_V ecteurs _d 'expression du facteur IX, cellules transformées ^p ar ces vecteurs et procédé de préparation du facteur IX.

La présente invention concerne la construction de lignées cellulaires produisant du facteur IX humain ou des molécules analogues .

Le facteur IX est une protéine intervenant au cours du cycle de la coagulation du sang . Il est synthétisé sous forme d ' un zymogene et modifié post-traductionnelle- ment par l ' addition de chaine hydrocarbonêe , l ' hydroxy- lation d ' un acide aspartique et la conversion des 12 acides glutamiques en acides 3 ^' -carboxy-glutamiques . Cette dernière modification dépend de la vitamine K

(Bertina et coll . , 1981 ) .

Le foie est le site de synthèse du facteur IX.

Le facteur IX possède une activité réduite ou est absent dans le sang des hémophiles B. L'hémophilie B, comme la forme la plus fréquente de l'hémophilie, l'hémophilie A, se manifeste par un temps de saignement très prolongé. Elle est transmise sous forme d'un carac¬ tère récessif lié au sexe (Hedner et coll., 1982).

La nature moléculaire de la déficience en facteur IX est ^' inconnue.

Le facteur IX lorsqu'il est fourni à des hémophiles B restaure des temps de saignement normaux.

Pour l'instant, la seule source disponible de facteur IX est le plasma humain, bien que dans certains 5 cas la protéine bovine correspondante puisse être utilisée.

Les préparations de facteur IX peuvent être pyrogènes (provoquer des fièvres) et comportent aussi des risques de contamination des agents pathogènes ou des 10 virus tels que le virus de l'hépatite et les agents vecteurs du S.I.D.A.

C'est pourquoi il est intéressant de développer un procédé permettant la préparation du facteur IX de très haute pureté. Le clonage moléculaire du cADN du 15 facteur IX et son expression dans des cellules hôtes particulières sont des techniques appropriées pour obtenir des préparations de facteur IX exemptes des risques et des complications mentionnés précédemment.

La présente invention concerne le clonage du 20 cADN du facteur IX et le développement de vecteurs plasmidiques autorisant l'expression du facteur IX dans les cellules hôtes suivantes :

1) Bactéries, en particulier Escherichia coli ;

2) Levures, en particulier Saccharomyces cerevisiae ; 25. 3) Les cellules de mammifères.

Chaque type de cellules hôtes permet, par l'intermédiaire de la technologie des ADN recombinants, la synthèse de la protéine du facteur IX qui peut être reconnu immunologiquement par des anticorps spécifiques. 30 La présente invention concerne des vecteurs de clonage et d'expression de protéines analogues au facteur I

dans des cellules, caractérisé en ce qu'il comporte au moins :

- une séquence d'ADN codant pour ladite protéine analogue au facteur IX : ADN.FIX ; - les éléments assurant l'expression de cette séquence dans lesdites cellules.

Ces vecteurs comportent, en outre,, une origine de réplication dans lesdites cellules et codent pou un caractère de sélection positif s 'exprimant dans lesdites cellules.

De façon générale, on entendra désigner dans la présente description par "protéine analogue au facteur IX" soit le facteur IX lui-même, soit une protéine ayant le même type d'activité biologique in vivo ou une activité apparentée, en particulier il peut s'agir d'une protéine ayant la même structure que le facteur IX à certains amino- acides près, ou bien des fragments du facteur IX ayant l'activité essentielle de la molécule complète.

La caractérisation plus fine des éléments du vecteur dépend bien entendu de la cellule hôte.

1) Cellules hôtes bactériennes

Dans le cas où les cellules hôtes sont des bactéries, par exemple Escherichia coli, les composants essentiels de ces vecteurs sont : 1) une origine de réplication dans les bactéries ;

2) un gène pour l'expression d'une résistance à un antibiotique qui assure une sélection positive des transformants ;

3) un promoteur qui peut être régulé, suivi par un site de fixation des ribosomes .

En aval du promoteur et du site de fixation des ribosomes, se trouve situé au moins un site de restric¬ tion- pour l'insertion d'un gène hétërologue, dans le cas présent le cADN codant pour le facteur IX ou un analogue. qui doit être exprimé sous le contrôle du promoteur régulab et du site de fixation des ribosomes.

La présence d'une origine de réplication pour le vecteur est essentielle pour permettre la réplication du vecteur dans les cellules bactériennes correspondantes, en particulier dans le cas de E. coli on utilisera, de préférence, l'origine de réplication du plasmide pBR322. Le plasmide pBR322 présente en effet l'avantage de donner un grand nombre de copies et ainsi d'augmenter la quantité de plasmides produisant la protéine désirée. Parmi les promoteurs utilisables, on envisagera de préférence les promoteurs du bactériophage λ, en parti¬ culier le promoteur principal de gauche noté ÀP-. _L est un promoteur puissant responsable de la transcription précoce de A. II est également possible d'utiliser d'autres promoteurs du bactériophage λ, notamment le promoteur de droite, P_, ou le second promoteur de droite P' _R -

Bien qu'il soit possible d'utiliser des sites de fixation des ribosomes ou séquences d'initiation de la traduction très variés, on préfère utiliser celle de la protéine cil du bactériophage qui sera nommée ci-après cIIrbs.

Comme cela sera démontré, il est également possible d'utiliser des séquences synthétiques, en particul tout ou partie de la séquence :

ATAACACAGGAACAGATCTÂTG

Le vecteur en cause peut comporter, en outre, de préférence une fonction d'antiterminaison de transcription codée par exemple par le gène N de A noté λN. En présence du produit de transcription du gène N la transcription à partir de P _r se poursuit au delà de la plupart des signaux stop.

Ceci écarte les problèmes posés par un arrêt prématuré de la transcription qui peuvent se produire lorsque les gènes étrangers clones présentent de tels signau stop. En outre, il a été démontré que l'expression à partir de P _τ est améliorée dans un environnement N .

Toutefois, la présence de cette fonction n'est pas indispensable.

Afin d'écarter les problèmes de toxicité et d'instabilité du système hôte-vecteur en cas de production en continu de grandes quantités d'une protéine étrangère, il est nécessaire d'adjoindre un système contrôlant l'activité du promoteur

De préférence, le contrôle par la température de la synthèse de la protéine étrangère est effectué au niveau de la transcription au moyen d'un répresseur thermosensible codé dans la bactérie hôte, par exemple cl857 qui réprime l'activité de P- à 28°C mais qui est inactivé à 42°C. Le répresseur agit sur l'opérateur 0_ qui est adjacent au promoteur P, . Bien que dans le cas précédent une partie du système d'expression thermo- inductible soit partie intégrante de la bactérie hôte, il est possible de prévoir que ce système fasse partie du vecteur lui-même. Dans le cas du vecteur spécifique décrit ci-après et utilisé pour exprimer le facteur IX dans E. coli (pTG951) ,

la résistance à l'antibiotique est obtenue par le gène de la ji-lactamase qui confère à la bactérie une résistance à l'ampicilline (Amp ) mais il est possible d'utiliser d'autre gènes de résistance. Si de l'ampicilline se trouve dans le milieu de culture, seules les cellules exprimant le gène de la >-lactamase peuvent croître. De cette façon le présence d'une résistance à un antibiotique sur le vecteur d'expressi permet la croissance des seules cellules portant ce plasmide Les exemples ci-après décriront la préparation de certains vecteurs, notamment de pTG320 qui assure l'expressi du _acteur IX dans E. coli.

La présente invention concerne en outre les bactéries, notamment les souches de E. coli,transformées par les vecteurs selon l'invention par des techniques connue et dont certaines seront rappelées dans les exemples.

Enfin 1'invention concerne un procédé de préparati du facteur IX dans lequel on cultive sur un milieu de cultur des bactéries transformées comme décrit précédemment et dans lequel on récupère ensuite le facteur IX formé.

Les milieux de culture mis en oeuvre sont connus de l'homme de métier et devront être adaptés à chaque souche cultivée. La culture sera de préférence effectuée en présence de l'antibiotique à l'encontre duquel la souche transformée est devenue résistante.

Le facteur IX est puri ié après éclatement des cellules par des techniques connues comme .la séparation sur colonne d'affinité ou la chromatographie d'exclusion.

La présente invention comporte, bien entendu, d'autres aspects, notamment les plasmides bactériens qui seront décrits dans les exemples ainsi que leurs mutants et dérivés et de façon générale les procédés de fermentatio des bactéries transformées ainsi que le facteur IX ainsi obtenu.

2) Les levures

Les composants du vecteur d'expression du facteur TX dans des levures sont similaires à ceux utilisés .pour les vecteurs d'expression dans E. coli. Ces vecteurs comprennent :

1) une origine de réplication dans les levures ;

2) un promoteur de levure qui peut être régulé et un terminateur de transcription ; 3) un système de sélection susceptible d'être mise en oeuvre dans les levures ;

4) une origine de réplication dans E. coli ;

5) un gène pour l'expression d'une résistance à un antibiotique dans E. coli. Le vecteur utilisé pour exprimer le facteur IX

_* dans les levures (pTG834) contient deux origines de réplication. La première, celle de pBR322, autorise la réplication dans E. coli, tandis que la seconde, prise dans le plasmide 2 μ de levure, autorise la réplication plasmidique dans la levure.

La résistance à l'antibiotique est fournie par le gène de la p-lactamase qui confère une résistance à l'ampicilline et ainsi un marqueur sélectif dans E. coli. Ce vecteur contient égε..ament le gène de levure URA3 qui complëmente la mutation correspondante dans les levures ura3 . Sur milieu minimum, ceci sert comme système de sélection pour sélectionner les cellules portant les plasmides .

Le promoteur et le terminateur de transcription pour l'expression d'un gène hétérologue proviennent du gène de la phosphoglycérate-kinase de levure (PGK) . Les gènes hêtérologues qui doivent être exprimés sont clones dans le site unique BglII qui est situé entre le promo¬ teur et le terminateur de PGK. 3) Les cellules de mammifères

Dans le cas où les cellules hôtes sont des cellules animales, les éléments d'expression proviennent le plus fréquemment de génomes de virus, par exemple des virus de la famille des Papovaviridiae tels que SV40 (virus simien 40, polyomavirus) ou le BPV (virus du papillome bovin, papillomavirus) . Mais on peut utiliser d'autres virus tels que des adenovirus. Les éléments d'expression des vecteurs selon l'invention comprendront au moins un promoteur d'origine virale. Ainsi, dans les vecteurs dérivés de SV40 on peut utiliser le promoteur des gènes tardifs ou précoces, mais ce promoteur peut provenir d'un virus différent, ainsi dans le vecteur dérivé du BPV on utilisera le promoteur du gène de la thymidine kinase du virus Herpès simplex.

Afin d'améliorer l'expression, les vecteurs selon l'invention peuvent comprendre également des introns et des sites de polyadénylation situés dans cet ordre à l'extrémité de la séquence d'ADN clonêe. Ces éléments peuvent, là aussi, provenir du virus vecteur ou bien être exogènes. Ainsi, dans le vecteur BPV les sites de polyadénylation proviennent de SV40. Parmi les introns utilisables, il faut citer l'intron I du gène de la P ^» -globine de lapin, bien que cela ne soit nullement limitatif.

Enfin, un vecteur d'expression autonome doit être capable de se répliquer dans les cellules hôtes, le vecteur devra donc comporter une origine de réplication, par exemple origine de réplication de SV40 ou de BPV. En outre, le vecte devra éventuellement être capable d'exprimer les protéines nécessaires à son maintien et à sa réplication dans lesdites cellules comme l'antigène T pour SV40.

Dans certains cas, les vecteurs comportant l'ensemble de ces éléments peuvent devenir trop importants pour être utilisables, dans ce cas certains des éléments nécessaires au maintien et à la réplication du vecteur peuvent être apportés par l'intermédiaire d'un autre vecteur ou bien être produits par les cellules elles-mêmes, en permettant de supprimer les parties correspondantes dans le vecteur.

Dans certains cas il peut être intéressant d'intro duire dans le vecteur d'expression un marqueur, gène de sélection positive ou négative dans les cellules hôtes, ainsi par exemple un gène de résistance à un composé chimiqu particulier. Dans le cas de la construction BPV, ce gène est le gène codant pour la dhfr (dihydrofolate-réductase) qui confère aux cellules la résistance au éthotrexate.

Ce gène de sélection permet la manipulation des vecteurs dans les cellules hôtes et peut, dans certains cas, assurer leur maintien.

Les vecteurs ainsi obtenus sont utilisés pour transformer les cellules eucaryotes correspondantes selon des processus connus.

to

Ul O Ul l

- la figure 4 représente la région codante et les 250 nucléotides de la région non codante 3' de pTG397,

- la figure 5 représente la stratégie de préparation de Ml3tg311, - la figure 6 représente la stratégie de préparation de M13tg315,

- la figure 7 représente la stratégie de préparation de pTG907,

- la figure 8 représente la stratégie de préparation de M13tg910,

- la figure 9 représente la stratégie de préparation de pTG908,

- la figure 10 représente la stratégie de préparation de pTG909, - la figure 11 représente la stratégie de préparation de pTG94l,

- la figure 12 représente la stratégie de préparation de pTG320,

- la figure 13 représente la stratégie de préparation de pTG832

- la figure 14 représente la structure de pMOP,

- la figure 15 représente la stratégie de préparation de pTG32β,

Les intitulés des figures suivantes sont simplifiés : - la figure 16 est une photographie des immunoprécipités des produits de fermentation bactérienne,

- la figure 17 est une photographie des immunoprécipités des produits de fermentation de levure,

- la figure 18 est une photographie des immunoprécipités des produits de fermentation de culture cellulaire NIH 3T3,

- la figure 19 est identique à la figure 18 mais culture avec des concentration différentes de méthotrexate,

- la figure 20 est identique à la figure li mais avec immunoprécipitation avec un antisérum, - la figure 21 est identique à la figure 18 mais culture de cellules LMTK avec une immunocompëtition,

- la figure 22 est identique à la figure 18 mais incubation avec des précurseurs radioactifs.

Les exemples ci-après sont présentés de la façon suivante : a) obtention d'un clone de cADN correspondant au facteur IX humain et clonage de ce cADN sur un phage, b) clonage de ce cADN dans un vecteur bactérien, c) clonage de ce cADN dans un vecteur de levure, d) clonage de ce cADN dans un vecteur pour cellule de mammifère, d) mise en évidence de l'expression du facteur IX grâce à ces différents vecteurs.

Obtention d'un clone de cDNA correspondant au facteur IX humain

Pour obtenir un clone de cDNA correspondant au facteur IX humain, on utilise une sonde constituée d'un oligonucleotide synthétique unique. Compte tenu que seule la séquence d'acide aminé du facteur IX bovin est connue, une stratégie possible aurait pu être de composer un oligonucleotide permettant de trouver un clone de facteur IX bovin dans une banque de cDNA de foie de bovins. Ce clone de facteur IX bovin aurait pu être ensuite utilisé comme sonde dans une banque de cDNA de foie humain pour obtenir le clone humain correspondant.

De façon surprenante, il a été possible d'obtenir directement le clone du facteur IX à partir d'une banque de cDNA de foie humain en utilisant 1'oligonucleotide synthétique, ce qui a écarté la nécessité d'effectuer une première séleetion dans une banque dé cDNA de foie de bovins. Cette stratégie est distincte de toutes celles qui ont été utilisées jusqu'à maintenant (Choo et coll., 1982 ; Karachi et coll., 1982) pour obtenir des clones de cDNA de facteur IX : nous avons utilisé une seule sonde oligonucleotide très longue, au lieu d'un mélange dOligonucleotide plus court qui couvre tous les réarrangements possibles des codons. Matëriels_et_méthθdes

1. Isolation de RNA messagers polyadénylés et synthèse du cDNA

Un foie fut obtenu post-mortem et rapidement refroidi dans l'azote liquide. Le RNA est préparé à partir de 5 g de foie en utilisant la technique d'extrac¬ tion au chlorhydrate de guanidium 8 M, tel qu'il est décrit par Tolstoshev et coll., 1981.

Le RNA ainsi obtenu est chro atographié sur une colon de polyU-Sepharose (Pharmacia) comme cela est indiqué par le fabricant de façon à obtenir un extrait enrichi en RNA contena du poly-A. Les séquences de poly-A servent de guide pour la tr criDtion reverse en utilisant des oligo (dT) comme "amorce",1e a été synthétisé en utilisant 100 μL de réactif contenant 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 10 M MgCl ₂ ,50 mM KC1, 30 mM - mercaptoéthanol, 10 ug/ml d'oligo (dT) , 50 μg/ l poly-A-RNA, 0,5 mM de chaque de dATP, dGTP, dTTP, et dCT , 80 unités de transcriptase reverse de virus de yoblaste avien (Life

Sciences Inc.,) . Après 45 minutes à 42°C, la réaction est terminée et le complexe de cDNA-RNA dénaturé par chauffage, à 105°C pendant 3 minutes puis est transféré rapidement sur bain de glace. Pour la synthèse du second brin de DNA, le mélange réactionnel précédent est dilué 5 fois et ajusté jusqu'à une concentration finale avec 100 mM HEPES-KOH, pH 6,9, 100 mM KC 200 uM de dATP, dGTP, dTTP, et P32-dCTP (activité spécifique 0,5 Ci/mmole) . 10 unités de polymérase DNA de E. coli (frag- ment Klenow, (Boehringer Mannheim) sont ensuite ajoutées et l'incubation est effectuée à 25°C pendant 2 heures.

Le cDNA double brin (dscDNA) est extrait avec un volume égal de phénol : chloroforme (50 : 50) saturé avec 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA et précipité deux fois à l'éthanol. Approximativement 970 ng de dsCDNA sont obtenus à partir de 5 yg de poly-A-RNA. Les extrémités sont rendues franches par digestion avec 5 unités de nucléase SI dans un milieu réactionnel de 0,1 ml contenant 30 mM d'acétate de sodium, pH 4,8, 300 mM NaCl, 3 mM ZnCl_. Après 1 heure à 37°C l'EDTA et SDS sont ajoutés jusqu'à une concentration finale de 10 mM et 0,1 % respectivement et le mélange réactionnel est chauffé à 65 ^β C pendant 5 minutes.

Le dscDNA digéré par SI est alors appliqué sur un gradient de sucrose pré-établi 5-20 % contenant 100 M Tris-HCl pH 7,5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl, et centrifugé à 30 000 tours par minutes à 15°C pendant 16 heures sur un rotor S 60 Ti. Les fractions de 0,5 ml sont collectées. Pour déterminer la taille du cDNA, un ul de chaque fraction est passé en électrophorèse sur un gel d'agarose neutre et la migration de chaque fraction est comparée avec un marqueur de poids moléculaire approprié. Les fractions contenant des cDNA plus grands que 1 kilobase sont rassemblées puis précipitées avec 2 volumes d'éthanol pendant une nuit en présence de 5 μg de tRNA de E. coli comme support. Le précipité est remis en suspension dans 20 μl 0,1 x SSC (5 mM NaCl, 0,5 mM de citrate de sodium pH 7,0) .

II. Clonage du cDNA Des éléments d'extrémités homopolymères (approximative ment 15 dCMP) sont ajoutés à l'extrémité 3' du cDNA en utilisa la transférase dëoxynuclêotidyl terminale(Deng et coli 1981.). De manière similaire des éléments d'extrémités homopolymères ρ dGMP (approximativement 10 dGMP) sont ajoutés aux extrémités 3 ' du plasmide pBR322 préalablement digéré avec l'enzyme de restriction Pstl.

60 ng de cDNA possédant des extrémités de poly-CdCMP et 1 μg du vecteur préparé dans les conditions du paragraphe précédent sont chauffés pendant 2 heures à 42°C dans 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl. Les plasmides recombinants sont utilisés pour transformer la souche E. coli 8739 (Murray et coll. 1977) et les transformants sont sélectionnés sur plaque d'agar-LB contenant 15 μg/ml de tétracycline. On obtient 30 000 transformants dont environ 50 % comportent un insert de cDNA supérieur à 1 kilobase. Tous les transformants sont prélevés des plaques dans un volume minimum de LB et après addition d'un volume égal de glycérol, la banque obtenue est stockée à -20 ^β C.

î δ

III. Sélection et synthèse de la sonde oligonucleotide pour le facteur IX 1 755 nucléotides de la séquence codant correspondant à la protéine bovine synthétisée par le foie sont analysées (voir Mac Gillivray et coli 1980 et Chung et coli 1981) de façon à mettre en évidence les codons utilisés préférentielle ment. ous avons sélectionné une séquence de 52 bases. Cet oligonucleotide est construit de la façon suivante :

Oligonucleotide A d(CTCACACTGATCACCATCCACATACT) , B d(GCTTCCAGAACTCTGTAGTCTTCTCA) , le fragment complémentaire C d(GGAAGCAGTATGT) sont- synthétisés chimiquement par la méthode phosphotriester sur un support solide inorganique comme cela a été décrit précédemment par Kohli et coli 1982 et purifiés par HPLC comme décrit par Fritz 1978. 0,5 nmole d'oligonucleotide B sont mis en incubation pendant 30 minutes à 37°C dans un milieu réactionnel de 10 μ contenant 60 mM Tris-HCl pH 7,8, 6 mM MgCL-, 6 mM dithiothre tol, 0,1 mM d'ATP, 6 pmole P32- T? (3000 Ci/mmole) , 2 unités de kinase T4 polynucléotide. LOligomère B 5' phosphorylé es mélangé avec 0,5 nmole d'oligonucleotide A et C dans 10 mM

Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, chauffé à 100°C et le mélange es traité par refroidissement lent à 4°C. Le mélange réactionne des oligonucléotides A et B est ligué dans 50 μl de mélange réactionnel contenant 66 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 7, mM MgCl-, 2 mM dithiothréitol, 0,5 mM spermidine, 0,2 mM EDT 4 unités de ligase DNA T4 à 4°C pendant une nuit. Le 52mer résultant est alors purifié du mélange de ligation par ëlect phorèse sur gel de polyacrylamide à 20 %.

IV. Analyse de la banque de cDNA de foie humain 10 OOO colonies environ sont mises en croissance pendant une nuit sur une plaque d'agar LB contenant 10 μg/m de tétracycline. Le jour suivant, les colonies bactériennes sont transférées sur filtres de nitrocellulose et les filtr sont préparés pour l'hybridation sur des colonies essentiel lement comme cela a été décrit par Grunstein et coll. 1979. Les bactéries restantes, sur les plaques à la tétracycline d'origine, sont remises en croissance pendant quelques heur à 37°C.

La sonde d'hybridat--m est préparée par kination de 100 ng du 52mer avec 50 μL. de P32-ATP. L'hybridation est effectuée à 48°C pendant une nuit dans 40 ml de 6 x SSC et 1 X de solution de Denhardt, 0,1 % SDS, 50 μg/ml d'E. co tRNA. Le jour suivant les filtres sont lavés à 42°C plusieu fois avec une solution de 6 x SSC, 0,1 % SDS. Les filtres sont séchés puis autoradiographiés pendant une nuit.

RESULTATS

La séquence d'amino-acide du facteur IX bovin (voir Katayama et coll. 1979) est analysée pour trouver une séquence longue composée d'acides aminés déterminés par des codons faiblement dégénérés. La sonde a ainsi été réalisée pour correspondre aux acides aminés 36 à 52 du facteur IX bovin, qui correspond à 4 acides aminés codés par 4 codons (thr, val, gly) , 12 acices aminés codés par 2 codons (glu, lys, phe, gin, tyr, asp, cys) et 1 acide aminé codé par 1 codon (trp) (figure 1) .

Ensuite, l'analyse de 585 codons de la prothrombin bovine et du fibrinogene bovin ont révélé que le codon valin GTG est utilisé 21 fois sur 38. De même, TTC et TGT sont

hh

P

Ω rt

Φ

P ht

H

X -

3

P

P-

3

•

Ul to ιo ¹ P ¹ o Ul o Ul O Ul

VO

-J oo

—

to to

Ul o uι Ul

d. Au contraire du facteur IX bovin qui a 4 sites pour la fixation d'hydrate de carbone, le facteur IX humain a 2 sit potentiels pour l'attachement des hydrates de carbone. Ces sites sont tous situés dans le peptide d'activation, aux nucléotides 608-616 et 638-646, et contiennent la séquence typique asn-x-thr/ser. Par contraste le facteur IX bovin a 4 hydrates de carbone attachés dont la structure a été récemment déterminée par Mizurochi et coli (1983) .

FREPARATION DU cDNA DE FACTEUR IX CLONE NECESSAIRE

POUR L'EXPRESSION

(Voir figures 5 et 6) . pTG397 a été mis en digestion avec l'enzyme de restriction Pstl. Comme la banque de cDNA a été clonée par des extrémités G/C dans le site Pstl de pBR322 et en outre que le facteur IX de pTG397 ne contient pas un site interne de reconnaissance Pstl, ce traitement libère un cDNA intact de 2,1 kb correspondant au facteur IX, avec des extrémités susceptibles d'être clonées dans les sites Pstl. Le fragment de cDNA facteur IX est transféré par des procédures standards dans le phage M13MP8 qui a été précédemment mis en digestion avec Pstl et traité avec la phosphatase alcaline. Les phages recombinants sont utilisés pour transfecter une souche de E. coli JM103-

Ul to to o Ul o Ul Ul

P φv rt φv o tr rt

Φ

3

P

Φ

•

M13tg311 permet l'excision du cDNA de facteur IX en utilisant une combinaison d'enzymes EcoRI et BglII ou par combinaison de Ba HI plus BglII*- La séquence de nucléotide à l'extrémité 5* du fragment excisé avec BamHI plus Bglu est la suivante :

1 10 20 30

5' G GATCCGTCCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGC

/ ₌₌₌ — ₌₌₌ >

BamHI

CTGCA G A GATCT

/ / Pstl BglII

La portion soulignée de cette séquence représente la portion du clone de cDNA de facteur IX provenant du fragment FnuDII/Pstl de M13tg397B. Le reste du clone provient du vecte M13tgl20. La portion doublement soulignée de cette séquence indique la localisation des séquences ATG. Il s'agit de sites potentiels pour l'initiation de la traduction du mRNA de facteur IX.

Le fragment BamHI/BglII qui peut être facilement excisé à partir de M13tg311 peut être clone dans deux types d vecteurs d'expression. Le premier type de vecteur contient un signal pour la transcription correcte, un site de fixation de ribosomes et un site d'initiation ATG. Dans ce vecteur, le facteur IX sera exprimé sous forme d'une protéine fusionnée, car la traduction commence sur un promoteur en amont et se continue sur 15 nucléotides précédant le premier codon ATG dans la séquence du facteur IX. Ceci conduira au moins à 5 a ino-acides fusionnés sur l'extrémité de la séquence signal du facteur IX.

to to

Ul o Ul Ul

Φ

3

P rt

P-

P ¹ ω > Ul ' P

3 rt

Ul Ul to

"• » o

P«

P- vq o

Ω Ω 3

Ω P π h3 Ω

P] O P*

Ω n Φv

Ω 1 > o

> 1 ι-3 rt h3 1 Ω P-

Ω 1 O C

1 > Φ

1 Ω Ul

1 O

1 Ω 01

*<

P et tr v

Ul Ul rt

-, - P ^*

XX

0

Φ m

..

•

La séquence soulignée dans 1'oligonucleotide A correspondant à la séquence écartée, moins le premier nucléotide T, du phage M13tg397B par digestion avec FnuDII. L'oligonucleotide B est complémentaire de 1'oligonucleotide A L'hybridation des oligonucléotides A et B donne la structure à double brins suivante qui possède des extrémités BamHI cohésives :

5 ' GATCCATGCAGCG 3' 3 ' GTACGTCGC 5 *

Les oligonucléotides A et B sont ligués avec le fragment de cDNA de facteur IX EcoRI/FnuDII qui a été purifié à partir de Ml3tg397B. Le phage M13MP701 traité par la phosph tase-alkaline et soumis à la restriction par BamHI est alors ajouté pour la ligation et la ligation est effectuée pendant toute une nuit. Un aliquote du mélange de ligation final est transformé dans une cellule JM103. La séquence de nucléotide du phage recombinant M13tg315 qui a donné une plage blanche confirme que la construction est correcte. La digestion de M13tg3l5 avec BamHI libère un fragment de cDNA de facteur IX dont la séquence 5' est la suivante :

1 10 20 5' G GATCCATGCAGCGCGTGAACATG////////FIX///////////G GATC

/ /

/ /

BamHI BamHI

La séquence correspondant à 1'oligonucleotide A a été indiquée ci-dessus en traits pointillés. La séquence souligné correspondant aux 15 nucléotides qui codent pour les 5 a ino- acides absents de la séquence signal du fragment de cDNA de facteur IX BamHI/BglII de M13tg311.

Ces vecteurs MI3tg311 et M13tg3l5 vont servir de source de cADN du facteur IX dans les expériences de clonage ci-après :

Il convient de remarquer que les différentes séquence de nucléotides figurant dans les dessins doivent être considérées comme faisant explicitement partie de la présente description, ces séquences n'ont pas été reproduites dans le corps du texte afin de ne pas l'alourdir inutilement.

1) Procédés généraux a) §ouches_bactériennes

Les souches bactériennes utilisées dans le cadre de la présente invention sont les suivantes :

. TGE900 qui est une souche de E. coli ayant les caractéristiques suivantes : su-F his ilv bio (λcl857ΔBamΔHI)

. N6437, souche de Ξ. coli ayant les caractéristiques -_. - _! - suivantes : F his ilv gai ^' IδproC : tr.10 iaclmlS

(λcl857 3amHI) .

. JM103 qui est une souche de Ξ. coli ayant les caractéristiques suivantes : (Iac-prc) sup" thi endA sbcBIS sttA rK ^~ nK ⁺ / ¹ traD36 prcAB ^* laci ^a IacZ.lιr.15. b) Souches de levures Saccharomyces cereviseae segregsants T Ylspl

TC-Y2sp4 toutes deux ura3 , his 3 .

TGYlspl est un segregeant obtenu par croisement de la souche GFR18 (Mator His3-ll-15 Leu2-3-12) (FINK et coll.) avec la souche TGY10-1 (Mat Ura3-251-373-328) . La souche TGY10-1 est un dérivé isogénique de la souche FLIOO (ATCC 228

Les souches mentionnées précédemment ont été utilisées parce qu'elles étaient disponibles, mais il est bien entendu qu'il est possible d'utiliser d'autres souches dans la mesure où elles présentent certaines caractéristiques essentielles qui sont rappelées dans le . cours de la description détaillée.

Des mini-préparations d'ADN de plasmides ou de ph

M13 sont effectuées comme cela est décrit par Ish-Horowit (1981) à la seule différence que 1 'ADN est précipi une seconde fois avec de l'éthanol avant d'être utilisé.

Les maxi-préparations sont effectuées comme cela décrit dans la publication précédente, avec une purificat complémentaire par un gradient de densité CaCl/bromure d'éthidium. c) echnigues_de_clonaσes

Le traitement des ADN avec des enzymes de restric est effectué, sauf indications contraires, en utilisant l conditions indiquées par le fabricant (New England Biolab Bethesda Research Laboratories et Boehringer Mannheim) .

Les oligonucléotides utilisés proviennent soit de Nev ^; England Biolab, Hana Biologics et Worthington Biochemica ou sont synthétisées par les techniques Kohli et coll. Tous les produits radioactifs ont été obtenus chez Amersham International.

Lorsque cela est nécessaire, les phosphates des extrémités 5' sont éliminés en utilisant, soit une phosphatase alcaline bactérienne, soit une phosphatase d'intestin de veau, pendant 30 minutes à 37°C dans le tampon d'enzyme de restricti La réparation des extrémités cohésives utilisant la polymérase de Klenow (Boehringer Manπhei ) est effectuée à 25°C pendant 15 minutes dans un mélange de 50 mMol. Tris HC1, pH 7,8, 5 mMol. MgCl ₂ , 10 Mol. de β-mercaptoéthanol, 0,4 mMol de dNTPs avec l'enzyme et 10 à 200 yg/ml d'ADN. La nuclëase S _χ (Miles) est utilisée à 2 u/μg d'ADN à 25°C pendant 30 minutes dans un milieu 0,3 Mol. NaCl, 0,03 Mol. NaOAc, pH 4,8, 0,003 Mol. ZnCl-,.

Bal31 est utilisée selon le procédé de Panayotatos et coll. (1981) . Les ligations sont effectuées à 15°C (sauf lorsque cela est indiqué différemment) pendant 4 à 24 heures en utilisant de l'ADN ligase T. (Boehringer Mannheim) avec 100 mMol. de NaCl, 66 mMol. de Tris KC1, pH 7,5, 10 mMol. de MgCl-, 0,5 mMol. de spermidine, 0,2 mMol. de EDTA, 2 mMol. de DTT, 1 mMol. d'ATP, 0,1 mg/ml de BSA et 5 à 50 μg/ml d'ADN. Pour la ligation d'extrémités cohésives, on utilise environ 30 unités/ml de ligase. Pour la ligation des extrémités franches on utilise environ 100 unités/ml de ligase.

Après chaque traitement enzymatique, l'ADN est extrait avec le phénol, deux fois avec octanol - chloroforme (1:8) puis précipitation avec l'éthanol. Dans le cas de petits fragments ( lOObp) une triple extraction avec le diéthyléther remplace- la précipitation à l'éthanol.

Lorsque cela est nécessaire, du tARN de E. coli ou de levure est utilisé comme entraineur. Les adaptateurs molëcu- laires (Collaborative Research, Bethesda Research Laboratories, New England Biolabs) sont prëhybridés et utilisés en excès

molaire de 10 à 50 fois pour les extrémités franches d'ADN utilisant les conditions de tampon décrites précédemment avec 100 unités/ml de ligase T. à 4°C pendant 15 heures. L'insertion des "linkerβ" non phosphorylés a été effectuée de la façon suivante t

Les linkers sont repris dans du tampon TE (10mM Tris.HCl pH 7,5, 1 M Na ₂ EDTA) à la concentration de 1 mg/ml et prehybridés par refroidissement de 65 ^β C à ^β C. La ligation est effectuée dans un tampon de concen- tration 30 mM NaCl, 30 M Tris.HCl pH 7,5, 1mM spermidine, 0,25 mM ATP, 2 mM DTT, 0,2 mM Na ₂ EDTA et 0,1 mg/ml sérum albumine bovine. En général, la ligation (10 à 50 μl est effectuée avec un excès molaire du linker sur les extré¬ mités d'ADN de 80 fois, et une concentration d'ADN cible de 0,1 μM. La ligase est utilisée à la concentration de 100 à 200 unités/ml et la ligation est effectuée à 4°C pendant 16 heures. Les linkers excédentaires sont éliminés par précipitation à la sper ine (Hoopes et Me Clure, 1981). L'ADN est ensuite repris dans 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 M Na ₂ EDTA, puis dilué dans du tampon d'hybridation

(100 M Tris.HCl pH 7,5, 5 mM Na ₂ EDTA, 100 mM NaCl). La réhybridation est effectué comme la préhybidation des linkers, et des aliguots sont transformés directement dans E.. coli. Le principe de la méthode est décrit par LATHE et Coll., 1983.

Lorsque l'on utilise des adaptateurs phosphorylés, mélange de ligation est tout d'abord extrait avec un mélan phénol/chloroforme puis précipité avec de l'éthanol avant coupure spécifique avec les enzymes de restriction appropr puis précipitation avec le tétrachlorhydrate de spermine.

Les cellules bactériennes compétentes sont préparées puis transformées avec les plasmides ou transfectëes par l'ADN de M.13 selon les procédés décrits par Dagert et Ehrlich (1979) . 5 Les plasmides de levures sont introduits dans les levures suivant la technique aux sels de lithium de Ito et coll. 1983.

La sélection est faite sur un milieu minimum synthétique plus histidine (40 ug/ml) pour les segregeants 10 mentionnés précédemment. EXEMPLE 1

Préparation de pTG320, vecteur d'expression dans les bactéries

La synthèse du plasmide pTG320 nécessite 5 d'une part la préparation d'un plasmide vecteur, pTG951.

Ce plasmide pTG95l a été obtenu par une stratégie complexe.

La synthèse de ce vecteur, qui est développée dans le brevet français n° 83 19777 déposé le 9 décembre 19 ^Q par la demanderesse, ne sera que brièvement rappelée en regard des schémas ci-annexés. a) Construction de pTG908 (fig. 7, 8 et 9)

Le plasmide de base utilisé est le plasmide pBR322 ; toutefois, celui-ci présente l'inconvénient ^• - d'avoir à l'intérieur du gène Amp un site de restriction

Pstl, car un site de même nature sera utilisé par la suite dans la zone de clonage comme site unique de restriction. Il convient donc de faire disparaître ce site de restric¬ tion Pstl en utilisant un mutant du plasmide pBR322, le Q plasmide pUC8, dans lequel le gène de résistance à l'ampicilline ne présente pas de site de restriction Pstl (ce site a été éliminé par mutation in vitro) . pBR322 est commercialisé notamment par Bethesda Research Laborator et pϋC8 est décrit dans l'article de Vieira J. et Messing J

Pour ce f ire, on échange le fragment PvuI/PvuII de 1 669 bp de pBR322 avec le fragment analogue PvuI/PvuII du plasmide pUC8. Afin de réaliser cet échange les plasmid pBR322 et pϋC8 sent traités successivement par Pvul, PvuII, puis circularisés par action d'une ligase.

On obtient ainsi le plasmide pTG902 qui ne présente plus de site de restriction Pstl et qui a également perdu l site de restriction Ndel présent à l'origine sur pBR322 (non représenté sur la figure η ) . En outre, le plasmide pTG902 porte un fragment de 50 bp correspondant à la séquen laci' dans lequel se trouve le site PvuII.

Le promoteur P- et le gène λN (qui provient du phag λ, le gène λN code pour une fonction d'antiterminaison de transcription) sont isolés du plasmide pKC30 pour être insérés dans pTG902 comme cela est indiqué sur la figure 7 ci-annexée par traitement EcoRI, SI, 3a HI pour ?TG902 et par traitement Pv l, SI, BamHI pour pKC30 avec ligation.

L'un des plasmides obtenus après transformation de la souche TGE900, pTG906, est traité de façon à éliminer le segment PvuII-SalI. Pour ce faire, pTG90β est traité succes vement avec Sali, la nucléase SI, PvuII et la ligase. On obtient ainsi pTG907.

On insère ensuite la "région de fixation des ribosomes" λcllrbs (provenant elle aussi du phage À) scus forme d'un fragment Aval/Taql dans le début du gène lacZ ' (fragment a de la 3-galactosidase) lequel a été clone dans le phage M13 nommé M13tgll0. Cette stratégie permet un test fonctionnel simple pour rbs, à savoir la production de la protéine lacZ ' et, par conséquent, d'obtenir des plaques bleues en présence d'IPTG et de Xgal ; ceci permet égalemen un séquençage rapide de la construction en utilisant la méthode dite du didéoxv.

On obtient ainsi après sélection dans les bactéries compétentes un clone résultant M13tgS10 dont la structure globale est représentée à la partie inférieure de la figure

8. Le fragment clIrbs/lacZ ' du phage M13tç9l0 est trans féré sur le plasmide vecteur pTG907 préparé précédemment.

Pour ce faire, on élimine les sites EcoRI, BamHI et Aval en amont de cllrbs puis on insère un site BglII.

Dans ces conditions, cllrbs peut être prélevé sous forme d'un fragment BglII-BglII et placé dans le site BamHI en aval du promoteur P et du gène --.N de pTG907.

Le phage M13tç9l0 est digéré avec EcoRI puis traité avec 3aI31 puis ensuite par la pclymérase de Kleno . Les fragments obtenus sent alors soumis à l'action de la ligase en présence d'adaptateurs 3giII r.c. phosphorylés. Le mélange de ligation obtenu est utilisé pour transformer des cellules compétentes JM1G3.

On sélectionne alors les plages bleues. Ces clones sont ensuite analysés afin de vérifier qu'ils contiennent Le site BglII et qu'ils ne présentent plus de site EcoRI eu

BamHI en amont. On obtient ainsi des clones tels que M13tg 912 dont la structure est représentée sur la figure9 .

Le traitement par Bal31 a produit une délétion de

101 bp éliminant les βiteε EcoRI, Ba HT. et Aval j ainsi q les éëquenceε de lac ATG et lac Shine/Dalgarno. Le site

BglII introduit se trouve placé enrion 100 bp en amont de l'ATG de cil et 10 bp en aval de Pl,a_c.

Le fragment BamHI/SphI de pTG907, le fragment Bgl Hpal portant cllrbs et lacZ' et l'adaptateur phosphorylé été préhybridés dans un rapport molaire de 1:2:1 puis tra avec la ligase T.. Des aliquots sont utilisés pour transf les cellules compétentes de la souche 6150 à 30°C.

Les cellules intéressantes sont identifiées en sélectionnant les transformants avec un fragment ^' clIrbs/l marqué au P 32 et la construction obtenue est confirmée pa une étude de restriction enzymatique. Afin d'avoir une première indication montrant que différents éléments du système d'expression se conduisent comme cela est désiré, le plasmide obtenu, pTG908, est tr féré dans une souche hôte N6437 qui possède à la fois cl8 le fragment ω de la β-galactosidase complémentant le frag α qui est codé par le plasmide.

Les transformants obtenus placés sur une boite contenant IPTG + Xgal sont blancs à 28*C puis virent au b environ 30 minutes après lorsqu'on les transfère à 42*C.

Ce vecteur avant d'être utilisé pour cloner FIX a été adapté pour cloner l'interféron ^y humain : IFN-3", en fait pou le clonage de FIX la nature de la protéine intermédiaire cloné n'a pas d'importance, mais les vecteurs ont été réalises selo le schéma ci-après.

L'analyse de la séquerice des nucléotides de IFN-γ pour les sites de restriction révèle un pite EcoRII à 8 bp en aval du départ de la protéine mature et un site Sau3A à 285 b en aval du codon stop, ce qui permet d'-isoler pratiquement toute la séquence codant pour la protéine mature sur un fragment EcoRII/Sau3A. Le clone de IFN-γ obtenu à partir d'une banque est nommé pTGll.

b) Construction de O *-ÏG90S

La figure 10 schématise la préparation de pTG909. On utilise tout d'abord une molécule d'adaptation synthétique qui permet : a) d'effectuer la jonction entre les extrémités EcoR et ffiel , b) d'introduire les 8 bp manquantes par rapport à la séquence codant pour IFN-γ mature et, c) de reconstituer le codon de départ ATG de cllrbs de façon que la séquence codant pour la protéine IFN-γ matur soit traduite sans amino-acides fusionnés à l'exception de l'initiateur F-met. Cet adaptateur est synthétisé chimiquement et sa constitution est représentée sur la figure χo. pTGll est mis en digestion avec EcoRII et Sau3A et pTG908 avec Ndel et BamHI.

Les fragments appropriés sont purifiés sur gel, mélangés avec une quantité équimolaire de l'adaptateur, préhybridés et liges. Le mélange est utilisé pour transformer des cellules compétentes TGE900 et les transformants sont sélectionnés en hybridant un insert Pstl de pTGll "nick- traduit" et marqué au p 32 avec les transformants.

13 clones sont sélectionnés et contrôlés par carto¬ graphie et l'un d'eux pTG909 est vérifié par séquençage.

c) Construction du vecteur pTG941

pTG909 contient 2 sites Ndel, l'un au codon de départ de IFN-γ et l'autre 22 bp en aval de la séquence IFN-γ (voir figurell ) .

La région entre ces sites qui est la région codant po les 7 premiers a ino-acides de IFN-γ a été éliminée par traitement avec Ndel et remplacée par un oligonucleotide synthétique qui est représenté sur la figure n.

Cette réaction détruit le site Ndel aval et reconsti¬ tue le site Ndel amont tout en introduisant un site BamHI qui est unique. On obtient ainsi le vecteur pTG941.

d) Construction de pTG951

La figure 12 schématise la construction de pTG951 qui est un dérivé de pTG941 dans lequel le fragment contenant le cllrbs a été remplacé par une séquence synthétique sur la base la séquence de la région d'initiation de la traduction de l'ope E. coli lac noté E. coli lac opéron rbs. Cet oligonucleotide synthétique a été inséré au niveau du site Hgalentre le site unique Ndel du codon de départ de la séquence codant pour IFN-èf et le site Clal qui a été inséré dans le gène N.

De ce fait par traitement avec Ndel et Clal le plasmi pTG951 ne contient plus qu'un gène N tronqué (un codon stop e phase avec la traduction du gène N est placé immédiatement en amont du nouveau site rbs) et est dépourvu des termlnateur de transcription tLl et tRl présents dans pTG909 et pTG941.

Le site rbs synthétique de pTG951 contient un site BglII immédiatement avant le codon de départ, il est donc possible de faire des dérivés de pTG951 par scission avec BglII suivi par diverses manipulations utilisant soit l'ADN 0 polymérase I ou la nucléase SI. Ces dérivés présentent des variations dans la distance et les séquences entre la séquenc de Shine/Dalgarno et l'ATG. Mais aucun des plasmides ainsi préparé ne présente une activité supérieure au pTG951 lui-mê

5

Les principaux résultats sont rappelés dans le tablea ci-aDrès :

NOM PROHOTEUR RBS SEQUENCE DE RBS ET JONCTION AVEC LA SEQUEN f et cys tyr cys gin asp p pTG909 PL Cil TAAGGAAGTACTTACATATG TGT TAC TGC CAG GAC C

f et cys tyr cys gin asp p pTG941 PL Cil TAAGGAAGTACTTACATATG TGC TAC TGT CAG GAT C

fmet cys tyr cys gin asp p pTG951 PL SYNTH CACAGGAACAGAGATCTATG TGC TAC TGT CAG GAT C (lac)

BglII

La construction de pTG320 est schématisée à la figure 12. pTG951 comporte un site de clonage avec de nombreux sites uniques de restriction situé en aval du promoteur et du site de fixation des ribosomes. Immédiate¬ ment en aval du site de fixation des ribosomes lac synthétique se trouve situé un site BglII. Lorsqu'un gène hétérologue est clone dans ce site, les sites de restriction uniques additionnels peuvent être introduits. Ces sites peuvent alors être employés pour exprimer des gènes hétérologues additionnels. Comme pTG951 contient une séquence d'interféron humain qui contient un site unique BamHI, 21 paires de base en aval du site BglII un gène hétérologue peut être aussi clone dans ce site. Le choix du site BglII ou du site BamHI à utiliser dépend du gène hétérologue qui doit posséder un ATG initiateur immédiatement en aval des extrémités cohésives de BglII BamHI. Si comme cela est le cas dans le facteur IX ceci n'est pas possible, le site BamHI doit être utilisé et la protéine sera exprimée sous forme fusionnée avec 5 des aminoacides de l'interféron humain.

Pour l'expression du facteur IX dans E. coli pTG951 a été mis en digestion avec BamHI et Pstl, éliminant ainsi les 5 aminoacides de la séquence de 1'interféron tf et insertion du fragment BamHI/PstI provenant de M13tg311. La séquence du plasmide résultant, DTG320, au niveau de la fusion interféron sr facteur IX est la suivante :

M C Y C Q D P Y A P S V Q M I M A pTG 951 A ^Λ GATCTATGTGCTACTGriCAG ^Λ GATCCσrAT M13tg311 G ^Λ _ATœGTCCCTGAACATC_A.TCATGGCA. / / /

/ / /

BglII BamHI BamHI

1 5 10

M C Y C Q D P S V Q M I M A pTG320 A GATCTATGTGCTACTGTCAG ^Λ GATCCGTCCGTGAACATGATCATGGCA . / /

/ /

BqlII BamHI

Les lettres au-dessus des séquences de nucléotide se réfèrent au code conventionnel à une lettre pour les amino-acides codés.

La séquence de facteur IX est soulignée.

Comme cela est indiqué, la traduction du mARN de facteur IX commence à l'ATG venant de l'extrémité 5' de 1*interféron if . La protéine résultante est ainsi une protéine fusionnée avec 8 amino-acides fusionnés à la séquence signal incomplète du facteur IX.

EXEMPLE 2

Expression du facteur IX dans la levure

Le vecteur d'expression utilisé est le plasmide pTG832.

La construction du plasmide pTG832 est rappelée dans la figure 13.

Le plasmide de départ est le plasmide pTG902 obtenu à partir de pBR322 par délêtion des sites Pstl et Ndel.

Par digestion de pTG902 et du plasmide portant le gène ura3 (ne possédant pas de site Pstl) avec HindIII et ligation du produit de digestion, on obtient le plasmide pTG803. Le plasmide 2μ de levure est mis en digestion avec

Avall et HindIII et les extrémités sont rendues franches par traitement avec la polymérase de Klenow. Ce fragment de 2μ Avall/HindIII est ligué avec pTG803 digéré par S al pour fournir le plasmide pTG807. Le gène ura3 et l'origine de réplication du 2μ sont libérés sous forme d'un fragment unique par digestion de ρTG807 avec HindIII.

Ce fragment est traité par la polymérase de Klenow et clone dans le site HindIII de pBR322 traité de façon similaire pour donner pTG831.

Le gène de levure phosphoglycerate kinase (PGK) est muté de façon que le site unique BglII soit introduit à l'AT d'initiation de la traduction de la protéine PGK.

Le fragment HindIII/SalI (2,15 kb) , comprenant le promoteur et le début de la région codante du gène correspon dant à la phosphoglycerate kinase de levure, a été clone dan les mêmes sites du vecteur M13mp8.

La création d'un site BglII au niveau de l'ATG initiateur de la phosphoglycératekinase a été effectuée suivant les techniques classiques de mutagénèse in-vitro (Gillam and Smith, 1979 gène 8_, 99-106) .

Pour ce faire, un oligonucleotide synthétique, de séquence 5* ATATAAAACAAGATCTTTATC 3*, a été utilisé afin de modifier la séquence originale 5* ATATAAAACAATGTCTTTATC 3* ; l'ATG initiateur est ainsi rendu non fonctionnel du fait de son remplacement par la séquence AGA.

Ce gène ainsi modifié est clone dans le plasmide pTG831 pour donner le plasmide pTG832.

Le terminateur de PGK situé dans le fragment EcoRI/HindIII est clone dans le site PvuII de pTG832 après traitement de ses extrémités à la polymérase de Klenow. Le plasmide résultant, pTG833, est mis en digestion avec BglII et recircularisé pour donner le vecteur d'expression final pTG834. Comme cela est indiqué précédemment, le site unique BglII dans ce vecteur est utilisable pour l'expression de gène hétérologue dans la levure. C'est dans ce site que le fragment de cADN BamHI/BglII provenant de M13tg311 et les fragments de cADN FIX BamHI de M13tg315 ont été clones pour donner respectivement pTG318 et pTG324. EXEMPLE 3

Expression du facteur IX dans les cellules de mammifère 1) le plasmide pMOP

Le virus BPV se divise en deux parties limitées par deux sites uniques de restriction HindIII et BamHI qui délimitent deux fragments dits respectivement de "69 %" et de "31 %".

Le vecteur dérivé du BPV mis en oeuvre dans cet exemple est dénommé pMOP. Il est obtenu par intro¬ duction dans le site BamHI du BPV du marqueur dhfr codant pour la dihydrofolate réductase sous le contrôle du promoteur prëcode de SV40 (voir figure 14) .

Ce vecteur pMOP comporte en outre un fragment de pBR322 portant le gène de résistance à l'ampicilline qui provient du plasmide pML2 décrit par Lusky et Botchan, 1981.

Ce plasmide vecteur a été préparé à l'origine afin de cloner la séquence codant pour une protéine antigénique de la rage, comme cela est décrit dans le brevet français n° 83 15716.

2) Le plasmide pTG158SAL (figure 15) Le gène codant pour la protéine antigénique de la rage provient du plasmide pTG147 dont la cons- truction a été explicitée dans le brevet français mention- né précédemment.

Ce gène est prélevé sous forme d'un fragment BglII/SalI par digestion partielle de pTG147 pour être introduit entre les sites correspondants du plasmide pTG301 traité par BglII/SalI. Ce plasmide pTG301 comporte le gène de la thymidine kinase (tk) et son promoteur (ptk) , il est obtenu par insertion dans le site BamHI de pBR322 d'un fragment BamHI-BamHI de l'Herpès virus simplex portant tk et ptk, le traitement de restriction mentionné élimine le gène tk. Le produit de ligation pTG156 comporte dans sa partie intéressante le gène de la rage sous le contrôle du promoteur de la thymidine kinase, le gène étant suivi du site de polyadénylation de SV40 (A) .

L'introduction de l'intron de la globine est eff tuée à partir du phage M13tgl40,dont la construction est dé dans le brevet français, sous forme d'un fragment BglII/Ba qui est inséré dans le site BglII de pTG156 après délétion fragment BgJ.II/BgJLII correspondant. Cette délétion ayant s primé le gène de la rage, celui-ci est réintroduit dans le unique BglII de pTG156 sous forme d'un fragment BglII/BglI de pTG147. On obtient ainsi le plasmide pTGl58.

La partie essentielle de ce plasmide devant être prélevée sous forme d'un fragment Sali/Sali (l'un des rare sites uniques de pMOP) on introduit en amont du promoteur niveau du site BamHI un petit fragment provenant de Ml3tgl et comportant un site Sali. M13tgl20 est mis en digestion BglII et BamHI et pTG158 avec BamHI, l'ensemble est lié po donner pTG158 S L.

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La ligne 1 correspond au standard de poids moléculaire.

Les lignes 2, 3 et 4 correspondent au plasmide pTG320 (facteur IX) . Les lignes 5 et 6 correspondent au vecteur plasmidique pTG951.

Les lignes 4 et 6 correspondent à des cultures à 30°C.

Les lignes 2, 3 et 5 correspondent à des cultures à 37°C.

La ligne 2 est la même que la ligne 3, sauf que l'immunoprécipitation est effectuée en présence de 10 y g de facteur IX comme compétiteur.

Comme cela est indiqué par la flèche, l'induction de pTG320 à 37°C produit une protéine qui est spécifique¬ ment immunoprécipitêe par l'antiserum de lapin anti-facteur IX. Le poids moléculaire apparent de cette protéine est de 47 000 daltons. L'antiserum utilisé a été préparé en utilisant une préparation de facteur IX natif.purifié. Ceci a été confirmé puisque la protéine du facteu

IX purifié non marquée peut entrer en compétition au niveau de 1'immunoprécipitation avec la protéine de 47 000 daltons (ligne 1) . Il faut mentionner que le facteur IX produit par les bactéries à la différence du facteur IX natif utilisé pour préparer l'antiserum est ni glycos lé ni H-carboxyle. En dépit de ceci, le facteur IX produit par les bactéries est reconnu par l'antiserum de lapin anti-facteur IX natif.

La taille espérée pour le facteur IX produit dans cette construction est de 51 300 daltons. Ceci tient compte des 8 amino-acides de 1'interféron tf qui sont fusionnés à la séquence signal du facteur IX. La taille observée pour le facteur IX bactérien est significativement plus petite que la taille espérée et correspond de façon plus proche à la protéine mature dans lequel on a supprimé la séquence signal et la préprotéine (46 000 daltons) . Ainsi, le mécanisme de sépa- ration spécifique qui est responsable de l'élimination de la séquence signal et de la séquence de la préprotéine du facteur IX pourrait être fonctionnelle dans E. coli. Expression de facteur IX dans Saccharomyces cerevisiae Les expériences suivantes sont effectuées pour déterminer si les cellules comportant le plasmide recom¬ binant pTG3l8 synthétise le facteur IX.

La culture en phase logarithmique de pTG834 (vecteur) et pTG3l8 (facteur IX) est effectuée en milieu minimum jusqu'au milieu de la phase logarithmique. Un aliquote de 5 ml est prélevé pour chaque culture et les protéines sont marquées avec de la methionine S35 pendant 20 minutes à 30°C. Les cellules sont récoltées par cen- trifugation, remises en suspension dans 0,5 ml TGE qui contient un mélange inhibiteur de protéase puis lysées par la méthode des billes de verre. Après clarification par centrifugation, les protéines dans les extraits cellulaires sont analysées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS. Le profil des protéines synthétisées est indiqué à la figure 17:

. ligne 1 pTG834 . ligne 2 pTG3l8 . M standard de poids moléculaire.

La flèche indique la position de la bande (poids moléculaire 57 000 daltons) qui est particulière¬ ment intense en particulier dans le facteur IX obtenu à partir de pTG318. La taille de cette protéine est en accord avec la taille espérée, si la forme mature du facteur IX plus le signal (50 600 daltons) est glycosylée, un procédé qui apparaît ^' dans les levures et qui est connu pour ajouter à peu près 7 000 daltons au poids moléculaire apparent du facteur IX. On trouve une répartition à peu près similaire des protéines pour le plasmide pTG324 qui contient, en outre, 5 amino-acides additionnels à l'extrémité N terminal du peptide signal de facteur IX.

D'autres informations confirment l'expression du facteur IX dans les levures portant les plasmides recom¬ binants pTG3l8 et pTG324 et proviennent d'une analyse ELISA des extraits cellulaires. A titre de contrôle, les extraits cellulaires portant le plasmide pTG834 ont également été testés et il a été démontré qu'il était incapable de prépar l'antigène du facteur IX. Ces expériences ont été effectuée à l'aveugle, l'expérimentateur ne connaissant pas les sourc et les préparations des échantillons qui étaient analysés par ELISA. Les résultats de cette analyse sont représentés au tableau I. La méthode employée pour la détermination quantitative de l'antigène de facteur IX est décrite.

L'expression du facteur IX dans les cellules de mammifères Des lignées cellulaires de cellules de mammifères sont transformées avec le plasmide pMOP ou les dérivés pTG317 ou pTG325 contenant le facteur IX dans le bloc d'expression fourni par le plasmide pTG326. 4 lignées cellulaires ont été transformées :

NIH-3T3 : (fibroblaste d'embryon de souris) ; LMTK : (fibroblaste d'embryon de souris) ; MDBK : (rein de bovins) VERO : (rein de singe) . Des résultats ont été obtenus pour les cellules

NIH-3T3 et LMTK et sont actuellement en attente pour les lignées MDBK et VERO.

Comme cela a été indiqué précédemment, le vecteur employé pour exprimer le facteur IX dans les cellules de mammifères (pMOP) permet la sélection de transformants stables en présente de l'antimétabolite methotrexate. Ainsi après transformation des cellules par la technique standard utilisant la précipitation de l'ADN au phosphate de calcium les transformants sont sélectionnés en présence de 0,4 μg/m de methotrexate. Les colonies de cellules transformées sont détectées visuellement sans l'aide de microscope au bout de deux à trois semaines. Ces colonies peuvent alors être isolées, cultivées et analysées séparément.

Le résultat d'une immunoprécipitation des protéin marquées à la methionine S35 avec un sérum de lapin anti¬ facteur IX natif pour différentes colonies isolées de cellu de NIH-3T3 portant le plasmide pTG317 est représenté à la figure 18: ligne 1 contrôle non transformé cellule 3T3, ligne 2 mélange de différentes colonies, ligne 3 marqueur de poids moléculaire, ligne 4 pTG3l7 clone 7, ligne 5 pTG3l7 clone 1, ligne 6 pTG317 clone 9, ligne 7 pTG3l7 clone 4,

Comme cela est indiqué dans les lignes 2, 4, 5 et on observe une expression très forte d'une protéine de 62 000 daltons immunoprêcipitëe spécifiquement avec un anti sérum de lapin anti-facteur IX. La présence ou l'absence de cette protéine est en corrélation avec la détection de l'antigène du facteur IX dans les extraits cellulaires analysés par ELISA.

La protéine de 62 000 daltons ne forme pas une bande aiguë dans les conditions d'électrophorèse utilisées. Comme cette glycoprotéine forme une bande diffuse carac¬ téristique sur gel de polyacrylamide SDS, ce résultat suggère que le facteur IX obtenu à partir des cellules 3T3 transformées par pTG3l7 peuvent être glycosylées. De façon à déterminer si la protéine de 62 000 daltons est une glycoprotéine, les extraits cellu¬ laires marqués à la methionine S35 de 3T3.pTG3l7.clone 7 (ci-après 3T3.317.7) sont mis en incubation avec la concanavaline A-Sépharose (Pharmacia) . Dans les conditions employées, la glycoprotéine est spécifiquement absorbée au dérivé de Sêpharσse. Le facteur IX restant dans le surnageant après incubation avec ConA-Sépharose est déterminé par immunoprécipitation et est comparé à la quantité de facteur IX immunoprecipitable avant incubation avec ConA-Sépharose. Dans ces conditions, la protéine de

62 000 daltons est quantitativement éliminée de l'extrait 3T3.317.7 par absorption sur ConA-Sépharose.

Le fait que cette absorption ne soit pas due à une absorption non spécifique des protéines sur .ConA- Sépharose est démontrée car seule le protéine de

62 000 daltons est prélevée alors que les protéines de l'arrière plan demeurent dans le surnageant.

L'analyse de protéine marquée à la methionine S35 sans immunoprécipitation montre la présence d'une protéine de 72 000 daltons dans tous les cas dans laquelle un antigèn de facteur IX est détecté par ELISA et immunoprécipitation d'une protéine de 62 000 daltons, L'identité de cette protéine de 72 000 daltons est incertaine ; toutefois elle est clairement associée avec la présence de l'antigène de facteur IX dans les cellules 3T3 trans¬ formées. Il est possible que cette protéine représente un précurseur biosynthétique de la protéine de 62 000 dalton Les expériences qui vont être décrites démontrent que cette protéine de 72 000 daltons est spécifiquement immunoprecipit par un anti-sérum de lapin anti-facteur IX.

La résistance au methotrexate dans 3T3.317.7 provient de l'expression du gène de la dihydrofolate reducta (dhfr) portée par le plasmide. Si la concentration de methotrexate est accrue, une certaine proportion des cellules répondra en augmentant le nombre de copies du gène de dhfr. Comme les séquences de dhfr et du facteur IX sont situées sur le plasmide pTG3l7, ..n pense pouvoir ainsi, en augmentant la dose de methotrexate, co-amplifier l'expression de dhfr et du gène de facteur IX. Pour tester cette hypothèse , le methotrexate est ajouté à la culture de 3T3.317.7 à une concentration variant entre 0,4 et 8 μg/ml.

Après plusieurs semaines de culture à ces concentrations, les cellules sont marquées avec de la methionine S35 comme cela est décrit précédemment et les protéines analysées sur gel de polyacrylamide SFS.

La figure 19 montre les résultats obtenus. Légendes des figures 19 et 20 : ligne 1: cellule 3T3, ligne 2: cellule 3T3 transformée par pMOP, lignes 3, 4, 5 et 6 :3T3.317.7 concentration de metho¬ trexate (microgramme/ml) . ligne 1: 0 lignes 2 et 3: 0,4, lignes 4, 5 et 6: 2, 4 et 8 ,ug respectivement. Comme cela ressort de la figure 19 , en augmentant la concentration de methotrexate, on augmente de façon significative la synthèse de protéine de poids moléculaire 72 000 daltons. Ces protéines corres¬ pondent en première approximation à la protéine de 62 ₀₀₀ daltons qui est immunoprecipitee avec un anti-sérum spécifique et dans le second cas à la protéine de 72 000 daltons que l'on observe dans l'extrait cellulaire total.

L'extrait cellulaire précédent est analysé par immunoprécipitation avec un anti-sérum de lapin anti-facteur IX natif. Les résultats sont reproduits à la figure 20. Comme on peut le constater, la protéine de 72 000 daltons qui a été observée à la figure 19 augmente en intensité lorsque l'on augmente la concen¬ tration de methotrexate et elle est immunoprecipitee spécifiquement avec l'anti-sérum de lapin anti-facteur IX natif. La relation entre dose et effet pour la protéine de 62 000 daltons est moins claire. Si comme cela a été indiqué précédemment, la protéine de 72 000 daltons représente un précurseur de la protéine de 62 000 daltons, il est possible que l'impossibilité d'observer une relation dose-effet pour la protéine de 62 000 daltons soit due aux conditions expérimentales ; par exemple la durée du

marquage est trop courte par rapport au temps nécessaire pour la transformation de la protéine de 72 000 daltons en protéine de 62 000 daltons.

Dans les expériences de la figure 21, les immuno- précipitations sont effectuées en présence ou en l'absence de 10 μg de facteur IX sous forme d'immunocompétiteur. Le résultat démontre que la protéine de 62 000 daltons est spécifiquement immunocompétitive avec le facteur IX natif.

Une compétition légère de la protéine de 72 000 daltons est observée, mais les résultats sont beaucoup moins nets.

Légendes de la figure 21 : ligne 1: extrait de cellule LMTK, ligne 2: extrait de cellule LMTK co-transformée avec pTK et pTG3l7, ligne 3: cellule 3T3 ligne 4: cellule 3T3 transformée par un plasmide, ligne 5: marqueur de poids moléculaire, lignes 6 et 7: 3T3.317.7,

Les lignes 1 à 4, 6 et 7 sont immunoprécipitées avec un anti-sérum de lapin anti-facteur IX natif. L'immuno¬ précipitation dans la ligne 7 est effectuée en présence de 10 μg de facteur IX natif comme compétiteur. La flèche indique la position de la protéine de 62 000 daltons.

De façon à déterminer si la protéine de 62 000 daltons est une glycoprotéine comme cela est suggéré par une nature diffuse sur gel de polyacrylamide SDS et par sa fixation par la Sepharose ConA, les cellules sont mises en incubation pendant une nuit en présence de 3H-mannose, 3H-galactose et 3H-glucosamine. L'incorporation de ces

précurseurs radioactifs dans une protéine constitue une indication de l'attachement d'une chaîne de carbohydrate. Les protéines marquées sont alors analysées par immuno¬ précipitation avec un anti-sérum de lapin anti-facteur IX natif.

Comme cela ressort de la figure 22, la protéine de 62 000 daltons est marquée dans ces conditions, ce qui confirme la présence d'une chaîne de carbohydrate attachée. La légende de la figure 22 est la suivante: lignes 1 à 7: comme pour la figure 2Q, lignes 8, 9 et 10: cellule marquée avec 3H-mannose,

3H-galactose et 3H-glucosamine. ligne 8: cellule 3T3 - ligne 9: cellule 3T3 transformée avec pMOP, ligne 10: 3T3.317.1.

Conclusions, le facteur IX a été exprimé dans E.co Saccharomyces cerevisiae et les lignées cellulaires 3T3 et LMTK. Dans E. coli la taille de la protéine du facteur IX produite (47 000 daltons) correspond à celle du polypeptide mature moins la séquence signal et la pré-protéine.

La détermination de la séquence d'amino-acides de l'extrémité N terminale de la protéine produite bacté- riennement peut être utilisée pour déterminer si tel est bien le cas.

Compte tenu des modifications post-traduction- nelles spécifiques nécessaires pour l'activité du facteur IX, il convient d'envisager la modification du produit bactérien de façon à pouvoir au moins le carboxyler, par exemple en utilisant des préparations de membranes microsomales eucaryotiques (par exemple de foie, de rate ou de rein) .

Dans les levures, la taille du produit de facteur IX (57 000 daltons) est nettement plus grande que celui produit dans E. coli. Ceci peut être du à la glycosylation du facteur IX dans les levures.

Dans les cellules eucaryotiques, deux protéines à 62 000 daltons et à 72 000 daltons immunoprécipitent spécifiquement avec un anti-sérum de lapin anti-facteur IX natif. Une relation de type précurseur-produit peut exister entre ces protéines.

La nature diffuse de la protéine de 62 000 dalton sur gel de polyacrylamide SDN, sa fixation sur la sepharose ConA et l'incorporation de précurseurs radioactifs qui marquent les glycoprotéines dans ces protéines, indiquent largement que la protéine de 62 000 daltons est la forme glycosylée du facteur IX.

Pour une activité biologique, 12 substituants d'acide glutamique à l'extrémité N terminale du facteur IX doivent être *-carboxylés. Le système enzymatique qui produit cette modification est délicat à manipuler et l'on espère que les lignées cellulaires qui exprimeront couram¬ ment le facteur IX effectueront elles-mêmes cette modifi¬ cation. Une étude préliminaire qui démontre que 100 % de l'antigène de facteur IX présent dans la lignée 3T3.317. absorbe le citrate de baryum (une propriété physico-chimiqu

des facteurs de coagulation dépendant de la vitamine K dont on pense qu'elle est en partie due à la présence d'acide îT-carboxygluta ique) , indique que la modification correcte intervient effectivement. Les souches suivantes ont été déposées à la

Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur-Roux, Paris 15ème le 30 avril 1985 :

E. coli comportant le plasmide pTG320, sous le n° 1-444 Ξ. coli comportant le plasmide pTG318, sous le n° 1-443

E. coli comportant le plasmide pTG325, sous le n° 1-445

TABLEAU I

Antigène Activit

Echantillon Plasmide FIX-Ag FIX:C (%) (%)

Levure contrôle cellule homog. pTG834 0,0064 0,05

Levure FIX cellule homog. pTG3l8 0,238 0,05

Levure contrôle culture sup. pTG834 0,0098 0,022

Levure FIX culture sup. PTG318 0,0061 0,02

E. coli contrôle homog. 30° pTG951 0,0405 0,02

E. coli contrôle homog. 37° pTG951 0,0422 0,02

E. coli FIX homog. 30° pTG320 0,328 0,08

E. coli FIX homog. 37° pTG320 1,37 0,01

3T3 contrôle culture sup. — 0,010 9,5

3T3-317 culture sup. pTG3l7 0,256 9,1

3T3-317 clone 7 pTG3l7 0,036 10,7

3T3-317 clone 1 PTG317 0,255 10,0

3T3-317 clone 9 pTG3l7 0,010 8,8

3T3-317 clone 4 ^' PTG317 0,0743 9,4

3T3 contrôle culture sup. — 0,008 5,7

3T3-317-1 PTG317 0,45 5,0

3T3 contrôle culture homog. - 0,004 12,5

3T3-317-1 PTG317 1,4 0,3

3T3 contrôle culture BaCl2 ppt. - 0,0075 3,15

3T3-317-1 culture BaCl2 ppt. pTG317 1,4 1,7

3T3 contrôle culture sup. précipité avec BaCl2 0,005 0,4 3T3-317-1 culture sup. précipité avec BaCl2 PTG317 0,09 26 T3 contrôle culture homog. - 0,017 30,26 T3-317-1 PTG317 1,41 0,4 T3 contrôle culture sup. - 0,027 6,5 T3-317-1 culture su . PTG317 0,37 7 T3-325 clone 1 culture sup, pTG325 0,269 8 T3-325 clone 2 culture sup, ρTG325 0,213 8 T3-325 clone 3 culture sup, pTG325 0,202 10 T3-325 clone 4 culture sup. pTG325 0,115 9,5 T3-325 clone 5 culture sup. pTG325 0,125 0,65

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