramienta disponible para determinar la identidad de secuencia.

Para los fines de la presente invención, la "identidad" de secuencia se determina objetivamente por cualquiera de un número de métodos. El experto en la materia conoce bien estos métodos y puede elegir un método adecuado sin una carga excesiva. Una variedad de métodos para determinar relaciones entre dos o más secuencias (por ejemplo, identidad, similitud y/o homología) están disponibles y se conocen bien en la técnica. Los métodos incluyen alineamiento manual, alineamiento de secuencias ayudado por ordenador y combinaciones de los mismos, por ejemplo. Un número de algoritmos (que en general están implementados en ordenador) para realizar el alineamiento de secuencias están ampliamente disponibles o los puede producir el experto en la materia. Estos métodos incluyen, por ejemplo, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. Appl. Math.; 2:482; el algoritmo de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol.; 48:443; el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA; 85:2444, y/o implementaciones computarizadas de estos algoritmos (por ejemplo, GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA, en Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Por ejemplo se describe software para realizar análisis de identidad de secuencia (y similitud de secuencia) usando el algoritmo BLAST en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Este software está públicamente disponible, por ejemplo, a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología en la World Wide Web en ncbi.nlm.nih.gov. Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencia de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que corresponde o satisface alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una base de datos de secuencias. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina. Estos aciertos iniciales de palabra vecina actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tan lejos como se pueda aumentar la puntuación acumulada de alineamiento. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos que se corresponde; siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos que no se corresponden; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se paran cuando: la puntuación acumulada de alineamiento disminuye en la cantidad X de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un valor de corte de 100, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP (BLAST Protein) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (B) (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA; 89: 10915).

Además, el algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA; 90:5873- 5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (p(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia al azar entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera un ácido nucleico similar a una secuencia de referencia (y, por tanto, en este contexto, homólogo) si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba con el ácido nucleico de referencia es menor de alrededor de 0,1, o menor de alrededor de 0,01 , y/o incluso menor de alrededor de 0,001.

Otro ejemplo de un algoritmo de alineamiento de secuencia útil es PILEUP. PILEUP crea un alineamiento múltiple de secuencia a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos progresivos, por pares. También puede representar un árbol que muestra las relaciones de grupo usadas para crear el alineamiento. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5 : 151-153. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras. El procedimiento de alineamiento múltiple empieza con el alineamiento por pares de las dos secuencias más similares, lo que produce un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo se puede alinear luego con la siguiente secuencia o grupo de secuencias alineadas más relacionadas. Se pueden alinear dos grupos de secuencias mediante una extensión simple del alineamiento por pares de dos secuencias individuales. El alineamiento final se alcanza por una serie de alineamientos progresivos por pares. El programa también se puede usar para representar un dendograma o representación en árbol de relaciones de grupo. El programa se corre diseñando secuencias específicas y sus coordinadas de aminoácidos o nucleótidos para regiones de comparación de secuencias. Un ejemplo adicional de un algoritmo que es adecuado pata alineamientos de secuencia múltiples de ADN o aminoácidos es el programa CLUSTALW (Thompson, J. D. et al. (1994) Nucí. Acids. Res. 22: 4673-4680). CLUSTALW realiza comparaciones múltiples por pares entre grupos de secuencias y los ensambla en un alineamiento múltiple basado en homología. Las penalización por apertura de brecha y extensión de brecha pueden ser, por ejemplo, 10 y 0,05 respectivamente. Para alineamientos de aminoácidos, se puede usar el algoritmo BLOSUM como una matriz de peso de proteínas. Véase, por ejemplo, Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919.

El alineamiento de las secuencias de diferentes virus de la familia Birnaviridae usando el algoritmo CLUSTALW produce el siguiente alineamiento múltiple de secuencias.

CLUSTAL 2.1 alineamiento múltiple de secuencias

IBDV MTNLQDQTQQIVPFIRSLLMPTTGPASIPDDTLEKHTLRSETSTYNLTVGDTGSGLIVFF 60

BSNV - DFSKENTQIR-YLNSLLVPETGSTSIPDDTLDRHCLKTETTTENLVAALGGSGLIVLF 58

IPNV NTNKATATYLKSI LPETGPASIPDDITERHILKQETSSYNLEVSESGSGVLVCF 56

DRXV NTTNEYLKTLLNPAQFISDIPDDIMIRHV SAQTITYNLKSGASGTGLIWY 53

::.::: * **** ·* ·* · ** *.*··* ·

IBDV PGFPGSIVGAHYTLQSNGN-YKFDQ LLTAQNLPASYNYCRLVSRSLTVRSSTLPGGVYA 119

BSNV PNSPSGLLGAHYTKTPQGS-LIFDKAITTSQDLKKAYNYARLVSRIVQVRSSTLPAGVYA 117

IPNV PGAPGSRIGAHYR NANQTGLEFDQWLETSQDLKKAFNYGRLISRKYDIQSSTLPAGLYA 116

DRXV PNTPSSISGFHYIWDSATSNWVFDQYIYTAQELKDSYDYGRLISGSLSIKSSTLPAGVYA 113

* ** **· *·*·* :::* **;* ··***** *·**

IBDV LNGTINAVTFQGSLSELTDVSYNGLMSATANINDKIGNVLVGEGVTVLSLPTSYDLGYVR 179

BSNV LNGTFNGVTYIGSLSEIKDLDYNSLLSATANINDKVGNVLVGDGVAVLSLPAGSDLPYVR 177

IPNV LNGTLNAATFEGSLSEVESLTYNSLMSLTTNPQDKVNNQLVTKGVTVLNLPTGFDKPYVR 176

DRXV LNGTFNAVWFQGTLSEVSDYSYDRILSITSNPLDKVGNVLVGDGIEVLSLPQGFNNPYVR 173

*★**·*_ *·***· *· _{; ;} * *·* **· * ** *· ** ** ***

IBDV LGDPIPAIGLDP-KMVATCDSSDI PRVYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSANIDAIT

BSNV LGDEVPSS AGVARCSPSDI PRHYNAN NKQVQVGTTDTKTNGFNIDATT

IPNV LEDETPQGLQS NGAK RCTAAI/ PRRYEIDLPS--QRLPPVPATGTLTTLYEGNADIVN

DRXV LGDKSPSTLSSPTHITNTSQNLAI GGAYMIP VTTVPGQGFHNKEFSINVDSVG

* * *

IBDV SLSVGGELVF QTSVHGLVLGATIYLIGFDG-TAVITRAVAANNGLTTGTDNLLPFN

BSNV PTEVTVDMQI AQIAAGKTLTVTVKLMGLTG-AKVASRSETVSG NGGTFHFSTT

IPNV STTVTGDINFSLA-EQPADETKFDFQLDFMGLDNDVPWTWSSVLATNDNYRGVSAKMT

DRXV PVDILWSGQMTMQDEWTVTANYQPLNISGTLIANSQRTLTWSNTGVSNGSHY N NNLNV

IBDV VAYERVATGSWTVAGVSNFELIPNPELAKNLVTEYGRFDPGAMNYTKLILSERDRLGIK 411 BSNV IAYESVATGSVLTLSGISNYELIPNPELAKNIQTSYGKLNPAEMTYTKWLSHRDELGLR 387

IPNV VAYEKMTPLSILTVAGVSNYELIPNPELLKNMVTRYGKYDPEGLNYAKMILSHREELDIR 412

DRXV VGYQGVAEGTAITISGINNYELVPNPDLQKNLPMTYGTCDPHDLTYIKYILSNREQLGLR 401 IBDV TVWPTREYTDFREYF EVADLNSPLKIAGA 441 (SEQ ID NO:3)

BSNV SIWSIPQYRD MSYFREVSDRSSPLKIAGA 417 (SEQ ID NO:4)

IPNV TVWRTEEYKERTRVFNEITDFSSDLPTSKA 442 (SEQ ID NO:5)

DRXV SVMTLADYNRMKMY HVLTNYHVDEREASS 431 (SEQ ID NO:6)

• * en donde la región marcada corresponde al dominio P que carece de la región horquilla

AA'.

El término "horquilla AA'", como se usa aquí, se refiere a una estructura de horquilla β que forma una solapa que invade y complementa el barril β del dominio P vecino.

El término horquilla β, como se usa aquí, se refiere a un motivo proteico que consiste en dos hebras beta que están adyacentes en la estructura primaria orientadas en un arreglo antiparalelo (donde el extremo N de una lámina está adyacente al extremo C de la siguiente) y unidas por un bucle corto de dos a cinco aminoácidos.

En una forma de realización preferida, la horquilla AA' es la de VP2 de IBDV que consiste en los aminoácidos 181 a 200. Los bucles de la horquilla AA' de otros virus de la familia Birnaviridae se pueden identificar por comparación de secuencias con las secuencia de VP2 de IBDV usando las herramientas descritas anteriormente.

2. Conjugados y kit de partes de la invención

En un segundo aspecto, la invención se refiere a un conjugado o kit de partes que comprende

(i) un primer componente que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus en donde dicho primer componente carece de la región horquilla AA' y

(ii) un segundo componente que es un agente co estimulador inmune.

El término "conjugado", como se usa aquí, se refiere a dos o más compuestos que están unidos de modo que la función de cada compuesto se mantiene en el conjugado. Como se describirá en detalle posteriormente, la unión entre el primer y el segundo componente del conjugado puede ser covalente o no covalente.

El experto en la materia observará que el primer y segundo componentes del conjugado se pueden proporcionar formando tal conjugado o, de forma alternativa, se pueden presentar como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que se pueden combinar para uso conjunto como una preparación combinada. De esta manera, la invención también se refiere a un kit de partes en donde el primer y el segundo componentes se formulan y empaquetan de forma individual.

2. A. Primer componente del conjugado de la invención

El primer componente del conjugado según la presente invención comprende el dominio P de un polipéptido VP2 de birnavirus, en donde dicho primer componente carece de la región horquilla AA'.

Los elementos del primer componente del conjugado de la invención corresponden al polipéptido de la invención y por tanto, se han descrito anteriormente en detalle.

2.B. Segundo componente del conjugado de la invención

El segundo componente de los conjugados según la invención es un agente coestimulador inmune. Preferiblemente, dicho agente coestimulador no es una región de dicha VP2 de birnavirus.

El término "polipéptido coestimulador inmune", como se usa aquí, significa cualquier molécula que aumenta la respuesta inmune de un individuo contra el primer componente.

2.B.I. Agonistas de TLR

En una forma de realización preferida, el agente coestimulador inmune es un agonista de TLR.

El término "agonista de TLR", como se usa aquí, se refiere a un componente que es capaz de producir una respuesta de señalización a través de una ruta de señalización de TLR, bien como un ligando directo o de forma indirecta mediante la generación de ligando endógeno o exógeno (Sabroe et al, JI 2003 p 1630-5). Los ligandos agonistas de los receptores TLR son: (i) ligandos naturales del receptor TLR real, o una variante funcionalmente equivalente de los mismos que conserva la capacidad de unirse al receptor TLR e inducir señales de coestimulación en el mismo, o (ii) un anticuerpo agonista contra el receptor TLR, o una variante funcionalmente equivalente del mismo capaz de unirse específicamente al receptor TLR y, más en particular, al dominio extracelular de dicho receptor, e inducir algunas de las señales inmunes controladas por este receptor y proteínas asociadas. La especificidad de unión puede ser para el receptor TLR humano o para un receptor TLR homólogo al humano de una especie diferente.

Los receptores de tipo Toll (o TLR) son una familia de proteínas transmembrana de tipo I que forman parte del sistema inmune innato. En vertebrados también permiten la adaptación del sistema inmune. Los TLR junto con los receptores de interleuquina forman una superfamilia conocida como la superfamilia de receptores de Interleuquina- 1/de tipo Toll. Todos los miembros de esta familia tienen en común el dominio denominado el dominio del receptor Toll-IL-1 (TIL). Se ha estimado que la mayoría de los mamíferos tienen entre 10 y 15 tipos de TLR. Se han identificado trece tipos de TLR hasta ahora en seres humanos y ratones (Du X, et al. 2000, Eur.Cytokine Netw. 11 : 362- 71; Chuang TH. et al, 2000. Eur. Cytokine Netw. 11 : 372-378; Tabeta K, et al; 2004, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 101 :3516-3521).

Los agonistas de TLR inducen varias respuestas inmunes dependiendo de las células en que se expresa el TLR así como dependiendo del origen del ligando de TLR. Por ejemplo, en el caso de ligandos microbianos, las células inmunes pueden producir citoquinas que producirán inflamación. En el caso de un factor vírico, las células pueden sufrir apoptosis.

En una forma de realización de la presente invención, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-1. Ejemplos no limitantes de agonistas de TLR-1 incluyen lipopéptidos triacilados (LP); modulinas solubles en fenol; LP de Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-bis(palmitoiloxi)-(2-RS)- propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, triclorhidrato (Pam3Cys) LP que imita el extremo amino acetilado de una lipoproteína bacteriana y OspA LP de Borrelia burgdorfei.

En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-2. Ejemplos no limitantes de agonistas de TLR-2 incluyen, sin limitación, uno o más de un lipopéptido bacteriano de M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. pallidum; peptidoglicanos de especies que incluyen Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicoicos, ácidos manurónicos, porinas de Neisseria, fimbras bacterianas, factores de virulencia de Yersina, viriones de CMV, hemaglutinina de sarampión y zimosano de levadura. En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-3, tal como ARN bicatenario o ácido poliinosínico-policitidílico (poli I:C).

En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-4, tal como lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gram negativas o fragmentos del mismo; proteína de choque término (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 o 90; surfactante proteína A; oligosacáridos de ácido hialurónico, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, péptidos de fibrinógeno y b-defensina-2. En una forma de realización el agonista de TLR es HSP 60, 70 o 90. En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-4 es un derivado no tóxico de LPS tal como monofosforil lípido A (MPL) como describen Ribi et al (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419) y que tiene la estructura:

Una versión adicionalmente detoxificada de MPL resulta de la eliminación de la cadena acilo de la posición 3 del esqueleto disacárido y se denomina monofosforil lípido A 3-0-desacilado (3D-MPL).

Los derivados no tóxicos de LPS, o lipopolisacáridos bacterianos, que se pueden usar como agonistas de TLR en la presente invención se pueden purificar y procesar de fuentes bacterianas, o de forma alternativa pueden ser sintéticos. Por ejemplo, el monofosforil lípido A purificado descrito en Ribi et al 1986 (supra) y monofosforil o difosforil lípido A 3-0-desacilado derivados de Salmonella sp. se describen en los documentos GB 222021 1 y US 4912094. Se han descrito otros lipopolisacáridos purificados y sintéticos (US 6.005.099 y EP 0 729 473 B l ; Hilgers et al., 1986, IntArch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6; Hilgers et al, 1987, Immunology, 60(1): 141- 6; y EP 0 549 074 B l). Los adyuvantes lipopolisacáridos bacterianos pueden ser 3D- MPL y los disacáridos 0(1-6) glucosamina descritos en los documentos US 6.005.099 y EP 0 729 473 B l . Según esto, otros derivados de LPS que se pueden usar como agonistas de TLR en la presente invención son esos inmunoestimulantes que son similares en estructura a la del LPS o MPL o 3D-MPL. En otro aspecto de la presente invención los derivados de LPS pueden ser un monosacárido acilado, que es una subparte de la estructura anterior de MPL. Un disacárido agonista puede ser un lípido A purificado o sintético de la fórmula siguiente:

en donde R ² puede ser H o P0 ₃ H ₂ ; R ³ puede ser una cadena acilo o 8-hidroximiristoilo o un residuo 3-aciloxiacilo que tiene la fórmula:

en donde R4 es

O y X e Y tienen un valor de 0 hasta 20.

Un derivado no tóxico adicional de LPS, que comparte poca homología estructural con LPS y es puramente sintético es el descrito en el documento WO 00/00462, el contenido del cual se incorpora aquí mediante referencia.

En una forma de realización preferida, el agente coestimulador inmune es un ligando de TLR específico para TLR5 y, más en particular, flagelina o una variante funcionalmente equivalente de la misma.

Las flagelinas adecuadas para su uso según la presente invención incluyen la flagelina codificada por el gen fljB de Salmonella entérica serovar Typhymurium LT2 así como cualquier flagelina de cepas de Salmonella entérica que se conocen y están públicamente disponibles en GenBank. Secuencias ejemplares incluyen, pero no están limitadas a los números de acceso de GenBank AB108532, AY352264, AY353263, AY353262, AY353285, AY353284, AY353283, AY353282, AY353281 , AY353280, AY353279, AY353278, AY353277, AY353276, AY353275, AY353274, AY353273, AY353272, AY353271 , AY353271 , AY353269, AY353268, AY353267, AY353266, AY353265, AY353307, AY353306, AY353305 y AY353303. Además, se pueden usar otros tipos de flagelina de especies de Salmonella, siempre que las flagelinas puedan funcionar como un adyuvante en un polipéptido de fusión. Por ejemplo, se puede usar la flagelina fase 1 codificada por el gen fliC. Secuencias ejemplares del gen fliC están disponibles en GenBank e incluyen, pero no están limitadas a, AY353368, AY353367, AY353366, AY353365, AY353364, AY353363, AY353362, AY353361, AY353360, AY353359, AY353358, AY353357, AY353356, AY353355, AY353354, AY353353, AY35352, AY353351, AY353350 y AY353349. Además, las flagelinas de otras especies de Salmonella, incluyendo flagelinas que tienen funciones similares a las codificadas por los genes fliB y fliC, se conocen bien y se pueden usar de forma similar como polipéptidos de fusión con un antígeno para estimular una respuesta inmune. En GenBank están disponibles secuencias ejemplares de flagelina e incluyen, pero no están limitadas a, AY353261 , AY353260, AY353259, AY353258, AE008826, D 12510, AJ295701 , AJ295700, AJ295699, AJ295698, AJ295697, AJ295696, AF045 151 , U17177, U17176, U17175, U17174, U17172, U17171, D13690 y D13689. Además, el componente de flagelina puede incluir al menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en un componente de flagelina de E. coli, un componente de flagelina de S. muenchen, un componente de flagelina de Yersinia, un componente de flagelina de Campylobacter, un componente de flagelina de P. aeruginosa y un componente de flagelina de L. monocytogenes.

En una forma de realización preferida, la flagelina es la flagelina A de AUivibrio salmonicida. En una forma de realización aún más preferida, el componente de flagelina A comprende la secuencia

1 VNVNTNVAAM TAQRYLNNAT NDLNNSMERL SSGTKINSAK DDAAGLQISN RLTAQTRGLD

61 VAMRNANDGI SIAQTAEGAM NESTNILQRM RDLSLQAANG SNSNQDRSSI QEEVHALSDE

121 LNRIAETTSF GGRRLLNGQF GESAFQIGAN SGEAILIKLP SVRSDDDSMG GQRFVSENGK

181 TAEWNVETGK NDLKLEFTTK KGEAVSININ AKAGDDIEEL ATYINGQSDK ISASVGDEGK

241 LQLFVAEPSI EGELAVSGNL ASELGLAGGV GTKATVDKLD VTSVGDAQVS IGVIDSALAY 301 IDRERADLGA KQNRLGHSIN NLSNIQENVS ASNSRIKDTD FAKETTNMTK AQILQQSSTS

361 ILAQAKQLPN AALKLLQ (SEQ ID NO: 7)

El término "variante funcionalmente equivalente", como se usa aquí, se refiere a cualquier polipéptido que provenga de la modificación por inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos de las moléculas de flagelina mencionadas anteriormente y que mantienen sustancialmente la misma actividad agonística de TLR5 de flagelina.

En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-6 tal como lipoproteína micobacteriana, LP diacilado y modulina soluble en fenol. Se describen agonistas adicionales de TLR6 en el documento WO2003043572.

En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-7, tal como loxorribina, un análogo de guanosina en las posiciones N7 y C8, o un compuesto imidazoquinolina, o derivado del mismo. En una forma de realización, el agonista de TLR es imiquimod. Se describen agonistas adicionales de TLR7 en el documento WO02085905.

En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-8, tal como una molécula imidazoquinolina con actividad antivírica, por ejemplo, resiquimod (R848); resiquimod también puede ser reconocido por TLR-7. Otros agonistas de TLR-8 que se pueden usar incluyen los descritos en el documento WO2004071459. En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR-9, tal como un ADN que contiene nucleótidos CpG sin metilar, en particular contextos de secuencia conocidos como motivos CpG. Los oligonucleótidos que contienen CpG inducen una respuesta predominantemente Thl . Tales oligonucleótidos se conocen bien y se describen, por ejemplo, en WO 96/02555, WO 99/33488 y las patentes de EE UU Nos. 6.008.200 y 5.856.462. En una forma de realización, los nucleótidos CpG son oligonucleótidos CpG. En una forma de realización preferida, el oligonucleótido CpG comprende la secuencia 5'-TCGTCGT T T TGTCGT T T TGTCGT T-3' (SEQ ID NO:8). En una forma de realización aún más preferida, el oligonucleótido CpG contiene enlaces fosforotioato.

En una forma de realización alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de TLR- 10. De forma alternativa, el agonista de TLR es capaz de producir una respuesta de señalización a través de cualquier combinación de dos o más de los TLR anteriores.

"Célula inmune" como se usa aquí, incluye cualquier célula que está implicada en la generación, regulación o efecto del sistema inmune adquirido o innato. Las células inmunes incluyen células T, tales como células CD4+, células CD8+ y otros varios subconjuntos de células T, células B, células citolíticas naturales, macrófagos, monocitos y células dendríticas, y neutrófilos.

2.B.II. Polipéptidos que se unen al receptor de Fe (FcR)

El segundo de los componentes de los conjugados según la invención también puede ser un polipéptido que se une al receptor de Fe (FcR). Esto permite que la región VP2 del conjugado se presente a células presentadoras de antígeno (CP A) una vez que el conjugado se une a la CPA a través de la interacción con los receptores de Fe en la superficie de la CPA (Lanza et al, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 11683-11687).

El término "receptor de Fe" o "FcR", como se usa aquí, se refiere a una proteína capaz de unirse específicamente a una parte de un anticuerpo conocida como Fe (fragmento cristalizable). FcR se encuentra en la superficie de ciertas células - incluyendo células citolíticas naturales, macrófagos, neutrófilos y células cebadas- que contribuyen a las funciones protectoras del sistema inmune. Su nombre deriva de su región. Polipéptidos de unión a FcR preferidos incluyen el segmento Fe de una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina así como una variante funcionalmente equivalente de la misma.

Como se usa aquí, el término "región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina" se usa de forma intercambiable con el término "región Fe" y se entiende que significa la parte carboxilo terminal de una región constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina, o un análogo o parte de la misma capaz de unirse a un receptor de Fe.

Como se sabe, cada región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende cuatro o cinco dominios. Los dominios se denominan secuencialmente como sigue: CHl-bisagra-CH2— CH3— CH4. CH4 está presente solo en IgY y por tanto es responsable del mayor peso molecular de esta molécula con respecto a IgG. La región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina útil en la práctica de la invención preferiblemente comprende una región bisagra de inmunoglobulina, y preferiblemente también incluye un dominio CH3. La región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina lo más preferiblemente comprende un región bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3. Como se usa aquí, el término "región bisagra" de inmunoglobulina se entiende que significa una región bisagra de inmunoglobulina entera o al menos una parte de la región bisagra de la inmunoglobulina suficiente para formar uno o más puentes disulfuro con una segunda región bisagra de inmunoglobulina.

Diferentes clases de inmunoglobulinas pueden ser adecuadas para su uso en la presente invención. La clase o 'isotipo' de un anticuerpo se define por su cadena pesada, y en particular la secuencia de la región de la cadena pesada. En particular, las inmunoglobulinas del isotipo IgG son las más preferidas, sin embargo anticuerpos de los isotipos IgA, IgM, IgE, IgD, IgM e IgY también pueden tener utilidad en varias formas de realización adicionales de la presente invención.

En ciertas formas de realización, la inmunoglobulina deriva de la misma especie que se va a tratar con el inmunoconjugado para minimizar que la parte del péptido de unión al receptor de FcR del inmunoconjugado sea inmunogénico. De esta manera, para tratar enfermedades en aves, sería preferido un dominio Fe o una secuencia de aminoácidos derivada de una inmunoglobulina aviar. En una forma de realización preferida, el polipéptido de unión a FcR es el Fe de IgY (inmuno globulina de yema). Estas definen inmuno globulinas que se extraen de yema de huevo de huevos de aves de corral y que corresponde a la IgG en el suero de los pollos. Estas inmunoglobulinas aviares se distinguen estructuralmente de la IgG de mamífero principalmente por su mayor peso molecular resultante de un mayor número de regiones constantes en el fragmento Fe. La región Fe de IgY comprende 4 dominios conocidos como Fe υΐ, Fe υ2, Fe υ3 y Fe υ4.

En una forma de realización preferida, el Fe de IgY comprende las regiones Fe υ2, Fe υ3 y Fe υ4. En una forma de realización aún más preferida, la región Fe de IgY comprende la secuencia

1 VCRVDPVPPV APEVQVLHPS SCTPSQSESV ELLCLVTGFS PASAEVEWLV

51 DGVGGLLVAS QSPAVRSGST YSLSSRVNVS GTDWREGKSY SCRVRHPATN

1 01 TWEDHVKGC PDGAQSCSPI QLYAI PPSPG ELYI SLDAKL RCLWNLPSD

151 SSLSVTWTRE KSGNLRPDPM VLQEHFNGTY SASSAVPVST QDWLSGERFT

2 01 CTVQHEELPL PLSKSVYRNT GPTTPPLIYP FAPHPEELSL SRVTLSCLVR

251 GFRPRDIE IR WLRDHRAVPA TEFVTTAVLP EERTANGAGG DGDTFFVYSK

301 MSVETAKWNG GTVFACMAVH EALPMRFSQR TLQKQAGK ( SEQ I D NO : 9 ) en donde las secuencias subrayadas corresponden, respectivamente desde el extremo N al extremo C, los dominios Fe υ2 y Fe υ4.

En otra forma de realización preferida, la región Fe de IgY usada en los conjugados de la invención comprende las regiones Fe υ3 y Fe υ4. En una forma de realización aún más preferida, la región Fe de IgY comprende la secuencia

1 GCPDGAQSCS PIQLYAI PPS PGELYI SLDA KLRCLWNLP SDSSLSVTWT

51 REKSGNLRPD PMVLQEHFNG TYSASSAVPV STQDWLSGER FTCTVQHEEL

1 01 PLPLSKSVYR NTGPTTPPLI YPFAPHPEEL SLSRVTLSCL VRGFRPRDIE

151 IRWLRDHRAV PATEFVTTAV LPEERTANGA GGDGDTFFVY SKMSVETAKW

2 01 NGGTVFACMA VHEALPMRFS QRTLQKQAGK ( SEQ I D NO : 1 0 ) que está formada por Fe υ3 y υ4 de IgY y además comprende los 8 aminoácidos del dominio Fe υ2 para conservar un residuo de C que podría estar implicado en el plegamiento de la proteína a través de un enlace disulfuro junto con el primer residuo de C del dominio Fe υ3.

Los dominios de la región constante de la cadena pesada de la inmuno globulina tienen homología cruzada entre las clases de inmunoglobulina. Las regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina preferidas incluyen dominios proteicos que corresponden a una o más regiones de la IgY seleccionadas del grupo que consiste en la región CH1 , la región CH2, la región CH3 y la región CH4 o partes o derivados funcionales de las mismas. Las regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina, sin embargo, preferiblemente carecen de al menos el dominio CH1.

En una forma de realización más preferida, la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende, en dirección de N a C terminal, una región bisagra de inmunoglobulina, un dominio CH2 y un dominio CH3 todos los cuales se basan en secuencias de una molécula de IgG. La elección de regiones constantes de la cadena pesada de la inmunoglobulina se discute en detalle en las patentes de EE UU No. 5.541.087 y 5.726.044. La elección de secuencias particulares de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ciertas clases y subclases de inmunoglobulinas para alcanzar un resultado particular se considera que está dentro del nivel destreza en la materia.

Puede ser útil, en algunas circunstancias, modificar la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, por ejemplo, por mutación, deleción u otros cambios mediados por ingeniería genética u otros planteamientos, de modo que ciertas actividades, tal como fijación del complemento o estimulación de la citotoxicidad celular mediada por anticuerpo (ADCC) se reduzcan o eliminen. Sin embargo, se considera necesario que se mantenga la capacidad de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de unirse a un receptor de Fe. En la práctica de esta invención, el componente de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina de los conjugados que comprenden Fe según la invención es no inmunogénico o débilmente inmunogénico en el receptor deseado. La región Fe se considera no o débilmente inmunogénica si la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina deja de generar una respuesta de anticuerpos detectable dirigida contra la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Según esto, la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina debe derivar de inmunoglobulinas presentes, o basarse en secuencias de aminoácidos correspondientes a inmuno globulinas presentes en la misma especie que el receptor deseado de la proteína de fusión. En otras palabras, se deben usar secuencias de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana cuando la construcción de fusión de Fe (la proteína de fusión Fc-antígeno y/o Fc-adyuvante) se va a administrar a un ser humano. Se divulgan secuencias de nucleótidos y aminoácidos de IgG Fe humano, por ejemplo en, Ellison et al. (1982) NUCLEIC ACIDS RES. 10:4071-4079. Asimismo, se deben usar secuencias murinas de Fe cuando la fusión de Fe se va a administrar a ratones. Se divulgan secuencias de nucleótidos y aminoácidos de IgG2a Fe murina, por ejemplo, en Bourgois et al. (1974) EUR J. BIOCHEM. 43:423-435. La misma lógica se aplicaría si las proteínas de fusión de Fe se fueran a administrar a otros animales incluyendo mascotas, por ejemplo, gatos y perros, y animales de granja, por ejemplo, vacas y caballos.

El término "variante funcionalmente equivalente", cuando se refiere a la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, como se usa aquí, se refiere a cualquier polipéptido resultante de la deleción, inserción o sustitución de uno o más residuos en la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina y que sustancialmente conserva sus propiedades de unión a FcR. Variantes funcionalmente equivalente son las que muestran un grado de identidad con respecto a la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina mayor de al menos el 25%, al menos el 40%>, al menos el 60%>, al menos el 70%>, al menos el 80%>, al menos el 90%>, al menos el 95%>, al menos el 96%>, al menos el 97%>, al menos el 98%> o al menos el 99%o. Como se usa aquí, "%> de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias óptimamente alineadas en una ventana de comparación, donde el fragmento de la secuencia del polipéptido o polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (por ejemplo, brechas o salientes) comparadas con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce el residuo de aminoácido o residuo de nucleótido idéntico en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. Los algoritmos para alinear secuencias se conocen en la técnica. Los algoritmos incluyen, pero no están limitados, el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Add APL. Math, 2:482, 1981); el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 1970; 48 :443); el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1988; 85:2444), e implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA, en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis.). En una forma de realización, se pueden alinear dos secuencias usando la herramienta "Blast 2 Sequences" en el sitio web del NCBI como ajuste por defecto (T atuso va y Madden. FEMS Microbio 1 Lett 1999;174:247-250). De forma alternativa, se pueden alinear las secuencias de aminoácidos o secuencias de ácidos nucleicos por inspección humana.

La capacidad de la variante funcionalmente equivalente de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina para unirse específicamente a FcR se determina usando métodos convencionales que conoce el experto en la materia. El término "unirse específicamente" o "especificidad de unión" se refiere a la capacidad del péptido que se une a FcR de unirse a un epítopo diana presente en el receptor de Fe o el homólogo del mismo con una afinidad mayor con la que se une a un epítopo no diana. En ciertas formas de realización, unión específica se refiere a la unión del péptido que se une a FcR a un epítopo diana presente en el FcR con una afinidad que es al menos 10, 50, 100, 250 o 1000 veces mayor que la afinidad por un epítopo no diana. Por ejemplo, a modo de ilustración, la capacidad de la variante de unirse a FcR se puede determinar usando experimentos de coinmunoprecipitación, en los que la proteína de interés se aisla con un anticuerpo específico y la moléculas que interaccionan con la proteína (por ejemplo, FcR) se identifican posteriormente por medio de una inmunotransferencia. De forma alternativa, la afinidad de unión se puede determinar por diferentes medios tal como, sin limitación, ensayo ELISA de afinidad o ensayo BIAcore o por un método cinético.

En el caso particular cuando una variante de la región Fe es la de una IgY, la determinación de si la variante es una variante funcionalmente equivalente se puede determinar como describen Pürzel et al. (J.Immunol. , 2009, 1 83 : 4554-4559) determinando la capacidad de la variante de fomentar la expresión de un gen indicador en una célula que expresa un proteína de fusión de ΉΙΙ-ΑΒ1^ϋ3ξ que comprende el dominio extracitoplásmico Ig del receptor similar a Ig de pollo CHIR-AB1 y el dominio citoplásmico de CD3ξ murina y un gen indicador bajo el control de un promotor sensible a CD3ξ.

Los ensayos para determinar la capacidad de las variantes funcionalmente equivalentes de la región Fe para fomentar la presentación del péptido unido a la misma en monocitos se pueden determinar, por ej emplo, como describen Liu et al. (J.Clin.Invest, 1996, 98:2001-2007) midiendo la capacidad del conjugado que comprende la variante de Fe de fomentar la proliferación de células T en presencia de monocitos previamente expuestos a dicho conjugado.

2.B.III. Agonistas de CD40

En otra forma de realización, la molécula coestimuladora es un agonista de CD40. El término "agonista de CD40", como se usa aquí, se refiere a un compuesto que se une al receptor CD40 y desencadena señalización de una manera similar al ligando de CD40 endógeno. Ensayos adecuados para determinar si un compuesto es capaz de actuar como un ligando de CD40 son los basados en la detección de el aumento en la expresión de más receptores CD40 y de TNF en macrófagos o la activación de células B y su transformación en células plasmáticas. La activación de células B en respuesta a un ligando de CD40 se puede ensayar midiendo el aumento en los niveles de inositol 1,4,5- trifosfato o de tirosinas quinasas como describen Uckun et al. (J Biol Chem 1991;26: 17478-17485). De forma alternativa, la determinación de si un compuesto es un agonista de CD40 se puede llevar a cabo, por ejemplo, en macrófagos que expresan CD40 en la membrana. En dichos macrófagos, cuando una célula T que tiene un agonista de CD40 interacciona con el macrófago, el macrófago expresa más receptores CD40 y de TNF en su superficie lo que ayuda a aumentar el nivel de activación. El aumento en activación produce la inducción de sustancias microbicidas potentes en el macrófago, incluyendo especies reactivas de oxígeno y óxido nítrico.

Agonistas de CD40 adecuados para su uso en la presente invención incluyen, sin limitación, ligando soluble de CD40 (CD40L), una variante funcionalmente equivalente del ligando de CD40, fragmentos de CD40L (tales como los descritos en el documento WO2009141335), conjugados y derivados de los mismos tales como polipéptidos oligoméricos de CD40L, por ejemplo, polipéptidos triméricos de CD40L, la proteína central C4BP (el dominio C-terminal de la cadena alfa de C4PB) como se describe en el documento WO05051414 y un anticuerpo agonístico de CD40.

En una forma de realización preferida, el agonista de CD40 es un anticuerpo agonístico de CD40 (tales como los descritos en los documentos US2008286289, US2007292439, US2005136055).

2.B.IV. Otras moléculas coestimuladoras inmunes

Moléculas (polipéptidos) coestimuladoras inmunes ejemplares útiles según la invención incluyen, sin limitación, LIGHT, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), ICOS, ICOSL (incluyendo B7h, B7-H2, B7RP-1, GL-50 y LICOS), CD94 (KP43), CD40L (CD154), ICAM-1 (CD54), ICAM-2, ICAM-3, SLAM (CD150), HAS (CD24), 4-1BB (CDwl37), 4-1BBL (CDwl37L), OX40L, CD28, CD40 (BP50), CD25 (IL-2R alfa), linfotoxina (LT alfa o LT beta), TNF, Fas-L, GITR (TNRF inducible por activación), ligando de GITR, CD l l a (integrina alfa L), CD l lb (integrina alfa M), L-selectina (CD62L), CD69 (antígeno de activación muy temprana), CD70 (CD27L), PD-L1 , PD- L2, B7-H3, B7-H4, OX40L, 4-1BBL, CD27L, CD30L, LIGHT, BAFF y APRIL. Véase, por ejemplo, Watts y DeBenedette, 1999, Curr. Opin. Immunol., 11 :286-93.

2. C. Etiquetas de polipéptidos

En una forma de realización preferida, el conjugado de la invención comprende además una "etiqueta". El término "etiqueta", como se usa aquí, se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos para la que están disponibles moléculas de unión específicas, lo que permite por tanto la detección/purificación de cualquier polipéptido que lleva dicha etiqueta. La etiqueta en general se coloca en el extremo amino o carboxilo del polipéptido. La presencia de tal etiqueta permite que la molécula adaptadora sea detectada usando un anticuerpo contra el polipéptido etiqueta. Además, la provisión de la etiqueta permite que el polipéptido adaptador se purifique fácilmente mediante purificación de afinidad usando un anticuerpo anti-etiqueta u otro tipo de reactivo de afinidad que se une a la etiqueta epítopo.

En la técnica se conocen bien varios polipéptidos etiqueta y sus anticuerpos respectivos. Los ejemplos incluyen etiquetas polihistidina (poli-his) o poli-histidina- glicina (poli-his-gly); el polipéptido etiqueta HA de la gripe y su anticuerpos 12CA5 (Field et al., Mol Cell Biol, 1988;8:2159-2165); la etiqueta c-myc y los anticuerpos contra la misma 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 1985;5:3610-3616); la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del herpes simple y su anticuerpo (Paborsky et al., Protein Engineering 1990;3:547-553). Otros polipéptidos etiquetas incluyen el péptido Flag (Hopp et al, BioTechnology 1988;6: 1204-1210); el péptido epítopo KT3 [Martin et al, Science 1993;255: 192-194); péptido epítopo de tubulina (Skinner et al., J Biol Chem 1991;266: 15163-15166); y la etiqueta péptido de la proteína 10 del gen T7 (Lutz-Freyermuth et al., Proc Nati Acad Sci USA 1990,;87:6393-6397). En una forma de realización preferida, la etiqueta de purificación es una etiqueta de polihistidina. En una forma de realización más preferida, la etiqueta de purificación es una etiqueta de hexahistidina.

3. Estructura de conjugados

3.A. Acoplamiento directo

Los conjugados según la invención se pueden formar por una unión directa del primer y segundo componentes, es decir, por medio de una interacción directa específica entre el componente que comprende el dominio de proyección y el agente coestimulador inmune. El primer y segundo componentes se pueden acoplar directamente o se pueden unir a través de un enlazador polipeptídico.

El experto en la materia apreciará que los conjugados pueden resultar del entrecruzamiento químico del primer y segundo componentes. Sin embargo, en el caso particular de que el agente coestimulador sea un polipéptido, se prefiere que el primer y el segundo componentes están conectados como resultado de "entrecruzamiento genético", es decir, en donde el primer y segundo componentes forman un único polipéptido.

Los conjugados pueden incluir un enlazador tal como un enlazador peptídico entre el primer y segundo componentes. La longitud y composición del enlazador se puede elegir para aumentar la actividad de cualquiera o ambos extremos funcionales del conjugado (por ejemplo, polipéptido coestimulador/ antí geno, agente infeccioso o miembro de un par de unión). El enlazador en general tiene desde alrededor de 3 hasta alrededor de 15 aminoácidos de longitud, más preferiblemente desde alrededor de 5 hasta alrededor de 10 aminoácidos de longitud, sin embargo, se pueden usar enlazadores más largos o más cortos o se puede prescindir del enlazador por completo. Enlazadores flexibles (por ejemplo, (Gly ₄ Ser ₃ ) tales como los que se han usado para conectar cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de cadena sencilla se pueden usar a este respecto. Véase, Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85 :5879-5883; patentes de EE UU No. 5.091.513, 5.132.405, 4.956.778; 5.258.498 y 5.482.858. Otros enlazadores son FENDAQAPKS o LQNDAQAPKS. También se pueden usar uno o más dominios de una región Fe de inmuno globulina (por ejemplo, CH1, CH2 y/o CH3) como enlazador. También se pueden usar enlazadores químicos.

Los conjugados que forman una proteína de fusión pueden tener una variedad de configuraciones. En una forma de realización, el extremo C del componente que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus está unido al extremo N del agente coestimulador inmune. De forma alternativa, el extremo C del agente coestimulador inmune se une al extremo N del componente que comprende el dominio de proyección del birnavirus. Además, se contempla que las proteínas de fusión puedan comprender una pluralidad de uno o más del primer componente o uno o más del segundo componente.

En una forma de realización preferida, el conjugado según la invención es el conjugado conocido como "FlagA_HT_VP2-PD" que comprende, en la orientación de N a C, un segundo componente que comprende la flagelina A de Aliivibrio salmonicida, una etiqueta de hexahistidina y un primer componente que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus en donde dicho dominio de proyección de VP2 de birnavirus carece de la región horquilla AA'.

En una forma de realización aún más preferida, el conjugado según la invención comprende la secuencia

1 ADPGVNVNTN VAAMTAQRYL NNATNDLNNS MERLSSGTKI NSAKDDAAGL

51 QISNRLTAQT RGLDVAMRNA NDGISIAQTA EGAMNESTNI LQRMRDLSLQ

101 AANGSNSNQD RSSIQEEVHA LSDELNRIAE TTSFGGRRLL NGQFGESAFQ

151 IGANSGEAIL IKLPSVRSDD DSMGGQRFVS ENGKTAEWNV ETGKNDLKLE

201 FTTKKGEAVS ININAKAGDD IEELATYING QSDKISASVG DEGKLQLFVA 251 EPSIEGELAV SGNLASELGL AGGVGTKATV DKLDVTSVGD AQVSIGVIDS

301 ALAYIDRERA DLGAKQNRLG HSINNLSNIQ ENVSASNSRI KDTDFAKETT

351 NMTKAQILQQ SSTSILAQAK QLPNAALKLL QLEACASGRL VPRGSPGSGY

401 IPEAPRDGQA YVRKDGEWVL LSTFLGHHHH HHDYDIPTTE NLYFQGAMGJi

451 DRPRVYTITA ADDYQFSSQY QPGGVTITLF SANIDAITSL SVGGELVFRT

501 SVHGLVLGAT IYLIGFDGTT VITRAVAANN GLTTGTDNLM PFNLVIPTNE

551 ITQPITSIKL EIVTSKSGGQ AGDQMSWSAR GSLAVTIH (SEQ ID NO:ll) en donde la región subrayada corresponde a la flagelina A de Aliivibrio salmonicida, la región en cursiva corresponde a la etiqueta de hexahistidina y la región doblemente subrayada corresponde al dominio P de VP2. El resto de las secuencias derivan del vector de expresión.

En un forma de realización preferida, el conjugado según la invención comprende, en la orientación N a C, la Fe de la IgY de Gallus gallus (segundo componente), una etiqueta de hexahistidina y el dominio de proyección de la VP2 de birnavirus en donde dicho dominio de proyección de VP2 de birnavirus carece de la región horquilla AA' (primer componente).

En otra forma de realización, el conjugado según la invención es IgY Fe υ2- 4 HT P que comprende la región Fe υ2-4 de IgY de Gallus gallus, una etiqueta de hexahistidina y el dominio P de VP2 de IBDV y que tiene la secuencia

1 ADPGVCRVDP VPPVAPEVQV LHPSSCTPSQ SESVELLCLV TGFSPASAEV

51 EWLVDGVGGL LVASQSPAVR SGSTYSLSSR VNVSGTDWRE GKSYSCRVRH

101 PATNTWEDH VKGCPDGAQS CSPIQLYAIP PSPGELYISL DAKLRCLWN

151 LPSDSSLSVT WTREKSGNLR PDPMVLQEHF NGTYSASSAV PVSTQDWLSG

201 ERFTCTVQHE ELPLPLSKSV YRNTGPTTPP LIYPFAPHPE ELSLSRVTLS

251 CLVRGFRPRD IEIRWLRDHR AVPATEFVTT AVLPEERTAN GAGGDGDTFF

301 VYSKMSVETA KWNGGTVFAC MAVHEALPMR FSQRTLQKQA GKLEACASGR

351 LVPRGSPGSG YIPEAPRDGQ AYVRKDGEWV LLSTFLGHHH HHHDYDIPTT

401 ENLYFQGAMG SDRPRVY IT AADDYQFSSQ YQPGGV I L FSANIDAITS

451 LSVGGELVFR TSVHGLVLGA TIYLIGFDGT VI RAVAAN NGLTTGTDNL 501 MPFNLVIPTN EITQPITSIK LEIVTSKSGG QAGDQMSWSA RGSLAVTIH (SEQ ID NO: 12) en donde la región subrayada corresponde a Fe υ2-4 de IgY de Gallus gallus, la región en cursiva corresponde a la etiqueta de hexahistidina y la región doblemente subrayada corresponde al dominio P de VP2. El resto de las secuencias derivan del vector de expresión.

En una forma de realización aún más preferida, el conjugado según la invención es el conjugado conocido como IgY Fe υ3-4_ΗΤ_Ρ que comprende la región Fe υ3-4 de IgY de Gallus gallus, una etiqueta de hexahistidina y el dominio P de VP2 de IBDV y que tiene la secuencia

1 ADPGCPDGAQ SCSPIQLYAI PPSPGELYIS LDAKLRCLW NLPSDSSLS

51 VTWTREKSGN LRPDPMVLQE HFNGTYSASS AVPVSTQDWL SGERFTCTVQ

101 HEELPLPLSK SVYRNTGPTT PPLIYPFAPH PEELSLSRVT LSCLVRGFRP

151 RDIEIRWLRD HRAVPATEFV TTAVLPEERT ANGAGGDGDT FFVYSKMSVE

201 TAKWNGGTVF ACMAVHEALP MRFSQRTLQK QAGKLEACAS GLVPRGSPGS

251 GYIPEAPRDG QAYVRKDGEW VLLSTFLGHH HHHHDYDIPT TENLYFQGAM

301 GSDRPRVYTI TAADDYQFSS QYQPGGV IT LFSANIDAIT SLSVGGELVF

351 RTSVHGLVLG ATIYLIGFDG TTVI RAVAA NNGLTTGTDN LMPFNLVIPT

401 NEITQPITSI KLEIVTSKSG GQAGDQMSWS ARGSLAV IH (SEQ ID NO: en donde la región subrayada corresponde a Fe υ2-4 de IgY de Gallus gallus, la región en cursiva corresponde a la etiqueta de hexahistidina y la región doblemente subrayada corresponde al dominio P de VP2. El resto de las secuencias derivan del vector de expresión.

Además, en el caso particular cuando el agente coestimulador inmune es un polipéptido de unión a FcR, se pueden asociar dos o más proteínas de fusión Fc- antígeno de forma no covalente o covalente, por ejemplo, a través de uno o más puentes disulfuro, para producir composiciones diméricas o multiméricas.

3.B. Acoplamiento a través de un par de unión

De forma alternativa, el primer y segundo componentes de los conjugados según la invención se pueden unir de forma indirecta, por ejemplo, mediante el uso de un "par de unión", en donde un primer miembro de un par de unión se acopla al primer componente y un segundo miembro de un par de unión se acopla al agente coestimulador inmune. De esta manera, poniendo en contacto ambas moléculas de fusión, se forma un complejo a través de la interacción del primer y segundo miembros del par de unión.

3.B.I. Pares de unión

Como se usa aquí, el término "primer miembro de un par de unión" y "segundo miembro de un par de unión" se refiere a un par de moléculas que pueden interaccionar específicamente y unirse entre sí. El primer y/o segundo miembros del par de unión pueden ser de naturaleza peptídica (proteica) o no peptídica.

Como se usa aquí, la expresión "que puede interaccionar específicamente" o "interacción específica" describe la interacción entre una primera especie y una segunda especie caracterizada en que la naturaleza de unión es tal que un anticuerpo, un receptor o una proteína de unión a ácido nucleico se une a su par de unión correspondiente pero no se une sustancialmente a otra especie. Asimismo, el término "unión" o "unión a", como se usa aquí, significa la asociación física entre una primera especie y una segunda especie, por ejemplo, la unión de un ligando a un receptor, la unión de un antígeno a un anticuerpo, la unión de un ácido nucleico a una proteína de unión a ácido nucleico, etc.

El término "par de unión" no implica ningún tamaño particular o ninguna otra característica técnica diferente de que dicho par de unión puede interaccionar y unirse al otro miembro del par de unión resultante en un conjugado en donde el primer y segundo componentes están unidos entre sí por medio de la interacción específica entre el primer y segundo miembros de un par de unión. A modo de ilustración, los pares de unión adecuados son, por ejemplo, biotina-avidina, epítopo-anticuerpo o fragmento funcional del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab o F(ab')2, un scFv (anticuerpo de cadena sencilla), un anticuerpo quimérico, etc.), lectina-hidrato de carbono, etc., en los que cada uno de las moléculas son miembros de dicho par de unión específico, cada una de ellas contiene los dominios de unión correspondientes o regiones de interacción.

El par de unión incluye cualquier tipo de interacción de tipo inmune tal como antígeno/anticuerpo, antígeno/fragmento de anticuerpo, hapteno/anti-hapteno así como interacciones de tipo no inmune tales como avidina/biotina, avidina/moléculas biotiniladas, ácido fólico/proteína de unión a folato, hormona/receptor de hormona, lectina/hidrato de carbono, lectina/molécula modificada con hidratos de carbono, enzima/sustrato enzimático, enzima/inhibidor enzimático, proteína A/anticuerpo, proteína G/anticuerpo, ácidos nucleicos complementarios (incluyendo secuencias de ADN, ARN y ácidos péptido-nucleicos (APN)), polinucleótido/proteína de unión a polinucleótidos y similares.

Como se usa en la presente invención, la expresión "unión específica" se refiere a la capacidad de una primera molécula de unirse específicamente a una segunda molécula por medio de la existencia de complementariedad entre las estructuras tridimensionales de las dos moléculas con una afinidad sustancialmente mayor para unión no específica de modo que la unión entre dicha primera y segunda molécula preferiblemente tiene lugar antes que la unión de cualquiera de dichas moléculas con respecto a las otras moléculas presentes en la mezcla de reacción. Se entiende que hay alta afinidad en la unión de dos moléculas cuando el complejo resultante de dicha unión tiene una constante de disociación (KD) de menos de 10 ^~6 M, menos de 10 ^~7 M, menos de 10 ^~8 M, menos de 10 ^~9 M, menos de 10 ^~10 M, menos de 10 ^"11 M, menos de 10 ^~12 M, menos de 10 ^~13 M, menos de 10 ^~14 M o menos de 10 ^~15 M.

Los términos "enlace" y "unión" se usan indistintamente para referirse a una interacción entre dos o más entidades. En esos casos en que dos entidades se unen entre sí, se pueden unir directamente (por ejemplo, por medio de enlaces covalentes, fuerzas iónicas, puentes de hidrógeno, interacciones electrostáticas, fuerzas de Van der Waals o una combinación de las anteriores) o se pueden unir indirectamente, por ejemplo, por medio de un enlazador.

En una forma de realización preferida, el primer miembro de un par de unión es una molécula que se une a biotina. Más preferiblemente, la molécula que se une a biotina es avidina, estreptavidina (SA) o fragmentos de SA o avidina que mantienen actividad de unión sustancial para biotina, tal como al menos el 50 por ciento o más de la afinidad de unión de SA nativa. Como se usa aquí, el término "avidina" se refiere a una glicoproteína encontrada en claras de huevo y en tejidos de aves, reptiles y anfibios y que tiene la capacidad de unirse a biotina con alta afinidad así como a cualquier forma expresada o manipulada de la molécula de unión a biotina avidina, tal como estreptavidina, neutravidina y similares. El término avidina incluye tanto avidina encontrada de forma natural en huevos de Gallus gallus (números de acceso de NCBI NM 205320.1/ GL45384353en) así como los ortólogos de dicha proteína en otras especies. Estreptavidina, que corresponde a la proteína de Streptomyces avidinii (número de acceso CAA00084.1 en GenBank), así como los ortólogos, homólogos y fragmentos de estreptavidina definidos de la misma manera que avidina. Estreptavidina comprende 4 subunidades cada una de las cuales contiene un sitio de unión para biotina. También se pueden usar fragmentos de estreptavidina (SA) o avidina que mantienen actividad de unión sustancial para biotina, tal como al menos el 50 por ciento o más de la afinidad de unión de SA o avidina nativas, respectivamente. Preferiblemente, la afinidad de la variante de avidina por biotina es de al menos 10 ¹⁵ M ^"1 , 10 ¹⁴ M ^"1 , 10 ¹³ M ^"1 , 10 ¹² 10 ¹⁰ M ^_1 o 10 ⁹ M ^"1 .

Las variantes de avidina y estreptavidina adecuadas para uso en la presente invención incluyen, sin limitación:

- "Núcleo de estreptavidina" ("CSA"), que es una versión truncada del polipéptido de longitud total de estreptavidina que puede incluir los residuos de estreptavidina 13-138, 14-138, 13-139 y 14-139. Véase, por ejemplo, Pahler et al, (J. Biol. Chem. 1987, 262: 13933-37).

Formas truncadas de estreptavidina y avidina que mantienen unión fuerte a biotina (Véase, por ejemplo, Sano et al., (J Biol Chem., 1995, 270: 28204-09) (que describe variantes centrales de estreptavidina 16-133 y 14-138) (patente de EE UU No. 6.022.951).

Mutantes de estreptavidina y formas del núcleo de estreptavidina que mantienen actividad sustancial de unión a biotina o actividad de unión a biotina aumentada. Véase , Chilcoti et al . , Proc Nati . Acad. S ci . USA. 28 de Febrero 1995;92(5): 1754-8; Reznik et al, Nat Biotechnol. Agosto 1996;14(8): 1007-11. Mutantes con inmunogenicidad reducida, tal como mutantes mutados por mutagénesis dirigida para eliminar potenciales epítopos de células T o epítopos de linfocitos. Véase Meyer et al, Protein Sci. 2001 10: 491-503.

También se pueden usar mutantes de avidina y formas del núecleo de avidina que mantienen actividad sustancial de unión a biotina o actividad de unión a biotina aumentada. Véase, Hiller et al., J. Biochem. (1991) 278: 573-85; Livnah et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA (90: 5076-80 (1993). - Variantes resultantes de modificación química de avidina tal como las resultantes de la modificación completa o parcial de glicosilación y fragmentos de las mismas así como la variante de avidina completamente desglicosilada conocida como neutravidina.

- Mutantes de avidina como se describen en el documento WO05047317A1.

Proteínas similares a avidina como se describen en el documento WO06045891

- Avidina recombinante como se describe en el documento WO0198349

- Variantes de avidina como se describe en el documento WO0027814

Estreptavidina monomérica como se describe en el documento WO06084388 Dímeros de estreptavidina modificada tales como los descritos en el documento WO06058226

La proteína con capacidad de unión a biotina como se describe en el documento WO04018509

Estreptavidina con una mayor afinidad por biotina como se describe en el documento WO9840396

- Las moléculas de estreptavidina y avidina modificadas como se describe en WO9640761

- Los mutantes de estreptavidina como se describe en el documento W09711183 La estreptavidina con actividad modificada como se describe en el documento WO9624606.

Por conveniencia, en la presente descripción, los términos "avidina" y "estreptavidina" como se usan aquí se pretende que abarquen fragmentos de unión a biotina, mutantes y formas del núcleo de estos miembros del par de unión. Diferentes variantes de avidina están comercialmente disponibles, tales como Extravidin (Sigma- Aldrich), NeutrAvidin (Thermo Scientific), NeutrAvidin (Invitrogen) y NeutraLite (Belovo). Además, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estreptavidina y avidina y las secuencias de aminoácidos de estreptavidina y avidina se pueden encontrar, por ejemplo, en los números de acceso de GenBank X65082; X03591; NM— 205320; X05343; Z21611 y Z21554.

En una forma de realización preferida, el primer miembro del par de unión comprende una avidina monomérica. En una forma de realización aún más preferida, la avidina monomérica resulta de avidina que comprende las mutaciones N54A y Wl 10K como describen Laitinen OH et al. J. Biol. Chem. 2003, 278:4010-4014). En una forma de realización aún más preferida, la avidina monomérica usada en la presente invención comprende la secuencia:

1 ARKCSLTGKW TNDLGSNMTI GAVNSRGEFT GTYITAVTAT SNEIKESPLH

51 GTQATINKRT QPTFGFTVNW KFSESTTVFT GQCFIDRNGK EVLKTMWLLR

101 SSVNDIGDDK KATRVGINIF TRLRTQKE (SEQ ID NO: 14) en donde los residuos subrayados corresponden a los aminoácidos mutados (N54A y W100K) que permiten expresar la proteína en un estado monomérico. (Laitinen OH et al. J. Biol. Chem. 2003, 278:4010-4014).

Según una forma de realización, el polipéptido que comprende el dominio P de la proteína VP2 de birnavirus está unido a través de un extremo C al extremo N del miembro del par de unión. Por ejemplo, el polipéptido que comprende el dominio P de VP2 de birnavirus puede estar unido a través de su extremo C al extremo N del núcleo de estreptavidina (CSA). Por tanto, la invención incluye proteínas de fusión PD de VP2- CSA, donde el dominio de proyección de VP2 de birnavirus que carece de la región horquilla AA' está unido a través de su extremo C al extremo N de CSA.

Según otra forma de realización, el polipéptido coestimulador inmune está unido a través de su extremo N al extremo C del miembro del par de unión. Por un ejemplo, un polipéptido coestimulador inmune puede estar unido a través de su extremo N al extremo C de CSA. Por ejemplo, la invención incluye proteínas de fusión CSA-PD de VP2, en donde el grupo CSA está unido a través de su extremo C al extremo N del polipéptido que comprende el dominio P de la proteína VP2 de birnavirus.

En una forma de realización preferida la molécula de unión a biotina es una versión muíante del polipéptido avidina de pollo (mAV) diseñado para que forme complejos con macromoléculas biotiniladas.

Como se usa aquí "biotina" incluye grupos que contienen biotina que son capaces de unirse a superficies, tales como superficies celulares (incluyendo superficies de células tumorales), tal como NHS-biotina y EZ-Link.TM. Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) . Tales formas de proteína reactivas de biotina están disponibles comercialmente. La interacción entre biotina y su compañero de unión, avidina o estreptavidina, ofrece varias ventajas en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, biotina tiene una afinidad extremadamente alta tanto por estreptavidina (10 ¹³ M ^"1 ) como avidina (10 ¹⁵ M ^"1 ). Además, tanto estreptavidina como avidina son polipéptidos tetraméricos que cada uno une cuatro moléculas de biotina. Los grupos co estimuladores inmunes que comprenden estreptavidina o avidina por tanto tienen una tendencia a formar tetrámeros y estructuras superiores. Como resultado, pueden entrecruzar sus receptores de células inmunes correspondientes para una transducción de señal más potente, tal como mediante agregación de receptores.

Para que se formen los complejos entre el primer componente del conjugado modificado con un primer miembro de un par de unión y la molécula coestimuladora, tal molécula coestimuladora se acopla a un segundo miembro del par de unión.

En una forma de realización preferida, el conjugado según la invención comprende una proteína de fusión que comprende el dominio P de VP2 de IBDV y avidina monomérica y oligonucleótidos CpG biotinilados. En una forma de realización aún más preferida, la proteína de fusión que comprende el dominio P de VP2 de IBDV y avidina monomérica comprende la secuencia

1 ADPGSDRPRV YTITAADDYQ FSSQYQPGGV TITLFSANID AITSLSVGGE

51 LVFRTSVHGL VLGATIYLIG FDGTTVITRA VAANNGLTTG TDNLMPFNLV

101 IPTNEITQPI TSIKLEIVTS KSGGQAGDQM SWSARGSLAV TIHGGLEACA

151 SGRLVPRGSP GSGYIPEAPR DGQAYVRKDG EWVLLSTFLG HHHHHHDYDI

201 PTTENLYFQG AMARKCSLTG KWTNDLGSNM TIGAVNSRGE FTGTYITAVT

251 ATSNEIKESP LHGTQATINK RTQPTFGFTV NWKFSESTTV FTGQCFIDRN

301 GKEVLKTMWL LRSSVNDIGD DKKATRVGIN IFTRLRTQKE (SEQ ID NO:15) en donde la región subrayada corresponde al dominio P de VP2, la región en cursiva corresponde a la etiqueta de hexahistidina y la región doblemente subrayada corresponde a mAV. El resto de las secuencias derivan del vector de expresión.

En una forma de realización aún más preferida, el oligonucleótido CpG biotinilado comprende la secuencia 5 '-TCGTCGT T T TGTCGT T T TGTCGT T-3 ' (SEQ ID NO:8). 4. Métodos para preparar los conjugados según la invención

4. A. Conjugados en donde los componentes están directamente conectados

Se puede hacer un conjugado según la presente invención por métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el primer y segundo componentes del conjugado se pueden unir covalentemente entre sí o conjugar entre sí directamente o a través de un enlazador.

El conjugado de la invención se puede obtener usando cualquier método que conoce el experto en la materia. Por tanto es posible obtener el polipéptido que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus que carece de región horquilla AA' por cualquier método estándar. Por ejemplo, se puede obtener el polipéptido de ADNc por medio de expresión en un organismo heterólogo tal como, por ejemplo, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris.

Una vez que está disponible una cantidad suficiente de polipéptido purificado, el último se debe conjugar al primer miembro del par de unión. La conjugación de dicho primer miembro del par de unión a la molécula de polipéptido se puede llevar a cabo en diferentes formas. Una posibilidad es la conjugación directa de un grupo funcional al polipéptido que comprende el dominio P de VP2 de birnavirus en una posición que no interfiera con la actividad de dicho componente. Como se entiende en la presente invención, grupos funcionales se refiere a un grupo específico de átomos en una molécula que son responsables para una reacción química característica de dicha molécula. Ejemplos de grupos funcionales incluyen, sin limitación, grupos hidroxi, aldehido, alquilo, alquenilo, alquinilo, amida, carboxamida, aminas primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, aminoxi, azida, azo (diimida), bencilo, carbonato, éster, éter, glioxililo, halo alquilo, haloformilo, imina, imida, cetona, maleimida, isocianuro, isocianato, carbonilo, nitrato, nitrito, nitro, nitroso, peróxido, fenilo, fosfina, fosfato, fosfo no , piridilo, sulfuro, sulfonilo, sulfinilo, tioéster , tiol y 3,4- dihidroxifenilalanina (DOPA) oxidado. Ejemplos de dichos grupos son grupos maleimida o glioxililo, que reaccionan específicamente con grupos tiol en la molécula Apo A y grupos 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) oxidado que reaccionan con grupos amino primarios en el componente que forma el polipéptido (i).

Otra posibilidad es conjugar el primer miembro del par de unión al polipéptido que comprende el dominio P de VP2 de birnavirus mediante el uso de grupos homo o hetera biñmcionales. El grupo bifuncional se puede conjugar primero al compuesto terapéuticamente activo y, después, conjugar al polipéptido o, de forma alternativa, es posible conjugar el grupo bifuncional al polipéptido y, después, conjugar el último al componente (ii). Ejemplos ilustrativos de este tipo de conjugados incluyen los conjugados conocidos como cetona-oxima (descritos en el documento US20050255042) en los que el primer componente del conjugado comprende un grupo aminoxi que se une a un grupo cetona presente en un grupo heterobifuncional que, a su vez, se une a un grupo amino en el segundo componente del conjugado.

En otra forma de realización, el agente usado para conjugar los componentes (i) y (ii) de los conjugados de la invención se puede procesar de forma fotolítica, química, térmica o enzimática. En particular, el uso de agentes de unión que se pueden hidrolizar por enzimas que están en la célula diana, de modo que el compuesto terapéuticamente activo solo se libera a la célula, es de interés. Se han descrito ejemplos de tipos de agentes de unión que se pueden procesar intracelularmente en los documentos WO04054622, WO06107617, WO07046893 y WO07112193.

En una forma de realización preferida, en donde el primer miembro de un par de unión es un compuesto de naturaleza peptídica (por ejemplo, estreptavidina), incluyendo tanto oligopéptidos, péptidos como proteínas, es posible modificar químicamente una cadena polipeptídica usando métodos que conoce ampliamente el experto en la materia de modo que la proteína se puede acoplar covalentemente a un segundo polipéptido. De esta manera, métodos adecuados para el acoplamiento covalente de dos polipéptidos incluyen métodos basados en la conjugación a través de grupos tiol presentes en los grupos de cisterna, métodos basados en la conjugación a través de grupos amina primarios presentes en los grupos de lisina (US6809186), métodos basados en la conjugación a través de grupos N- y C-terminales se pueden usar. Los reactivos adecuados para la modificación de polipéptidos para permitir su acoplamiento a otros compuestos incluyen: glutaraldehído (permite la unión de compuestos al extremo N-terminal de polipéptidos), carbodiimida (permite la unión del compuesto al extremo C-terminal de un polipéptido), ésteres de succinimida (por ejemplo, MBS, SMCC) que permite la activación del extremo N-terminal y grupos de cisterna, bezidina (BDB), que permite activar grupos de tirosina, y peryodato, que permite activar grupos glucídicos en esas proteínas que están glicosiladas.

Según una forma de realización, el primer y segundo componentes forman una proteína de fusión. Las proteínas de fusión se pueden hacer por cualquiera de un número de diferentes métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno o más de los polipéptidos componentes de las proteínas de fusión se pueden sintetizar químicamente o se pueden generar usando tecnología de ácidos nucleicos recombinantes bien conocida. (Como se usa aquí, "ácido nucleico" se refiere a ARN o ADN). Las secuencias de ácido nucleico útiles en la presente invención se pueden obtener usando, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se describen varios métodos de PCR, por ejemplo en PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach 7 Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995.

En el caso particular en el que el primer y segundo componentes del conjugado según la invención forman una única cadena polipeptídica, es posible expresar el conjugado en un solo paso usando una construcción génica de la invención que codifica dicho conjugado, para lo cual se introduce dicha construcción en un vector adecuado para su expresión en un organismo heterólogo junto con elementos de control de transcripción y, opcionalmente, traducción. Los elementos de control de transcripción y, opcionalmente, traducción presentes en el cásete de expresión de la invención incluyen promotores, que dirigen la transcripción de la secuencia de nucleótidos a la que están operativamente unidos y otras secuencias que son necesarias o adecuadas para la transcripción y su regulación en tiempo y espacio, por ejemplo, señales de iniciación y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilación, origen de replicación, potenciadores transcripcionales, silenciadores transcripcionales, etc. Dichos elementos, así como los vectores usados para construir los casetes de expresión y los vectores recombinantes según la invención en general se eligen según las células huésped que se van a usar.

4.B. Conjugados en donde los componentes (i) y (ii) están unidos por un par de unión

Los conjugados de la invención en donde los componentes (i) y (ii) están unidos a través de la interacción del primer y segundo miembros de un par de unión unido a cada uno de los componentes se pueden hacer por métodos conocidos en la técnica, y ejemplificados posteriormente en los ejemplos.

El polipéptido que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus puede contener un segundo miembro de un par de unión o se puede hacer reaccionar en presencia de un agente modificador que acopla dicho segundo miembro del par de unión a la entidad antigénica. Los agentes adecuados para acoplar un primer miembro de un par de unión a un polipéptido se han descrito anteriormente. En una forma de realización preferida, el primer miembro de un par de unión es una molécula que se une a biotina.

La entidad molécula co estimuladora puede contener un segundo miembro de un par de unión o se puede hacer reaccionar en presencia de un agente modificador que acopla dicho segundo miembro del par de unión a la entidad antigénica. Los agentes adecuados para acoplar un primer miembro de un par de unión a un polipéptido se han descrito anteriormente. En una forma de realización preferida, el segundo miembro de un par de unión es biotina.

La incorporación de biotina a una molécula coestimuladora se puede llevar a cabo usando agentes biotinilantes. Como se usa aquí un "agente biotinilante" se refiere a cualquier molécula que es capaz de añadir una molécula de biotina a un grupo reactivo en una molécula diana. Un agente biotinilante puede reaccionar con grupos amino, grupos carboxilo o grupos tiol en la molécula diana. Los agentes biotinilantes adecuados incluyen, sin limitación, Biotina-PEO-Amina (reactivo con grupos carboxilo), PEO- yodoacetilo-Biotina (reactivo con grupos tiol), biotina-NHS, biotina-sulfoNHS, biotina- LC-NHS, biotina-LC-sulfoNHS, biotina-LC-LC-NHS y biotina-LC-LC-sulfoNHS (reactivo con grupos amino). "LC" significa "cadena larga", que representa un espaciador de siete átomos entre biotina y el éster NHS. Otro ejemplo de un agente biotinilante derivado de biotina es tetrafluorofenilo óxido de polietileno biotina (TFP- PEO-biotina).

Los reactivos éster activos preferiblemente se usan a concentraciones alrededor de 0,05-0,5 M y más preferiblemente a concentraciones de 0,1 M, en solución salina tamponada con fosfato ("PBS") o en una solución de PBS a dimetilsulfóxido ("DMSO") 9: 1, si es necesario para solubilización. De forma alternativa, se puede añadir biotina a la molécula coestimuladora por medios enzimáticos usando, por ejemplo, la tecnología Biotin AviTag de Avidity, Inc. (Denver, Coló.). Biotin AviTag está compuesta de un único péptido de 15 aminoácidos reconocido por biotina ligasa, BirA que une biotina a un residuo de lisina en la secuencia peptídica (Schatz, Biotechnology 1993; 1 1 : 1 138-43. Biotin AviTag se pueden fusionar genéticamente a cualquier proteína de interés, lo que permite que la proteína sea etiquetada con una molécula de biotina.

Una potencial desventaja de la tecnología Biotin AviTag es la posibilidad de un bajo grado de biotinilación, porque el sistema biotinila la proteína en único residuo de lisina individual en la región etiqueta. Para superar tal problema, las proteínas etiquetadas purificadas se pueden modificar in vitro usando biotina ligasa purificada. Puesto que la biotinilación se realiza de forma enzimática, las condiciones de reacción son más suaves, el mareaje es muy específico y la reacción es más eficiente que la modificación química de la proteína usando derivados de biotina. De forma alternativa, se pueden usar los métodos descritos en Jordán, et al. (Clin Diag Lab Immunol 2003;10: 339-44) para producir una proteína biotinilada genéticamente manipulada.

El experto en la materia apreciará que el acoplamiento del segundo miembro del par de unión a la molécula coestimuladora inmune se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica para la modificación química de moléculas según la naturaleza química de dichas moléculas. De esta manera, en esos casos en donde el coestimulador inmune es un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que se une a FcR o flagelina como ligando agonístico de TLR5), cualquiera de los métodos descritos anteriormente (acoplamiento químico usando agente biotinilante o incorporación de un péptido BAP) son adecuados para añadir una o más moléculas de biotina a la molécula coestimuladora inmune. En esos casos en donde la molécula coestimuladora es un oligonucleótido (por ejemplo, poli I :C como ligandos agonísticos de TLR3 u oligonucleótidos CpG como ligando agonísticos de TLR9), la molécula coestimuladora inmune se puede incorporar por síntesis a medida de los ácidos nucleicos que incorporan durante la síntesis nucleótidos modificados con el segundo miembro del par de unión. En esos casos en donde la molécula coestimuladora inmune es un compuesto orgánico pequeño (por ejemplo, imiquimod como ligando de TLR-7), el acoplamiento del segundo miembro del par de unión dependerá de los grupos químicos disponibles en la molécula coestimuladora. Por ejemplo, se han descrito métodos para modificar imiquimod con biotina en el documento WO09152179A1.

En esos casos en donde la molécula coestimuladora inmune es lipopolisacárido (por ejemplo, LPS de Salmonella como ligando de TLR-4), el acoplamiento del segundo miembro del par de unión típicamente se lleva a cabo usando una forma activada del segundo miembro del par de unión capaz de reaccionar con los residuos glicosilo en la molécula de LPS. Por ejemplo, el documento WO09093250A2 describe un método para la biotinilación de LPS usando biotina hidrazida.

5. Polinucleótidos, vectores y células huésped de la invención

En otro aspecto, la invención se refiere a un polmucleótido que codifica un polipéptido de la invención así como un polmucleótido que codifica el conjugado de la invención. El experto en la materia entenderá que los polinucleótidos que codifican los conjugados según la invención solo codifican los conjugados en los que el componente (ii) tiene naturaleza peptídica y que forma una única cadena peptídica con el componente (i), independientemente tanto de la orientación relativa como del hecho de que ambos componentes estén unidos directamente o separados por una región espaciadora.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a una construcción génica que comprende un polmucleótido de la invención. La construcción preferiblemente comprende el polinucleótido de la invención localizado bajo el control operativo de secuencias que regulan la expresión del polinucleótido de la invención. El experto en la materia entenderá que los polinucleótidos de la invención deben acceder al núcleo de un tejido diana y allí ser transcritos y traducidos para dar lugar a la proteína de fusión biológicamente activa.

En principio, se puede usar cualquier promotor para las construcciones génicas de la presente invención siempre que dicho promotor sea compatible con las células en las que el polinucleótido se va a expresar. De esta manera, los promotores adecuados para la forma de realización de la presente invención incluyen, sin estar necesariamente limitados a, promotores constitutivos tales como los derivados de los genomas de virus eucariotas tales como el virus del polioma, adenovirus, SV40, CMV, virus del sarcoma aviar, virus de la hepatitis B, el promotor del gen de la metalotioneína, el promotor del gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple, regiones LTR de retrovirus, el promotor del gen de la inmuno globulina, el promotor del gen de la actina, el promotor del gen de EF-1 alfa así como promotores inducibles en los que la expresión de la proteína depende de la adición de una molécula o una señal exógena, tal como el sistema de tetraciclina, el sistema NFKB/IUZ UV, el sistema Cre/Lox y el promotor de los genes de choque térmico, los promotores regulables de la ARN polimerasa II descritos en WO/2006/135436 así como promotores específicos de tejido. Preferiblemente, el promotor usado para expresar los polinucleótidos de la invención son promotores funcionales en células dendríticas tal como el promotor del gen de la fascina como describen Bros et al. (J Immunol 2003;171 : 1825-1834), los promotores de los genes DC-CK1, DC-STAMP y DC-SIGN, el promotor de Dectina-2 descrito en Morita et al., (Gene Ther 2001 ;8: 1729-37), el promotor del gen CDl lc descrito en Masood, R., et al. (Int J Mol Med 2001;8:335-343) y Somia, N. V., et al. (Proc Acad Sci USA 1995;92:7570-7574).

Otros ejemplos de promotores que son específicos de tejido incluyen el promotor del gen de la albúmina (Miyatake et al., J Virol 1997;71 :5124-32), el promotor central del virus de la hepatitis (Sandig et al, Gene Ther 1996;3: 1002-9), el promotor del gen de la alfa- fetopro teína (Arbuthnot et al., Hum.GeneTher 1996;7: 1503-14) y el promotor de la proteína de unión a globulina que se une a tiroxina (Wang, L., et al, Proc Nati Acad Sci USA 1997;94: 11563-11566).

Los polinucleótidos de la invención o las construcciones génicas que los forman pueden formar parte de un vector. De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector que comprende un polinucleótido o una construcción génica de la invención. El experto en la materia entenderá que no hay limitación respecto al tipo de vector que se puede usar porque dicho vector puede ser un vector de clonación adecuado para la propagación y obtención de los polinucleótidos o construcciones génicas adecuadas o vectores de expresión en diferentes organismos heterólogos adecuados para purificar los conjugados. De esta manera, los vectores adecuados según la presente invención incluyen vectores de expresión en procariotas tales como pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mpl 8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, fagos y vectores lanzadera tales como pSA3 y pAT28, vectores de expresión en levadura tales como vectores del tipo de plásmidos de 2 mieras, plásmidos de integración, vectores YEP, plásmidos centroméricos y similares, vectores de expresión en células de insecto tales como la serie pAC y la serie pVL, vectores de expresión en plantas tales como vectores de las series pIBI, pEarleyGate, pAVA, pCAMBIA, pGSA, pGWB, pMDC, pMY, pORE y similares y vectores de expresión en células eucariotas superiores basados en vectores víricos (adenovirus, virus asociados a adenovirus así como retrovirus y lentivirus) así como vectores no víricos, tales como pSilencer 4.1- CMV (Ambion), pcDNA3, pcDNA3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1 , pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pS VL y pKS V- 10, pBPV- 1 , pML2d y pTDT 1.

El vector de la invención se puede usar para transformar, transfectar o infectar células que se pueden transformar, transfectar o infectar por dicho vector. Dichas células pueden ser procariotas o eucariotas. A modo de ejemplo, el vector en donde dicha secuencia de ADN se introduce puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que se ha integrado. Dicho vector se puede obtener por métodos convencionales que conocen los expertos en la materia (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001), mencionado anteriormente).

Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula que comprende un conjugado, un polinucleótido, una construcción génica o un vector de la invención, para lo cual dicha célula ha sido capaz de ser transformada, transfectada o infectada con una construcción o vector proporcionado por esta invención. Las células transformadas, transfectadas o infectadas se pueden obtener por métodos convencionales que conocen los expertos en la materia (Sambrook et al., 2001 , mencionado anteriormente). En una forma de realización particular, dicha célula huésped es una célula animal transfectada o infectada con un vector adecuado.

Las células huésped adecuadas para la expresión de los conjugados de la invención incluyen, sin estar limitadas, células de mamífero, vegetales, insecto, fúngicas y bacterianas. Las células bacterianas incluyen, sin estar limitadas, células bacterianas Gram positivas tales como especies de los géneros Bacillus, Streptomyces, Listeria y Staphylococcus y células bacterianas Gram negativas tales como células de los géneros Escherichia, Salmonella y Pseudomonas. Las células fúngicas preferiblemente incluyen células de levadura tal como Saccharomyces, Pichia pastoris y Hansenula polymorpha. Las células de insecto incluyen, sin estar limitadas, células de Drosophila y Sf9. Las células vegetales incluyen, entre otras, células de plantas de cosecha tales como cereales, plantas medicinales, ornamentales o bulbosas. Las células de mamífero adecuadas en la presente invención incluyen líneas celulares epiteliales (humanas, ovinas, porcinas, etc.), líneas celulares de osteosarcoma (humanas, etc.), líneas celulares de neuroblastoma (humanas, etc.), carcinomas epiteliales (humanos, etc.), células de glía (murinas, etc.), líneas celulares hepáticas (de mono, etc.), células CHO (ovario de hámster chino), células COS, células BHK, células HeLa, 91 1 , AT1080, A549, 293 o Per.C6, células ECC humanas NTERA-2, células D3 de la línea mESC, células troncales embrionarias humanas tales como HS293, BGV01, SHEF1 , SHEF2, HS 181, células NIH3T3, 293T, REH y MCF-7 y células hMSC.

6. Usos terapéuticos de los conjugados según la invención

Los autores de la presente invención han observado que los polipéptidos de la invención son capaces de inducir la activación de una respuesta inmune in vivo contra el polipéptido VP2 de birnavirus. Estos resultados muestran que un polipéptido que comprende un dominio P de VP2 de birnavirus y que carece de la horquilla AA' puede ser capaz de inducir la activación de una respuesta inmune in vivo contra el polipéptido VP2 de birnavirus.

Además, los autores de la presente invención han observado que los conjugados de la invención son capaces de inducir la activación de una respuesta inmune in vivo contra el polipéptido VP2 de birnavirus. Estos resultados muestran que un polipéptido que comprende un dominio P de VP2 de birnavirus que carece de la horquilla AA' y un primer miembro de un par de unión se puede usar para preparar complejos inmunorreactivos con moléculas coestimuladoras acopladas a un segundo miembro de dicho par de unión que se podría incluir en formulaciones de vacunas profilácticas o terapéuticas contra infecciones causadas por birnavirus.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica, o composición farmacéutica de la invención, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido o conjugado de la invención y al menos un soporte o adyuvante farmacológicamente aceptable. En aún otro aspecto, la invención se refiere a un conjugado o composición farmacéutica según la invención para uso en medicina.

El término "cantidad inmunogénicamente eficaz" tiene su significado habitual en la técnica, es decir, una cantidad de un inmunógeno que es capaz de inducir una respuesta inmune significativa contra agentes patógenos que comparten características inmuno lógicas con el inmunógeno.

"Adyuvante" se entiende como cualquier sustancia que intensifica la eficacia de la composición farmacéutica de la invención. Los adyuvantes adecuados incluyen, sin limitación, adyuvantes formados por sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc., formulaciones de emulsiones de aceite en agua o agua en aceite tal como adyuvante completo de Freund (CFA) así como el adyuvante incompleto de Freund (IFA); geles minerales; copolímeros en bloque, Avridine™, SEAM62, adyuvantes formados por componentes de la pared celular bacteriana tales como adyuvantes que incluyen lipopolisacáridos (por ejemplo, lípido A o monofosforil lípido A (MLA), dimicolato de trehalosa (TDM) y componentes del esqueleto de la pared celular (CWS), proteínas de choque térmico o los derivados de las mismas, adyuvantes derivados de toxinas bacterianas ADP- ribosilantes, que incluyen la toxina de la difteria (DT), toxina pertúsica (PT), toxina del cólera (CT), toxinas lábiles por calor de E. coli (LT1 y LT2), endotoxina A y exotoxina de Pseudomonas, exoenzima B de B. cereus, toxina de B. sphaericus, toxinas C2 y C3 de C. botulinum, exoenzima de C. limosum así como las toxinas de C. perfringens, C. spiriforma y C. difficile, S. aureus, EDIM y mutantes de toxinas mutantes tal como CRM-197, mutantes no tóxicos de la toxina de la difteria; saponinas tales como ISCOM (complejos inmuno estimulantes), quemoquinas, quimioquinas y citoquinas tales como interleuquinas (IL-1 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, etc.), interferones (tal como el interferón gamma) factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), defensinas 1 o 2, RANTES, ΜΙΡΙ-alfa, y MEP-2, muramil péptidos tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N- acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-M D P ) , N-acetilmuramil-L-alanil-D- isoglutaminil-L-alanina-2-( -2'-dipalmitoil-s-n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) etc.; adyuvantes derivados de la familia de moléculas de CpG, dinucleótidos CpG y oligonucleótidos sintéticos que comprenden motivos CpG, exoenzima de C. limosum y adyuvantes sintéticos tal como PCPP, la toxina del cólera, toxina de Salmonella, alumbre y similares, hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D- isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, MTP-PE y RIBI, que contienen tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2% de Tween 80. Otros ejemplos de adyuvantes incluyen DDA (bromuro de dimetil dioctadecil amonio) y QuilA.

El término "soporte" se refiere a un diluyente o excipiente con el que se administra el principio activo. Tales soportes farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tal como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Se usan preferiblemente como soportes agua o soluciones acuosas de solución salina y dextrosa acuosa y soluciones de glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Los soportes farmacéuticamente adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin, 1995. Preferiblemente, los soportes de la invención están aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o un estado o enumeradas en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea en general reconocida para su uso en animales, y más en particular en seres humanos.

Para uso en medicina, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier vía, incluyendo, sin limitación, vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual o rectal. Se puede encontrar un revisión de las diferentes formas para la administración de principios activos, de los excipientes a ser usados y de los procesos para fabricarlos en Tratado de Farmacia Galénica, C . Faulí i Trillo, Luzán 5, S.A. de Ediciones, 1993 y en Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20 ^a edición, Williams & Wilkins PA, EE UU (2000). Ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables se conocen en el estado de la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas en fosfato (PBS), agua, emulsiones, tal como emulsiones de aceite en agua, diferentes tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprenden dichos soportes se pueden formular por métodos convencionales conocidos en el estado de la técnica. En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido, conjugado o composición farmacéutica según la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus. De forma alternativa, la invención se refiere al uso de un conjugado o composición farmacéutica según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus. De forma alternativa, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus en un sujeto en necesidad del mismo que comprende la administración a dicho sujeto de un conjugado según la invención.

El experto en la materia apreciará que la enfermedad a ser tratada requerirá un conjugado adecuado que comprende un polipéptido que comprende el dominio P de VP2 derivado del birnavirus que produce la enfermedad. De esta manera, en aspectos adicionales, la invención se refiere a usos terapéuticos del conjugado y composición según la invención en donde

(i) si el polipéptido que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus deriva de VP2 de IBDV, entonces la enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra dicho polipéptido es una enfermedad infecciosa causada por el microorganismo patógeno IBDV, tal como bursitis infecciosa (IBD) (también conocida como enfermedad de Gumboro) que se caracteriza por inflamación de la bolsa, hemorragia, linfocitolisis, atrofia, depresión y necrosis hepática, o

(ii) si el polipéptido que comprende el dominio de proyección de VP2 de birnavirus deriva de VP2 de IPNV, entonces la enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra dicho polipéptido es una enfermedad infecciosa causada por IPNV, tal como enfermedad de necrosis pancreática infecciosa (IPN).

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una composición o kit de partes de la invención o una composición farmacéutica de la invención para la fabricación de una vacuna.

Como se usa aquí, el término "vacuna" se refiere a una formulación que contiene una composición según la presente invención y que está en una forma que es capaz de ser administrada a un vertebrado y que induce una respuesta inmune protectora suficiente para prevenir y/o mejorar una infección y/o para reducir al menos un síntoma de una infección y/o para aumentar la eficacia de otra dosis de composición de la invención. Como se entenderá, la respuesta inmune generada por la vacuna puede ser una respuesta inmune humoral o celular.

La expresión "respuesta inmune celular", se usa aquí para describir una respuesta inmune contra antígeno(s) exógeno(s) que está mediada por células T y sus productos de secreción.

La "respuesta inmune humoral", se usa aquí para describir una respuesta inmune contra antígeno(s) exógeno(s) que está mediada por anticuerpos producidos por células B.

La vacuna se administra de forma sistémica o local. La vacuna se puede administrar por medio de una administración única, o con una inducción por medio de administraciones múltiples como se ha descrito previamente para la administración de las composiciones de la invención.

La composición inmunogénica y vacunas según la invención se pueden presentar como una formulación única (por ejemplo, como un comprimido o cápsula que comprende una cantidad fija de cada componente) o, de otra manera, se puede presentar como formulaciones separadas para la posterior combinación para la administración unida, secuencial o separada. Las composiciones de la invención también contemplan la formulación como un kit de partes en donde los componentes se formulan por separado pero se empaquetan en el mismo envase.

El experto en la materia apreciará que la formulación del primer y segundo componente de las composiciones de la invención puede ser similar, en otras palabras, formuladas de una manera similar (por ejemplo, en comprimidos o pildoras), lo que permite la administración por la misma vía. En una forma de realización en donde los diferentes componentes de la invención se formulan por separado, los dos componentes se pueden presentar en un blíster. Cada blíster contendrá los medicamentos a ser consumidos durante el día. Si se necesita administrar los medicamentos varias veces al día, los medicamentos correspondientes a cada administración se pueden colocar en secciones separadas del blíster, preferiblemente anotando en cada sección del blíster la hora del día cuando se necesitan administrar. De forma alternativa, los componentes de la composición de la invención se pueden formular en una manera diferente de modo que los diferentes componentes se administren de forma diferente. De esta manera, es posible, por ejemplo, que el primer componente se formule como un comprimido o cápsula para la administración oral y que el segundo componente se formule para administración intravenosa.

La inyección de antígenos proteicos típicamente se usa para provocar respuestas inmunes en un animal receptor. Sin embargo, la invención también proporciona métodos de administrar antígenos a CPA por inyección de ADN. Una técnica comúnmente usada es inyectar vectores de expresión de ADN, que codifican una proteína antigénica, en músculo. Artículos sugieren que el antígeno proteico se expresa por las células musculares pero que el antígeno no se presenta al sistema inmune por estas células. En su lugar, se cree que CPA especializadas, por ejemplo, macrófagos y células dendríticas, migran al sitio de inyección, recogen y presentan el antígeno a través de un proceso que aún no se ha elaborado. El uso de vectores de expresión de proteínas de fusión Fc-antígeno hace este proceso más eficiente porque la proteína de fusión secretada se une más eficazmente a las CPA que la proteína antígeno nativa.

Una consecuencia del planteamiento de inyección de ADN es que con frecuencia produce la generación de respuesta tanto humoral como celular. Típicamente, las proteínas administradas exógenamente lo tienen más difícil para entrar a la vía para la presentación en moléculas de MHC de clase I. Sin embargo, la administración de las proteínas de fusión de Fe de la invención aumenta la generación de células citotóxicas, probablemente a través de la presentación en MHC de clase I del antígeno exógeno preseleccionado. Las combinaciones de inmunización con ADN e inmunización con proteína también pueden funcionar sinergísticamente para cebar primero el sistema inmune y después estimular el nivel de respuesta en forma tanto de producción de anticuerpos como de respuestas celulares citotóxicas. La coadministración de proteína de fusión Fc-adyuvante, por ejemplo, Fc-IL-2, Fc-GMCSF, Fc-IL-12 y Fc-ligando de Flt3, junto con la proteína de fusión Fc-antígeno asegura la colocalización de las proteínas de fusión al mismo compartimento celular de las CPA, estimulando de esta manera una respuesta inmune más potente contra el antígeno preseleccionado.

Las composiciones de la presente invención (es decir, conjugados o secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales conjugados) se pueden suministrar a un animal por cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, mediante inyección, implantación o administración tópica a un sitio de tejido) o sistémicamente (por ejemplo por vía parenteral u oral). Donde la composición se va a administrar por vía parenteral, tal como mediante administración intravenosa, subcutánea, oftálmica, intraperitoneal, intramuscular, yugal, rectal, vaginal, intraorbital, transdérmica, intracerebral, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisterna, intracapsular, intranasal o por aerosol, la composición preferiblemente comprende parte de una suspensión o solución acuosa o de líquido fisiológicamente compatible. De esta manera, el soporte o vehículo es fisiológicamente aceptable de modo que además de distribución de la composición deseada al paciente, no afecta adversamente de otra manera al equilibrio de electrolitos y/o de volumen del paciente. El medio líquido para el agente puede comprender por tanto solución salina fisiológica normal (por ejemplo, NaCl acuoso al 9,85%, SM 0,1, pH 7-7,4).

Las dosis preferidas de los conjugados por administración están en el intervalo de 50 ng/m 2 a 1 g/m 2, más preferiblemente de 5 mu g/m 2 a 200 mg/m 2, y lo más preferiblemente de 0,1 mg/m 2 a 50 mg/m 2. Las dosis preferidas de ácidos nucleicos que codifican los conjugados por administración están en el intervalo de 1 mu g/m 2 a 100 mg/m 2, más preferiblemente de 20 mu g/m 2 a 1 0 mg/m 2 , y lo más preferiblemente de 400 mu g/m 2 a 4 mg/m 2.

Se contempla que la inmunización máxima se pueda alcanzar realizando numerosas inmunizaciones separadas, por ejemplo, de una o tres inoculaciones alrededor de 3 semanas a seis meses de distancia. Además, como se ha discutido anteriormente, las respuestas inmunes máximas se pueden alcanzar en ciertas circunstancias alternando entre la administración de conjugados y ácidos nucleicos que codifican tales conjugados. Los modos óptimos de administración, pautas de dosis y recuerdos se pueden determinar por experimentación de rutina en el nivel del experto en la materia.

7. Composiciones adicionales de la invención

En otra forma de realización, la invención proporciona un conjugado que comprende un dominio P de VP2 de birna virus que carece de la región horquilla AA' y un primer miembro de un par de unión en donde dicho primer miembro de un par de unión no es una región de dicha VP2 de birnavirus.

Los términos "conjugado", "birnavirus", "VP2", "dominio P", "región horquilla AA'" y "primer miembro de un par de unión" se han descrito en detalle anteriormente.

En una forma de realización preferida, el primer miembro de un par de unión es una región de unión a biotina y, más preferiblemente, avidina o una variante funcionalmente equivalente de la misma. Las variantes funcionalmente equivalentes adecuadas se han descrito en detalle anteriormente.

En una forma de realización preferida, el conjugado comprende además una o más etiquetas peptídicas. Las etiquetas adecuadas para su uso en los conjugados se han descrito en detalle anteriormente. Preferiblemente, la etiqueta se selecciona del grupo que consiste en una etiqueta de hexahistidina, una etiqueta FLAG o una combinación de las mismas.

Como se ha descrito anteriormente, el conjugado se puede formar por el entrecruzamiento químico del polipéptido que comprende un dominio P de VP2 de birnavirus que carece de la región horquilla AA' y el primer miembro de un par de unión. De forma alternativa, el conjugado puede resultar del entrecruzamiento genético de ambas regiones, en cuyo caso el dominio P de VP2 de birnavirus y la avidina o la variante funcionalmente equivalente de la misma forman una proteína de fusión.

En formas de realización adicionales, la invención se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína de fusión como anteriormente, a un vector que comprende un polinucleótido como se ha definido anteriormente o una célula huésped que comprende un conjugado, un polinucleótido o un vector como se ha definido anteriormente.

8. Composiciones inmunogénicas celulares de la invención

Otro planteamiento de terapia es tomar ventaja del papel normal de las células presentadoras de antígeno como educador inmune. Como se ha mencionado previamente, las células presentadoras de antígeno capturan antígenos de virus entre otros y los presentan a células T para reclutar su ayuda en una respuesta inmune de células T inicial. Debido al hecho de que un antígeno solo puede no ser suficiente para generar una respuesta inmune, es posible poner en contacto células presentadoras de antígeno inmaduras con un conjugado según la invención que produce la activación y maduración de las células presentadoras de antígeno, la captura del antígeno o antígenos encontrados en la entidad antigénica y la presentación de la misma en la superficie asociada al antígeno mayor de histocompatibilidad. Estas células así activadas y maduradas se pueden administrar al paciente, de modo que se produzca la presentación de los antígenos al sistema inmune del paciente, lo que finalmente produce la generación de una respuesta inmune mediada por células T.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para obtener una célula presentadora de antígeno inmunogénica específica para una entidad antigénica determinada que comprende los pasos de:

(i) poner en contacto una célula presentadora de antígeno inmadura con un conjugado según la invención en condiciones adecuadas para la estimulación de la presentación de antígeno y

(ii) recuperar la célula presentadora de antígeno inmunogénica.

El término "célula presentadora de antígeno" (CPA), como se usa aquí, se refiere a una clase de células capaces de presentar uno o más antígenos en forma de complejo péptido-MHC reconocible por células efectoras específicas del sistema inmune, e inducir de esta manera un respuesta celular efectiva contra el antígeno o antígenos que se presentan. CPA adecuadas para su uso en la presente invención incluyen tanto CPA profesionales tal como células dendríticas (CD), macrófagos y células B como CPA no profesionales tal como fibroblastos, células epiteliales tímicas, células epiteliales tiroideas, células gliales, células pancreáticas beta y células endoteliales vasculares. En una forma de realización preferida, las CPA son células dendríticas. Preferiblemente, las CPA para su uso en los métodos de la invención son células dendríticas puesto que estas son las únicas CPA que tienen la capacidad de presentar antígenos en una cantidad eficiente para activar células T indiferenciadas para respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL).

El término "inmunogénico", cuando se usa aquí para referirse a las CPA, se refiere a una célula presentadora de antígeno fenotípicamente madura con una función efectora de inmunogenicidad (Reís e Sousa C, Nature reviews, 2006; 6:476-483). Una célula presentadora de antígeno fenotípicamente madura es una CPA que expresa niveles altos en la superficie celular de moléculas de MHC, CD40, CD80, CD83 y CD86. Una función efectora de inmuno genicidad se refiere a la capacidad de cebar una respuesta inmune. Estas células se deben distinguir de las CPA tolerogénicas, que son células que, en ausencia de exposición deliberada a señales de maduración, pueden tolerizar células CD4+ y CD8+ periféricas induciendo deleción, anergia o regulación, dependiendo del sistema modelo estudiado.

El término "células dendríticas (CD)" se refiere a una población diversa de tipos de células morfológicamente similares encontrados en una variedad de tejidos linfoides y no linfoides (Steinman Ann. Rev Immunol., 1991; 9: 271-296). Las células dendríticas constituyen las CPA más potentes y preferidas en el organismo. Mientras que las células dendríticas se pueden diferenciar de los monocitos, poseen distintos fenotipos. Por ejemplo, un marcador diferenciador particular, antígeno CD14, no se encuentra en células dendríticas, pero lo poseen los monocitos. Además, las células dendríticas maduras no son fagocíticas, mientras que los monocitos son células fuertemente fagocíticas. Se ha mostrado que las CD maduras pueden proporcionar todas las señales necesarias para la activación y proliferación de células T.

Se pueden aislar o generar células dendríticas a partir de sangre o médula ósea, u órganos linfoides secundarios del sujeto, tal como pero no limitados a bazo, ganglios linfáticos, amígdalas, placas de Peyer del intestino y médula ósea, por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las CD usadas en los métodos de la invención son células dendríticas (o terminalmente diferenciadas). La fuente de células dendríticas es preferiblemente monocitos de sangre humana.

Las células inmunes obtenidas de tales fuentes típicamente comprenden predominantemente linfocitos y macrófagos recirculantes en varias fases de diferenciación y maduración. Las preparaciones de células dendríticas se pueden enriquecer por técnicas estándar (véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, 7.32.1-7.32.16, John Wiley and Sons, Inc., 1997) tal como por eliminación de células T y células adherentes, seguido por centrifugación en gradiente de densidad. Opcionalmente, las CD se pueden purificar más por separación de células marcadas con fluorescencia, o usando bolas magnéticas con MAb anti-CD83. De forma alternativa, se puede obtener un alto rendimiento de una población relativamente homogénea de CD tratando progenitores de CD presentes en muestras de sangre o médula ósea con citoquinas, tal como factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM- CSF) e interleuquina 4 (IL-4). En tales condiciones los monocitos se diferencian a células dendríticas sin proliferación celular. El tratamiento adicional con agentes tales como TNF alfa estimula la diferenciación terminal de las CD.

De forma alternativa, las células presentadoras de antígeno (CPA), incluyendo pero no limitadas a macrófagos, células dendríticas y células B, se pueden obtener mediante producción in vitro a partir de células troncales y progenitoras de sangre humana periférica o médula ósea como describen Inaba et al. (J Exp Med;\992: \16 1693-1702).

Las CPA y, en particular, células dendríticas, obtenidas de esta manera característicamente expresan el marcador de superficie celular CD83. Además, tales células característicamente expresan niveles altos de moléculas de MHC de clase II, así como los marcadores de superficie celular CD1 alfa, CD40, CD86, CD54 y CD80, pero pierden expresión de CD14. Otros marcadores de superficie celular característicamente incluyen los marcadores de células T CD2 y CD5, el marcador de células B, CD7 y los marcadores de células mieloides CD13, CD32 (Fe gamma RII), CD33, CD36 y CD63, así como un gran número de antígenos asociados a leucocitos.

Opcionalmente, se pueden usar técnicas estándar, tal como observación morfológica y tinción inmunoquímica, para verificar la presencia de las CPA y, en particular, de células dendríticas. Por ejemplo, se puede evaluar la pureza de las CPA y, en particular, células dendríticas, por citometría de flujo usando anticuerpos marcados con ñuorocromos dirigidos contra uno o más de los marcadores de superficie característicos anotados anteriormente, por ejemplo, CD83, HLA-ABC, HLA-DR, CD1 alfa, CD40 y/o CD54. Esta técnica también se puede usar para distinguir entre CD inmaduras y maduras, usando anticuerpos marcados con ñuorocromos dirigidos contra CD14, que está presente en DC inmaduras, pero no en maduras.

Se pueden obtener precursores de CPA y, en particular, de células dendríticas de un sujeto sano o un sujeto que se sabe padece una enfermedad asociada con la expresión de un antígeno particular. Tales precursores de CD pueden alogénicos o autólogos.

Una vez se han obtenido precursores de las CPA, se cultivan en condiciones apropiadas y durante un tiempo suficiente para expandir la población celular y mantener las CPA en un estado para la captación, procesamiento y presentación óptima de antígeno. En un planteamiento preferido para el cultico de precursores de CPA, las CPA se generan de tales precursores de CPA mediante cultivo ex vivo en medio sin suero o sin proteínas durante 40 horas, en ausencia de citoquinas exógenamente añadidas, como se detalla en el documento WO0127245.

Aspectos preferidos del aislamiento y cultivos de CPA incluyen el uso de medio de cultivo que carece de citoquinas exógenamente suministradas y cultivo en condiciones sin suero de una manera efectiva para producir la generación de CD superactivadas cargadas de antígeno, que son células que ya han procesado un antígeno y tienen la capacidad de presentar el antígeno a las células inmunes y generar rápidamente respuestas inmunes específicas de antígeno, por ejemplo, respuestas de células T mediadas por CTL a antígenos tumorales.

Las células dendríticas se pueden conservar por crioconservación antes o después de la exposición a las composiciones o kit de partes de la invención.

En el paso (i) del método de obtener CPA inmunogénicas de la invención, las CPA inmaduras se ponen en contacto con un conjugado de la invención. Típicamente, el paso de poner en contacto comprende la puesta en contacto/incubación de la CPA inmadura con el conjugado durante tiempo suficiente. En una forma de realización, la sensibilización se puede aumentar poniendo en contacto las CPA con proteína(s) de choque térmico (hsp) unidas de forma no covalente a la composición. Se ha demostrado que las hsp unidas de forma no covalente a moléculas antigénicas pueden aumentar la sensibilización de CPA.

La activación de las CPA se puede detectar poniendo en contacto las CPA con clones de células T que expresan un receptor de células T específico para el péptido antigénico presente en la composición y midiendo la proliferación de las células T, normalmente midiendo la incorporación de un análogo de nucleótido marcado.

Una vez que se han sensibilizado las CPA con el antígeno, las células se aislan para obtener las CPA cebadas con el antígeno. Se pueden usar marcadores de la superficie celular para aislar las células necesarias para practicar los métodos de esta invención. Por ej emplo, las CD expresan moléculas de MHC y moléculas coestimuladoras (por ejemplo B7-1 y B7-2). La expresión de marcadores de superficie facilita la identificación y purificación de estas células. Estos métodos de identificación y aislamiento incluyen FACS, cromatografía en columna y similares. Agentes de mareaje que se pueden usar para marcar antígenos celulares incluyen, pero no están limitados a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, proteínas u otros polímeros tales como matrices de afinidad, hidratos de carbono o lípidos. La detección sigue por cualquier método conocido, tal como inmunotransferencia, análisis por transferencia Western, seguimiento de marcadores radioactivos o bioluminiscentes, electroforesis capilar u otros métodos que siguen una molécula basado en tamaño carga o afinidad.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a una CPA obtenible por el método previamente mencionado.

La CPA inmunogénica cargada con antígeno obtenida usando el método de la presente invención se puede usar para activar células T CD8+ y/o células T CD4+ in vitro o se puede introducir directamente en un sujeto para activar las células T in vivo. De esta manera, en aspectos adicionales, la invención se refiere a una CPA obtenible por el método de la invención para uso en medicina así como a una vacuna o composición inmunogénica que comprende la CPA obtenible por el método de la invención. Se entenderá que, para los fines de usos médicos, las células se pueden originar del mismo individuo que se va a tratar (trasplante autólogo) o de un individuo diferente (trasplante alogénico). En el trasplante alogénico, el donante y receptor se emparejan basados en similitud antígenos HLA para minimizar la respuesta inmune de células tanto del donante como del receptor unas contra las otras.

Las CPA según la invención o las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas CPA o CD se pueden usar en un método para el tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus.

Se pueden introducir células T CD8+ educadas in vitro en un sujeto donde son citotóxicas contra células diana que tienen péptidos antigénicos correspondientes a células T activadas para reconocerlas en moléculas de MHC de clase I. Esas células diana son típicamente células infectadas con patógeno que expresan péptidos antigénicos únicos en sus superficies de MHC de clase I.

De forma similar, las células T CD4+ cooperadoras, que reconocen péptidos antigénicos en el contexto de MHC de clase II, también se pueden estimular por las CPA de la invención, que presentan péptidos antigénicos tanto en el contexto de MHC de clase I como de clase II. Las células T cooperadoras también estimulan una respuesta inmune contra una célula diana. Como con las células T citotóxicas, las células T cooperadoras se estimulan por las CP A cargadas con antígeno in vitro o in vivo.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a una célula presentadora de antígeno según la invención, para uso en un método para inducción de una respuesta celular citotóxica contra el antígeno. En otro aspecto, la invención se refiere a una célula presentadora de antígeno según la invención para uso en un método para la inducción de una respuesta celular citotóxica contra una enfermedad causada por un birnavirus.

La inmuno genicidad de las células presentadoras de antígeno o células T educadas producidas por los métodos de la invención se puede determinar por metodologías bien conocidas incluyendo, pero no limitadas a las siguientes:

- Ensayo de lisis por liberación de ⁵¹ Cr (o equivalente) para función CTL,

Ensayo para citoquinas liberadas por células T tras ponerlas en contacto con CPA modificadas,

- Educación de células T in vitro

- Modelos de animales transgénicos

- Ensayos de proliferación que miden la capacidad de células T de proliferar en respuesta a composiciones reactivas

- Seguimiento de sucesos de transducción de señales de TCR.

Las CPA se pueden usar para el tratamiento de diferentes enfermedades dependiendo del tipo de VP2 de birnavirus que forma parte de las composiciones usadas para la sensibilización de las células presentadoras de antígeno. Se han descrito previamente VP2 de birnavirus adecuadas para sensibilización. De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a las células presentadoras de antígeno de la invención para uso en el tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus. De forma alternativa, en otro aspecto, la invención se refiere al uso de células presentadoras de antígeno de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus. De forma alternativa, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad que requiere la generación de una respuesta inmune contra VP2 de birnavirus en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto de células presentadoras de antígeno de la invención. Si el antígeno usado para preparar las células presentadoras de antígeno es el dominio de proyección de VP2 de birnavirus y que carece de la región horquilla AA' derivado de IBDV, entonces la enfermedad causada por una infección de birnavirus que se puede tratar o prevenir usando las células de la invención es bursitis infecciosa.

Si el antígeno usado para preparar las células presentadoras de antígeno es el dominio de proyección de VP2 de birnavirus y que carece de la región horquilla AA' derivado de IPNV, entonces la enfermedad causada por una infección de birnavirus que se puede tratar o prevenir usando las células de la invención es necrosis pancreática infecciosa.

Preferiblemente, los métodos de tratamiento de la presente invención comprenden la denominada inmunoterapia adoptiva. El término "inmunoterapia adoptiva" se refiere a un planteamiento terapéutico para tratar una enfermedad causada por infección de birnavirus en las que las células inmunes se administran a un huésped con el fin de que las células medien directa o indirectamente inmunidad específica hacia (es decir, montar una respuesta inmune dirigida contra) las células indeseadas. Las células inmunes pueden derivar de un organismo/huésped diferente (células inmunes exógenas) o pueden ser células obtenidas del organismo objeto (células inmunes autó logas).

Las células inmunes típicamente se activan in vitro por un antígeno particular (en este caso la entidad antigénica usada en las composiciones de la invención) aplicando cualquiera de las técnicas mencionadas anteriormente para la activación de CPA in vitro. Los métodos para llevar a cabo inmunoterapia adoptiva los conocen bien los expertos en la materia (véase, por ejemplo, las patentes de EE UU No. 5.081.029, 5.985.270, 5.830.464, 5.776.451 , 5.229.1 15, 690.915 y similares). La invención contempla numerosas modalidades de inmunoterapia adoptiva. En una forma de realización, las CD (por ejemplo, aisladas del paciente o células dendríticas autólogas) se pulsan con las composiciones de la invención y después se inyectan de vuelta en el sujeto donde presentan y activan células inmunes in vivo. En aún otra forma de realización, las CD se pulsan con las composiciones de la invención y después se usan para estimular linfocitos de sangre periférica o TIL en cultivo y activan CTL dirigidas contra la entidad antigénica que se infusionan después en el paciente. De forma similar, se pulsan fibroblastos y otras CPA o células tumorales con las composiciones de la invención y se usan para activar células tumorales o PBL ex vivo para producir CTL dirigidas contra la entidad antigénica que se pueden infusionar luego en un paciente.

La inoculación de las células activadas es preferiblemente mediante administración sistémica. Las células se pueden administrar por vía intravenosa mediante un catéter venoso central o en una vena periférica grande. Otros métodos de administración (por ejemplo, infusión directa en una arteria) están en el ámbito de la invención.

Las CPA de la invención y, en particular, las células dendríticas de la invención, se pueden suministrar en una formulación que es adecuada para administración a un paciente, por ejemplo, por vía intravenosa. Las CPA y, en particular, CD de la invención, que son adecuadas para la administración a un paciente se denominan aquí una "vacuna", "vacuna de CPA" o "vacuna de CD". Una vacuna o vacuna de CD puede comprender además componentes adicionales para ayudar a modular las respuestas inmunes, o se puede procesar adicionalmente para que sea adecuada para la administración a un paciente. Los métodos de administración intravenosa de células dendríticas se conocen en la técnica, y el experto en la materia será capaz de variar los parámetros de la administración intravenosa para maximizar el efecto terapéutico de las CD administradas.

De esta manera, se administran CPA o CD a un sujeto de cualquier forma adecuada, con frecuencia con al menos un soporte farmacéuticamente aceptable. La idoneidad de un soporte farmacéuticamente aceptable se determina en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Lo más típicamente, se realizan pruebas de control de calidad (por ejemplo, ensayos microbiológicos, ensayos clonogénicos, pruebas de viabilidad) y las células se vuelven a infusionar al sujeto, en algunos casos precedido por la administración de difenilhidramina e hidrocortisona. Véase, por ejemplo, Korbling et al. Blood 1986;67:529-532 y Haas et al. Exp. Hematol 1990;18:94-98.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral tal como, por ejemplo, administración intravenosa, incluyen soluciones de inyección acuosas isotónicas estériles que pueden contener antioxidantes, tampones, bacterio statos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor deseado, así como suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. En general, se pueden administrar CPA de la invención a un sujeto a una tasa determinada por la dosis efectiva, la toxicidad del tipo celular (por ejemplo, la DL-50) y los efectos secundarios del tipo celular a varias concentraciones, según sea apropiado respecto a la masa y salud global del sujeto determinado por un experto en la materia. La administración se puede lograr a través de dosis únicas o divididas. Las CPA de la invención pueden suplementar otros tratamientos para una enfermedad o trastorno, incluyendo, por ejemplo, terapia de radiación convencional, agentes citotóxicos, análogos de nucleótidos y modificadores de respuesta biológica.

La dosis de las CPA administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención debe ser suficiente para desencadenar una respuesta terapéutica beneficiosa en un paciente durante el tiempo, o para inhibir el crecimiento de células cancerosas, o para inhibir la infección. De esta manera, las células se administran a un paciente en una cantidad suficiente para provocar una respuesta CTL efectiva al virus o antígeno tumoral y/o mejorar, reducir, curar o al menos parar parcialmente los síntomas y/o complicaciones de la enfermedad o infección. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". La dosis se determinará por la actividad de las CPA producidas y el estado del paciente, así como el peso corporal o el área de superficie del paciente a ser tratado. El tamaño de la dosis también se determinará por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que acompañe la administración de una célula particular en un paciente particular. Al determinar el número efectivo de células a ser administradas en el tratamiento o profilaxis de enfermedades tal como cáncer (por ejemplo, melanoma metastásico, cáncer de próstata, etc.), el médico necesita evaluar niveles circulantes en plasma, toxicidad de CTL, evolución de la enfermedad e inducción de respuesta inmune contra cualquier tipo celular introducido.

Antes de la infusión, se obtienen muestras de sangres y se guardan para análisis. En general, se infusionan al menos alrededor de 10 ⁴ a 10 ⁶ y, típicamente entre 10 ⁸ y 10 ¹⁰ células por vía intravenosa o intraperitoneal a un paciente de 70 kg durante aproximadamente 60-120 minutos. Preferiblemente, se usan números de células de al menos 10 ⁷ para cada punto de vacunación. Las inyecciones se pueden, por ejemplo, repetir 4 veces en un intervalo de 2 semanas y deben dar preferiblemente cerca de los ganglios linfáticos mediante inyecciones intradérmicas o subcutáneas. Se pueden realizar inyecciones de recuerdo después de una pausa de 4 semanas. Se siguen atentamente signos vitales y saturación de oxígeno por pulsioximetría. Se obtienen muestras de sangre 5 minutos y 1 hora después de la infusión y se guardan para análisis. La infusión celular se repite aproximadamente cada mes durante un total de 10-12 tratamientos en un periodo de un año. Después del primer tratamiento, las infusiones se pueden realizar de forma ambulatoria según decida el médico. Si se da la reinfusión ambulatoria, el participante se controla durante al menos 4 horas después de la terapia. Para la administración, se pueden administrar células de la presente invención a una tasa determinada por la DL-50 (u otra medida de toxicidad) del tipo celular, y los efectos secundarios del tipo celular a varias concentraciones, como se aplica a la masa y la salud general del paciente. La administración se puede logar mediante dosis individuales o divididas. En algunas pautas, los pacientes pueden recibir opcionalmente además una dosis adecuada de un modificador de respuesta biológica incluyendo, pero no limitado a las citoquinas IFN-a, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, TNF u otro factor de crecimiento citoquina, TGF-β antisentido, IL-10 antisentido y similares.

La invención se describe aquí a modo de los siguientes ejemplos que se deben considerar solamente ilustrativos y no limitantes del ámbito de la invención.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Expresión y purificación de P HT mAV.

Esta construcción comprende el dominio P unido a la secuencia de monoavidina, con un tag de 6 histidinas entre ambos elementos para facilitar su purificación. Las construcciones pOTATOl incluyen el péptido señal de la proteína GP67 del baculovirus AcMNPV en el extremo amino terminal de la proteína de interés para secretarla al medio de cultivo. La proteína producida por esta construcción tendría la siguiente secuencia de aminoácidos:

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADPGSDRPRVYTITAADDY QFSSQYQ PGGVTITLFSANIDAITSLSVGGELVFRTSVHGLVLGATIYLIGFDGTTVITRAVAANNG LTTG TDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSARGSLAVTIHGGLEACA SGRL VPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMAR KCSL TGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYITAVTATSNEIKESPLHGTQATINKRTQPTFGF TVNW KFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDKKATRVGI I FTRLRTQKE (SEQ ID NO: 16)

La sequencia correspondiente al fragmento P de VP2 se representa subrayada, la etiqueta de histi dinas en negrita, y la secuencia de monoavidina en doble subrayado. El péptido señal se representa en cursiva. Tras su procesamiento la proteína madura y secretada al medio tendría la siguiente secuencia de aminoácidos:

ADPGSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSA I DAITSLSVGGELVFRTSVHGLVLGA TIYLIGFDGTTVITRAVAANNGLTTGTDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGG QAGD QMSWSARGSLAVTIHGGLEACASGRLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF LGHH HHHHDYDI PTTENLYFQGAMARKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYITAVTATSNEI KESPLHGTQATI KRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFI DRNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGD DKKATRVGINIFTRLRTQKE (SEQ ID NO:17)

La proteína recombinante, que se secreta al medio de cultivo, se purificó usando una resina de afinidad de cobalto.

La figura 3 se muestra la proteína purificada, tanto en SDS-PAGE teñida con Coomassie como detectada por western-blot. En el caso de esta proteína se puede observar una banda del doble de tamaño que correspondería a un dímero de la misma.

EJEMPLO 2

Acoplamiento de P HT mAV y oligonucleótido CpG biotinilado

Para comprobar si la parte mAV del conjugado se une a oligonucleótido CpG biotinilado se combinó 1 μg de la proteína purificada con diferentes cantidades de un oligonucleótido CpG biotinilado. El oligonucleótido CpG biotinilado usado fue Biotin ODN 2006 (InvivoGen, San Diego, CA-EE UU) . S u s e cuen ci a e s : 5 '- TCGTCGT T T TGTCGT T T TGTCGT T-3' (SEQ ID NO:8) marcado con biotina en el extreme 3' (las bases son fosforotioato).

P HT mAV se incubó 45 minutos a temperatura ambiente con CpG a una relación molecular de 1 :0 (sin CpG), 1 : 1, 1 :2 y 1 :4. La unión se comprobó por cambios en la movilidad de la proteína en electroforesis en gel agarosa al 0,7% nativa seguida por inmunotransferencia (figura 4). Se pudo detectar un cambio en la movilidad de la proteína incluso a una relación molecular de 1 : 1, lo que indica que se producía el acoplamiento.

EJEMPLO 3

Expresión y purificación de FlagA HT P.

Se sintetizó una proteína de fusión formada por Flagelina A de AUivibrio salmonicida unida a la secuencia del fragmento P de VP2, con una etiqueta de 6 histidinas entre ambos elementos. En esta construcción es el fragmento P el que está fusionado al extremo carboxilo terminal de Flagelina.

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAAOPGVNVNTNVAAMTAQRY NNATNO LNNSMERLSSGTKINSAKDDAAGLQI SNRLTAQTRGLDVAMRNANDGISIAQTAEGAMNESTNI LQRMRDLSLQAANGSNSNQDRSSIQEEVHALSDELNRIAETTSFGGRRLLNGQFGESAFQ IGAN SGEAILIKLPSVRSDDDSMGGQRFVSENGKTAEWNVETGKNDLKLEFTTKKGEAVSININ AKAG DDIEELATYINGQSDKISASVGDEGKLQLFVAEPSIEGELAVSGNLASELGLAGGVGTKA TVDK LDVTSVGDAQVSIGVIDSALAYIDRERADLGAKQNRLGHSINNLSNIQENVSASNSRIKD TDFA KETTNMTKAQILQQSSTSILAQAKQLPNAALKLLQLEACASGRLVPRGSPGSGYIPEAPR DGQA YVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHDYDI PTTENLYFQGAMGSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQPGG VTITLFSANI DAITSLSVGGELVFRTSVHGLVLGATIYLIGFDGTTVITRAVAANNGLTTGTDN LMPFNLVI PTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSARGSLAVTIH ( SEQ ID NO:18)

La secuencia correspondiente al fragmento P de VP2 se representa en doble subrayado, la etiqueta de histidinas en negrita y la secuencia de flagelina A con subrayado sencillo. El péptido señal se representa en cursiva. Tras su procesamiento la proteína madura tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ADPGVNVNTNVAAMTAQRYLNNATNDLNNSMERLSSGTKINSAKDDAAGLQISNRLT AQTRGLD VAMRNANDGISIAQTAEGAMNESTNILQRMRDLSLQAANGSNSNQDRSSIQEEVHALSDE LNRI AETTSFGGRRLLNGQFGESAFQIGANSGEAILIKLPSVRSDDDSMGGQRFVSENGKTAEW NVET GKNDLKLEFTTKKGEAVSI INAKAGDDIEELATYI GQSDKI SASVGDEGKLQLFVAEPSIEG ELAVSGNLASELGLAGGVGTKATVDKLDVTSVGDAQVSIGVIDSALAYI DRERADLGAKQNRLG HSINNLSNIQENVSASNSRIKDTDFAKETTNMTKAQILQQSSTSILAQAKQLPNAALKLL QLEA CASGRLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHDYDIPTTENLYF QGAM GSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSANI DAITSLSVGGELVFRTSVHGLVLGATIY LIGFDGTTVITRAVAANNGLTTGTDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAG DQMS WSARGSLAVTIH (SEQ ID NO:19)

En la figura 5 se muestra la proteína purificada, tanto en SDS-PAGE teñida con Coomassie como detectada por western-blot.

EJEMPLO 4

Expresión y purificación de IgYFc2-4_HT_P.

Se construyó una proteína de fusión que comprende los dominios Fcu2-4 de IgY de Gallus gallus fusionados al dominio P de VP2 con una etiqueta de 6 histidinas entre ambos elementos. En esta construcción también está el dominio P en la mitad carboxilo terminal del modelo.

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAAOPGVCRVOPVPPVAPEVQ V HPSSC TPSQSESVELLCLVTGFSPASAEVEWLVDGVGGLLVASQSPAVRSGSTYSLSSRVNVSGT DWRE GKSYSCRVRHPATNTVVEDHVKGCPDGAQSCSPIQLYAI PPSPGELYISLDAKLRCLWNLPSD SSLSVTWTREKSGNLRPDPMVLQEHFNGTYSASSAVPVSTQDWLSGERFTCTVQHEELPL PLSK SVYRNTGPTTPPLIYPFAPHPEELSLSRVTLSCLVRGFRPRDIEIRWLRDHRAVPATEFV TTAV LPEERTANGAGGDGDTFFVYSKMSVETAKWNGGTVFACMAVHEALPMRFSQRTLQKQAGK LEAC ASGLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHDYDIPTTENLYFQG AMGS DRPRVYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSANI DAITSLSVGGELVFRTSVHGLVLGATIYLI GFDGTTVITRAVAANNGLTTGTDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQ MSWS ARGSLAVTIH (SEQ ID NO:20)

La secuencia correspondiente al fragmento P de VP2 se representa en doble subrayado, la etiqueta de histidinas en negrita y la secuencia del fragmento de IgY subrayado. El péptido señal se representa en cursiva. Tras su procesamiento la proteína madura tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ADPGVCRVDPVPPVAPEVQVLHPSSCTPSQSESVELLCLVTGFSPASAEVEWLVDGV GGLLVAS QSPAVRSGSTYSLSSRVNVSGTDWREGKSYSCRVRHPATNTWEDHVKGCPDGAQSCSPIQ LYA I PPSPGELYI SLDAKLRCLVVNLPSDSSLSVTWTREKSGNLRPDPMVLQEHFNGTYSASSAVPV STQDWLSGERFTCTVQHEELPLPLSKSVYRNTGPTTPPLIYPFAPHPEELSLSRVTLSCL VRGF RPRDIEIRWLRDHRAVPATEFVTTAVLPEERTANGAGGDGDTFFVYSKMSVETAKWNGGT VFAC MAVHEALPMRFSQRTLQKQAGKLEACASGLVPRGSPGSGYI PEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTF L GHHHHHHDYDI PTTENLYFQGAMGSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQPGGVTITLFSANIDAIT SLSVGGELVFRTSVHGLVLGATIYLIGFDGTTVITRAVAANNGLTTGTDNLMPFNLVIPT NEIT QPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSARGSLAVTIH (SEQ ID NO:21)

En la figura 6 se muestra la proteína purificada, tanto en SDS-PAGE teñida con Coomassie como detectada por western-blot.

EJEMPLO 5

Expresión y purificación de IgYFc3-4_HT_P.

Esta construcción es similar a la descrita en el ejemplo 4, pero con un fragmento de la inmunoglobulina Y menor, que comprende sólo los dominios Fcu3 y 4. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura y secretada al medio sería la siguiente:

ADPGCPDGAQSCSPIQLYAIPPSPGELYISLDAKLRCLVVNLPSDSSLSVTWTREKS GNLRPDP MVLQEHFNGTYSASSAVPVSTQDWLSGERFTCTVQHEELPLPLSKSVYRNTGPTTPPLIY PFAP HPEELSLSRVTLSCLVRGFRPRDIEIRWLRDHRAVPATEFVTTAVLPEERTANGAGGDGD TFFV YSKMSVETAKWNGGTVFACMAVHEALPMRFSQRTLQKQAGKLEACASGLVPRGSPGSGYI PEAP RDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHDYDIPTTENLYFQGAMGSDRPRVYTITAADDYQ FSSQ YQPGGVTITLFSANIDAITSLSVGGELVFRTSVHGLVLGATIYLIGFDGTTVITRAVAAN NGLT TGTDNLMPFNLVIPTNEITQPITSIKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSARGSLAVTIH (SEQ ID NO: 22)

La secuencia correspondiente al fragmento P de VP2 se representa en doble subrayada, la etiqueta de histidinas en negrita, y la secuencia del fragmento Fcu3-4 de IgY, en subrayado sencillo.

En la figura 7 se muestra la proteína purificada, tanto en SDS-PAGE teñida con Coomassie como detectada por western-blot. EJEMPLO 6

Construcción de Pgm97_mAV_HT:

Esta construcción introduce algunos cambios con respecto a las anteriores. La secuencia de DNA está optimizada para la expresión en células de insecto, el fragmento P de VP2 corresponde a la cepa virulenta GM97, y la etiqueta de 6 histidinas está en el extremo carboxilo terminal. Además entre las secuencias del fragmento P, del monómero de avidita y la etiqueta de histidinas se introducen unos espaciadores. El péptido señal es el mismo que en las construcciones pOTATO l , es decir, el de la proteína GP67 del baculovirus AcMNPV.

MILVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAAOPPGSDRPRVYTITAADD YQ FSSQYQSGGVTITLFSANIDAITSLSVGGELVFQTSVQGLILGATIYLIGFDGTTVITR AVAANNGLTAGTDNLMPFNLVI PTNEITQPITS IKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSVSGSL AVTIHLESEFAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPWKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRG EFTGTYITAVTATSNEIKESPLHGTQATINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFID RNGKEVLKTMWLLRSSVNDIGDDKKATRVGINIFTRLRTQKESRAVDAEAAAKEAAAKA TSSGTHHHHHH (SEQ ID NO: 23)

La secuencia correspondiente al fragmento P de VP2 se representa con subrayado sencillo, la etiqueta de histidinas en negrita, y la secuencia de monoavidina con subrayado sencillo. El péptido señal se representa en cursiva. Tras su procesamiento la proteína madura tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

ADPPGSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQSGGVTITLFSANIDAITSLSVGGELVF QTSVQGLILGATIYLIGFDGTTVITRAVAANNGLTAGTDNLMPFNLVI PTNEIT QPITS IKLEIVTSKSGGQAGDQMSWSVSGSLAVTIHLESEFAEAAAKEAAAKEA AAKEAAAKAPWKCSLTGKWTNDLGSNMTIGAVNSRGEFTGTYITAVTATSNEIK ESPLHGTQATINKRTQPTFGFTVNWKFSESTTVFTGQCFIDRNGKEVLKTMWLL RSSVNDIGDDKKATRVGINIFTRLRTQKESRAVDAEAAAKEAAAKATSSGTHHH HHH (SEQ ID NO:24) En la figura 8 se muestra la proteína purificada, tanto en SDS-PAGE teñida con Coomassie como detectada por western-blot.

EJEMPLO 8

Inmunización de pollos con P HT mAV e infección de provocación

La inmunización de pollos se lleva a cabo esencialmente como describen Martinez-Torrecuadrada JL. et al. (Vaccine, 2003, 21 :3342-3350).

La cantidad requerida de antígeno se emulsiona con aceite en 0,5 mi para cada dosis de vacuna. Se usa una vacuna inactivada comercial HipraGumboro-BPL2, que contenía virus IBDV completo inactivado, como una vacuna estándar.

Los ensayos fueron realizados mediante inmunización intramuscular de pollos de 14 días de edad empleando dosis de 5 y 25 μg de la la proteína sin acoplar P HT mAV (VP2-P) o acoplada a CpG-ODN biotinilado (VP2-P) en grupos de 25 animales por proteína y dosis. Tras un periodo de 18 días los pollos fueron desafiados con una dosis LD50% de una cepa virulenta de IBDV. Los resultados descritos en la figura muestran la mortandad acumulada durante los 10 días posteriores al desafío tras el cual no se produjeron más bajas. Estos resultados indican que la inmunización con P HT mAV (VP2-P) acoplada a CpG-ODN inducen un cierto nivel de protección frente a al desafío con una cepa virulenta de IBDV.