【명세서】

【발명의 명칭]

다수의 단백질-단백질 상호작용 동시 분석을위한 백터

[기술분야】

<ι> 본 출원은 2014년 4월 25일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0049726 호 및 2015년 3월 19일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0037979호를 우선권 으로주장하고, 상기 명세서 전체는본 출원의 참고문헌이다.

<2> 본 발명은 다수의 단백질-단백질 상호작용 동시 분석을 위한 백터에 관한 것 으로, 보다 상세하게는 라이브러리 수준의 단백질들의 결합 쌍들을 동시에 효율적 으로 검색하기 위한 특수한 컨스트럭트 (construct )를 가지는 공여 백터 및 수용 백 터, 상기 백터들을포함하는 키트 및 이를 이용한 단백질 상호작용 검출 방법에 관 한 것이다.

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【배경기술】

<4> 세포 내에서 하나 또는 두 개 이상의 단백질은 서로 상호작용 (비공유결합， 물리적인 결합)을 통하여 생물학적인 기능을 나타낸다. 따라서 단백질 간의 상호작 용에 대한 이해는 생물학적인 기능을 이해하는데 있어서 매우 중요한 의미를 갖는 다. 생화학 (biochemistry) , 단백질체학 (Proteomics)， 분자 동력학 (molecular dynamics) , 신호 전달 (signal transduct ion) 등의 다양한 학문에서 단백질 간의 상 호작용을 밝히기 위한 노력이 현재까지 지속되고 있다. 최근 사용되고 있는 단백질 간의 상호작용을 알아보기 위한 방법들은 Co-imraunoprecipi tat ion(Co-IP) , Fluorescence resonance energy transfer (FRET) , Yeast two-hybrid 그리고 최근에 고안된 Bimolecular Fluorescence Complementat ion (BiFC) 등이 잘 알려져 있다.

<5> 그 중에서도 Yeast two-hybrid(Fields S, Song 0, 1989)는 1989년에 송옥규 박사와 Stanley Fields에 의하여 고안된 방법으로서 일반적인 전사인자 (Transcr ipt ion factor)가 갖는 modular한 특징을 이용한 방법이다. 여기서 modular라는 것은 전사인자의 구조는 DNA 결합 도메인 (DNA binding domanin, DBD) 과 활성 도메인 (Act ivat ion domain, AD)으로 구성이 되며 서로 독립적으로 분리되 어 발현되어도 어떠한 상호작용에 의하여 두 도메인이 가까운 거리를 유지할 때 전 사인자로서의 정상적인 기능이 가능하다는 원리를 이용한 방법이다.

<6> 일반적으로 Yeast two-hybr id mothod에서는 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae)의 GAL4 전사인자를 주로 사용하며 특정 단백질 간의 상호작용 또는 하 나의 단백질에 대한 상호작용 파트너를 선별 (screening)하는데 널리 사용되고 있 다. 따라서 GAL4 전사인자의 각 각의 도메인에 연구하고자하는 단백질의 유전자를 재조합하여 동일한 효모 내에서 발현을 유도하여 상호작용 유무를 알 수 있는 방법 이다. 일반적으로 DNA 결합 도메인에는 Bait (미끼 )를 활성 도메인에는 Prey (먹이 ) 를 결합하게 되는데 Bai t에는 주로 연구하고자하는 한 종류의 단백질에 대한 유전 자를 Prey에는 주로 cDNA l ibrary를 재조합하여 Bait 단백질에 대한 상호작용 파트 너를 선별하는 방식으로 진행된다. DNA 결합 도메인 (DBD)과 Bait , 활성 부위 (AD)와 Prey는 각 각 독립적인 백터 (Vector)의 형태로 효모에 형질전환 (transformat ion)되 고 도입 후 각 각의 백터에 존재하는 ADH1 프로모터 (ADH1 promoter)에 의하여 항시 발현 (Const itut ive expression)된다. 발현된 DBD-Bait , AD-Prey 결합 단백질은 DNA 결합 도메인과 활성 도메인의 N-말단 (N-terminus)에 존재하는 NLS(Nuclear Local izat ion Signal )에 의하여 효모의 핵으로 이동하게 된다. 그 후 핵 내에서 Bait와 Prey가 서로 상호작용하지 않을 경우에는 DBD-Bait , AD-Prey가 복합체를 이 루지 못하므로 정상적인 GAL4 전사인자의 기능을 할 수 없다. 그러나 Bai t와 Prey 가 서로 상호작용하는 경우에는 DBD-Bait-Prey-AD 복합체 (DBD-Bai t -Prey-AD complex)가 형성되어 GAL4 전사인자의 정상적인 기능을 수행할 수 있게 되어 효모 의 유전체 내에 존재하는 리포터 (R印 orter)의 발현을 유도하게 된다.

<?> 이러한 원리로 리포터 유전자의 발현을 통하여 Bai t와 Prey의 상호작용을 확 인하는 방법이다. 효모 유전체 내의 리포터는 GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인이 결합할 수 있는 GAL4 UAS (Upstream Act ivat ion Sequence)와 레포터 유전자로 구성 되는데 대표적으로 LacZ, MELKColormetric repoter) , HI S3, ADE2 , URA3(Authotrophic reporter) 등의 유전자가 사용된다. 따라서 결과 적으로 Bai t와 Prey가 서로 상호작용하는 경우 DBD-Bait-Prey-AD 복합체가 리포터의 GAL4 UAS에 결합하여 리포터 유전자의 발현을 유도하게 된다.

<8> 이러한 Yeast two-hybrid가 가지는 장점 중에는 in vivo 에서 수행이 가능하 다는 점， 고등진핵생물 (Higher eukaryote)인 효모를 이용하므로 박테리아 (Bacter ia)를 이용할 때 보다 유리하다는 점， 실험을 수행하는데 필요한 요소가 많 지 않다는 점， 수천가지 단백질 간의 상호작용을 동시에 선별할 수 있다는 점 등이 있다. 반면 기존의 Yeast two-hybrid system (이하 Y2H)은 몇 가지 한계를 가지고 있었다.

<9> 첫 번째 한계는 대량 선별이 어렵다는 것이다. Y2H를 통하여 특정 단백질에 대한 상호작용 단백질을 찾기 위한 선별 (screening)을 수행할 경우 높은 다양성 (diversity)을 갖는 단백질 라이브러리가 사용된다. 예를 들어 특정 단백질 A에 대 한 상호작용 단웩질을 찾기 위한 선별에서 1.0 X 10 ⁷ 의 다양성을 갖는 단백질 라이 브러리를 사용할 경우 1개의 한천배지에서 천 (1.0 X 10 ³ )개의 효모 colony를 선별할 수 있다고 하면 실험자는 선별을 위해서 만개의 한천배지를 사용하여야 한다. 이는 실험자에게 상당히 높은 노동력이 소모됨과 동시에 시간 그리고 비용적인 측면에서 상당히 비효율적이다. 따라서 이러한 문제로 인하여 대량 선별이 어렵다는 한계를 가지고 있다.

<10> 두 번째 한계는 선별을 통하여 얻은 데이터의 분석이다. 기존의 방법에서는 한천배지를 이용하여 positive candidate (단백질 간의 상호작용이 존재하는 효모) 를 선별한 후에 plasmid를 얻어 Sanger sequencing을 통하여 prey 유전자의 데이터 를 분석하는 방식으로 진행되었다. 이러한 방식을 사용 할 경우 대량 선별을 통하 여 얻은 positive candidate를 모두 분석하는 것은 많은 노동력을 필요로 하며 시 간과 비용 또한 상당히 비효율 적이다.

<ιι> 세 번째 한계는 기존의 reporter system의 민감도 (sensitivity) 문제이다.

기존의 Y2H에 사용되는 reporter system (예를 들어 |3 -galactosidase, HIS3, ADE2 등)을 사용하였을 경우 약한 단백질 간의 상호작용을 선별할 수 없다는 단점을 가 지고 있다. 그 외 자동화가 어렵다는 점, 단백질 자체가 스스로 활성화 되어 전사 (transcript ion)를 활성화 할 경우 사용 할 수 없다는 점， 단백질 간의 상호작용에 보인자 (Co-factor)가 필요한 경우 선별하기 어렵다는 점 등이 있다.

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【발명의 상세한 설명]

[기술적 과제]

<13> 본 발명자들은 기존 투 -하이브리드 (two-hybrid) 시스템의 단점을 보완하여， 라이브러리 수준의 단백질들의 결합 쌍들을 동시에 효율적으로 검색하기 위한 특수 한 컨스트럭트 (construct)를 가지는 백터 세트 (set)를 제조하여 본 발명을 완성하 였다.

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<15> 따라서 본 발명의 목적은, 제 1프로모터; 숙주세포 라포터 유전자의 프로모 터에 결합하는 DBD 코딩 서열; 베이트 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 제 1 클로닝 부위 (cloning site) ; 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (site-specif ic recombination site) ; 상기 베이트 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제 2클로닝 부위; 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 포함하는 것을 특징 으로 하는 공여백터를 제공하는 것이다.

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<17> 본 발명의 다른 목적은， 제 1 프로모터; 숙주세포 리포터 유전자의 전사를 돕 는 AD 코딩 서껼; 프레이 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 제 1클로닝 부위 ; 상기 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제 2클로닝 부위; 게 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (si te-speci f ic recombinat ion si te) ; 및 제 2 부위 특 이적 재조합효소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용백터를 제공하는 것이다.

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<19> 본 발명의 또 다른 목적은， 상기 공여백터 및 수용백터를 포함하는 단백질 상호작용 검출을 위한 키트 (ki t )를 제공하는 것이다.

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<2i> 본 발명의 또 다른 목적은， (a) 상기 공여백터에 베이트 (bai t ) 단백질 및 상 기 베이트 단백질을 표시하는 바코드 서열을 도입하여 베이트 라이브러리를 제작 하는 단계 ; (b) 상기 수용백터에 프레이 (prey) 단백질 및 상기 프레이 단백질을 표 시하는 바코드 서열을 도입하여 프레이 라이브러리를 제작하는 단계; (c) 상기 베 이트 라이브러리 및 프레이 라이브러리를 리포터로서 재조합효소를 발현하는 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 숙주세포로부터 리포터 발현 여부를 조사하여 베이트-프레이 단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하는， 단백질 상호작용 검 출 방법을 제공하는 것이다.

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【기술적 해결방법]

<23> 상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 제 1프로모터; 숙주세포 리포터 유 전자의 프로모터에 결합하는 DBD 코딩 서열; 베이트 단백질 코딩 서열의 삽입을 위 한 계 1 클로닝 부위 (cloning si te) ; 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (site- speci f ic recombinat ion site) ; 상기 베이트 단백질을 표사하는 바코드 서열의 삽 입을 위한 제 2클로닝 부위; 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 공여백터를 제공한다.

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<25> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 제 1프로모터; 숙주세포 리 포터 유전자의 전사를 돕는 AD 코딩 서열; 프레이 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 제 1클로닝 부위; 상기 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제 2클 로닝 부위; 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (si te-speci f i c recombinat ion si te) ; 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용백터를 제공한다.

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<27> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 공여백터 및 수용백터 를 포함하는 단백질 상호작용 검출을 위한 키트 (ki t )를 제공한다.

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<29> 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 상기 공여백터에 베이 트 (bai t ) 단백질 및 상기 베이트 단백질을 표시하는 바코드 서열을 도입하여 베이 트 라이브러리를 제작 하는 단계; (b) 상기 수용백터에 프레이 (prey) 단백질 및 상 기 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열을 도압하여 프레이 라이브러리를 제작하 는 단계; (c) 상기 베이트 라이브러리 및 프레이 라이브러리를 리포터로서 재조합 효소를 발현하는 숙주세포에 도입하는 단계; 및 (c) 상기 숙주세포로부터 리포타 발현 여부를 조사하여 베이:트-프레이 단백질 결합 쌍들을 검출하는 단계를 포함하 는， 단백질 상호작용 검출 방법을 제공한다.

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<31> 이하 본 발명을 상세히 설명한다.

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<33> 본 발명에서 용어 '백터' 란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 백터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 백터는 플라스미드 백터， 코 즈미드 백터， 박테리오파아지 백터， 효모 백터， 바이러스 백터 등을 포함한다. 적 당한 숙주로 형질전환되면， 백터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거 나， 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 백터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로， 본 발명의 명세서에서 "플라스미드

(plasraid) " 및 "백터 (vector) "는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적 상， 플라스미드 백터를 이용하는 게 바람직하다.

<34> 본 명세서에서 각 백터의 구성은 특별한 언급이 없는 한， 플라스미드를 이루 는 이중 가닥 중 하나의 가닥 (strand)을 기준으로하여 5' 에서 3' 방향으로 기술된 다. 따라서 백터를 구성하는 유전적 구성 단위의 기술 순서는 실질적으로 유전체가 전사되는 방향과 일치하지 않을 수 있으며， 백터에 포함된 유전체의 전사 방향은 프로모터로부터 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 구조유잔자로 향하는 방향이 다. 그러므로 본 발명에서 용어 '상류' ， '하류 ' 는， 특별한 언급이 없는 한, 상기 기준가닥 상에서 각 핵산 단위들의 상대적 위치를 나타낸다. 당업자라면 전사배향 에 꾀하여 당해 유전자가본 발명에서 기술하는 기준 가닥 (sense strand)에서 발현 되는지， 이의 상대 가닥 (ant i sense strand)에서 발현되는지 자명하게 이해 가능하 다.

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<36> 본 발명에서 용어 "작동 가능하게 연결된 "은 유전자 발현의 매개나 조절과 같은 의도된 기능을 수행하기 위해 특정 서열들이 직접적으로 또는 간접적으로 상 호작용하는 것을 의미한다. 작동 가능하게 연결된 서열들의 상호작용은, 예를 들어 작동 가능하게 연결된 서열들과 상호작용하는 단백질에 의해 매개될 수 있다. 전사 조절영역과 관심 서열이 작동 가능하게 연결된 경우， 이 서열들이 기능적으로 연결 됨으로써 전사조절영역에 의해 관심 서열의 전사가 매개되거나조정될 수 있다.

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<38> 본 발명에서 용어: '프로모터' 는 광의의 개념으로서 구조유전자로부터의 전 사개시 영역을 의미할 수 있으며， 좀 더 구체적으로는 특정 뉴클레오티드 서열과 연결된 경우 상기 특정 뉴클레오티드 서열이 mRNA로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로， 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아나나 mRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5' 에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다. 숙주세 포의 종류에 따라 때때로 상기 프로모터는 UAS(upstream act ivat ing sequence)등의 조절서열을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

<39> 본 발명의 프로모터는 구성적이거나 조절 가능한프로모터를 이용할 수 있으 며， 바람직하게는 구성적 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 사용되는 용어 "구성 적''은 프로모터가 자극 (예， 열 쇼크， 화학물질 등) 없이도 작동가능하게 연결된 핵산서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 반면， "조절 가능한'' 프로모 터는 자극 (예， 열 쇼크， 화학물질 등)이 존재하는 경우 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사 수준을 자극 없는 경우와 구별되게 지시할 수 있는 프로모터를 의미한 다.

<40> 당업자라면 백터가 도입되는 숙주세포에 따라 적당한 프로모터를 선택하여 사 ^가능하며 , 예를 들어 숙주세포가 효모인 경우 GAL10 프로모터， ADH1 프로모터， GAL1 프로모터， CYC1 프로모터， PGK 프로모터 등을 사용할 수 있으며 , 이에 제한되 지 않는다. 또한 포유 동물의 세포에 적합한 프로모터는， 예를 들어, CMV 프로모 터， HSV-TK 프로모터 , RSV 프로모터， SV40 프로모터 및 LTR 프로모터 등이 있을 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

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<42> 본 발명에서 용어 "이중 -하이브리드 시스템 (two hybr id system) "은 리포터 유전자의 활성화를 이용하여 단백질 결합을 확인함으로써 단백질 상호작용을 분석 하는 방법 및 이를 위해 사용되는 일련의 구성물을 의미한다. 일반적으로， 이중-하 이브리드 시스템은 리포터 유전자를 활성화할 수 있는 전사인자를 두 개의 물리적 으로 분리되는 모들 도메인， 즉 DNA-결합 도메인과 전사활성 도메인으로 나누어 사 용한다. 이들을 이용하여 단백질 상호작용을 분석하기 위해서는， 상기 DNA—결합 도 메인과 전사활성 도메인을 상호작용을 알아보고자 하는 베이트 및 프레이 단백질에 각각 융합하여 재조합 단백질을 발현시키고， 발현된 재조합 단백질은 베이트 및 프 레이 단백질의 상호작용에 의해 DNA-결합 도메인과 전사활성 도메인이 결합하여 활 성을 나타내면서 리포터 유전자를 발현시킴으로써 두 단백질의 상호작용을 확인할 수 있다. 상기 이중 -하이브리드 시스템의 기본 원리는 진핵세포 및 원핵세포를 아 우르는 다양한 세포에 대하여 적용된 바 있으며， 예를 들어 식물세포 -이중 하이브 리드 시스템 (대한민국 등록특허 10-1460231)， 군소 -이중 하이브리드 시스템 (대한민 국 등록특허 10-0471605) , 포유동물세포—이중 하이브리드 시스템 (US 6251676 B1) , 박테리아 이중 -하이브리드 시스템 (EP 1224324 B1) 등이 공지된 바 있다.

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<44> 본 발명에서 용어 "전사인자 (Transcr ipt ion factor) "는 DNA의 프로모터 영역 에 결합하여 전사를 조절하는 인자로서 , 본 발명에서 분할 가능한 DNA-결합 도메인 (DBD) 및 전사활성 도메인 (AD)으로 구성된 모들 (module) 특성을 가지는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어， GAL4, GCN4 , ARD1 , the human estrogen receptor , E . col i LexA 및 B42 단백질， herpes s implex vi rus VP16 , NF— kB p65등을 포함하며， 이에 제한되지 않는다.

<45> 또한 상기 DNA-결합 도메인 (DBD) 및 전사활성 도메인 (AD) 조합의 모들에 있 어서， 상기 두 도메인은 하나의 전사인자로부터 유래되는 것 또는 서로 다른 전사 인자들로부터 유래되는 것 일 수 있다. 후자에 있어서, 당업계에 서로 다른 전사인 자로부터 유래되지만 서로 상호작용 (결합)하여 목적 유전자의 전사를 촉발시키는 활성을 가지는 모듈의 구체적 종류가 공지되어있으며， 예를들어， 이에 제한되지 않 으나, GAL4 DBD의 경우 이와 상호작용하는 전사활성 도메인은 GAL4 AD, VP16 AD, MSG1 유래 CR2 AD로 이루어진 군에서 선택되는 것 일 수 있다.

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<47> 본 발명에서 용어 "베이트 (bai t ) "는 단백질 상호작용에 대한 연구에 있어 단 백질 결합을 확인할 때, 상호작용을 알아보고자 하는 목적 단백질 또는 이를 암호 화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 베이트 단백질은 단백질 상호작용을 확인하기 위하여 리포터 유전자를 활성화시키는 전사인자의 DNA-결합 도메인 또는 전사활성 도메인과 융합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서， 베이트 단 백질은 전사인자의 DNA-결합 도메인과 융합된다.

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<49> 본 발명에서 용어 "프레이 (prey) "는 단백질 상호작용에 대한 연구에 있어 단 백질 결합을 확인할 때, 목적 단백질과 결합할 것으로 예상되는 단백질 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 상기 프레이 단백질은 단백질 상호작용 을 확인하기 위하여 리포터 유전자를 활성화시키는 전사인자의 DNA-결합 도메인 또 는 전사활성 도메인과 융합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 프레이 단백질은 전사인자의 전사활성 도메 과 융합된다.

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<5i> 본 발명에서 용어 "링쩌 ( l inker) "는 두 핵산사이를 연결하는 임의의 핵산서 열을 의미하는 것으로서， 예를들어 본 발명에서 베이트 단백질과 전사인자의 DBD 또는 프레이 단백질과 전사인자의 AD사이에 삽입되어 두 단위체를 연결한다.

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<53> 본 발명에서 용어 "클로닝 부위 (또는 외래 DNA 삽입좌) "는 제한효소 부위

(restrict ion enzyme site , 제한효소가 인식 또는 /및 절단할 수 있는 부위를 의미) 를 한 세트 가지고 있는 부분을 의미한다. 즉， 클로닝 시에 유전자 조작을 용이하 게 하기 위하여 백터 내에 목적하는 유전자를 삽입할 수 있도록 한 세트의 제한효 소 부위를 포함하도록 구성된 염기서열 부위로서, 적어도 두 개의 제한효소 부위가 하나의 세트를 구성한다. 상기 클로닝 부위는 한 세트로서 두 개 이상의 제한 효소 부위를 포함 할 수 있으나， 바람직하게 본 발명의 클로닝 부위는 한 종류의 제한효 소에 대한 제한효소 부위 두 개가하나의 세트를 이루는 것이거나 또는 두 개의 제 한효소에 대한 각각의 제한효소 부위 두 개가 하나의 세트를 이루는 것 일 수 있 다. 본 발명에서는 공지의 다양한 제한효소 부위 중 어느 것을 사용하여도 무방하 나, 바람직하게 Π 형 제한효소 부위를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 I I 형 제 한효소는 Sf i I , BsiW I， Sac I I , Xbal , Sac I I , Af l I I 또는 Age I 등을 포함하 나, 이에 제한되지 않는다.

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<55> 본 발명에서 용어 '바코드 서열 (barcode sequences)' 은 서로 다른 백터 내 에 부가되어, 상기 백터에 부가된 각각의 외래 유전자 (또는 관심 유전자)를 표시 또는 구분할 수 있도록 하는 임의의 짧은 핵산서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 외래 유전자 (또는 관심 유전자)는 베이트 또는 프레이 단백질에 해당하는 것으로 세 당업자는 상호관계를 알고자하는 각각의 베이트 및 프레이 단백질 (또는 이들을 코딩하는 핵산 서열)에 대하여 사전에 임의로 바코드 서열을 부가하고 이들의 관계 를 정립한다. 상기 바코드 서열은 백터에 삽입된 베이트 또는 프레이 단백질에 따 라 당업자가 이를 표시할 수 있도톡 임의로 설정할 수 있다. 상기 바코드 서열에 있어서 이를 구성하는 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나, 1개 내지 20 개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으며， 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티 드로 구성될 수 있다.

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<57> 본발명에서 용어 '인접한다' 는， 컨스트럭트 (construct ) 내의 유전적 요소 ( 엘리먼트, element )의 위치 관계에 관해서， 약 1 내지 ： LOObp 내로 떨어져 있는 것 을 의미할 수밌으며， 바람직하게는 1 내지 50bp 내로 떨어져 있는 것을 의미할 수 있다.

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<59> 본 발명에서 용어 '부위 (위치) 특이적 재조합효소 인식 서열 (site-speci f i c recombinat ion si te 또는 si te-speci f ic recombinase site)' ᅵ은 재조합효소에 의하 여 인식되는 짧은 핵산 서열로서， 부위 특이적 재조합 현상이 일어나는 동안 교차 영역 (crossover region)을 구성한다. 상기 부위 (위치 ) 특이적 재조합효소 인식 서 열은 당업계에 공지되어있으며， 예를 들어 lox 부위, rox 부위， att 부위, di f 부 위， 및 frt 부위 등을포함하며, 이에 제한되지 않는다.

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<61> 본 발명에서 용어 '라이브러리' 는 이종 폴리펩티드 또는 핵산의 흔합물, 수집물 또는 세트를 의미한다. 라이브러리는 각각이 단일 폴리펩티드 또는 핵산 서 열을 지니는 일원으로 구성된다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이는 라이브러리 에 존재하는 다양성을 책임진다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 단순한 흔 합물의 형태를 취하거나， 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포， 예를 들어 박테리아， 바이러스， 효모, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 본 발명에서 용어 'NGS(Next generation sequencing)' 은, 당업계에 알려진 바와 같이 용어 '병렬적 시뭔성 (paral lel sequencing)' 과 호환적으로 사용된다. 본 발명은

제 1프로모터;

숙주세포 리포터 유전자의 프로모터에 결합하는 DBD 코딩 서열;

베이트 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 제 1 클로닝 부위 (cloning site) ; 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (site-speci f ic recombinat ion site) ; 상기 베이트 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제 2클로닝 부위; 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 공여 백터를 제공한다. 상기 제 1프로모터는 이의 하류에 위치하는 DBD 및 상기 DBD에 연결된 베이 트 단백질 코딩 서열과 작동 가능하게 연결되어 상기 서열의 전사를 조절하기 위한 핵산 서열을 의미한다. 숙주세포 또는 전사인자의 종류 등에 따라 상기 제 1 프로모 터의 종류를 당업자가 용이하게 설정 변경하여 사용할 수 있으며， 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 DBD 코딩 서열로부터 발현되는 DBD는 숙주세포 리포터 유전자의 프로모 터에 결합하여, 리포터 유전자의 전사활성에 영향을 준다. 이때 상기 숙주세포의 라포터 유전자는 종래 이중 -하이브리드 시스템에서 리포터로 사용하는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 상기 숙주세포 리포터 유전자는 재조합효소 발현 유전자인 것이 바람직하다. 상기 재조합효소는 부위-특이적 재조합 (site speci f ic recombinat ion) 기능을 가진 것으로 당업계에 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 bacteriophage PI Cre recombinase, yeast FLP recombinase, φ 031 recombinase , Int i integrase , bacteriophage λ recombinase, phi 80 recombinase, P22 recombinase , P2 recombinase, 186 recorabinase, P4 recombinase, Tn3 resolvase, Hin recombinase, Cin recombinase, E. col i xerC recombinases , E. col i xerD recombinases , Baci l lus thuringiensis recombinase, Tpnl 및 β -lactamase transposons , immunoglobul in recombinases , KD recombinase, R recombinase, B2 recombinase, B3 recorabinase, Dre recombinase 등을 포함한다.

<76>

<77> 본 발명의 공여백터에서 후술하는 제 1 및 제 2 부위-특이적 쎄조합효소 인식 서열은 상기 숙주세포가 리포터로서 발현하는 재조합효소에 따라 그 서열 종류를 당업자가 설정 변경하여 사용가능한 것으로서, 당업계에는 예를들어 Cre/lox system, Flp/FRT system, Dre/rox system, Xer/di f system, phiC31/att system 등 의 '재조합효소 /해당 부위특이적 인식서열' 의 재조합 시스템이 공지되어있다. 당 업자라면 상기 시스템을 이용하여 본 발명의 백터에서 제 1 및 제 2 부위-특이적 제 조합효소 인식서열을 구성할 수 있음이 자명하다.

<78>

<79> 상기 '제 1 클로닝 부위' 는 본 발명의 명세서에서 '유전자 삽입 부위' 등으 로 호환적으로 지칭될 수 있으며， 베이트 단백질 코딩 서열꾀 삽입을 위한 영역으 로서 한 세트의 제한효소 부위로 이루어진다. 목적 핵산의 클로닝을 위한 제한효소 부위는 당업계에 잘 알려져 있으며， 전술한 바를 참조할 수 았다.

<80>

<81> 상기 DBD 코딩 서열과 상기 제 1 클로닝 부위에 삽입되는 베이트 단백질 코딩 서열은 직접적으로 연결되거나， 또는 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 따라서 상 기 DBD 코딩 서열과 제 1 클로닝 부위 사이에는 링커 서열이 추가적으로 포함될 수 있다.

<82>

<83> 상기 공여백터에서 '제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열' 및 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서멸은' 상호 간에 일정 간격으로 떨어져 백터 내에 위치 되며， 바람직하게 상호 간에 500 내지 4000bp(base pair) 범위의 간격으로 위치되 는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 '제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열' 및 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은' 상호 간에 750 내지 3500bp 범위의 간격으로， 가장 바람직하게는 1500 내지 2500bp 범위^ 간격으로 위치되는 것일 수 있다.

<84>

<85> 본 발명에서， 상기 제 1 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은 동일 배 향 (same orient at ion)으로 위치된다.

<86> <87> 상기 제 1 또는 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은 당업계의 공지된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 lox 부위 (si te) , rox 부 위, att 부위， di f 부위 및 frt 부위 등을 포함한다. 좀 더 구체적으로 상기 제 1 또는 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은 lox P와 그 이형, rox와 그 이형， att P와 그 이형, di f와 그 이형 및 frt와 그 이형으로 이루어진 군에서 선택되는 것 일 수 있다. 상기 이형 (variant )는 야생형 (wi ld type) 서열로 알려진 서열에 대 하여 변이체 (mutant )를 포함하는 의미이다.

<88>

<89> 바람직하게 본 발명의 상기 제 1 또는 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 은 lox 부위 (site)일 수 있으며， 예를 들어 loxB, loxL, loxR, ΙοχΡ, 1οχΡ3 , loxP23(당업계에 1οχ23으로도 표기)， loxᅀ 86， 1οχ Δ 117, 1οχΡ511(당업계에 1οχ511 로도 표기)， loxC2 , 1οχΡ2272(당업계에 1οχ2272로도 표기) , 1οχΡ5171(당업계에 1οχ51기로도 표기)， 1οχΡ71(당업계에 lox기로도 표기)， 1οχΡ66(당업계에 1οχ66으로 도 표기)， M2, M3, M7 및 Mil 등을 포함하나， 이에 제한되지 않는다. 상기 제 1 또 는 제 2 부위：특이적 재조합 효소는 동일한 것 일 수 있고, 서로 다른 것일 수 있 다. 가장 바람직하게 본 발명의 상기 제 1 또는 계 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은 ΙοχΡ 및 ΙοχΡ 변이체 (mutant ΙοχΡ)의 관계에 있는 것이 바람직하며, 상기 ΙοχΡ 변이체 (mutant ΙοχΡ) 종류에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 명세서에서 전술한 바를 참조할 수 있다.

<90>

<9i> 본 발명의 공여백터에서 상기 '제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (site- speci f ic recombinat ion site)' 내지 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열' 로 구성되는 영역은 재조합효소에 의하여 스위칭 (swiching)되며, 본 발명에서 용어 ' 공여영역 (donor region)' 으로 지칭될 수 있다. 상기 공여영역 이외의 백터의 부 분을 비-공여영역으로 지칭한다.

<92>

<93> 상기 공여영역에는 바코드 서열이 포함되는 것이 그 특징으로서， 즉， 상기 공여영역에는 베이트 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제 2클로닝 부 위를포함한다. 상기 제 2클로닝 부위는 본 발명의 명세서에서 '바코드 삽입 부위' 등의 용어와호환적으로 지칭될 수 있다.

<94>

<95> '제 2 클로닝 부위' 는 한 세트의 제한효소 부위로 이루어진다. 목적 핵산의 클로닝을 위한 제한효소 부위는 당업계에 잘 알려져 있으며， 전술한 바를 참조할 수 있다. 상기 게 2 클로닝 부위는 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열의 하류에 바로 연결되어있거나, 1 내지 30bp 이내, 바람직하게는 1내지 20bp 이내로 근접해 있는것이 바람직하다.

<96>

<97> 또한， 상기 공여영역에는 터미네이터 서열이 포함 될 수 있다. 상기 용어 ' 터미네이터' 는 구조 유전자의 번역 정지 코돈에 대해 하류방향에 위치하고, 구조 유전자에 대해 작동적으로 연결되어 있으며 전사 종결을 조절하는 비번역 서열을 지칭한다. 상기 터미네이터 서열은 바람직하게 공여역역에서 바코드 서열의 하류에 위치하는 것 일 수 있다.

<98>

<99> 또한, 상기 공여 영역에는 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함 할 수 있 다. 바람직하게 본 발명의 공여 백터는 상기 공여영역 중 상기 제 2 클로닝 부위와 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 사이에, 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 공여영역에 포함되는 마커는， 첫째로 본 발명의 공여백터로 숙주세포의 형질전환이 적절히 이루어졌는지를 확인하는 기능; 및 둘째로 공여백터 로부터 발현된 베이트 단백질이 후술하는 수용백터로부터 발현된 프레이 단백질과 상호작용하는지를 확인하는 기능의 두 가지 기능을 가진다.

<100>

<101> 상기 마커 유전자는 당업계에 통상의 클로닝 백터 마커 유전자로서 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 ( i ) 약물 저항성 유전자;

( ii ) 형광 단백질 코딩 유전자; ( Hi ) 영양 요구성 표지 유전자; ( iv ) 전사 인자 유 전자; 및 ( V ) 세포 표면 마커 유전자 등을 포함한다.

<102>

<103> 상기 약물 저항성 유전자는 특정 약물처리에 의하여 적절히 형질전환된 형질 전환체의 선택가능표현형을 부여하는 유전자를 의미하는 것으로서, 상기 약물로는 항생제， 세포 독성제 등이 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 약물 저항성 유전자는 항생제 저항성 유전자를 의미하는 것으로， 예를 들어 앰피실린 저항성 유전자， 카 나마이신 저항성 유전자， 클로람페니콜 저항성 유전자, 스트템토마이신 저항성 유 전자, 테트라사이클린 저항성 유전자， 겐타마이신 저항성 유전자， 카베니실린 저항 성 유전자 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

<104> <105> 상기 형광 단백질 코딩 유전자에 있어서， 상기 형광 단백질은 형광을 내는 것으로 당업계에 공지된 단백질이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 녹색 형광 단백질 (GFP), 변형된 녹색 형광 단백질 (modified green fluorescent protein), 증 강 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein; EGFP), 적색 형광 단 백질 (RFP), 증강된 적색 형광 단백질 (ERFP)， 청색 형광 단백질 (BFP), 증강된 청색 형광 단백질 (EBFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 증강된 황색 형광 단백질 (EYFP), 남색 형광 단백질 (CFP), 및 증강된 남색 형광 단백질 (ECFP)을 이용할 수 있으며， 바람직 하게는 녹색 형광 단백질 (GFP)을사용하는 것 일 수 있다.

<106>

<107> 상기 영양 요구성 표지 유전자는 본 명에서에서 용어 '영양성 표지자' 와 호 환성 있게 사용되며， 세포의 영양 요구성을 보상할 수 있고 그래서 그 영양요구성 세포에 원영양성을 부여하는 유전자 생산물을 암호화하고 있는 표지자 서열이다. 본 발명에 따라 "영양요구성 " 은 세포가 반드시 영양요구성 세포 스스로에 의해서 는 생산될 수 없는 필수 영양소를 가지고 있는 배지에서 길러져야 한다는 것을 의 미한다. 영양성 표지자 유전자의 유전자 생산물은 영양요구성 세포에서 상실한 필 수 영상소의 합성을 촉진한다. 성공적으로 발현한 영양성 표지자 유전자에 의해 세 포가 길러지는 배양 배지에 필수 영양소를 첨부할 필요는 없을 것이다. 바람직한 표지자는 URA3, LEU2, CAN1, CYH2, TRP1, ADE1, ADE2 및 MET5등을 포함한다.

<108>

<109> 전사 인자 유전자는 특정 유전자의 전사 조절 부위 , 일반적으로 프로모터 부 위에 결합하여 그 유전자의 전사 (Transcript ion)를 유도 또는 억제에 관여하는 단 백질로서 당업계에 공지된 단빡질이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， Adrl, Cat 8, Gal4, Glc7, Hap2, Hxt , Hxk, Lac4, Lac9, Mal63, Migl, Mig2, Mig3, Mxrl, Oafl, Sip4, Snfl, Snf3, Rgt2 및 URS등을 이용할 수 있다.

<110>

<ιιι> 상기 '세포 표면 마커 (cell surface marker) 유전자' 는 세포 표면 (즉, 세포 막 또는 세포벽)에 특정 단백질 또는 항원의 발현시켜 형질전환체의 선택가능 표현 형을 부여하는 유전자를 의미하는 것으로, 상기 세포 표면 마커로는 예를 들어 α- galactosidase, Agalp/Aga2p, Flolp, Cwplp, Cwp2p, Tiplp, Pirl, Pir2, Pir3 및 Pir4등을 포함하나， 이에 제한되지 않는다.

<112>

<113> 상기 공여영역에 포함되는 마커 유전자는， 전술한 DBD 및 상기 DBD에 연결된 베이트 단백질 코딩 서열과 서로 다른 번역 프레임 (frame)에 위치하는 것이 바람직 하다. 따라서 상기 공여영역에 포함되는 마커 유전자는， 상기 마커 유전자의 하류 에 위치하며 제 1 프로모터와 반대 전사 배향인 제 2 프로모터와 작동가능하게 연결 되는 것이 바람직 할 수 있다.

<114>

<115> 상기 '제 2 프로모터' 는 전술한 바와 같이 공여영역에 포함되는 상기 마커 유전자를 발현시키기 위한 것으로서， 상기 마커 유전자와 작동 가능하게 연결되며 제 1프로모터와는 완전하게 독립적으로 작동한다. 본 발명의 제 1프로모터 -DBD 및 베 이트 단백질 코딩 서열로 연결되는 구조 및 제 2프로모터 -마커 유전자로 연결 되는 구조는 게 1프로모터와 게 2프로모터가 듀얼 -프로모터로 따로 작동하기 용이하도록， 각각의 구조가 반대의 전사방향으로 백터 내에 삽입되어 존재하는 것이 바람직하 다.

<116>

<117> 공여영역 내에 위치하는 마커 유전자와 관련하여 본 발명의 일 실시양태에 서， 본 발명 공여 백터는 제 2 클로닝 부위와 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서 열 사이에 순차적으로 마커 유전자; 및 제 1 프로모터와 반대 전사 배향이며 상기 마커 유전자와 작동 가능하게 연결된 제 2 프로모터를 포함하는 형태로 아루어진 것 일 수 있다. 즉， 본 발명 공여백터의 공여영역이 순차적으로 '제 1 부위특이적 재조 합효소 인식서열- 바코드 서열을 위한 제 2 클로닝 부위 -마커 유전자-제 2 프로모터- 제 2 부위특이적 재조합효소 인식서열' 로 이루어지는 것 일 수 있다.

<118> 상기 실시양태에서 적용될 수 있는 마커 유전자의 종류는 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게 항생제 저항성 유전자일 수 있고 이는 전술한 바를 참조로 한 다.

<119>

<120> 또 한가자 바람직한 실시양태에서， 본 발명의 공여백터는 제 2 클로닝 부위와 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 사이에 순차적으로 제 1 마커 유전자; 제 1 프로모터와 반대 전사 배향이며 상기 제 1마커 유전자와 작동 가능하게 연결된 제 2 프로모터; 및 제 1 마커 유전자와 다른 제 2 마커 유전자를 포함하는 형태로 이루어 진 것 일 수 있다. 즉， 본 발명 공여백터의 공여부위가 순차적으로 '제 1 부위특이 적 재조합효소 인식서열- 바코드 서열을 위한 제 2 클로닝 부위-제 1 마커 유전자-제 2 프로모터- 제 2 마커 유전자— 게 2 부위특이적 재조합효소 인식서열' 로 이루어지 는 것 일 수 있다. <121>

<122> 상기 실시양태에서, 공여영역에 존재하는 제 1 마커 유전자는 본 발명의 공여 백터로 적절하게 형질전환이 수행된 형질전환체를 선별하기 위한 선별마커인 것이 적절하다. 상기 쎄 1마커는 제 2 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 본 발명의 공 여백터가 도입된 형질전환체에서 항시 발현한다.

<123> 또한 상기 실시양태에서, 공여영역에 존재하는 상기 제 2 마커 유전자는 베이 트 및 프레아 단백질의 상호작용 여부를 검출 및 선별하기 위한 마커로 사용되는 것으로서， 본 발명의 공여백터가 도입된 형질전환체는 상기 제 2 마커를 항시 발현 하지 않는다. 즉， 공여 백터 내에는 상기 제 2 마커 유전자를 전사또는 발현시키기 위한 조절서열 (프로모터)이 포함되어 있지 않고, 또한 제 2 마커는 '제 2 프로모터- 제 1 마커 유전자' 로 연결 되는 구조의 번역 프레임 밖 (out of frame)에 존재한다. 따라서 단순히 본 발명의 공여백터가 형질전환체 내에 도입된 사실 만으로는 제 2 마커의 발현이 보장되지 못하며， 상기 제 2 마커는 베이트 및 프레이 단백질의 상호 작용에 의하여 숙주세포에서 재조합효소 리포터가 발현됨으로 인하여 후술하는 수 용백터에 공여영역이 재조합되었을 때 비로소 발현된다. 따라서 공여 백터 내에는 상기 제 2 마커 유전자를 전사 또는 발현시키기 위한 조절서열 (프로모터)이 포함되 어 있지 않은 것이 특징이며, 이는 형질전환체 선별을 목적으로 하는 계 1 마커와 구별된다. 상기 제 2 마커의 전사또는 발현을 위한 조절서열은 후술하는 수용 백터 내에 포함되는 것이 바람직하며 특히， 수용백터의 제 2 부위특이적 재조합효소 인식 서열에 바로 인접하여 존재하는 것이 바람작하다.

<124>

<125> 상기 실시양태에서 적용될 수 있는 제 1 마커 유전자와 제 2 마커 유전자는 서 로 다른 종류의 것이라면 상기 마커의 조합 및 종류가 특별히 제한되지 않으며， 전 술한 바를 참조하여 당업자가 설정 변경하여 사용할 수 있다. 바람직하게 상기 제 1 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자일 수 있으며, 상기 제 2 마커 유전자는 형광 단백질 코딩 유전자알 수 있다.

<126>

<127> 또한 본 발명의 공여백터는 상기 공여영역 이외의 부분인 비 -공여영역에 대 하여, 마커 유전자가 추가로 포함될 수 있다. 상기 비 -공여영역의 마커 유전자는 본 발명의 공여백터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 목적으로 삽입되는 것일 수 있으며， 공여영역에 삽입된 마커 유전자와 다른 종류의 것인 것이 바람직하다. 백터에 삽입 될 수 있는 통상의 마커 유전자에 대해서는 전술한 바와 같다. <128>

<129> 본 발명의 상기 공여 백터는 프로모터, 복제 기원, 오퍼레이터, 폴리아데닐 화 신호， 인핸서 및 분비 신호 및 친화성 태그 (aff inity tag)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 았다.

<130>

<131> 상기 본 발명 공여백터의 구현 일례로서， 본 발명은 플라스미드 pGBKT7에 멀티 클로닝 사이트 (MCS)를 제거하고, 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고, 그 뒤로 10x2272서열과 바코드 삽입 부위， 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터, GFP 유전자 및 ΙοχΡ 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pDBD-donor 백터를 제공한다.

<132>

<133> 본 발명의 상기 pDBD-donor 백터는 pGBKT7 백터를 기본으로 유전자 변형을 통하여 제조된 것으로 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 제가하고， 멀티플 클로닝 사이 트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고， 그 뒤로 1οχ2272 서열과 바코 드 삽입 부위 , 카나마이신 항생제 저항성 유전자와 프로모터， GFP 유전자 및 ΙοχΡ 서열이 순차적으로 도밉된 것을 특징으로 한다.

<134>

<135> 상기 pGBKT7 백터는 목적 단백질이 GAL4 DNA binding 도메인 (DBD)에 결합 (융 합)하여 발현될 수 있도록 디자인 된 yeast two hybrid 백터로 [도 4]의 개열지도 와 같은 구조를 가진다.

<136> ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 Cre recombinase에 인식되고 swi t ching 되는 서열이다. 본 발명의 pDBD— donor 백터는 Cre recombinase에 의해 인식되고 재조합 되는 ΙοχΡ 서열 및 10x2272 서열을 포함하며, 상기 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 바람직하게 상호 간에 500 내지 4000bp(base pair) 범위와 간격으로 위치되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 ΐοχρ 서열 및 1 ₀ x2272 서열은 상호 간에 750 내지 3500bp 범위의 간격으로， 가장 바람직하게는 1500 내지 2500bp 범위의 간격으로 위 치되는 것일 수 있다. 상기 pDBD-donor 백터의 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열은 동일 배향 (same orient at ion)으로 위치된다. 상기 ΙοχΡ 서열 및 1οχ2272 서열 사이에 GFP유전자 및 바코드 서열 삽입부위가 도입되어 있다.

<i37> Cre recombinase에 의해 ΙοχΡ서열 및 1οχ2272 서열 사이의 부분이 후술하는 pAD-acc 백터로 도입되면， 상기 GFP(green f luorescent protein) 유전자는 LEU2 프 로모터에 의해 발현이 되어 형광을 나타내며， 상기 pDBD-donor 백터의 바코드 서열 은 후술하는 pAD-acc 백터의 바코드 서열과 연결 (또는 인접)되어 식별될 수 있도록 구성되어 있다 (도 18 참조) .

<138> 상기 '멀티플 클로녕 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체' 는, 상기 기존 백터의 MCS를 목적 단백질에 대한 유전자 삽입부위로 만드는 것을 의미한다. 상기 유전자 삽입부위는 라이브러리를 구성하는 목적 단백질의 유전자가 삽입될 수 있는 부위로 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 유전자를 도 압할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류 가 특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 두 개의 Sf i I 일 수 있다. 상기 유전 자 삽입부위에 삽입되는 유전자는 후술하는 pAD— acc 백터에 도입되는 유전자와 상 호 interact ion을 알고자 하는 목적 유전자로 그 종류는 특별히 제한되지 아니한 다.

<139> 상기 바코드 서열 삽입부위는 상기 pDBD-donor 백터의 유전자 삽입부위 (두 개의 Sf i I 제한효소 자리 사이)에 도입되는 베이트 단백질 유전자를 표시하는 서 열로 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나, 1개 내지 20개의 뉴클레오티드 로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있 다. 상기 바코드 서열 삽입부위는 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 바 코드를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지와 제한효소로 그 종류가특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 Af l I I 및 Age I 일 수 있다.

<140>

<i4i> 본 발명의 pDBD-donor 백터는 바람직하게는 [도 2]의 개열지도로 나타내어질 수 있다. 도 2의 개열지도로 표시되는 pDBD-donor 백터는 베이트 단백질 삽입을 위 한 제 1 클로닝 부위로서 한 세트의 Sf i I 제한효소 자리가 포함되며, 바코드 삽입 부을 위한 제 2 클로닝 부위로서 Af l I I 및 Age I 세트의 제한효소 인식서열이 포 함되어있다. 도 2의 개열지도로 표시되는 pDBD-donor 백터는 바람직하게 서열번호 15의 염가서열로 이루어지는 것 일 수 있으며， 본 발명자에 의하여 기탁번호 KCTC12790BP로 기탁되었다.

<142>

<143> 한편' 본 발명은

<144> 제 1 프로모터；

<145> 숙주세포 리포터 유전자의 전사를 돕는 AD코딩 서열;

<146> 프레이 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 제 1클로닝 부위;

<147> 상기 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제 2클로닝 부위; <148> 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열; 및

<149> 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용 백터를 제공한다.

<150>

<i5i> 상기 제 .1프로모터는 이의 하류에 위치하는 AD 및 상기 AD에 연결된 프레이 단백질 코딩 서열과 작동 가능하게 연결되어 상기 서열꾀 전사를 조절하기 위한 핵 산 서열을 의미한다. 숙주세포 또는 전사인자의 종류 등에 따라 상기 제 1 프로모터 의 종류를 당업자가 용이하게 설정 변경하여 사용할 수 있으며， 이는 당업계에 잘 알려져 있다. .

<152>

<153> 상기 AD는 전술한 공여백터의 DBD와 상호작용 또는 결합하는 것이라면 그 종 류가 특별히 제한되지 않으며 , 전사인자의 DBD 및 AD 조합에 대해서는 전술한 바와 같다.

<154>

<155> 상기 '제 1 클로닝 부위' 는 본 발명의 명세서에서 '유전자 삽입 부위' 등으 로 호환적으로 지칭될 수 있으며， 프레이 단백질 코딩 서열의 삽입을 위한 영역으 로서 한 세트의 제한효소 부위로 이루어진다. 목적 핵산의 클로닝을 위한 제한효소 부위는 당업계에 잘 알려져 있으며， 전술한바를 참조할 수 있다.

<156>

<157> 상기 AD 코딩 서열과 상기 제 1 클로닝 부위에 삽입되는 프레아 단백질 코딩 서열은 직접적으로 연결되거나， 또는 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 따라서 상 기 AD 코딩 서열과 제 1 클로닝 부위 사이에는 링커 서열이 추가적으로 포함될 수 있다.

<158>

<159> 수용백터에서 상기 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열의 삽입을 위한 제

2클로닝 부위는 계 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열의 상류에 위치하는 것이 특 징이다. 게 2클로닝 부위는 게 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열의 상류에 바로 연결되어있거나, 1 내지 30bp 이내， 바람직하게는 1내지 20bp 이내로 근접해 있는 것이 바람직하다.

<160>

<161> 상기 수용백터에서 '제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열' 및 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은' 상호 간에 일정 간격으로 떨어져 백터 내에 위치 되며, 바람직하게 상호 간에 500 내지 4000bp(base pai r) 범위의 간격으로 위치되 는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 '제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열' 및 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은' 상호 간에 500 내지 3000bp 범위의 간격으로， 가장 바람직하게는 700 내지 1200bp의 범위로 위치되는 것일 수 있다.

<162>

<163> 수용 백터의 게 1 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열은 각각 전술한 공여 백터의 제 1 및 제 2 부위 특이적 재조합 효소 인식 서열과 동일하다. 따라서 공여백터에서 1 및 제.2 부위 특이적 재조합 효소 인식 서열 조합에 따라， 당업자라 면 수용 백터의 제 1 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 용이하게 설정할 수 있다. 상기 공여백터의 제 1 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열에 대해서 는 전술한 바와 같다.

<164>

<165> 본 발명에서， 수용백터의 상기 제 1 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서 열은 동일 배향 (same or ient at ion)으로 위치된다. 또한， 상기 수용백터의 제 1 및 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식서열은 전술한 공여백터의 계 1 및 제 2 부위 특이 적 재조합효소 인식 서열과 동일한 상대배향으로 배열 (또는 위치)되는 것이 바람직 하다.

<166>

<167> 본 발명의 수용백터에서 상기 '제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 (s i te- speci f ic recombinat ion si te) ' 내지 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열' 로 구성되는 영역은 재조합효소에 의하여 스위칭 (swiching)되며， 본 발명에서 용어 ' 수용영역 (acceptor region) ' 으로 지칭될 수 있다. 상기 수용영역 이외의 백터의 부분을 비 -수용영역으로 지칭한다.

<168>

<169> 상기 수용영역에는 터미네이터 서열이 포함 될 수 있다. 상기 용어 '터미네 이터' 는 구조 유전자의 번역 정지 코돈에 대해 하류방향에 위치하고， 구조 유전자 에 대해 작동적으로 연결되어 있으며 전사 종결을 조절하는 비번역 서열을 지칭한 다. 상기 터미네이터 서열은 바람직하게 수용영역에서 제 1 부위특이적 재조합효소 인식 서열의 하류에 위치하는 것 일 수 있다.

<170>

<171> 상기 수용백터에서 수용영역은， 베이트 및 프레이 단백질 간에 상호작용이 있는 경우 숙주세포로부터 리포터로서 발현된 재조합효소에 의하여 전술한 공여백 터의 공여영역으로 교체 (또는 치환， 스위칭, 재조합)된다. 이로서， 베이트 표시 바 코드 서열과 프레이 표시 바코드 서열이 제 1 부위 특이적 재조합효소 인식 서열을 사이에 두고서로 인접해있게 된다.

<172>

<173> 상기 수용백터는 비 -수용영역에 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 수용백터는 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열의 하 류에 하나 이상의 마커 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

<174>

<175> 수용백터에 포함되는 상기 마커 유전자는 당업계에 통상의 클로닝 백터 마커 유전자로서 공지된 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 ( i ) 약물 저항성 유전자; ( Π ) 형광 단백질 코딩 유전자; (iii ) 영양 요구성 표지 유전 자; ( iv ) 전사 인자 유전자; 및 ( V ) 세포 표면 마커 유전자 등을 포함한다. 상기 수용백터에 포함되는 마커 유전자는 상기 공여백터에 사용된 마커 유전자와 동일한 것을 사용하지 않는 것이 바람직하며， 마커 유전자의 구체적 종류에 대해서는 공여 백터 설명 시 전술한 바와 같다.

<176> ·

<177> 상기 비 -수용영역에 포함되는 마커 유전자는 전술한 AD 및 상기 AD에 연결된 프레이 단백질 코딩 서열과 서로 다른 번역 프레임 (frame)에 위치하는 것이 바람직 하다. 따라서 상기 비 -수용영역에 포함되는 마커 유전자는, 상기 마커 유전자의 하 류에 위치하며 제 1 프로모터와 반대 전사 배향인 제 2 프로모터와 작동가능하게 연 결되는 것이 바람직 할 수 있다.

<178> 상기 '제 2 프로모터' 는 전술한 바와 같이 비 -수용영역에 포함되는 상기 마 커 유전자를 발현시키기 위한 것으로서， 상기 마커 유전자와 작동 가능하게 연결되 며 제 1프로모터와는 완전하게 독립적으로 작동한다. 본 발명의 제 1프로모터 -AD 및 프레이 단백질 코딩 서열로 연결되는 구조 및 제 2프로모터 -마커 유전자로 연결 되 는 구조는 제 1프로모터와 제 2프로모터가 듀얼 -프로모터로 따로 작동하기 용이하도 록， 각각의 구조가 반대의 전사방향으로 백터 내에 삽입되어 존재하는 것이 바람직 하다.

<179>

<180> 비-수용영역에 위치하는 마커 유전자와 관련하여 본 발명의 일 실시양태에 서， 본 발명의 수용 백터는 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열이 이의 하류에 순차적으로, 번역 종결 코돈이 제거된 제 1 마커 유전자; 및 제 1 프로모터와 반대 전사 배향이며 상기 제 1 마커 유전자와 작동 가능하게 연결된 제 2 프로모터를 포함 하는 형태로 이루어진 것 일 수 있다. 즉， 본 발명 수용백터에서 겨 12 부위 특이적 재조합효소 인식 서열의 하류에 위치하는 비 -수용영역이 '제 2 부위 특이적 재조합 효소 인식 서열 -번역 종결 코돈아 제거된 제 1 마커 유전자-제 2 프로모터' 로 이루 어지는 것 일 수 있다.

<181> 상기 실시양태에서， 베이트 및 프레이 단백질의 상호작용에 의하여 숙주세포 에서 재조합효소 리포터가 발현됨으로 인해 상기 수용백터에 공여영역이 재조합되 면 상기 공여영역의 제 2 마커 (공여백터로부터 유래된 것)가 상기 수용백터의 제 2 프로모터에 의한 번역 프레임에 통합되고 ( in frame) 발현된다.

<182>

<183> 추가적으로， 본 발명의 수용 백터는 상기 제 2 프로모터의 하류에 순차적으 로， 제 2 마커 유전자; 및 제 1 프로모터와 반대 전사 배향이며 상기 제 2 마커 유전 자와 작동 가능하게 연결된 제 3 프로모터를 포함하는 형태로 이루어진 것 일 수 있 다. 즉， 본 발명 수용백터에서 제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열의 하류에 위 치하는 비 -수용영역이 '제 2 부위 특이적 재조합효소 인식 서열 -번역 종결 코돈이 제거된 제 1 마커 유전자-제 1 프로모터와 반대 전사 배향이며 상기 제 1 마커 유전자 와 작동 가능하게 연결된 제 2 프로모터-제 2마커 유전자-제 1 프로모터와 반대 전사 배향이며 상기 제 2 마커 유전자와 작동 가능하게 연결된 제 3 프로모터' 로 이루어 지는 것 일 수 있다.

<184> 상기 수용백터의 제 2 마커 유전자는 본 발명의 수용백터로 형질전환된 세포 를 선별하기 위한 목적으로 삽입되는 것일 수 있으며, 공여백터에 삽입된 마커 유 전자와 다른 것을 사용하는 것이 바람직하다. 백터에 삽입 될 수 있는 통상의 마커 유전자에 대해서는 전술한 바와 같으며， 바람직하게 상기 수용백터의 제 2 마커 유 전자는 항생제 저항성 유전자일 수 있다.

<185>

<186> 본 발명의 상기 수용 백터는 프로모터， 복제 기원, 오퍼레이터， 폴리아데닐 화 신호， 안핸서 및 분비 신호 및 친화성 태그 (aff inity tag)로 이루어진 군에서 선택된 선택된 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

<187>

<188> 상기 본 발명의 수용 백터의 구현 일례로서， 본 발명은 플라스미드 _P GADT7 의 LEU2 유전자 말단에 loxP 서열을 삽입하고， 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개 의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고 그 뒤로 바코드 삽입 부위， 10x2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로 하는 pAD-acc 백터를 제공한다.

<189>

<190> 본 발명의 상기 pAD-acc 백터는 pGADT7백터를 기본으로유전자 변형을 통하 여 제조된 것으로 LEU2 유전자 말단 (전사방향 기준)에 loxP 서열을 삽입하고， 멀티 풀 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체하고， 그 뒤로 바코 드 삽입 부위, 10x2272 서열이 순차적으로 도입된 것을 특징으로한다.

<191>

<192> 상기 _P GADT7 백터는 목적 단백질이 GAL4 act ivat ion 도메인 (AD)에 결합 (융 합)하여 발현될 수 있도록 디자인 된 yeast two hybrid 백터로 [도 3]의 개열지도 와 같은 구조를 가진다.

<193> 상기 LEU2 유전자는 류신의 upst ream조절 인자로 일반적으로효모의 스크리 닝에 사용되며, pGADT7백터에 기본적으로 포함된다. 상기 LEU2 유전자는 이와 작동 가능하게 연결되어있는 LEU2 프로모터에 의해 발현이 조절된다.

<194> loxP 서열 및 1οχ2272 서열은 Cre recombinase에 인식되고 swi tching 되는 서열이다. 상기 pAD-acc 백터에서 loxP 서열 및 1 ox2272 서열은 상호 간에 일정 간 격으로 떨어져 백터 내에 위치되며， 바람직하게 상호 간에 500 내지 4000bp(base pair) 범위의 간격으로 위치되는 것일 수 있다. 더욱 바람직하게 상기 loxP 서열 및 1οχ2272 서열은 상호 간에 500 내지 3000bp 범위의 간격으로, 가장 바람직하게 는 700 내지 1200bp의 범위로 위치되는 것일 수 있다. 상기 pAD-acc 백터의 loxP 서열 및 10x2272 서열은 동일 배향 (same oriental; ion)으로 위치된다. 또한 상기 pAD-acc 백터의 loxP 서열 및 1οχ2272 서열은， 상기 pDBD-donor 백터의 loxP 서열 및 10x2272 서열과 서로 동일한 상대배향으로 배열 (또는 위치)되는 것이 바람직하 다. 본 발명의 백터는 LEU2 유전자 하단 (전사방향 기준)에 loxP 서열아위치하여 , Cre recombinase에 의해 다른 서열 (유전자)이 LEU2 하단에 결합하면 발현이 이루어 지게 구성되어 있다. 이를 위하여 loxP 서열이 도입되는 LEU2 유전자 말단은 종결 코돈을 제거하여 발현시 LEU2 말단에서 발현이 중단되지 않도록 구성되어 있다. 또 한 10x2272 서열 앞에 바코드 서열 삽입부위를 도입하여， 상기 바코드 서열 삽입부 위에 삽입된 바코드 서열이 Cre recombinase에 의해 이동된 다른 바코드 서열 (즉, pDBD-donor 백터로부터의 바코드 서열)과 함께 결합 또는 인접 되도록 구성되어 있 다. 도 5에서 Cre recombinase에 의하여 pDBD-donor 백터로부터 일부 서열 (양 말단 이 각각 loxP 및 1οχ2272에 의하여 f lanking 되어있는 서열)이 pAD-acc 백터로 switch 된 후의 백터의 개열지도를 도시하며， 이러한 백터의 swi tch 과정 및 결과 물을 도 14에서 도시한다.

<195> 상기 '멀티플 클로닝 사이트 (MCS)를 두 개의 Sf i I 제한효소 자리로 대체' 는， 상기 기존 꿱터의 MCS를 목적 단백질에 대한 유전자 삽입부위로 만드는 것을 의미한다. 상기 유전자 삽입부위는 라이브러리를 구성하는 목적 단백질의 유전자가 삽입될 수 있는 부위로 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 유전자를 도 입할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류 가 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 두 개의 Sf i I 일 수 있다. 상기 유전 자 삽압부위에 삽입되는 유전자는 pDBD-donor 백터에 도입되는 유전자와 상호 interact ion을 알고자 하는 목적 유전자로서 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다.

<196> 상기 바코드 서열 삽입부위는 상기 pAD-acc 백터의 유전자 삽입부위 (두 개의

Sf i I 제한효소 자리 사이)에 도입되는 프레이 단백질 유전자를 표시하는 서열로 뉴클레오티드 수는 특별히 제한되지 아니하나， 1개 내지 20개의 뉴클레오티드로 구 성될 수 있으며， 바람직하게는 5개 내지 15개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있다. 상기 바코드 서열 삽입부위는 임의의 제한효소 인식부위를 포함하여 원하는 바코드 를 도입할 수 있게 하는 것이 바람직하며， 상기 제한효소는 공지의 제한효소로 그 종류가 특별히 제한되지 아니하나， 바람직하게는 BsiW I， Xbal 및 Sac I I의 제한 효소 일 수 있으며， 예를 들어 BsiW I 및 Sac I I의 세트 또는 Xbal 및 Sac I I 세트 를 사용할 수 있다.

<197>

<198> 본 발명의 pAD-acc 백터는 바람직하게는 [도 1] 또는 [도 1()]의 개열지도로 나타내어질 수 있다. 도 1과 도 10의 개열지도는 바코드 삽입부위에 포함되는 제한 효소 인식 서열에서 차이가 있을 뿐 이외의 다른 구성은 모두 동일하다. 도 1의 개 열지도로 표시되는 pAD-acc 백터의 바코드 삽입부위에는 BsiW I 및 Sac I I의 제한 효소 인식 서열이 포함되어있으며 도 10의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 백터의 바 코드 삽입부위에는 Xbal 및 Sac I I의 제한효소 인식서열이 포함되어 있다.

<199>

<200> 상기 도 1의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 백터는 바람직하게 서열번호 16의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다.

<20i> 상기 도 10의 개열지도로 표시되는 pAD-acc 백터는 바람직하게 서열번호 17 의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있으며， 본 발명자에 의하여 기탁번호

KCTC12791BP로 기탁되었다.

<202> <203> 본 발명은 상기 공여백터 맟상기 수용백터를 포함하는, 단백질 상호작용 검 출을 위한 키트 (ki t )를 제공한다.

<204>

<205> 본 발명에 따른 단백질 상호작용 검출 키트는 상기 공여백터 및 수용백터 외 에도, 상기 백터들에 목적 핵산을 삽입시키기 위한 제한효소， 프라이머， 완층용액 등의 재료 (material )와 제조된 백터를 세포에 도입시키기 위한 트랜스펙션 제제， 모세포주 등을 비롯하여 형질전환 된 세포주의 선별에 필요한 모든 생물학적 또는 화학적 시약을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 흔합하는데 사용될 튜브， 웰 플레이트 등의 실험도구들과사용방법을 기재한 지시 자료 (사용설명서) 등을 추가로 포함할 수 있다. 이 외에도， 본 발명의 키트의 구 성은 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다.

<206>

<207> 또한 본 발명은， 상기 공여백타 및 수용백터를 이용하여 단백질간의 상호작 용을 검출하는 방법을 제공한다. 구체적으로，

<208> (a) 상기 공여백터에 베이트 (bai t ) 단백질 코딩 서열 및 상기 베이트 단백질 을 표시하는 바코드 서열을 도입하여 베이트 라이브러리를 제작 하는 단계;

<209> (b) 상기 수용백터에 프레이 (prey) 단백질 코딩 서열 및 상기 프레이 단백질 을 표시하는 바코드 서열을 도입하여 프레이 라이브러리를 제작하는 단계 ;

<210> (c) 상기 베이트 라이브러리 및 프레이 라이브러리를 리포터로서 재조합효소 를 발현하는 숙주세포에 도입하는 단계; 및

<211> ( C ) 상기 숙주세포로부터 리포터 발현 여부를 조사하여 베이트-프레이 단백 질 결합쌍들을 검출하는 단계를 포함하는, 단백질 상호작용 검출 방법.

<212>

<213> 본 발명에서 제공하는 단백질 상호작용 검출방법은 기존 이증 -하이브리드 시스템을 근간으로 하고 있으나， 전술한 본 발명의 공여백터 및 수용백터를 이용함 으로서 단백질 라이브러리간 (베이트 단백질 라이브러리 및 프레이 단백질 라이브러 리)에서 동시 다발적으로 일어나는 단백질 상호작용 검출을 가능하게 한다. 뿐만아 니라 각 백터에 포함된 바코드 서열을 이용하여， 라이브러리 간 단백질 반웅에 있 어서 서로 상호작용하는 단백질들을 규명하기 위한 대량의 정보처리에 있어 이점을 제공한다.

<214>

<215> 상기 '베이트 라이브러리' 는 서로 상이한 베이트 단백질을 코딩하는 핵산의 총 집합체를 의미한다. 본 발명에서 상기 베이트 라이브러리는 본 발명의 상기 공 며백터 각각에 대하여 서로 다른 베이트 단백질 코딩 서열과 상기 베이트 단백질을 표시하는 바코드 서열을 삽입함으로서 제조된다.

<216>

<217> 상기 '프레이 라이브러리' 는 서로 상이한 프레이 단백질을 코딩하는 핵산의 총 집합체를 의미한다. 본 발명에서 상기 프레이 라이브러리는 본 발명의 상기 수 용백터 각각에 대하여 서로 다른 프레이 단백질 코딩 서열과 상기 프레이 단백질을 표시하는 바코드 서열을삽입함으로서 제조된다.

<218>

<219> 한편 상기 라이브러리의 제조에 있어서, 본 발명에서 사용되는 표준 재조합

DNA 및 분자 클로닝 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고， 다음 문헌에 기재되 어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Sambrook, J . , Fri tsch, E. F. and Maniat is , T. , Molecular Cloning ^' . A Laboratory Manual , ^l 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spr ing Harbor , NY (1989)； by Si lhavy, T. J . , Bennan, M. L . and Enquist , L. W. , Experiments with Gene Fusions , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor , NY (1984)； and by Ausubel , F . M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, publ i shed by Greene Publ i shing Assoc . and Wi ley-lnterscience (1987) ) .

<220>

<221> 상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포 일 수 있다. 예를들어 진핵세포는 균류 (ex. 효모)， 곤층 및 포유동물 세포 등을 포함하는 종류 일 수 있으며， 원핵세 포로는 박테리아 (ex. 대장균 (£s^e ^/a «?//) ) 등을 포함할 수 있으나， 이에 제 한되지 않는다.

<222>

<223> 본 발명에서 상기 숙주세포는 리포터로서 재조합효소를 발현하는 것이 그 특 징으로, 상기 재조합 효소는 상기 (a) 단계에서 사용된 공여백터 및 (b) 단계에서 사용된 수용백터에 삽입되어있는 부위-특이적 재조합효소 인식 서열을 인식할 수 있는 재조합효소인 것이 바람직하다. 상기 공여백터 및 수용백터 내에 포함되는 부 위-특이적 재조합효소 인식 서열과 숙주세포가 리포터로서 발현하는 재조합 효소간 의 특이적 관계 및 이를 이용한 재조합 시스템은 전술한 바와 같이 당업계에 공지 되어있으며, 당업자는 이를 이용하여 본 발명의 단백질 상호작용 검출방법의 구성 을 조합할 수 있다. <224>

<225> 한편， 상기 숙주세포로서 본 발명은 하기 (i) 및 (ii)의 발현 카세트를 동시 에 포함하는 아중 (dual) 리포터 효모 균주를 제공한다;

<226> (i) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UASCupstream activation sequence), GALl 프로모터， MF α 1 유전자， c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Agal 유전자를 포함하는 c-myc 리포터 발현 카세트; 및

<227> (ii) 순차적으로 작동 가능하게 연결되며 GAL4 UASCupstream activation sequence) , GALl 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포 함하는 Cre 리포터 발현 카세트.

<228>

<229> 본 발명에서 용어 '발현 카세트' 는 '발현 구조체' 와 호환성 있게 사용되 며, 목적하는 구조 유전자를 발현할 수 있는 핵산 구조체를 의미하는 것으로， 세포 에 따라 적절한 프로모터 및 이와 작동가능 하게 연결된 구조 유전자 등을 포함한 다.

<230>

<23i> 상기 이증 리포터 효모 균주는， 상기 (i)의 발현 카세트에 의한 c-myc 리포 터 시스템 (도 11의 A에 도시) 및 (ii)의 발현 카세트에 의한 Cre 리포터 시스템 (도 11의 B에 도시)의 이중 리포터 시스템을 가지는 것이 그특징이다.

<232>

<233> 상기 효모균주는 효모 이중 보합계 (yeast two hybrid)에 사용될 수 있는 균 주는 어떤 것이든 가능하며, 예를 들어 사카로마이세스 속 Saccharomyces spp.), 클루이베로미세스 쏙 UUiiyveroinyces spp.), 시조사카로마이세스 속 ( Schi zosaccharomyces spp. ) , 피키아 ^{Pichia spp . ) , ^■ 파피아 속 G¾///a spp.), 칸디다 쏙 Candida spp.), 탈라로미세스 쏙 {Talaromyces spp.), 브레타노미세스 속 Brettanomyces spp.), 파키솔렌 쏙 iPachysoIen spp.) 또는 데바리오미세스 속 {Debaryowyces spp.) 등을 포함하며， 이에 제한하지 않는다.

<234> 바람직하게는 사카로마이세스 속 균주일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 사카 로마이세스 세레비지애 (5 c ?arcw?yces cerevisiae) 균주 일 수 있다.

<235>

<236> 상기 (i)의 c-myc 리포터 발현 카세트는 본 명세서에서 '1st 리포터' 또는

'1st 리포터 시스템' 등으로 지칭 될 수 있으며， 순차적으로 작동 가능하게 연결 되어있는 GAL4 UAS(upstream activation sequence), GALl 프로모터， MF α 1 유전자， c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Ag a l 유전자가 포함된 것이 그 특징이 다ᅳ

<237>

<238> 상기 GAL4 UAS는 GA 전사인자의 DNA 결합 도메인 (DBD)이 결합 할 수 있는 서열을 말한다. GAL4 전사인자를 이용하는 이중 -하이브리드 시스템에 있어서， GAL4 전사인자의 DNA 결합 도메인 (DBD)과 전사활성 도메인 (AD)은 각각 베이트 및 프레이 단백질과 융합 (이들은 통상 각각 DBD-Bait 및 AD-Prey로 불림)되어 효모 균주 내에 서 발현되며， DBD-Bait 및 AD— Prey가 상호작용하면 GAL4 전사인자가 작동하여 하위 에 작동 가능하게 연결된 리포트 (report ) 서열의 전사가 일어나게 된다.

<239> GAL1프로모터는 GAL4 UAS의 하류에 작동가능하게 연결되며， 본 발명에서 상 기 GAL1 프로모터의 핵산서열은 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

<240> MF a l 유전자는， 효모에서 외래 유전자에 의한 단백질 (본 발명에서 c-myc 에 피토프)의 분비를 위한 분비 신호 인자이다. 본 발명에서 상기 MF a l 유전자의 핵 산 서열은 이에 제한되지 않으나， 예를 들어 서열번호 25의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다.

<24i> c-myc 에피토프 (epi tope， 항원결정기) 코딩 폴리뉴클레오티드는 Myc 단백질 중 특정 에피토프만을 발현하도록 구성되었다. 본 발명의 상기 c-myc 에피토프 코 딩 폴리뉴클레오티드의 서열구성은 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 26 의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다. 상기 c-myc 에피토프는， 상기 c-myc 에 피토프의 반복체 (즉, 첫번째 c-myc 에피토프에 연결되어 수회 반복하여 발현된 것) 를 의미하는 것 수 있다. 상기 반복 흿수는 특별히 제한되지 아니하나， 1회 내지 20회 일 수 았으며, 바람직하게는 1회 내지 10회 일 수 있다/

<242> Ag a l 유전자는 효모 균주의 세포 표면 당단백질인 알파 -아글루티닌 ( a - agglut inin)을 발현하는 유전자이다. 상기 Ag a l 유전자는 c myc 에피토프 코딩 폴 리뉴클레오티드와 연결되어 있다. 따라서 yeast two hybrid실험 시 bait와 prey가 상호작용하는 경우, 알파-아글루티닌이 c-myc 에피토프와 함께 세포 표면에 발현되 므로 세포 표면에 c-myc 에피토프가 노출된다. 본 발명에서 상기 Ag a l 유전자의 핵산 서열은 이에 제한되지 않으나， 예를 들어 서열번호 28의 염기서열로 이루어지 는 것 일 수 있다.

<243> 상기 ( i ) c-myc 리포터 발현 카세트에서, c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오 티드 및 Ag a l 유전자는 상기 핵산이 직접 연결되는 것 일 수 있고 도는 링커에 의 해 연결되는 것 일 수 있다.

<244> 본 발명에서 상기 용어 '링커 ( l inker)' 는 두 핵산 사이를 연결하는 임의의 핵산서열을 의미한다. 본 발명에서 상기 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오티드 및 Ag a l 유전자를 연결하는 링커는 그 서열구성이 특별히 제한되지 않으나， 바람직하 게 글리신 (Glycine) 또는 / 및 세린 (Serine)으로 이루어지는 펩타이드 단편을 코딩 하는 핵산서열 일 수 있다. 상기 '글리신 또는 / 및 세린으로 이루어지는 펩타이드 단편' 은 펩타이드 단편을 이루는 글리신과 세린의 개수 및 조합이 특별히 제한되 지 않으며, 당업자라면 목적하는 바에 따라 상기 링커의 구성을 용이하게 설정할 수 있음이 자명하다. 일례로 본 발명에서 상기 c-myc 에피토프 코딩 폴리뉴클레오 티드 및 Ag a l 유전자를 연결하는 링커는 서열번호 27의 염기서열로 이루어지는 것 일 수 있다.

<245>

<246> 가장 바람직하게 상기 ( i )의 c-myc 리포터 발현 카세트는 GAL4 UAS의 하류에 서열번호 13으로 표시되는 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 것 일 수 있다. 상기 서열번호 13와 DNA 서열은 c-myc 에꾀토프의 10회 반복체가 삽입되어있는 것이 특 징이다.

<247>

<248> 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입된 bai t와 prey가 상호작용하여 GAL4 전 사인자를 작동시키면 하위 Myc단백질 (특히， c-myc 에피토프)이 세포 표면에 발현이 되고, 이를 검출 (detect ion)하는 방법으로 bait와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있다.

<249> 상기 Myc 단백질의 세포 표면 발현을 검출하는 방법은 공지의 단백질 detect ion 방법에 의할 수 있으며, 바람직하게는 Myc 단백질 (특히, c-myc 에피토 프)에 특이적으로 결합하는 항체 및 식별가능한 표자를 포함하며 상기 항체에 특이 적으로 결합하는 항체에 의한 검출 방법일 수 있다.

<250> 상기 항체를 사용하는 경우， 항체의 결합 특이성을 이용하는 공지의 세포 검 출 또는 세포 선별 방법을 사용하는 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 Magnet ic-act ivated cel l sort ing (MACS) 방법에 의한 것 일 수 있다.

<251> 상기 식별 가능한 표지는 바람직하게는 형광물질 일 수 있으며， 더욱 바람직 하게는 시아닌 계열의 형광물질 일 수 있다. 상기 형광물질의 발현을 detect ion하 는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며， 바람직하게는 형 광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACS(Fluorescence-act ivated cel l sort ing) 방법, 형광현미경 등에 의할 수 있다.

<252>

<253> 상기 ( i i )의 Cre 리포터 발현 카세트는 본 명세서에서 '2nd 리포터' 또는 '

2nd 리포터 시스템' 등으로 지칭 될 수 있으며， 순차적으로 작동 가능하게 연결되 며 GAL4 UAS(upstream act ivat ion sequence) , GAL1 프로모터 및 Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자를 포함하는 것이 특징이다.

<254>

<255> 상기 GAL4 UAS(upstream act ivat ion sequence) 및 GAL1 프로모터는 전술한 바와 같다. 상기 'Cre 재조합효소 (Cre recombinase) 발현 유전자' 는 본 명세서에 서 ' CRE 유전자' 등의 용어와 호환성 있게 사용된다. 상기 Cre 재조합효소는 P1 박 테리아파지에서 유래되는 티로신 재조합 효소로서， Cre-Lox site 재조합을 유발하 는데 활용되는 효소로서 알려져 있다. 공지의 Cre 재조합효소 활성을 가지는 단백 질을 코딩 하는 한， 본 발명에서 상기 Cre 재조합효소 발현 유전자의 구체적인 염 기서열은 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 서열번호 29의 염기서열로 이루어지 는 것 일 수 있다.

<256>

<257> 가장 바람직하게 ( i i )의 Cre 리포터 발현 카세트는 GAL4 UAS 의 하류에 서열 번호 14로 표시되는 DNA서열이 작동가능하게 연결된 것 일 수 있다.

<258>

<259> 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입된 bai t와 prey가 상호작용하여 GAL4 전 사인자를 작동시키면 Cre 재조합효소가 발현된다. 따라서 상기 Cre 재조합효소를 직접 검출 (detect ion)하거나， 상기 Cre 재조합효소가 발현됨으로 인해 세포 내에 발생된 유전적인 변화를 탐지하는 방법으로 bai t와 prey의 상호작용 여부를 확인할 수 있다.

<260> 상기 Cre 재조합효소를 직접 검출하는 방법은 공지의 단백질 검출 방법에 의 할 수 있으며, 바람직하게는 Cre 재조합효소에 특이적으로 결합하는 항체 및 식별 가능한 표지를 포함하며 상기 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 의한 검출 방법 일 수 있다. 상기 식별 가능한 표지는 당업계에 단백질 또는 항체표지 물질로 사용 되는 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 바람직하게는 형광물질 일 수 있다. 상기 형광물질의 발현을 검출하는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아니하며， 바람직하게는 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한 FACSCFluorescence-act ivated cel l sort ing) 방법， 형광현미경 등에 의할 수 있다. <26i> 상기 Cre 재조합효소가 발현됨으로 인해 세포 내에 발생된 유전적인 변화를 탐지하는 방법으로는， 구체적으로 Cre-lox 재조합 시스템 (Cre ox recominat ion system)을 본 발명의 효모에 도입하여 세포 내 핵산들의 변화를 탐지하는 방법일 수 있다. 이를 위해서는 bait 및 prey 단백질을 효모 세포 내에 발현시키기 전에, 효모 균주의 유전체 또는 /및 상기 효모 균주에 도입될 와래 핵산 (예를들어， 백터 등)에 하나 이상의 lox site를 도입하는 사전 작업이 필요할 수 있다. 상기 lox si te에 대해서는 전술한 바와 같다.

<262>

<263> Cre 재조합효소가 발현되면 lox site를 함유하는 핵산 영역 간에 재조합이 일어나 핵산 서열에 변화가 생기게 되며, 상기 변화된 핵산 서열은 실질적인 변화 표현형 (phenotype)을 나타낼 수 있다.

<264> ᅵ상기 변화된 핵산서열은 공지의 시뭔성 (sequencing) 방법에 의하여 탐지 (규 명) 될 수 있다. 상기 시뭔싱 방법으로는 이에 제한되지 않으나， Sanger sequencing 또는 NGS(Next generat ion sequencing)등의 방법에 의해 수행될 수 있 다.

<265> 또한, 상기 변화된 핵산서열로 인하여 세포에 변화된 표현형이 나타나는 경 우에는 상기 변화 표현형을 검출하여 bai t 및 prey 단백질 간에 상호작용을 판정할 수 있다.

<266> 상기 변화 표현형이란, 기존에 나타내지 않던 표현형을 새롭게 나타내는 것 또는 표현형의 조합을 모두 포함하는 의미이다.

<267> 기존에 나타내자 않던 표현형을 새롭게 나타내는 경우는， 예를 들어， 사전에 어떠한 번역 프레임 (frame)에도 속하지 않는 마커 유전자 근처에 하나 이상의 lox site를 위치시키는 경우, bait 및 prey 단백질 상호작용으로 인해 발현된 Cre 재조 합효소에 의하여 lox site 재조합이 일어났을 때, 상기 마커 유전자가 번역 프레임 에 들어오도록 ( in frame) 핵산 서열들의 위치가 스위칭 (switching)될 수 있으며, 이에 따라 기존에 발현되지 않던 마커 유전자가 발현되므로 표현형의 변화를 가져 오게 된다.

<268> 표현형의 조합은， 예를 들어， 어떤 마커 유전자에 대한 하나의 번역 프레임 근처에 하나 이상의 lox site를 위치시키는 경우， bait 및 prey 단백질 상호작용으 로 인해 발현된 Cre 재조합효소에 의하여 lox site 재조합이 일어났을 때， 상기 마 커 유전자의 번역 프레임 전체가 유전체 상의 다른 위치로 스위칭 (switching)되어 복수의 표현형을 나타낼 수 있다. <269> 상기 마커 유전자는 그 종류가 특별히 제한되지 않으나， 예를 들어 약물 저 항성 유전자, 형광 단백질 코딩 유전자， 영양 요구성 표지 유전자 등을 포함한다. 본 발명에서 상기 마커 유전자로는 형광 단백질 코딩 유전자가 사용되는 것이 바람 직할 수 있으며， 이 경우 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가 가능한

FACS(Fluorescence-act ivated cel l sort ing) 등의 방법을 통하여 손쉽게 해당 세포 들을 선별할 수 있다.

<270>

<271> 상기 이중 리포터 효모 균주에서, 상기 1st 리포터 시스템과 2nd 리포터 시 스템은 효모 유전체 내에서 서로 상이한 영역에 위치하는 것 일 수 있다. 즉, 1st 리포터 시스템과 2nd 리포터 시스템은 서로 다른 염색체 (chromosome) 상에 위치하 는 것 일 수 있다.

<272>

<273> 상기 이중 리포터 효모 균주는 본 발명자에 의해 KCTC12792BP로 기탁되었다.

상기 기탁균주는 1st 리포터 시스템으로서 GAL4 UAS 의 하류에 서열번호 13으로 표 시되는 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 c-myc 리포터 발현 카세트가 효모 유전체 중 15번 염색체에 포함되어있으며， 2nd 리포터 시스템으로서 GAL4 UAS 의 하류에 서열번호 14로 표시되는 DNA 서열이 작동가능하게 연결된 Cre 리포터 발현 카세트 가 5번 염색체에 포함되어있다.

<274>

<275> 상기 '도입' 은 숙주세포 내에 해당 핵산이 발현되도록 형질전환 하는 것을 의미하며， 숙주세포의 백터로 형질전환은 당업계에 공지된 형질전환방법, 예를 들 면, 인산칼슘법, 염화칼슴법， 염화루비듐법， 미세사출법 (microproject i le bombardment ) , 일렉트로포레이션 (electroporat ion) , _ᅵ 입자 총 충격 (part icle gun bombardment ) , 실리콘 탄화물 위스커 (Si l icon carbide whiskers) , 초음파 처리 (sonicat ion) , PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion) , 미세주입법 (microinject ion) , 리포좀 매개법 ( l iposome-mediated method) , 자성나노입자 매개 법 (magnetic nanopart icle-mediated method) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제 한되지 않는다.

<276>

<277> 상기 숙주세포로부터 리포터 발현 여부를 조사하면 베이트-프레이 단백질 결 합 쌍들을 검출할 수 있으며， 특히 리포터로서 재조합효소가 발현되는 경우에 공여 백터 및 수용백터에 포함되어있던 각각의 바코드 서열이 서로 인접하도록 조합된다 (도 14 참조) . 이렇게 인접하게 조합된 바코드 서열을 이용하면， PCR을 통하여 해 당 단백질의 상호작용의 유무를 검출 할 수 있을 뿐만아니라， NGS를 통한 바코드 리딩 (bacord reading)을 통하여 라이브러리-라이브러리간 대량의 단백질 동시 분석 시에 단백질간 상호작용의 세기 차이 또한 검출 가능하다.

<278>

<279> 본 발명의 단백질 상호작용 검출 방법에 있어서, 가장 바람직한 실시 방법은 하기와 같을 수 있다;

<280> (a) 상기 pAD-acc 백터 및 상기 pDBD-donor 백터에 각각상이한 바코드 서열 을 도입하고， 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1， 쩨 2 라이브러리를 구성하는 단계;

<28i> (b) 상기 제 1 및 제 2라이브러리를 상기 이중 리포터 효모 균주에 도입하는 단계;

<282> . ( C ) 상기 제 1라이브러리 및 제 2라이브러리가 도압된 효모 균주로부터， 상기 pAD-acc 백터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질과 상기 pDBD-donor 백터에 도 입된 유전자로부터 발현된 단백질이 서로 상호작용하는 효모균주를 선별하는 단계;

： ^■ 및

<283> (d) 상기 선별된 효모균주와 바코드 서열을 식별하여 상기 상호작용하는 단 백질을 선택하는 단계를 포함하는 단백질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한 다.

<284>

<285> 이하상기 방법에 관하여 단계별로 설명한다.

<286>

<287> ( a) 단계에서는 전술한 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor백터에 각각 상이한 바코 드 서열을 도입하고, 서로 다른 목적 단백질을 발현하는 유전자를 재조합하여 제 1 및 제 2라이브러리를 구성한다.

<288> 상기 pAD-acc 백터， pDBD-donor백터 및 바코드 서열에 관해서는 전술한 바와 같다. 도 14와 A 및 B에서 상기 백터들에 대한모식도가제공된다.

<289> 바코드는 재조합되는 유전자를 식별하기 위하여 도입되는 서열로서， 각 백터 에 재조합 되는 목적 단백질 유전자 (즉, 베이트 단백질 유전자 또는 프레이 단백질 유전자)에 따라 상이한 바코드 서열이 도입되는 것이 바람직하다. 바코드 서열은 상기 pAD-acc 백터 및 상기 pDBD-donor 백터의 바코드 서열 삽입부위에 삽입된다.

<290> 상기 목적 단백질 유전자는 상호작용 여부를 확인하고자 하는 단백질을 코딩 하는 DNA (유전자)를 말하며， pAD-acc 백터 및 pDBD-donor백터의 유전자 삽입부위( 두개의 Sf i I site 사이에)에 삽입된다.

<291> 본 발명의 백터에 바코드 서열 및 유전자를 재조합하는 방법은 공지의 유전 자 조작 방법에 의할 수 있다.

<292> 본 발명의 제 1라이브러리는 목적 단백질 유전자 (특히， 프레이 단백질 유전 자) 및 바코드 서열이 도입된 pAD-acc 백터군을 말하며， 제 2라이브러리는 목적 단 백질 유전자 (특히, 베이트 단백질 유전자) 및 바코드 서열이 도입된 pDBD-donor 백 터군을 말한다.

<293>

<294> 상기 (b) 단계에서는 상기 제 1 및 게 2라이브러리를 본 발명의 이증 리포터

효모 균주에 도입한다 . 본 발명의 라이브러리를 효모 균주에 도입하는 방법은 공지 의 효모 형질전환 방법에 와할 수 있다. .

<295>

<296> 상기 (c) 단계에서는 pAD-acc 백터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질

(AD— Prey)과 pDBD-donor 백터에 도입된 유전자로부터 발현된 단백질 (DBD-Bait )이 상호작용 하는 효모균주를 선별한다.

<297> 상기 본 발명의 효모균주는 전술한 ( i ) 및 ( i i )의 이중 (dual ) 리포터 시스템 을 가지므로， 상기 AD-Prey와 DBD-Bai t이 상호작용하는 경우, ( i )의 리포터 시스템 에 의하여 c-myc에피토프가 효모 세포벽 표면에 발현하고， ( i i )의 리포터 시스템에 의해 GFP의 발현， 바코드 서열 조합, 두 개 이상의 항생제에 대한 내성을 가지는 등 다양한 표현형이 발현된다.

<298> 상기 ( i i )의 리포터 시스템에의한 표현형과 관련하여 좀 더 구체적으로 설명 하면， 상기 ( i i )리포터 시스템의 CRE 유전자의 발현에 의해 생성된 Cre recombinase는 yeast two hybird 과정에서 본 발명의 효모 균주에 도입된 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터의 ΙοχΡ 및 1 ox2272서열을 인식하고 이들을 재조합한다ᅳ 상기 두 백터의 Cre recombinase에 의한 재조합에 의해 GFP 단백질의 발현 (재조합 에 의해 LEU2 하단에 GFP가 발현 가능하도록 연결됨. 즉， LEU2 번역 프레임에 GFP 가 인프레임 ( in frame) 됨) 및 바코드 서열의 조합 (pDBD-donor 백터의 바코드 서열 이 pAD-acc 백터로 이동 (transfer)됨)이 일어나게 되며， 상기 GFP 단백질꾀 발현을 detect ion하여 bai t와 prey간 상호작용이 일어난 균주를 select ion 할 수 있으며, 상기 조합된 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터에 포함된 바코드 서열을 식별하여 . 상호작용이 일어난 단백질이 어떤 것인지 확인이 가능하다. 상기 식별은 바코드의 폴리뉴클레오티드 서열을 식별하는 것을 말하며， 공지의 시¾싱 방법에 의하여 식 별할 수 있다. 상기 GFP 단백질의 발현을 detect ion하는 방법은 공지의 형광 분석 방법이면 특별히 제한되지 아나하며， 바람직하게는 형광 분석 및 형광 발현 세포의 분류가가능한 FACS(Fluorescence— act ivated cel l sort ing) 방법에 의할 수 있다. 또한 상기 바코드 서열의 조합은 PCR을 통하여 해당 단백질의 상호작용의 유무를 검출 할 수 있을 뿐만아니라， NGS를 통한 바코드 리딩 (bacord reading)을 통하여 라이브러리—라이브러리간 대량의 단백질 동시 분석 시에 단백질간 상호작용의 세기 차이 또한 검출 가능하다.

<299>

<300> 상기 표현형들을 이용하여 AD-Prey와 DBD-Bait가 상호작용하는 효모균주를 선별할 수 있다. 도 14의 C에서 상기 AD-Prey와 DBD-Bai t이 상호작용하는 경우， ( i i )의 리포터 시스템에의해 재조합된 백터의 모식도를 도시하며, 구체적으로 도 5 에서 그 개열지도를 도시한다.

<301>

<302> 상기 효모균주 선별은 상기 표현형을 이용하는 한 그 방법이 특별히 제한되 지 않으나, 예를 들어， Myc 단백질 (특히， c-myc 에피토프)에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 Myc 단백질에 결합시킨 후 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하며 형광 물질 (특히 시아닌 계열)로 표지된 2차 항체를 결합시키고 형광현미경 또는 FACS 등 을 이용하여 선별하는 방법， Myc 단백질에 특이적으로 결합하는 1차 항체를 단백질 에 결합시킨 후 상기 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체로 코팅된 자성 비드를 사용하여 MACS를 수행하여 선별하는 방법， 2종 이상의 항생제를 처리하여 선별하는 방법， GFP에 대하여 형광현미경 관찰 또는 FACS 등을 수행하여 선별하는 방법 등을 사용할 수 있다. 특히 , 본 발명에서 MACS 또는 FACS를 사용하는 방법은 기존의 한 천배지를 이용한 yeast two hybrid 스크리닝에 바하여, 한천 배지를 사용하지 않고 도 월등히 적은 시간과 노동력으로도 많은 양의 균주를 처리할 수 있어 매우 유용 하다.

<303>

<304> 상기 (d) 단계에서는 상기 선별된 효모균주의 바코드 서열을 식별하여 어떤 유전자의 단백질들이 서로 상호작용을 하였는지 확인하여 선택한다.

<305> 상기 (d) 단계의 바코드 서열은, 상기 ( a) 단계에서 pAD-acc 백터 및 pDBD- donor 백터에 Prey 및 Bait를 코딩하는 유전자와 함께 도입한 각 바코드 서열의 조 합이다. 본 발명의 효모균주는 Prey 및 Bait가 상호작용하는 경우 Cre recombinase 가 생성되어 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터에 포함된 바코드 서열을 결합 (또는 인접)시킨다. 즉, pDBD-donor 백터에 포함된 바코드 서열이 pAD-acc 백터 내로 이 동 (transfer)되므로 각 바코드 서열들이 인접되어 특수한 핵산 조합을 나타낸다. 이처럼 본 발명의 단백질 상호작용 검출 방법은 바코드 이동 분석 (barcode transfer assay >에 기반을두는 것으로 이해될 수 있다.

<306> 라이브러리 구성시 각 백터에 도입되는 유전자가 어떤 바코드 서열과 매칭

(matching)되었는지 조사되므로， 상기 선별된 효모 균주의 바코드 서열의 식별을 통하여 어떤 단백질이 서로 상호작용하여 해당 효모균주에서 형광물질이 발생한 것 인지 손쉽게 확인 할 수 있다. 상기 바코드 서열을 식별하는 방법은 공지의 폴리뉴 클레오티드 서열의 식별 방법인 시뭔싱 (예를들어 Sanger sequencing, NSG)등에 의 할수 있다.

<307> .

[유리한 효과】

<308> 특수한 컨스트럭트 (construct )를 가지는 본 발명의 공여백터 및 수용백터 세 트를 이용하여 단백질간의 상호작용을 검출하면, 단백질 라이브러리간 (베이트 단백 질 라이브러리 및 프레이 단백질 라이브러리)에서 동시 다발적으로 일어나는 단백 질 상호작용 검출을 가능하게 할뿐만 아니라， 각 백터에 포함된 바코드 서열을 이 용하여 라이브러라간 단백질 반웅에 있어서 서로 상호작용하는 단백질들을 규명하 기 위한 대량의 정보처리에 있어 이점을 제공한다.

<309>

[도면의 간단한 설명】

<3io> 도 1은 본 발명의 pAD-acc 백터의 개열지도이다.

<311>

<312> 도 2는 본 발명의 pDBD-donor 백터꾀 개열지도 (기탁번호 KCTC12790BP)이다.

<313>

<314> 도 3은 본 발명의 pAD-acc 백터 제작을 위한 기본 백터인 pGMDT7 AD 백터의 개열지도이다.

<315>

<316> 도 4는 본 발명의 pDBD-donor 백터 제작을 위한 기본 백터인 pGBI V 백터의 개열지도이다.

<317>

<318> 도 5는 본 발명의 Cre recombinase에 의하여 pDBD-donor 백터로부터 일부 서 열이 pAD-acc 백터로 swi tch 된 후 백터의 개열지도이다. 구체적으로 도 1의 개열 지도를 가지는 pAD-acc 백터와 도 2의 개열지도를 가지는 pDBD-donor 백터 사이에 서 lox site에 의해 재조합이 일어난 후의 백터 개열지도를 나타낸다.

<319>

<320> 도 6 및 도 7은 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도압한 본 발명 백터를 형질전환 후 효모의 리포터 유전자가 정상작동 하는지를 확인한 형광 현미경 사진이다 (p53 (WT) : 야생형 Murine p53 ; p53 (D278G, 34 %) ： p53 단백질의 278번째 아미노산 D spart ic acid)!- G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이， SV40 L.T와 결합력이 34%로 감소; p53 (V144G, 4.9%) ： p53 단백질의 144번째 아미노산 V(Val ine)를 G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 4.9%로 감소; p53 (E255K, 1.5%) ： p53 단백질의 255번째 아미노산 E(Glutamic acid)를 K(Lysine)으 로 바꾼 돌연변이, SV40 L.T와 결합력이 1.5%로 감소; Lamin A ： p53 단백질과 전 혀 상호작용하지 않는 단백질 (Negat ive control ) ) .

<321>

<322> 도 8은 본 발명 효모 균주에 p53(wi ld type 및 이의 muatant )과 SV40 large

T 항원을 도입한본 발명 꿱터를 형질전환 후， 단백질 상호작용이 일어난 효모세포 를 FACS로 검출 분리한 결과그래프로서， 붉은색은 Cy5(Ag a I-myclO 발현확인)를 초 록색은 GFP(Cre recombinase 발현확인) 분석 결과를 나타낸다 (도 8a: p53 (WT)와 Sv40 T, 도 8b: D278GC34 %)와 Sv40 T, 도 8c : V144G (4.9%)와 Sv40 T, 도 8d: E255K (1.5 %)와 Sv40 Tᅳ 도 8e: Lamin A와 Sv40 T) .

<323>

<324> 도 9는 본 발명 효모 균주에 p53과 SV40 large T 항원을 도입한 본 발명 백 터를 형질전환 후 단백질 상호작용이 일어난 효모세포를 FACS로 검출 분리한 결과 그래프이다 (X 축 ： GFP 발현강도， Y 축 ： Cy5 발현강도, 도 9a: ρ53 0ΓΓ)와 Sv40 T, 도 9b: D278GC34 %)와 Sv40 T, 도 9c : V144G (4.9%)와 Sv40 T, 도 9d: E255K (1.5 %)와 Sv40 T, 도 9e : Lamin A와 Sv40 T) .

<325>

<326> 도 10은 본 발명에서 또다른 형태의 pAD-acc 백터 (기탁번호 KCTC12791BP)의 개열지도이다.

<327>

<328> 도 11은 본 발명의 효모 세포에 포함된 두 개의 리포터 시스템을 나타낸다

(A: c-myc 리포터 시스템, B: Cre 리포터 시스템) <329>

<330> 도 12는 c-myc 리포터 시스템에 의해， 목적하는 두 단백질이 상호작용하는 경우효모세포벽에 c-myc 에피토프가 발현되는 것을 나타내는 모식도이다.

<331>

<332> 도 13은 c-myc 리포터 시스템을 위한 c-myc 리포터 발현 시스템의 여러 가지 구현형태를 도시한다 (A: c-myc 10개 반복， B: c-rayc 5개 반복, C: c-myc 1개 )

<333>

<334> 도 14는 ere 리포터 시스템에 의하여 , pDBD-donor 백터 (A) 및 pAD-acc 백터

(B)가 재조합 (C)되는 것을 보여주는 모식도이다.

<335>

<336> 도 15는 c-myc 리포터 시스템에서 , c-myc 에피토프 반복 갯수에 따른 신호강 도를 나타낸다.

<337>

<338> 도 16은 본 발명의 dual repot er Y2H 시스템을 적용한 효모에서， 단백질 상 호작용에 따른 MACS 선별 및 이의 결과를 GFP로 확인한 것이다.

<339>

<340> 도 17은 본 발명의 dual repot er Y2H 시스템을 적용한 효모에서, MACS를 1 회 및 2회 반복 수행하여 단백질 상호작용에 따른 MACS 선별 결과를 형광신호로 확 인한 결과이다.

<341>

<342> 도 18은 본 발명에서 Cre recombinase 발현에 의해 바코드 이동 (barcode transfer) 결과로서 생성된 본 발명에서 바코드 조합을 검출하기 위해 사용된 primer A,B,C의 결합위치를 나타낸다.

<343>

<344> 도 19는 PCR 방법으로 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에 서， 단백질 상호작용 여부에 따른 바코드조합여부를 검출한 결과이다.

<345>

<346> 도 20은 본 발명의 dual repoter Y2H 시스템을 적용한 효모에 2종의 항생제 처리 후 생성된 콜로니에 대하여， PCR 방법으로 단백질 상호작용에 따른 바코드 조 합여부를 검출한 결과이다.

<347>

<348> 도 21는 NGS 분석 방법을 이용하여， 단백질 상호작용 강도에 따른 바코드 리 H(bacord read) 수치를 나타낸다.

<349>

<350> 도 22는 NGS 분석 방법흘 이용하여， 라이브러리 -라이브러리 간 단백질 상호 작용 강도에 따른 바코드 리드 (bacord read) 수치를 나타낸다.

<351>

<352> 도 23은 상기 도 22와 관련하여 NGS결과 bacord read수가 높은 순서로 상위

36개를 정렬한 결과이다.

<353> .

<354> 도 24는 단백잘상호작용 세기에 따라 MACS 수행시 세포 선별능이 달라지는 것을 나타내는 것을 보여주는 데이터로서， 단백질 상호작용 세기가 강할수록 MACS 에 의해 세포 선별이 잘되며, 이를 형광강도로 확인한 결과이다 (도 24a: p53 (WT) 와 Sv40 T, 도 24b: D278GC34 %)와 Sv40 T, 도 24c : ¥144(} (4.9%)와 Sv40 T, 도 24d: E255K (1.5 %)와 Sv40 T, 도 24e : Lamin A와 Sv40 T) .

<355>

【발명의 실시를 위한 형태】

<356> 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

<357> 단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.

<358>

<359> <실시예 1>

<360> 이증 리포터 시스템을 가지는 Mega-throush it Y2H 효모 규주 개발

<361>

<362> <1-1> c-myc 에피토프를 발현하는 1st repoter 발현 카세트

<363> GAL4 UASCupstream act ivat ion sequence)의 downstream에 서열번호 13의 '

Gal l promoter MF α 1- myc 10 repeats- Glycine/Serine l inker一 Ag a I (C-term)' 의 발현 구조체 (발현 카세트)가 연결된 형태의, c-myc 리포터 시스템을 제작하였다.

<364> 이때， 상기 발현 구조체 중 myc repeat의 개수를 0개, 1개， 5개， 10개 (myclO repeats)로 하는 발현 구조체 (도 13 참조)를 제작 및 효모에 도입하여 발현시키고， 상기 효모에 1차 항체인 mouse α -myc 항체 (c-Myc Ant ibody (9E10) (Santa cruz사 의 sc-40))와 2차 항체인 goat a -mouse IgG-Cy5(Molecular probe사의 A10524) 항 체를 처리하여， 형광현미경으로 관찰하였다.

<365> <366> 그 결과， 도 15에서 보는 바와 같이 c-myc 10 repeat에서 형광 발현이 강한 것을 확인하였고， 이를 이후의 실험에서도 확인하였다.

<367>

<368> <1-2> Cre recombinase를 발현하는 2nd repoter 발현 카세트

<369> GAL4 UASCupstream act ivat ion sequence)의 downstream에 서열번호 14의 _ᅵ '

GALl promoter- CRE recombinase' 가ᅳ 연결된 형태의， Cre 리포터 시스템을 제작하 였다.

<370>

<37i> <1-3> c-myc 리포터 발현 카세트 및 Cre 리포터 발현 카세트를 동시에 포함 하는효모 균주 제작

<372>

<373> 상기 실시에 1—1 및 1-2의 발현 구조체가 영구적으로 발현되는 효모균주를 제작하였다. 서열번호 13의 'Gal l promoter MF α 1- myc 10 repeat s- Glycine/Serine l inker- Ag a l (C-term)' 의 발현 구조체는 15번 크로모좀 (chromosome)에서 GAL4 UASCupstream act ivat ion sequence)의 downstream에 위치하 며 , 서열번호 14의 'GALl promoter- CRE recombinase' 발현 구조체는 5번 크로모 좀 (chromosome)에서 GAL4 UASCupstream act ivat ion sequence)의 downstream에 위치 한다.

<374> 구체적으로， _c -myc 리포터 및 Cre 리포터 동시발현 효모 균주인 'SK10— CRE( 기탁번호 KCTC12792BP)' 를 제작하였으며， 상기 효모 균주는 하기 표 1의 유전자 형을 가진다.

<375> [표 1】

<376> 상기 효모의 제작방법은 하기와 같다. 먼저 하기 표 2의 유전자형을 가지는

JC-993 (ATCC 204097) 효모 균주에 pRS_pGALl-MF a I-myclO-GS-Ag a l(350a. a)를 도 입하여 GALl-Ag α 1— myclO repoter 시스템을 가지는 효모인 SK10을 제작하였다. 상 기 pRS_pGALl-MF a I-myclO-GS-Ag a l(350a. a)는 효모 게놈상의 his3 유전자에 상동 성이 있는 부분이 있어 이를 이용하여 재조합을 유도하여 리포터를 도입하였다. 구체적으로, 5ug pRS_pGALl-MF a I-myclO-GS-Ag a l(350a. a)를 제한효소 Msc I (His3 유전자의 중간을 자름)를 처리하여 완전히 반웅한 후 에탄을 침전을 사용하여 DNA 를 모두 가라 앉힌 후 형질전환에 사용 하였다. 형질전환체의 선별은 SD I -Ura, -Hi s + 25mM 3-AT medi a 선택배지에서 진행하였으며 선별된 후보군 중 게놈상에 리 포터가 삽입된 효모를 PCR과 GAL4를 지속적으로 발현하는 백터를 형질전환하여 리 포터의 정상적인 작동을 확인 하였다.

<377> 이렇게 제작된 SK10 효모의 유전자형은 하기 표 2와 같으며, 상기 SK10 효모 에서 효모 게놈상의 URA3 : :GALl-LacZ 부분의 LacZ 를 CRE유전자로 바꾸어주어 , 본 발명의 이중리포터를 가지는 SKIO-Cre 효모 균주를 제작하였다. Cas9-gRNA를 이용 하여 게놈상의 cZ 부위에 dsDNA 절단부위를 만들고 여기에 CRE 유전자의 5 '말단 에 Gal l 프로모터의 끝부분의 300 bp와 3' 말단에 LacZ 유전자의 끝부분 500 bp를 갖는 Donor DNA를 PCR을 통하여 제작하여 형질전환시에 함께 넣어 상동성 재조합을 유도하였다. 구체적으로, 먼저 200 ng p414-TEFlp-Cas9-CYClt (Cas9 발현백터)을 SK10 효모 균주에 형질전환하고 SD/-Ura, -Hi s , -Trp 한천배지에서 선별하여, SK10 + Cas9 형질전환체를 얻었다. PCR을 통하여 Cre Donor DNA를 증폭하여 준비하고， 6 ug의 DNA를 에탄올 침전을 통하여 침전후 층분히 말린 후 사용하였다. 그리고 상기 효모 균주 SK10 + Cas9 형질전환체 (on the SD/ -Ura, -Hi s , -Trp)에 상기 Donor DNA와 200 ng과 Guide RNA express ion vector를 함께 형질 전환 하였다. 형질전환 체는 SD/ -Ura, -Hi s , -Trp , -Leu 한천배지를 통하여 선별 하였고 리포터 유전자의 도입은 형질전환체의 게놈에 존재하는 CRE 유전자를 PCR을 통하여 확인하였다.

<378> [표 2】

<실시예 2>

Mega-throughput Y2H vector 구죽

본 발명의 Mega-through put Y2H system에 사용되는 vector를 제작하였다. 본 발명의 vector는 pAD-acc 및 pDBD-donor의 두 종류가 한 쌍으로 이루어져 있으 며， 상기 두 백터 모두 barcode sequence와 CRE recombinase에 의해 _. swi tching 되 는 서쉴을 포함하고 있다. pDBD-donor 백터에는 형광을 방출하는 단백질의 유전자 (GFP)가 포함되어 있는 것이 특징으로서, Cre recombinase에 의해 swi tching되면 pDBD-donor 백터에 포함되어있던 식별용 barcode 및 GFP 유전자가 pAD-acc 백터로 이동되어, 각각 검출 및 발현이 가능한 상태로 만들어진다. <383>

<384> <2-l> pAD-acc vector의 구축

<385> 기존의 Y2H vector인 pGADT7 vecto Clontech， 도 3 참조)를 바탕으로 하여 본 발명의 목적에 맞게 변형하였다. 먼저 MCS 부분을 모두 제거하고， 두 개의 Sf i I 제한효소 인식자리를 포함하는 유전자 삽입 부위를 도입하였다. 그 다음 NGS 분 석을 통하여 삽입된 유전자가 무엇인지 파악하기 위하여 바코드 삽입부위 (제한효 소 BsiW I 및 Sac I I [도 1의 개열지도 참조]， 또는 제한효소 Xbal 및 Sac I I [도 10 의 개열지도 참조] )와 CRE recombinase에 의하여 재조합을 유도할 수 있는 1οχ2272 염기서열 (서열번호 20)을 두 번째 Sf i I 인식부위 바로 뒤에 삽입하였다. ΙοχΡ 염 기서열 (서열번호 21)은 Leu2 유전자의 종결코돈을 제거하고 삽입하였다. 그 결과 ΙοχΡ와 10x2272 사이는 약 lOOObp 떨어져 있도록 배열되었으며, 상기 ΙοχΡ와 10x2272는 동일한 배향 (orientat ion)으로 위치되었다. 전술한 과정을 통하여， 각각 도 ful l sequence: 서열번호 16) 또는 도 10(ful l sequence : 서열번호 17)의 개 열지도를 가지는 pAD-acc vector를 제조하였다.

<386>

<387> <2-2> pDBD-donor vector의 구축

<388> 기존의 Y2H vector인 pGBKT7 vector (Clontech, 도 4참조)를 바탕으로 하여 본 발명의 목적에 맞게 변형하였다. 먼저 MCS 부분을 모두 제거하고， 두 개의 Sf i I 제한효소 인식자리를 포함하는 유전자 삽입부위를 도입하였다. 그 다음 CRE recombinase에 의하여 재조합을 유도할 수 있는 1οχ2272 염기서열과 함께 NGS 분석 을 통하여 삽입된 유전자가 무엇인지 파악하기 위한 바코드 삽입 부위 (제한효소 Af l I I/ Age I )를 두 번째 Sf i I 인식부위 뒤에 삽입하였다. 그 뒤로 항생제 카나 마이신 (Kanamycin) 저항성 유전자와 프로모터 그리고 GF? 유전자와 ΙοχΡ 염기서열 을 차례로 삽입 하였다. 그 결과 ΙοχΡ와 10x2272 사이는 약 2000bp 떨어져 있도록 배열되었으며， 상기 ΙοχΡ와 10x2272는 동일한 배향 (orientat ion)으로 위치되었다. 전술한 과정을 통하여， 도 2(ful l sequence: 서열번호 15)의 개열지도를 가지는 pDBD-donor vector를 제조하였다.

<389>

<390> <2-3> Barcode 및 백터 준비

<39i> 상기 구축한 vector에 삽입하기 위한 barcode를 준비하였다. barcode 주형 ol igo와 이를 PCR을 통하여 증폭하기 위한 프라이머를 제작한다. High-f idel i ty Phusion DNA polymerase(NEB, Cat . No M0530)를 사용하여 PCR을 통해 Barcode를 합 성하였다. PCR machine으로 Bio-rad T100 thermal cycler (Cat. No 186-1096)를 사 용하였고， 하기 표 3과 같은 조성으로 PCR 반웅액을 만들었으며， 구제적인 PCR

Condition 은 다음과 같다; 95 ^° C/30초 -[95Γ/20초 -65 ^° C/30초] _{xl5 cycles} -72 ^° C/60초 -4 ^° C

<392>

<393> 【표 3】

<394> PCR 반웅액와조성

[표 ⁴ 】

Barcode 제작에 사용된 주형 을리고 및 프라이머 서열

<398> PCR을 통하여 얻은 산물에 각 각 제한효소를 처리하였다. AD 용 바코드는 pAD-acc에 맞도록 제한효소 BsiW I (NEB사) 및 Sac II (NEB사)를 처리하며， DBD용 바코드는 pDBD-donor에 맞도록 제한효소 Afl II (NEB사) 및 Age I (NEB사)를 처리 하였다.

<399> 제한효소 처리 후 Shrimp alkaline phosphatase (USB사의 78390)를 처리하여 양 말단의 인산기를 모두 제거하였다. 완전히 제한된 절편 (약 30 bp)을 1OT polyacryl amide gel (IX TBE)을 통하여 순수하게 정제하였다.

<400>

<401> 실시예 2-1 및 2-2를 통하여 구축한 vector에 각각 제한효소를 처리하였다. pAD-acc vector는 제한효소 Bsi I (NEB사) 및 Sac I I (NEB사)를 처리하며, pDBD- donor vector는 제한효소 Af l I I (NEB사) 및 Age I (NEB사)를 처리하였다. <402> 효소 처리 후 완전히 제한된 절편을 Expin Gel SV(Geneal l사의 102-150)를 사용하여 정제하였다.

<403>

<4ό4> <2-4> Barcode 삽입 라이브러리 구축

<405> 상기 과정을 통하여 덛은 vector와 barcode를 분자 수의 비율을 1 : 10이 되도 록 섞은 후 T4 DNA Hgase(NEB사의 M0202)를 처리하여 재조합을 유도한다. (4 ^° C에 서 12시간) 반옹을 마친 후 박테리아 (ToplOF ' )에 형질전환을 하여 총 1.0 X 10 ⁷ 개의 박테리아 클론을 얻을 수 있는 양을 준비한다.

<406> 준비된 클론을 미리 준비한 0.3% seaPrep agarose(Lonza사의 50302) LB 배지 에 접종하여 37 ^° C에서 36시간 동안 배양 후 Plasmid Maxi ki Qiagen사의 12165)를 사용하여 barcode가 삽입 된 라이브러리를 얻는다.

<407>

<408> <2— 5> PCR을 통한 재조합유전자준비

<409> 재조합에 사용된 유전자는 총 27종으로서 Amino-acyl tRNA 합성에 관여하는 유전자를 대상으로 하였다. 구체적으로 AIMP genebank ΝΜ_004757.3) , ΑΙΜΡ2(ΝΜ_006303.3) , ΑΙΜΡ3 _004280) , DRS(NM_001349.2)， FRS α (丽 _004461.2)， FRSP (蘭 _005687.3)， HRS (匪 _002109.3)， NRS (匪 _004539.3) , SRS(NM_006513.3)， WRS(NM_004184.3) , YRS(NM_003680.3) , CRS (丽 _139273.3) , GRS(NM_G02047.2) , LRS (匪 _020117 · 9)는 유전자의 크기가 너무 커 클로닝에 어려움이 있어 LRS-AC 1-520 aa) 및 LRS-B(521-1176 aa)의 두 부분으로 나누어 실험함， MRS (應 _004990.3) , QRS(NM_005051. 1) , RRS(NM— 002887.3)， TRS(NM_152295.4) , PRS(N¾L004446.2에서 753-1512 aa) , IRS (醒 _013417.2)， ARS(NM_001605.2) , ERS (丽 _004446.2에서 1-953 aa) , KRS (匪 _0Q1130089. 1) , VRS (匪 _006295.2)는 유전자의 크기가 너무 커 클로닝에 어려움이 있어 VRS-AU-938 aa) 및 VRS-B( 939- 1265 aa)의 두 부분으로 나누어 실험 함, DX2 IMP2-DX2 , 서열번호 22)의 유전자가 사용되었으며, 유전자의 목록은 [표 6]에 표시하였다.

<410>

<4ΐ ι> 상기 각각의 유전자의 cDNA를 주형으로 하여， 사용된 프라이머를 제외하고는 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 PCR을 수행하여 핵산을 증폭하였다. 본 실험 에서 사용된 프라이머는 하기 표 5와 같다. pAD— acc vector에 삽입될 유전자는 서 열번호 7 및 9번의 프라이머를 이용하여 증폭하고， pDBD-donor vector에 삽입될 유 전자는 서열번호 7 및 8번의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.

<412>

<413> [5. 5]

<414> 라이브러리 제작에 사용된 프라이머 서열

<415>

<416> <2-6>유전자 재조합

<4i7> 상기 얻은 PCR 산물 총 54종 (AD-aaRS 27종， DBD-aaRS 27종)과 pAD-acc와 pDBD-donor를 제한효소 Sf i I (NEB사의 R0123)을 사용하여 절단한다 . 절단을 마친 후 Expin Gel SV(Geneal l사의 102-150)를 사용하여 원하는 산물만을 정제하였다. 아후 제한효소를 처리한 aaRS 유전자와 vector와 분자 수의 비율을 3 : 1로 하여 섞 어 주었고 T4 DNA l igase(NEB사의 M0202)를 처리하여 재조합을 유도하였다. 재조합 반웅은 41에서 1시간 동안 진행하였고 반웅을 마친 후 박테리아 (ToplOF ' )에 형질 전환 하였고, LB 한천배지 내에서 각각 Ampici U in과 kanamycin 항생제에 대한 저 항성을 통하여 재조합 클론을 선별하였다. (주) 코스모진텍에 의뢰하여 Sanger sequencing 방법으로 각각의 백터에 도입된 aars 유전자와 barcode의 서열의 연관 관계를 정립 하였다 ( [표 6] 참고) . 간략하게 상기 sequencing에는 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Cat .No. 4337455 , l i fe technologies) 및 ABI 3730XL Sequencing machine(capi 1 lary 96ea X 50cm)이 사용되었다.

<418>

<419> [표 6】

<420> 제작된 라이브러리의 유전자와 이들에 부여된 Barcode DNA Binding Domain Act ivat ion Domain

Gene Barcode Gene Barcode

AIMP1 GTTTGACGAG AIMP1 GATTGATTGG

AIMP2 TACTCACAGT AIMP2 CATGCCATCT

AIMP3 GGGCGCTCTT AIMP3 TTGGGATTA

DRS CTACTGAGC DRS GTGTGTGGCC

FRS a GGCMTGTTG FRS a AGTAGGAGAA

FRSP GAACGAGTCA FRSP ATACGTCGTG

HRS TCAGCGTGGG HRS TGGGTGTGCG

NRS ATGGAAGAGC NRS CGATGAACGG

SRS GTTTAGTATG SRS GTAGTTGTGG

WRS GTTTGGCGGG WRS ACTGGATAAG

YRS TGTCAGCTTC YRS GACGATGCGA

CRS GTTGGATTTA CRS TGTTGGTGGG

GRS CTCGAGCGGG GRS GCGCATCGGA

LRS-A TAGGTGTTGT LRS-A GAGCTCTCCC

LRS-B TTTGGTTGGC LRS-B ATAGAACCCA

MRS GAGTTAGGGG MRS TGGCAGGGAT

QRS TGGCTGGGGG QRS CTATATCATT

RRS GCATTAAGGC RRS ACGTGTAGGA

TRS TAATCTCCTA TRS GTGTGCTTG

PRS GATAAGCGCG PRS GTCATAAGAA

IRS TGACGGGGAC IRS GGTGATATCG

A S AGTTAAGAAT ARS TGTAGGGGGA ERS GCAGACGGCC ERS CCTGTTGTGC

KRS TGCGGACGGG KRS CAGTAGAGTA

VRS-A GACACCTAGG VRS-A TTGGGGTTGG

VRS-B ATATGAGTGA VRS-B GAATAGTCAG

DX2 GGTAGGAGGC DX2 GGGACCGGTG

<421>

<422> <실시예 3>

<423> dual repot er Mega一 throughput Y2H system 구축 및 시스템 작동 확인

<424> 스크리닝 시스템 작동 시험을 하기 위하여 이미 단백질간상호작용하는 것으 로 알려진 p53 단백질 (서열번호 19) 및 SV40 l arge T 항원 (서열번호 18)을 각각 본 발명의 백터에 도입하고 상기 각 단백질이 도입된 백터를 본 발명의 이중 리포터 효모 균주 (실시예 1의 효모 균주， 즉 리포터 유전자인 CRE유전자 및 c-myc 유전자를 모두 리포터 유전자로 가지는 효모 균주)에 도입하여 형광 발색을 관찰하였다.

<425>

<426> <3-1> 라이브러리 구성

<427> 우선 표 7에 기재된 바와 같이， Sv40과의 결합력이 제한된 p53 돌연변이를 제조하고, 이를 백터에 도입하여 시험용 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 구 축을 위하여 유전자를 백터에 도입하는 방법은 실시예 2와 동일하게 실시하였다.

<428>

<429> 【표 7】

<430>

<431>

<432> 【표 8】 DNA Binding Domain Act ivat ion Domain

Gene Barcode Gene Barcode p53(WT) TTATCAACGC SV40 LTag TGMGGGTTC p53(D278G) AGATGAGAGG p53(V144G) GTTTTTGGGC p53(E255K) AGTTTAGGCG

Lamin A GGGGTGAAGG

<433>

<434> 상기 표의 기재에 관한 설명은 다음과 같다.

<435> p53 (W.T) : 야생형 Mur ine p53(서열번호 19)

<436> _P 53 (D278G, 34 %) ： p53 단백질의 278번째 아미노산 DCaspart i c acid)를

G(Glycin)으로 바꾼 돌연변이， SV40 L .T와 결합력이 34%로 감소

<437> p53 (V144G, 4.9%) ： p53 단백질의 144번째 아미노산 V(Val ine)를 G(Glycin) 으로 바꾼 돌연변이， SV40 L.T와 결합력이 4.9%로 감소

<438> p53 (E255K, 1.5%) ： p53 단백질의 255번째 아미노산 E(Glutami c ac i d)를

K(Lysine)으로 바꾼 돌연변이， SV40 L .T와 결합력이 1.5%로 감소

<439> Lamin A ： SV40 LT 단백질과 전혀 상호작용하지 않는 단백질 (Negat ive control , 서열번호 23)

<440> SV40 LT ： 야생형 Mur ine p53와 상호작용하는 것으로 알려진 단백질 (서열번 호 18)

<441>

<442> <3-2>효모균주의 형질전환 및 GFP를 통한 CRE 리포터의 작동 여부 확인

<443> 실시예 1에서 제작한 효모의 형질전환은 Yeastmaker™ Yeast Transformat ion

System 2(Clontech 사의 Cat ηο ·630439)을 사용하여 진행하였다. 형질전환에 사용 된 재조합 DNA는 표 7에 따라 plasmid 하나 당 100 ng 씩 섞은 후 사용하였다. (총 11종의 실험군) 상기 실시예 1에서 제조한 효모에 형질전환시킨 후 형질전환체 선별 을 위하여 SD/ -U.H.L J 한천 배지에서 배양하였다. 3일간 배양 후 배양이 진행된 한천배지를 형광현미경으로 관찰하였다.

<444>

<445> 실험 결과, [도 6]에서 보는 바와 같이， 상호작용이 일어난 세포에서 성공적 으로 형광이 나타나는 것을 확안하였다. 또한 단백질 간의 결합력이 강할수특 리포 터 유전자의 발현 수준이 증가하여 결론적으로 형광의 강도가 강해지는 것을 확인 하였다.

<446>

<447> <3-3>항생제 처리에 의한 CRE 리포터의 작동 여부 확인

<448> 전술한 바와 같이 형질전환된 세포에서, 단백질 간의 상호작용이 일어나는 경우 CRE recombinase에 의하여 AmpiciUin과 kanamycin 모두에 저항성을 갖는 plasmid가 재조합된다. 이를 확인하기 위하여, 구체적으로 상기 실시예 3-2와 같은 방법을 통하여 얻은 형질전환 효모에서， Easy Yeast Plasmid Isolation Kit (Clontech, Cat. No ： 630467)를 이용하여 plasmid를 정제한 후에， 박테리아 (ΤορΙΟΓ)에 형질전환하고 이를 LB-엠피실린 배지 또는 LB-엠피실린 및 카나마이신 배지 접종한 후 생성된 콜로니를 측정하였다. 상기 배지는 1L기준 lOg Tryptone, 5g Yeast extract, lOg NaCl의 조성으로 이루어지는 Luria-Bertani(LB) Broth, Mi Her (Company ： Difco, Cat. No ： 244620)를 기초로 하여, 각각 엠피실린 50 ug/ml 또는 /및 카나마이신 15 ug/ml의 농도가 되도록 제조한 것이다.

<449>

<450> [표 9】

<451>

<452> * 3 반복 실험에 대한 평균 결과임

<453>

<454> 그 결과 상기 표 9에서 보는 바와 같이, 단백질 간의 상호작용이 강할수록

CRE에 의한 recombination 비을이 높아지기 때문에 두 종의 항생제에 저항성을 갖 는 plasmid가 증가하게 되고, 더 많은 콜로니가형성되는 것을 확인하였다.

<455>

<456> <3-4>효모균주의 Myc뫼포터 작동 여부 확인

<457> 상기 배양한 형질전환체 효모에서 c-myc 리포터 유전자가 정상 작동하는지 여부를 확인하기 위하여 상기 배양한 형질전환체 효모에 1차로 발현된 Myc과 결합 하는 mouse a - c-myc 항체와상기 c-myc 항체에 결합하는 2차 항체로 Alexa Fluor 568 Goat Ant i -Mouse IgG 항체 (Molecular probe)를 처리한 후 형광현미경으로 관찰 하였다.

<458> 실험결과 [도 기에서 보는 바와 같이， 효모균주의 Myc가 단백질간 상호작용 에 의해 정상 작동하여 붉은색 형광이 나타나는 것을 확인하였다. 또한 Cre recombinase 정상 발현에 의하여 GFP 형광 발현도 함께 관찰되었다.

<459>

<460> <3-5> 형광표지 효모세포의 선별 process 작동 여부 확인

<46i> 효모 균주에 도입된 pAD-acc 백터 및 pDBD-donor 백터에 도입된 알려진 p53 단백질과 SV40 large T 항원의 상호작용에 의해 형광이 발현된 효모균주를 한천배 지 작업 없이 검출하고 분리할 수 있는지 확인하기 위하여 실시예 3-2에서 형질전 환 한 효모균주 실험군을 액상배지에서 배양 후， 세포를 분리하여 버퍼에 현탁하고 FACS분석을 하였다.

<462> 구체적으로， 실시예 3-2에서 형질전환시킨 효모균주 실험군들에서 배양을 마 친 배양액을 원심분리하여 배지를 완전히 제거하고 효모만을 얻었다. 여기에 5 ml WB 버퍼 (IX PBS, 5% BSA, 5mM EDTA)를 이용하여 2 번 효모를 세척하고 1 ml WB buffer에 1차 항체인 mouse α -myc 항체 (c-Myc Ant ibody (9E10) (Santa cruz사의 sc-40))를 1: 500으로 회석하여 세척한 효모에 넣고 잘 섞어 주었다. 얼음에 사료가 담긴 튜브를 보관하여 차가운 상태를 유지하면서 30분간 1차 항체가 결합하도록 반 웅시켰다. 30분 후 5 ml WB 버퍼를 이용하여 효모를 세척한 후 1 ml buffer에 형광 염료가 표지된 2차 항체인 goat a -mouse IgG-Cy5(Molecular probe사의 A10524) 항 체를 1 :500으로 회석하여 1차 항체를 부착한 효모에 넣고 잘 섞어 주었다. 이 또한 얼음에 보관하여 차가운 상태를 유지하면서 30분간 반웅시켰다. 염색을 마친 후 5 ml WB buffer로 한번 5 ml IX PBS로 두 번 세척한 후 3 ml IX PBS로 효모 세포를 완전히 풀어 준 후 14 ml FACS tube(BD falcon사의 352017)에 옮겼다.

<463> 준비된 시료를 FACS Mof lo XDPCBackman Coulter)를 이용하여 분석하고 단백 질 잔의 상호작용에 의하여 유도된 레포터 유전자의 발현을 통하여 나타나는 형광 (GFP, Cy5)을 가지는 효모 군을 따로 분리하였다. 선별되는 세포는 최소 1.0 x 10 이상이 되도록 하였다.

<464>

<465> 그 결과 [도 8] 및 [도 9]에서 보는 바와 같이， 상호작용이 일어나는 1번， 2 번 실험군의 경우 리포트 유전자의 정상 발현에 의해 세포들이 분리되는 반면 (도

8a 및 도 8b, 도 9a 및 도 9b 참조) , 형질전환된 단백질이 상호작용하지 않는 3번 내 지 5번 실험군 (각각 도 8c , 도 8d 및 도 8e 참조， 및 각각 도 9c，도 9d 및 도 9e 참조)의 경우 대조군 (6번 내지 11번, 데이터 미도시)과 동일한 분포를 나타내는 것을 확인 하였다.

<466>

<467> <3-6>선별된 효모의 barcord reading가능 여부 확인

<468> 단백질 상호작용이 일어난 효모에서 바코드가 재조합을 통하여 PCR이 가능한 상태로 조합되었는지 확인하기 위하여， 상기 실시예 3-5에서 GFP를 발현하는 콜로니 의 효모 세포로부터， Easy Yeast Plasmid Isolat ion Ki t (Clontech, Cat .No ： 630467)를 이용하여 Plasmid를 정제하고, 하기 표 10의 프라이머들을 사용하여 PCR 을 수행하였다. PCR machine으로 Bio-rad T100 thermal cycler (Cat . No 186-1096) 를 사용하였고， DNA 중합효소로는 High-f idel ity DNA polymerase(NEB, Cat .No M0530)를 사용하였으며， 상기 표 3과 같은 조성으로 PCR 반웅액을 제조하였다. 구 체적인 PCR Condit ion은 다음과 같다; 95 ^° C/30초 -[95 ^° C/20초 -65 ^° C/30초] _{x25 cycles} -72

1：/60초-41 /∞.

<469> GFP를 발현하지 않았던 콜로니의 효모는 대조군으로 사용되었다. 도 18에서 보는 바와 같이， 하기 표 10의 프라이머 A 및 C의 쌍은 DBD-donor vector로부터 도 입된 바코드 서열 (즉， 베이트 단백질을 표시하는 서열)과 AD-acc vector의 바코드 서열의 조합여부를 검출하기 위해 사용되었으며, 하기 표 10의 프라이머 A 및 B의 쌍은 플라스미드의 존재 여부를 확인하기 위한 대조군 실험에 사용되었다. 구체적 인 실험군 및 대조군은 하기 표 11에 나타내었다.

<470>

<471> [표 10】

<472> 프라이머 서열 서염버호 명칭 seauence

10 pr imer A GGCCsTCGAcTaaTtGAGTGACGTACGCTTGGG

11 Dr imer B ggccATGCCGCGGTGGAAA

12 Drimer C GCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATCTTAAG

<473>

<474> 【표 111

<475>

<476> 도 19는 loxP 인근에서 재조합 된 Barcode를 PCR을 통하여 증폭한 결과를 나 타낸다ᅳ 단백질 상호작용이 일어나 GFP가 발현되는 효모 ( lane 1)에서는 Cre recombinase에 의해 재조합이 일어나 115bp의 Barcode PCR 산물이 형성된 것을 확 인하였으나， GFP 를 발현하지 않았던 콜로니의 효모 ( lane 2)에서는 Barcode PCR 산 물이 검출되지 않았다. lane 3 및 lane 4는 plasmid가 있다는 것을 확인하기 위한 contr 로서 사용되었다 (48 bp) .

<477>

<478> 이를 좀 더 알아보기 위하여 상기 실시예 3 의 방법으로 선별된 세포로부터 핵산을 추출하고 전술한 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과 도 20 에서 보는 바와 같이, 단백질 상호작용이 일어나 ampici l l in과 kanamycin 모두에 저항성을 갖는 효모들에서는 정상적으로 Barcode PCR 산물이 검출되는 것을 확인하 였다.

<479> 이로서 본 발명의 효모균주 및 백터를 이용한 단백질간의 상호작용을 검출하 는 system이 정상 작동하는 것을 확인하였다.

<480>

<481> <실시예 4>

<482> dual repot er Mega-throughput Y2H system을 이용한. 단백질 상호작용 조사

<483>

<484> <4-1> MACS(Magnet ic— act ivated cel l sort ing)를 이용한， 단백질 상호작용 효모의 선별

<485> 전술한 표 6에서와 같이 총 27 종의 ARS 유전자 및 상기 각각의 단백질을 표 시하는 바코드 서열을 pAD-acc vector와 pDBD-donor vector에 재조합 후에 실험을 진행하였다. 또한 negat ive control 로서 Lamin A와 SV40 T를 사용하였다. 전술한 바와 같이 각 각의 백터를 제조하고 본 발명의 효모에 형질전환하여， 하기 표 12와 같은 실험군으로 실험을 진행하였다. l .OxlO ⁸ 개의 효모 세포에 80ng c-Myc 항체 (9el0, SantaCruz , sc-40)를 처리하여 효모 세포 표면에 발현된 Ag a l-myclO에 결 합하도록 하였고, 그 후에 BioMag Goat Ant i -Mouse IgG (Ant i -mouse IgG 항체가 코 팅된 자성비드, qiagen, Cat . No . 310007) 1 ml과 함께 섞어 최종적으로 효모와 자 성비드가 항원 -항체 결합을 통하여 결합된 상태가 되도록 하였다. 자석을 이용하여 자성비드를 바닥으로 모두 가라앉힌 후 비드에 부착하지 않은 효모를 제거 한 후， SD/-U,H,L,T 한천 배지를 넣고 비드에 결합한 효모를 30 ^° C에서 24시간 동안 배양 하였다. 선별된 세포들은 형광현미경을 통하여 분석하였다.

<486>

<487> 【표 12】

<488> 도 16에서 보는 바와 같이， MACS를 통하여 c-myc 리포터가 발현된 세포들을 선별하였으며， 이들 세포에서 GFP 형광발현이 일어나는 것을 형광현미경 관찰을 통 해 확인하였다. 따라서 한천배지 작업 없이도, MACS 등의 작업을 통해 단백질 상호 작용이 일어나고 있는 효모들을 선별할 수 있었다.

<489>

<490> 또한, 단백질 상호작용 세기와 관련하여 MACS 방법이 얼마나 효율적으로 효 모 세포들을 선별할 수 있는지 확인하기 위하여, 하기 표 1 과 같이 백터를 제조하 고 본 발명의 효모 (실시예 1의 이중 리포터 효모)에 형질전환하여, 전술한 방법과 동일하게 MACS수행하였다.

<491>

<492> [표 13】

PHAB210 pDBDᅳ donorᅳ p53 VS PHAB215 ： pAD-acc-SV40 T

PHAB211 pDBD-donor-p53-E255K (1.5 %)

PHAB212 pDBD-donor-p53-V144G (4.9%)

PHAB213 pDBD-donor-p53-D278G (34 %)

PHAB214 pDBD-donor-Lamin A <493>

<494> .【표 14】

<495>

<496> 그 결과 상기 표 14 및 도 24에서 보는 바와 같이， 단백질 사이의 상호작용 세기가 강할수록 MACS에 의해서 선별되는 세포의 양이 다른 것을 알 수 있다. 따라 서 MACS를 수행함으로써 단백질 상호작용이 강한 것들이 더 잘 선별되며, 이는 본 발명의 Y2H system 정확도 향상에 기여하는 것으로 생각되었다.

<497>

<498> <4-2>단백질 상호작용 효모의 선별에 있어서， 형광 이용 방법과 MACS 이용 방법의 효율 비교

<499> 실제로 단백질 상호작용이 일어난 효모 세포 (즉 posit ive cel l )를 선별하는 방법으로서， 형광을 이용하는 방법과 상기 MACS를 이용하는 방법 증 어느 방법이 더욱 정확한 선별을 가능하게 하는지 알아보았다. 먼저, 상기 실시예 4-1과 같이

TM

본 발명의 효모를 형질전환하고 36시간 후에 Cy5 및 GFP의 형광을 FACS( Mof low XDP, Beckman coulter)를 통하여 조사하였다. 그리고 상기 실시예 4-1과 같이 본 발명의 효모를 형질전환하고 MACS를 1회 및 2회 시행하여 선별한 세포들에서 24시

TM

간 후에 Cy5 및 GFP의 형광을 FACS( Mof low XDP, Beckman coulter)를 통해 조사하 였다. <500>

<50i> 도 17에서 보는 바와 같이， MACS를 수행하지 않은 형질전환 효모에서는 각 백터들을 효모에 도입한지 36시간째에 형광발현을 통하여 단백질 상호작용 여부를 알기 어려웠으나 (도 17의 A) , MACS는 실제로 단백질 상호작용이 일어난 posi t ive cel l들을 분리 가능하였으며 특히 MACS 시행 횟수가 증가할수록 posi t ive cel l 선 별력이 증가되는 것이 확인되었다 (도 17의 B) . MACS를 이용하면, 높은 정확도로 posit ive cel l들을 선별 가능함을 확인하였다.

<502>

<503> <4-3>상호작용하는 단백질들의 규명을 위한 바코드 리딩 (reading)

<504> 본 발명의 dual repot er Mega-throughput Y2H system에서 어떤 단백질들이 상호작용을 하고 있는지 규명하기 위하여, 이들의 바코드 서열흘 분석하였다. 구체 적으로 먼저 , 전술한 방법으로 표 7의 라이브러리를 구축하고 이들을 본 발명의 효 모에 도입하였다. 실시예 3-6과 동일한 방법으로 재조합된 barcode DNA 시료를 얻 은 후， 이를 (주)셀레믹스에 NGS 분샥 의뢰하였다. 간곽하게， 상기 NGS 분석은, Sample 준비에 MiSeq Reagent Kit v2(300 cycle) (I l lumina, Cat . No MS-102-2001) 가 ^' 사용되었고， I l lumine MiSeq Desktop Sequencer를 이용하여 각 barcode read 수 가 분석되었다.

<505>

<506> 그 결과 도 21에서 보는 바와 같이， LaminA, SV40 T의 p53과의 친화도에 따 라서 바코드 리드 (barcode reads) 수가 현격히 차이가 나는 것을 확인하였다. 즉, 단백질의 친화도 (상호작용 세기)가 감소될수록 바코드 리드수가 감소되었다.

<507>

<508> <4-4>라이브러리 -라이브러리 단백질 상호작용 분석

<509> 본 발명의 dual repot er Mega-throughput Y2H system이 라이브러리-라이브러 리 간의 각 단백질 상호작용에 대한 정보를 제공할 수 있는지 확인하기 위하여， ARS 라이브러리 (표 6 참조)를 대상으로 본 발명의 Y2H system을 작동시키고， (주) 셀레막스에 의뢰하여 NGS로 바코드를 리딩 (reading)한 결과를 확인하였다. 실험은 AD-acc 백터는 AIMP2가 발현되도록 고정하고 DBD-doner 백터에 ARS 라이브러리를 적용하는 방법 (도 22의 A) , DBD-doner 백터는 AIMP2가 발현되도록 고정하고 D-acc 백터에 ARS 라이브러리를 적용하는 방법 (도 22의 B)의 두 가지로 확인하였다.

<510>

<5ΐ ι> 그 결과 도 22 및 도 23에서 보는 바와 같이， 라이브러리를 이용한 대량의 단백질 동시 분석 실험에서 바코드 read 정도를 비교함에 따라 단백질간 상호작용 세기의 분석이 가능하였다,

<512>

【산업상 이용가능성】

<513> 이상 살펴본 바와 같이 , 본 발명은 다수와 단백질-단백질 상호작용 동시 분 석을 위한 백터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 라이브러리 수준의 단백질들의 결 합 쌍들을 동시에 효을적으로 검색하기 위한 특수한 컨스트럭트 (construct )를 가지 는 공여 백터 및 수용 백터， 상기 백터들을 포함하는 키트 및 이를 이용한 단백질 상호작용 검출 방법에 관한 것이다.

<514> 본 발명의 백터 세트를 이용하여 단백질간의 상호작용을 검출하면, 단백질 라이브러리간 (베이트 단백질 라이브러리 및 프레이 단백질 라이브러리)에서 동시 다발적으로 일어나는 단백질 상호작용 검출을 가능하게 할뿐만 아니라， 각 백터에 포함된 바코드 서열을 이용하여 라이브러리 간 단백질 반웅에 있어서 서로 상호작 용하는 단백질들을 규명하기 위한 대량의 정보처리에 있어 이점을 제공한다.

<515>

<516> [수탁번호]

<517> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원

<518> 수탁번호 ： KCTC12790BP

<519> 수탁일자 ： 20150408

<520>

<521> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원

<522> 수탁번호 ： KCTC12791BP

<523> 수탁일자 ： 20150408

<524>

<525> 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원

<526> 수탁번호 ： KCTC12792BP

<527> 수탁일자 ： 20150408

<528> 국 제 양 식

특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙 기에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 수신: 황 병 준

대한민국 200-701강원도춘천시 강원대학길 1, 강원대학교

항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음사항이 포함되어 있다:

[X] 고 I"학적 성질의 설명

[ ] 제안된 분류학상의 위지

(적용시 X표시)

m. 기탁 및 수탁 본국제기탁기관은 2015년 04월 08일에 기탁된항목 I에표시된 미생물을수탁하였다.

IV. 이관청구의 수령 본국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을수탁하였으며, 에 원기탁의부다페스트조약하의 기탁으로의 이관청구를수령하였다.

V.국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을

명 : Korean Collection for Type Cultures

또는 권한을 부여받은공무원 서명:

주소: 대한민국 305-806 대전 유성구

과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB) 박두 상 이사

서명일: 2015. 04. 23.

BP/4형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지 (원문과상위 없음을확인함) 대리인 ： 변리사 이 희 숙 김 석 만 국 제 양 식

특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙기에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 수신:황 병 쭌

대한민국 200-701강원도춘천시 강원대학길 1, 강원대학교

L 미생물의 표시

π.과학적 성질의 설명 및 /또는 분류학상의 위지

항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음사항이 포함되어 있다:

[X] 고 f학적 성질의 설명

[ ] 제안된 분류학상의 위치

(적용시 X표시)

HL 기탁 및 수탁 ᅳ ᅳ 본국제기탁기관은 2015년 04월 08일에 기탁된항목 I에표시된 미생물을수탁하였다.

IV. 이관청구의 수령 본국제기탁기관 에 항목 I에 표시된 미생물을수탁하였으며, 에 원기탁의 부다페스트조약하의 기탁으로의 이관청구를수령하였다.

V.국제기탁기관

BP/4 형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지

(원문과 상위 없음을 확인함) 대리인 ： 변리사 이 희 숙 김 석 만 국 제 Ot ΛΙ

ο — I

특허출원을 위한 부다페스트 국제 조약 하의 미생물 수탁 증명 국제기탁기관에 의해 규칙 7.1에 따라 발행된 원기탁에 대한 수탁증 수신: 황 병 준

대한민국 200-701강원도춘천시 강원대학길 1, 강원대학교

L 미생물의 표시

기탁자가첨부한 미생물 식별에 대한표시:

국제 기탁기관이 부여한수탁번호:

Saccharomyces cerevisiae SK10-CRE

KCTC 12792BP

Π.과학적 성질의 설명 및 /또는 분류학상의 위지

항목 I에 표시된 미생물에 대하여 다음 사항이 포함되어 있다:

[X]과학적 성질의 설명

[ ] 제안된 분류학상의 위치

(적용시 X표시)

m. 기탁 및 수탁 본국제기탁기관은 2015년 04월 08일에 기탁된 항목 I에표시된 미생물을수탁하였다.

IV. 이관청구의 수령 본국제기탁기관은 에 항목 I에 표시된 미생물을수탁하였으며, 에 원기탁의 부다페스트조약하의 기탁으로의 이관청구를수령하였다.

V.국제기탁기관 국제기탁기관을 대표하는 권한을 가진 자 명칭: Korean Collection for Type Cultures

또는 권한을부여받은공무원 서명:

주소: 대한민국 305-806 대전 유성구

과학로 125 한국생명공학연구원 (KRIBB) 박두 상 이사

서명일: 2015. 04. 23.

BP/4형식 (KCTC Form 17) 단일 페이지 (원문과상위 없음을확인함) 대리인 ： 변리사 이 회 숙 김 석 만