LINZMAYER-HIRT, Pola (Maurer Langegasse 15, Wien, A-1230, AT)
SCHMIDT, Walter (Böcklinstrasse 19, Wien, A-1020, AT)
WANKO, Bettina (Freundgasse 4-6/3, Wien, A-1040, AT)
WINSAUER, Gabriele (Laurenzgasse 6/12, Wien, A-1050, AT)
WOESS, Christina (Hasnerstrasse 124a/5/5, Wien, A-1160, AT)
BRUNNER, Sylvia (Lange Gasse 67/20, Wien, A-1080, AT)
LINZMAYER-HIRT, Pola (Maurer Langegasse 15, Wien, A-1230, AT)
SCHMIDT, Walter (Böcklinstrasse 19, Wien, A-1020, AT)
WANKO, Bettina (Freundgasse 4-6/3, Wien, A-1040, AT)
WINSAUER, Gabriele (Laurenzgasse 6/12, Wien, A-1050, AT)
WOESS, Christina (Hasnerstrasse 124a/5/5, Wien, A-1160, AT)
| Patentansprüche : 1. Vakzin umfassend mindestens ein von der Aminosäuresequenz TLGTNFGRCVDLFAPGEDIIGASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIA (SEQ ID Nr . 1) abgeleitetes Peptid mit einer Mindestlänge von 7 Aminosäuren, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz DIIGA (SEQ ID Nr. 2) und/oder CFVSQSG (SEQ ID Nr. 3) von SEQ ID Nr. 1 mitumfasst. 2. Vakzin nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus II- GASSDCSTCFVSQSG (SEQ ID Nr. 5), DLFAPGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr . 6), STCFVSQSGTSQAAAH (SEQ ID Nr. 7), LFAPGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr . 8), FAPGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr. 9), APGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr . 10), PGEDIIGAC (SEQ ID Nr. 11), GEDIIGASSDC (SEQ ID. Nr. 12), EDII- GASSDC (SEQ ID Nr. 13), DIIGASSDC (SEQ ID Nr. 14), STCFVSQSGTSQAAA (SEQ ID Nr. 15), STCFVSQSGTSQAA (SEQ ID Nr . 16), STCFVSQSGTSQA (SEQ ID Nr. 17), STCFVSQSGTSQ (SEQ ID Nr. 18), STCFVSQSGTS (SEQ ID Nr. 19), STCFVSQSGT (SEQ ID Nr . 20), STCFVSQSG (SEQ ID Nr . 21), TCFVSQSGT (SEQ ID Nr . 22) und CFVSQSG (SEQ ID Nr. 23) . 3. Vakzin nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid am C-Terminus und/oder am N-Terminus einen Cystein- rest aufweist. 4. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise an KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) , gekoppelt ist. 5. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid zur intradermalen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung formuliert ist. 6. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit einem Adjuvans, vorzugsweise mit Aluminiumhydroxid, formuliert ist. 7. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid in einer Menge von 0 , 1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 μg, im Vakzin enthalten ist. 8. Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Behandlung und/oder Prävention von durch Atherosklerose verursachten Störungen, insbesondere kardiovaskulären Erkrankungen, Schlaganfällen oder peripheren vaskulären Erkrankungen. 9. Peptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert. 10. Peptid nach Anspruch 9 zur Behandlung und/oder Prävention von durch Atherosklerose verursachten Störungen, insbesondere kardiovaskulären Erkrankungen, Schlaganfällen oder peripheren vaskulären Erkrankungen. 11. Isolierter Antikörper gerichtet gegen ein Peptid nach Anspruch 10. 12. Verwendung eines Peptids nach Anspruch 9 oder eines Antikörpers nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von durch Atherosklerose verursachte Störungen, insbesondere kardiovaskulären Erkrankungen, Schlaganfällen oder peripheren vaskulären Erkrankungen. |
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vakzin zur Behandlung oder Verhinderung von gesundheitlichen Problemen, die durch Atherosklerose verursacht werden können, insbesondere Schlaganfall, kardiovaskuläre Erkrankungen (die zu Herzinfarkt führen können), sowie Erkrankungen peripherer Gefäße („peripheral vas- cular disease") .
Erkrankungen aufgrund von Atherosklerose, vor allem Erkrankungen der Herzkranzgefässe, sind mit -50% die häufigste Todesursache in der westlichen Welt. Atherosklerose ist unter anderem durch die Ablagerung von Lipid-Partikeln in großen Arterien gekennzeichnet. In einem vielstufigen Prozess, der über viele Jahre bis Jahrzehnte andauert, führt Atherosklerose zur Verengung der betroffenen Gefäße. Je nach Lage der Gefäße können kardiovaskuläre Erkrankungen (Herzinfarkt) , Schlaganfall und periphere vaskuläre Erkrankungen die Folge sein. Eine Hauptursache für Atherosklerose sind durch Lebensstil (v.a. wenig Bewegung, fettreiche Ernährung, Rauchen) und/oder genetische Faktoren bedingte Probleme mit dem FettstoffWechsel, d.h. zu hohes Gesamtcholesterin beziehungsweise insbesondere zu hohe Werte an LDLc („Low Density Lipoprotein Cholesterol") in Kombination mit niedrigen HDLc-Werten („High Density Lipoprotein Cholesterol" ) .
Hohe LDLc-Werte korrelieren direkt mit dem Auftreten von kardiovaskulären Erkrankungen. Die häufigste Form von erblich bedingten zu hohen LDLc-Spiegeln ist die Autosomal-dominante Hy- percholesterinämie (ADH) . Damit in Zusammenhang stehen drei Gene: der LDL-Rezeptor (LDLR) , Apolipoprotein B-100 (der Ligand für den LDLR) sowie die Proteinkonvertase PCSK9 ( „proprotein convertase subtilisin kexin 9") .
Zur Familie der sekretorischen Proproteinkonvertasen (PC) gehören sieben für basische Aminosäuren spezifische Subtilisin- ähnliche Serin-Proteinasen ( „subtilisin-like serine proteina- ses w ), nämlich PCl/3, PC2 , Furin, PC4, PC5/6, PACE4 and PC7. Außerdem gehören zwei weitere PC dazu, die an nicht-basischen Aminosäuren schneiden, nämlich SKI-1/S1P und PCSK9 (auch NARC-I ( "neural apoptosis-regulated convertase 1") genannt).
Mit Ausnahme von PC4 werden die Konvertasen im Gehirn und peripheren Organen exprimiert. Sie haben unterschiedliche Funk- tionen, beispielsweise für die Produktion von Neuropeptiden, Wachstumsfaktoren, Zytokinen, Rezeptoren, bei der Zelladhäsion und Zellmigration sowie Wachstum und Differenzierung von Vorläuferzellen. Für etliche Konvertasen ist bekannt, dass sie bei Erkrankungen wie Krebs, oder auch bei viralen Infektionen eine Rolle spielen. Konditionelles Ausschalten von PC5/6 in Mäusen führt zu Fehlbildungen und Knochendefekten in Embryos, was vermutlich auf ausbleibendes Prozessieren des Wachstumsdifferenzierungsfaktors 11 („growth differention factor 11") zurückzuführen ist.
Einige Mitglieder der Familie der Konvertasen beeinflussen auch den LipidstoffWechsel :
- SKI-1/S1P aktiviert die Synthese von Cholesterin und Fettsäuren sowie des LDL Rezeptors (LDLR)
- Furin, PC5 und PACE4 inaktivieren endotheliale Lipase sowie Lipoprotein-Lipase
- PCSK9 inaktiviert den Low Density Lipoprotein Rezeptor (LDLR) .
Das Gen für das humane PCSK9-Protein ist auf Chromosom Ip32.3 lokalisiert. Das Gen ist circa 22 Kilo-Basenpaare lang und kodiert für ein 692 Aminosäuren (AS) langes Glykoprotein. Die Expression von PCSK9 wird durch "sterol regulatory element binding proteins" (SREBPs) und Statine reguliert, was auch bei anderen im CholesterinstoffWechsel wichtigen Genen der Fall ist. PCSK9 wird hauptsächlich in der Leber, aber auch in Dünndarm und Niere exprimiert und sekretiert. Das 74 kDa große Pro-Protein wird im endoplasmatischen Retikulum autokatalytisch prozessiert, dabei entsteht das etwa 60 kDa große Protein.
PCSK9 besteht aus
- einem 30 AS langen Signalpeptid
- der Propeptid- oder inhibitorisehen Domäne (AS 31-152)
- der „subtilisin-like catalytic domain" (AS 153-452) und
- der C-terminalen Domäne ("cystein-rich unique C-terminal domain", CRD, AS 453-692).
PCSK9 spielt eine entscheidende Rolle im Cholesterinstoff- wechsel, da es direkt die Menge an vorhandenem LDLR auf den Leberzellen reguliert. Der LDLR ist ein in der Plasmamembran lokalisiertes Glykoprotein, das cholesterinreiche LDLc-Partikel durch Endozytose aus dem Plasma entfernt. Das Binden von PCSK9 führt zur Aufnahme des LDLR in die Leberzellen und anschließend zu dessen Abbau in Lysosomen im Gegensatz zum Recycling Richtung Zelloberfläche, das ohne Bindung von PCSK9 stattfinden würde.
Zusätzlich scheint PCSK9 einen Einfluss auf die Rezeptoren für ApoE (ApoER2) und VLDL ( „Very Low Density Lipoprotein") zu haben .
In in vivo Experimenten in Mäusen wurde gezeigt, dass die Menge an PCSK9 in humanem Plasma ausreicht, um die Menge an LDLR auf den Leberzellen zu reduzieren. Außerdem wurden in den letzten Jahren einige natürlich vorkommende Mutationen im PCSK9-Gen identifiziert, die zu verstärkter ( „gain-of-function mutations") bzw. verminderter ( „loss-of-function mutations") Aktivität des Proteins führen.
Sowohl im Menschen als auch in Mäusen führen „gain of func- tion mutations" zu verringerten Mengen an LDLR in der Leber. Das verursacht große Mengen an LDLc im Plasma (Hypercholesterinä- mie) , was eine Prädisposition für atherosklerotische Erkrankungen der Herzkranzgefäße (Koronare Herzkrankheit, KHK) hervorruft.
Die Über-Expression von PCSK9 in Mäusen führt zu höheren LDLc-Spiegeln. Auch die Administration von rekombinant hergestelltem PCSK9-Protein reduziert im Mausmodell die Anzahl der LDL-Rezeptoren dramatisch.
„Loss of function mutations" bewirken größere Mengen an LDLR, was zu geringeren LDLc Werten führt. Diese Hypoeholesteri- nämie erweist sich als Schutz vor Erkrankungen der Herzkranzgefäße.
„Nonsense"-Mutationen sind in manchen Bevölkerungsgruppen häufig anzutreffen, z.B. haben circa 2% der Afro-Amerikaner eine von zwei Mutationen, die zu einer Verringerung der LDLc-Spiegel um -30% führt. In Kaukasiern ist eine „missense" -Mutation bekannt, die das LDLc um ~15% erniedrigt. Diese geringeren LDLc Mengen führen zu einer deutlich verringerten Inzidenz an KHK.
PCSK9-„knock-out"-Mäuse haben mehr LDLR auf ihren Leberzellen und reduzierte Mengen an LDLc im Plasma. Auch die Inhibierung von PCSK9 führt zu einer signifikanten Reduktion von Gesamt-Cholesterin und LDLc in Mäusen, die auf fettreiches Futter gesetzt werden. Gleichzeitig wird die Menge an LDLR in der Leber verdoppelt .
Es sind derzeit keine negativen Auswirkungen eines Fehlens von PCSK9 bekannt. . Angeborener homozygoter „knock-out" von PCSK9 führt im Menschen zu extrem geringen Werten an LDLc ohne erkennbare Nebenwirkungen. Die Inhibierung von PCSK9 , beispielsweise durch Antisense-Oligonukleotide, „small molecule inhibitors" oder Antikörper, stellt daher ein attraktives Ziel dar. Damit sollen die Auswirkungen von Atherosklerose, vor allem kardiovaskuläre Erkrankungen, verringert werden. Dieser therapeutische Ansatz ist sowohl als Einzeltherapie als auch in Kombination z.B. mit Statinen (die das PCSK9-Protein hochregulieren) oder auch mit Medikamenten, die den HDLc Spiegel beeinflussen, vorstellbar.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Verfügung zu stellen, die geeignet sind den Gehalt an PCKS9 und infolgedessen von LDLc zu reduzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Vakzin umfassend mindestens ein von der Aminosäuresequenz TLGTNFGRCVDLFAPGEDII- GASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIA (SEQ ID Nr. 1) abgeleitetes Peptid mit einer Mindestlänge von 7 Aminosäuren, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz DIIGA (SEQ ID Nr. 2) und/oder CFVSQSG (SEQ ID Nr. 3) von SEQ ID Nr. 1 mitumfasst.
Es hat sich gezeigt, dass Peptide mit mindestens 7 Aminosäureresten, welche von SEQ ID Nr. 1 abgeleitet sind und entweder SEQ ID Nr. 2 oder SEQ ID Nr. 3 umfassen, in der Lage sind, in einem Säugetier und in einem Menschen die Bildung von Antikörpern gerichtet gegen PCSK9 zu induzieren. Die durch Verabreichung gebildeten Antikörper sind in der Lage, an einen Teil von PCKS9 zu binden, der für die Bindung von PCKS9 an den LDL- Rezeptor verantwortlich ist. Dadurch soll der PCSK9-vermittelte Abbau von LDLR verhindert und die Menge an LDLc reduziert werden, was wiederum zur Folge hat, dass Erkrankungen, die Folge eines erhöhten LDLc-Levels sind (z.B. kardiovaskuläre Erkrankungen) , behandelt werden können bzw. dass auch vorbeugend behandelt werden könnte.
Peptide, die von SEQ ID Nr. 1 abgeleitet sind, jedoch weder SEQ ID Nr. 2 noch SEQ ID Nr . 3 umfassen, zeigen überraschenderweise die erfindungsgemäßen Effekte nicht oder nur unzureichend.
Das erfindungsgemäße Peptid, welches sowohl SEQ ID Nr. 2 als auch SEQ ID Nr. 3 umfasst, weist die zwischen beiden Sequenzen befindlichen und von SEQ ID Nr. 1 abgeleiteten Aminosäurereste ebenfalls auf.
Der Begriff „von der Aminosäuresequenz TLGTNFGRCVDLFAPGEDII- GASSDCSTCFVSQSGTSQAAAHVAGIA (SEQ ID Nr. 1) abgeleitetes Peptid" bezieht sich auf Peptidfragmente von SEQ ID Nr. 1, die eine Mindestlänge von 7 Aminosäureresten aufweisen. Diese Peptide können auch eine Mindestlänge von 8, 9, 10, 11 oder 12 Aminosäuren umfassen. Andererseits umfassen die erfindungsgemäßen Peptide vorzugsweise maximal 47, 45, 43, 40 oder 35 Aminosäuren. Bevorzugte Peptide weisen eine Länge von 8 bis 20, noch bevorzugter 9 bis 17, insbesondere 10 bis 15, Aminosäuren auf.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IIGASSDCSTCFVSQSG (SEQ ID Nr. 5), DLFAPGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr. 6), STCFVSQSGTSQAAAH (SEQ ID Nr . 7), LFAPGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr. 8) , FAPGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr . 9), APGEDIIGASSDC (SEQ ID Nr. 10), PGEDIIGAC (SEQ ID Nr. 11), GEDIIGASSDC (SEQ ID. Nr. 12), EDIIGASSDC (SEQ ID Nr. 13), DIIGASSDC (SEQ ID Nr. 14), STCFVSQSGTSQAAA (SEQ ID Nr. 15), STCFVSQSGTSQAA (SEQ ID Nr. 16), STCFVSQSGTSQA (SEQ ID Nr. 17), STCFVSQSGTSQ (SEQ ID Nr . 18), STCFVSQSGTS (SEQ ID Nr. 19), STCFVSQSGT (SEQ ID Nr . 20), STCFVSQSG (SEQ ID Nr. 21), TCFVSQSGT (SEQ ID Nr. 22) und CFVSQSG (SEQ ID Nr. 23) . Insbesondere das Peptid STCFVSQSGTSQAAAH (SEQ ID Nr. 7) und dessen C-terminale Deletionsderivate mit zumindest 9 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 21) haben sich als besonders geeignet herausgestellt .
Das erfindungsgemäße Peptid weist vorzugsweise am C-Terminus und/oder am N-Terminus einen Cysteinrest auf, ein Cysteinrest kann z.B. auch am N- und/oder C-Terminus angefügt sein. Cystein- reste können beispielsweise zur Zyklisierung der Peptide verwendet werden. Ferner können an die SH-Gruppen der Cysteinreste, vorzugsweise an die N- oder C-terminalen Cysteinreste, weitere Substanzen gekoppelt werden. Der Cysteinrest kann dabei ein in natürlicher Weise an dieser Stelle vorkommender Cysteinrest sein oder aber am N- oder C-Terminus einer aus der nativen Sequenz entstammenden Sequenz angehängt sein. Es ist aber selbstverständlich auch möglich, über ein internes Cystein zu koppeln.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das erfindungsgemäße Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger gekoppelt, vorzugsweise an KLH (Keyhole Lim- pet Hemocyanin (Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin) (z.B. mit NHS-PEO4-Maleimiden oder anderen den Fachleuten auf dem Ge ¬ biet bekannten geeigneten Linkern) ) , Tetanus-Toxoid, Albumin- bindendes Protein, Serumalbumin, ein Dendrimer (MAP; Biol., Chem. 358: 581), Peptid-Linker (oder flankierende Regionen) sowie Adjuvans-Substanzen, die in Singh et al . , Nat . Biotech. 17(1999): 1075-1081 (insbesondere jene in Tabelle 1 dieses Dokuments) und O 'Hagan et al . , Nature Reviews Drug Discovery 2 (9) (2003) : 727-735 geoffenbart sind (insbesondere die endogenen immunverstärkenden Verbindungen und Abgabesysteme, die darin beschrieben sind) oder Mischungen davon.
Außerdem kann die Vakzin-Zusammensetzung mit einem Adjuvans, vorzugsweise einer wenig löslichen Aluminium-Zusammensetzung, insbesondere Aluminiumhydroxid, formuliert werden. Natürlich können auch Adjuvantien wie MF59, Aluminiumphosphat, Calcium- phosphat, Cytokine (z.B. IL-2, IL-12, GM-CSF), Saponine (z.B. QS21) , MDP-Derivate, CpG-Oligos, LPS, MPL, Polyphosphazene, Emulsionen (z.B. Freundsches Adjuvans, SAF), Liposome, Virosome, Iscome, Cochleate, PLG-Mikropartikel, Poloxamer-Partikel, Virusartige Partikel, Hitze-instabiles Enterotoxin (LT) , Cholera- Toxin (CT), mutierte Toxine (z.B. LTK63 und LTR72), Mikroparti- kel und/oder polymerisierte Liposome, verwendet werden.
Weitere geeignete Adjuvantien können beispielsweise Purcell W et al. (Nature Reviews Drug Discovery 6 (2007) : 404-414) , insbesondere Box 2, entnommen werden.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise an den Träger oder das Adjuvans über einen Linker gebunden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NHS-poly (Ethylen- oxid) (PEO) (z.B. NHS-PEθ 4 -Maleimid) . Die Konjugations-Chemie (z.B. über heterobifunktionelle Verbindungen, wie GMBS, und natürlich auch andere, wie sie etwa in „Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson beschrieben sind) kann in diesem Zusammenhang aus dem Fachmann bekannten Reaktionen ausgewählt werden. Die ko- valente Konjugation wird vorzugsweise über den (die) N- oder C- terminale(n) Cysteinrest (e) etabliert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid zur intradermalen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung am Menschen formuliert.
Ein Vakzin, das das erfindungsgemäße Peptid umfasst, kann auf jede geeignete Anwendungsweise, beispielsweise i.d., i.V., i.p., i.m., intranasal, oral, subkutan, usw., und mit jeder geeigneten Abgabevorrichtung verabreicht werden (O 'Hagan et al . , Nature Reviews Drug Discovery 2 (9) (2003) : 727-735) . Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist besonders bevorzugt zur intravenösen, subkutanen, intradermalen oder intramuskulären Verabreichung formuliert (vgl. z.B. „Handbook of Pharmaceutical Manufac- turing Formulations" , Sarfaraz Niazi, CRC Press Ine, 2004).
Typischerweise enthält das Vakzin das erfindungsgemäße Peptid in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 μg, oder alternativ z.B. 100 fmol bis 10 μmol, vorzugsweise 10 pmol bis 1 μmol, insbesondere 100 pmol bis 100 nmol . Typischerweise kann das Vakzin auch HilfsSubstanzen, z.B. Puffer, Stabilisatoren usw., enthalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungs- gemäße Vakzin zur Behandlung und/oder Prävention von kardiovaskulären Erkrankungen sowie anderen durch Atherosklerose hervorgerufenen Störungen, insbesondere kardiovaskulären Erkrankungen, Schlaganfällen und peripheren vaskulären Erkrankungen (siehe Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, 261.) geeignet.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Patentanmeldung betrifft ein Peptid wie oben definiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur ein Vakzin der eingangs beschriebenen Art sondern auch die darin enthaltenen Peptide.
Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich zur Behandlung und/oder Prävention von durch Atherosklerose verursachten Krankheiten, insbesondere Schlaganfall, kardiovaskulären Erkrankungen, sowie Erkrankungen peripherer Gefäße.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen isolierten Antikörper gerichtet gegen ein erfindungsgemäßes Peptid.
Anstelle der erfindungsgemäßen Peptide können auch Antikörper eingesetzt werden, die in der Lage sind, an diese Peptide zu binden. Derartige Antikörper binden nicht nur an die Peptide sondern auch an das im Körper vorhandene PCSK9-Protein.
Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise monoklonale Antikörper. Solche Antikörper, welche homogene Populationen von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen sind, können mittels jeder Technik erhalten werden, welche die Produktion von Antikörper-Molekülen erlaubt. Zu diesen zählen beispielsweise die Hybridom-Technik von Köhler und Milstein (Na- ture 256 (1975) :495-497 und U.S. Pat. Nr. 4,376,110), die Human- B-Zell-Hybridom-Technik (Kosbor et al . , Immunology Today 4 (1983) :72; CoIe et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) :2026-2030) und die EBV-Hybridom-Technik (CoIe et al . , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., (1985) : 77-96) . Solche Antikörper können zu jeder ImmunglobulinKlasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, IgD, und jeder Unterklasse derselben gehören. Das die mAk dieser Erfindung erzeugende Hybridom kann in vitro oder in vivo gezüchtet werden. Natürlich ist es auch möglich, monoklonale Antikörper mittels rekom- binanter Technologien in eukaryontisehen, Hefe-, Insekten- und Pflanzen-Zellen und in Pflanzen zu erzeugen. Diese Expressionssysteme sowie die Methoden zur Isolierung dieser Antikörper aus den Zellen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Besonders bevorzugt sind dabei erfindungsgemäß humanisierte monoklonale Antikörper oder funktionelle Teile davon (Fab, Single chain-Antikörper, etc., die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Peptide zu erkennen) .
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids oder Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Prävention von durch Atherosklerose verursachten Störungen, insbesondere Schlaganfall, kardiovaskulären Erkrankungen, sowie Erkrankungen peripherer Gefäße.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Figuren und Beispielen näher veranschaulicht, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 6 mittels ELISA.
Fig. 2 zeigt den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 27 mittels ELISA.
Fig. 3 bis 9 zeigen den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 8 bis 14 mittels ELISA.
Fig. 10 zeigt den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 24 mittels ELISA.
Fig. 11 zeigt den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 7 mittels ELISA. Fig. 12 bis 20 zeigen den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit den Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 15 bis 23 mittels EDISA.
Fig. 21 zeigt den Nachweis von PCK9-spezifischen Antikörpern in Mäusen nach Verabreichung eines Peptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 25 mittels ELISA.
Fig. 22 zeigt einen ELISA, in dem gereinigte monoklonale Maus-Antikörper, die nach Immunisierung mit SEQ ID Nr. 7 generiert wurden, an die immunisierte Peptid-Sequenz sowie an Verkürzungen dieses Peptids (Seq. ID Nr. 21, 22, 23 und 25) gebunden wurden.
Proben: gereinigte monoklonale Antikörper Detektion: α Maus IgG
In der Tabelle sind die ELISA-Rohdaten der Abbildung 22 dargestellt. Es wurde dabei die Bindung von monoklonalen anti- PCSK9-Antikörpern an verschiedene Peptide getestet, um die Bindungsstelle der Antikörper näher zu bestimmen.
Kein Signal (Hintergrund): OD geringer als 0,2
Schwaches Signal : OD bis 0,4
Mittelstarkes Signal: OD zwischen 0,4 und 1,2
Starkes Signal: OD höher als 1,2
Ein Antikörper sollte vorzugsweise nicht nur am C-Terminus binden, daher sind alle Antikörper, die die getesteten Peptide erkennen, prinzipiell geeignet.
Fig. 23 zeigt die Titration der monoklonalen Antikörper aus Fig. 22 (Immunisierung mit p4918 = SEQ ID Nr. 7) Proben: monoklonale Antikörper (Start: 500 ng/ml) Detektion: α Maus IgG In der Tabelle sind die ELISA-Rohdaten der Abbildung 23 dargestellt. Es wurden im ELISA die Signalstärken von definierten Mengen an monoklonalen anti-PCSK9- Antikörpern an rekombinant hergestelltes PCSK9-Protein verglichen, wobei sich die Signalstärken auf eine Verdünnung von 15,6 ng/ml Antikörper beziehen.
Schwaches Signal: OD bis 0,4
Mittelstarkes Signal: OD zwischen 0,4 und 1,2 Starkes Signal: OD höher als 1,2
Bevorzugt sind dabei möglichst hohe Signale (über OD 1,2 bei einer Antikörper-Verdünnung von 15,6 ng/ml) .
Fig. 24 und 25 zeigen den Nachweis von Antikörpern gegen die verabreichten Peptide (STCFVSQSGT-C, IIGASSDCSTCFVSQS, C- IIGASSDCSTCFVSQS, und IIGASSDCSTCFVSQS-C ) in Mäusen nach Injektion der Peptide mittels Peptid-ELISA zur Messung der Antikörper-Titer (Fig. 24) und den Nachweis von PCSK9-spezifischen Antikörpern mittels PCSK9-Protein-ELISA in diesen Seren (dazu wurden die Seren 1:100 und 1:400 verdünnt; Fig. 25).
BEISPIELE:
Beispiel 1:
1. Methoden:
Herstellung Vakzine:
Die Peptide wurden über GMBS 4-Maleimidobuttersäure N- Hydroxysuccinimid-Ester an KLH gekoppelt. 30 μg dieser Konjugate (die Mengenangabe bezieht sich aufs Peptid) wurden mit Aluminiumhydroxid (Endkonzentration Alum 0,2%) gemischt. Der verwendete Puffer war PBS.
Immunisierung:
Balb/c oder C57B1/6 Mäuse wurden subkutan (in die Flanke) immunisiert. Anzahl der Injektionen 2 bis 4 mal. Das Intervall zwischen den Immunisierungen betrug 1 Woche bis 6 Wochen. Das Injektionsvolumen pro Maus betrug zwischen 200 μl und 1 ml. 2 Wochen nach erfolgter Immunisierung wurde Blut abgenommen.
ELISA:
Serum oder Plasma der immunisierten Mäuse wurde im ELISA auf Antikörper gegen das immunisierte Peptid und auf Antikörper gegen das PCSK9-Protein getestet.
Ablauf:
• die Mikrotiterplatten wurden mit Peptid (gekoppelt an BSA) oder Protein gecoatet
• die gecoateten Wells wurden mit Serum bzw. Plasma in verschiedenen Verdünnungen inkubiert
• das Vorhandensein von Peptid- bzw. PCKS9-spezifischen Antikörpern im Serum bzw. Plasma wurde mittels (vorzugsweise biotinylierter) polyklonaler anti-Maus IgG-Antikörper detektiert. Die gebundenen anti-Maus-Antikörper wurden dann durch Inkubation mit Streptavidin-HRP ( „horse rad- dish peroxidase") nachgewiesen (Farbreaktion, z.B. ABTS als Substrat)
2. Ergebnisse:
Diese Ergebnisse (siehe auch Fig. 1 bis 23) zeigen, dass die Injektion von erfindungsgemäßen Peptiden zur Bildung von PCKS9- spezifischen Antikörpern führt. Die Injektion der Peptide mit den Sequenzen SEQ ID Nr. 24 und 25 zeigte hingegen keine Bildung PCKS9-spezifischer Antikörper.
Beispiel 2:
Peptid-ELISA (siehe Fig. 22) ;
Die genannten Peptide wurden an BSA gekoppelt und auf ELISA- Platten gecoatet. Anschließend wurden die monoklonalen Antikörper auf die Platten gegeben. Die Bindung von Antikörpern an die Peptide wurden standardmäßig mittels biotinyliertem polyklonalem anti-Maus IgG Antikörper (Detektions-Antikörper) und anschließender Parbreaktion (Streptavidin-HRP („Horse Raddish Peroxida- se*); ABTS (2,2 '-Azinobis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) für die Farbreaktion, Messung bei OD 405 nm) nachgewiesen.
Nach Immunisierung einer Maus mit Seq ID Nr. 7 waren verschiedene monoklonale Antikörper generiert worden. Diese Antikörper wurden im beschriebenen ELISA auf ihre Bildung an von Seq ID Nr. 7 beziehungsweise an davon abgeleiteten verkürzten Pep- tidsequenzen getestet, um zu erkennen, ob alle Antikörper gegen die gleichen Aminosäuren von Seq ID Nr. 7 gerichtet sind, oder ob manche davon beispielsweise nur am N- oder nur am C-Terminus binden. Dieser ELISA kann dazu benutzt werden, für die folgenden Experimente Antikörper auszuwählen, die an bestimmte Aminosäuren binden oder auch nicht binden können. Es kann damit die Bindungsstelle der Antikörper am immunisierten Peptid definiert werden .
Alle getesteten Antikörper binden stark (OD höher als 1,2) an Seq ID Nr. 7, 21, 22 und 23. Unterschiede ergeben sich nur bei der Bindung an Seq ID Nr. 25. Keine Bindung (Hintergrund; OD geringer als 0,2) ist bei vier der Antikörper zu erkennen (U1B1A4, U7F95H11, U10F11D4, U17G6C10) , schwach (OD bis 0,4) bindet ein Antikörper (U4G5G8) , mittelstarke Bindung (OD zwischen 0,4 und 1,2) zwei Antikörper (U9D8A2, U15E8C2) .
Es ergibt sich aus diesem ELISA, dass für eine Bindung aller getesteten Antikörper das Vorhandensein von Glutamin (AS Nr 9 in Seq ID Nr. 7) wichtig zu sein scheint. Die C-terminal dieses Glutamins gelegenen Aminosäuren sind für die Antikörper-Bindung offensichtlich irrelevant. Für alle getesteten Antikörper scheinen die 7 Aminosäuren von Seq. ID Nr. 23 auszureichen, um im ELISA ein starkes Signal zu ergeben, d.h. die beiden Aminosäuren am N-Terminus von Seq. ID Nr. 7 scheinen in dieser Analyse ebenfalls nicht wesentlich zu sein.
PCSK 9 Protein ELISA:
Die in Fig. 22 dargestellten monoklonalen Maus-anti hu PCSK9-Antikörper wurden in verschiedenen Mengen (jeweils zwischen 7,8 und 500 ng/ml) auf eine mit rekombinant hergestelltem PCSK9-Protein gecoatete ELISA-Platte aufgetragen. Die Detektion von gebundenen Antikörpern erfolgte mit biotinyliertem anti-Maus IgG und Streptavidin-HRP. Nach Zugabe des Substrates (ABTS) wurde die OD bei 405 nm gemessen. Die Signalstärke der verschiedenen Antikörper wurde dabei verglichen. Je höher das Signal, desto stärker bindet der getestete Antikörper an das PCSK9-Protein. Dieser ELISA kann dazu benutzt werden, für darauffolgende Experimente diejenigen Antikörper auszuwählen-, die möglichst stark an das Zielprotein binden.
Analyse der ELISA-Daten:
Als stark bindende Antikörper wurden in diesem ELISA jene bezeichnet, die auch bei einer Verdünnung von 15,6 ng/ml eine OD von mehr als 1,2 aufweisen, OD zwischen 0,4 und 1,2 wird als mittelstarkes Signal bezeichnet, darunter als schwaches Signal. Vorzugsweise wurden in weiterführenden Experimenten Antikörper mit möglichst hohem Signal verwendet. Beispiel 3 :
Jeweils 8 Mäuse wurden mit den in den Figuren 24 und 25 beschriebenen Peptiden (an KLH gekoppelt und mit Alum gemischt) vakziniert und die Seren nach 1, 2, und 3 Injektionen mittels Peptid-ELISA zur Messung des Antikörpertiters analysiert. Die Seren mit vergleichbar hohen anti-Peptid-Titern wurden in der Folge mittels PCSK9 Protein ELISA auf PCSK9-spezifische Antikör- per untersucht um die Fähigkeit der Peptide, PCSK9-spezifische Antikörper zu induzieren, festzustellen.
Dabei zeigte sich, dass das Peptid STCFVSQSGT-C eine stärkere PCSK9-spezifische Iiranunantwort induziert als die Peptide II- GASSDCSTCFVSQS, C-IIGASSDCSTCFVSQS, und IIGASSDCSTCFVSQS-C (siehe Fig. 24 und 25) . Diese Ergebnisse zeigen, dass zumindest die C-terminale Aminosäure (G) , von STCFVSQSGT-C notwendig ist, um PCSK9-spezifische Antikörper zu induzieren. Dies ist auch in der zusammenfassenden Tabelle unter Beispiel 1 gezeigt; die Injektion von Seq ID Nr. 20 (STCFVSQSGT) und Seq ID Nr. 21 (STCFVSQSG) führen zur Bildung von PCSK9-spezifischer Antikörper, während Seq ID Nr. 25 (STCFVSQS) keine PCSK9-spezifischen Antikörper induziert.
Next Patent: TIMBER STRUCTURAL MEMBER