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| 权 利 要 求 书 1、 一种长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐， 其中所述的长春碱类二肽衍生物 选自如下所示的 BX-CCXJ、 BX-CCJ、 BX-CCRB或 BX-CCFN: BX-CCRB BX-CCFN 其中， Z-GP-表示具有如下结构的苄氧羰基甘氨酰脯氨酰基： 2、 权利要求 1所述的长春碱类二肽衍生物的制备方法， 其包括如下歩骤： ( 1 ) 将长春碱类化合物或其盐与水合肼反应得肼解长春碱类化合物； (2)将肼解长春碱类化合物与苄氧羰基甘氨酰脯氨酸在缩合剂作用下反应得所述的长 春碱类二肽衍生物； 其中， 所述的长春碱类化合物选自长春新碱、 长春碱、 长春瑞滨、 长春氟宁或其盐； 所述的肼解长春碱类化合物选自如下所示的 JJ-CCXJ、 JJ-CCJ、 JJ-CCRB或 JJ-CCFN: JJ-CCRB JJ-CCFN 、 根据权利要求 2所述的制备方法， 其中所述的缩合剂选自氯甲酸乙酯、 1-乙基 -(3-二 甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、 N， -二异丙基碳二亚胺、 六氟磷酸苯并三唑 -1- 基-氧基三吡咯垸基磷和 1-氯 2-三甲基丙烯胺中的一种或几种的混合。 、 一种肼解长春碱类化合物或其生理上可接受的盐， 其中所述的肼解长春碱类化合物 为如下所示的 JJ-CCXJ或 JJ- CCFN: JJ-CCXJ JJ-CCFN 长春碱类衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用， 所述的长春碱类衍生物为肼解长春碱 类化合物、 长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受的盐； 其中， 所述的肼解长春碱 类化合物如权利要求 4所述的肼解长春碱类化合物； 所述的长春碱类二肽衍生物如 权利要求 1所述的长春碱类二肽衍生物； 优选地， 所述的肿瘤为胃癌、 肺癌、 鼻咽 癌、 乳腺癌、 肠癌、 肝癌、 白血病、 淋巴瘤、 前列腺癌、 宫颈癌、 黑色素瘤、 卵巢 癌、 神经母细胞瘤、 鼻咽癌、 肾母细胞瘤或多药耐药性肿瘤。 、 根据权利要求 5所述的应用， 其中如权利要求 1所述的长春碱类二肽衍生物或其生 理上可接受的盐在制备作为肿瘤间质成纤细胞激活蛋白酶 a (FAPa) 特异性水解底 物的药物中的用途。 、 长春碱类衍生物在制备预防或治疗糖尿病性视网膜病变或类风湿关节炎药物中的应 用， 所述的长春碱类衍生物为肼解长春碱类化合物、 长春碱类二肽衍生物或其生理 上可接受的盐，其中，所述的肼解长春碱类化合物选自 JJ-CCFN、 JJ-CCJ, JJ-CCRB JJ-CCXJ或其生理上可接受的盐， 所述的长春碱类二肽衍生物如权利要求 1所述的 长春碱类二肽衍生物。 、 长春碱类衍生物在制备用作血管生成抑制剂或者血管阻断剂的药物中的应用， 所述 的长春碱类衍生物选自 JJ-CCFN、 JJ-CCJ、 JJ-CCRB, JJ-CCXJ ^ BX-CCJ, BX-CCFN、 BX-CCRB、 BX-CCXJ或其生理上可接受的盐。 、 根据权利要求 1一 8中任一项， 其中所述的生理上可接受的盐选自盐酸盐、 硫酸盐、 醋酸盐、 酒石酸盐或柠檬酸盐。 0、 一种药物组合物， 包含如权利要求 1所述的长春碱类二肽衍生物或其生理上可接受 的盐或者如权利要求 4所述的肼解长春碱类化合物或其生理上可接受的盐。 |
本发明提供一类新的长春碱类衍生物及其制备 方法和新应用。 属于医药领域。
背景技术 说 血管生成是一个各方面严格调节的过程， 在成熟的哺乳动物机体中， 生理性的血管仅 发生在卵巢、 子宫和胎盘中， 而在其他组织中血管生成后即保持高度的稳定 性， 受到许多 正、 负性调节因子的调控， 从而保持动态平衡状态； 病理性的血管生成包括伤口愈合和恶 书
性肿瘤、糖尿病性视网膜病变以及类风湿关 节炎等一系列疾病过程（Peter B, et al. Curr Opin Genet Dev, 2005, 15: 102-111 )。
20世纪 70年代初， Judah Folkman 首先提出， 恶性肿瘤的生长、 迁移都与肿瘤血管的 生成密切相关， 大多数的肿瘤在生长到直径为 2〜3 mm时就需要新生血管以供给养分及氧 气 （Folkman J. N EMg/ JM ， 1971 , 285: 1182-1186 ) ; 与肿瘤组织比较， 正常组织的血管内 皮细胞处于静息状态， 血管成熟而稳定； 而肿瘤组织的血管细胞具有迅速增殖、 血管分级 不规则、 网络混乱等特点 (Dietmar W, et al. Cancer Treat Rev, 2011 , 37: 63-74)。 因此， 肿瘤的 血管系统成为一个非常重要的治疗靶点。 目前大多数文献趋于将血管靶向剂分为血管生 成 抑制齐 lJ(anti-angiogenic drugs或 angiogenesis inhibitors, Als)禾口血管阻断齐 U(vascular disrupting agents, VDAs) ( Patherson DM, et al. Clin Oncol (R Coll Radiol), 2007, 19: 443-456)。 Als主 要通过抑制基质降解、抑制血管生成因子活化 以及影响肿瘤血管内皮细胞增殖（Folkman J. Nat Rev Drug Discov. 2007, 6: 273-286 ) 等方式抑制肿瘤的血管新生。 大量临床数据证实， Als通过抑制血管的生成可有效地抑制肿瘤的恶 化， 减少肿瘤转移的发生 (Gasparini G, et al. Nat Clin Pract Oncol. 2005, 2: 562-577)； 而 VDAs则可以快速、 广泛地破坏已形成的肿瘤血 管，导致肿瘤内部缺血而大面积坏死，从而抑 制肿瘤的生长（ Philip ET. Clin Cancer Res, 2004, 10: 415-427 )。 因此， 抑制肿瘤血管生成以及破坏已形成的肿瘤血管 己成为抗肿瘤药物研发 的有效策略。
糖尿病性视网膜病变是一种严重的糖尿病并发 症， 严重影响糖尿病患者的生活质量 ( Malone JI, et al. Diabetes Care, 2001 , 24: 522-526; Ramavat PR, et al. J Clin Diagn Res, 2013, 7: 1387-1390)。 虽然目前关于糖尿病性视网膜病变的确切发病 机制还不完全清楚， 有研究 认为视网膜新生血管的形成参与了该病变的进 程 （Jae SY, et al. Diabetes Metab J, 2013, 37: 262-269)。 近年来， 临床上发现， 贝伐单抗作为 VEGF (血管内皮生长因子）受体拮抗剂可 用于治疗糖尿病性视网膜病变患者视网膜血管 的生成，并取得了一定的疗效（Zhao LQ, et al. Br J Ophthalmol, 2011 , 95: 1216-1222 )。 然而， VEGF受体拮抗剂并不能完全抑制糖尿病性 视网膜病变患者视网膜血管的生成 （Watanabe D, et al. N Engl J Med, 2005, 353: 782-792)。 可见， 寻找更加有效的抑制糖尿病性视网膜病变的药 物具有重要意义。
另一方面， 类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病， 以慢性滑膜炎合并侵蚀软骨， 最 终导致骨与关节破坏为特征的难治性疾病。类 风湿性关节炎的发病机制至今尚未完全阐明， 也无特效疗法。 有文献报道， 滑膜血管生成伴随炎性细胞浸润是类风湿性关 节炎血管翳形 成及关节破坏的重要病理特征 （Liot6 F. Rev Prat, 1993, 43: 2239-2245; Roccaro AM, et al. Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 4: 27-30; Hirohats S, et al. Lancet, 1999, 353: 1331-1334)。抑制类风湿性关节炎病人的滑膜血 生成巳成为当前类风湿性关节炎的有 效治疗策略之一。
长春碱类化合物包括从夹竹桃科植物长春花中 分离得到的长春碱和长春新碱及其衍生 物长春瑞滨和长春氟宁， 它们都属于双吲哚生物碱。 长春碱 （VLB ) 和长春新碱 （VCR) 是天然来源的双吲哚生物碱（Beer MT. Br Emp Cancer Campaign, 1955, 33: 487-489; Gorman M, et al. J Am Chem Soc, 1959, 81 : 4745-4746)。 药理作用研究表明， 长春碱及其类似物或者 衍生物属于细胞毒性药物， 主要抑制微管蛋白的聚合， 妨碍纺锤体微管的形成， 使细胞核 分裂被阻滞于中期 （Olmsted J B, et al. Annu Rev Biochem, \ 973, 42: 507-509)。 长春碱及其衍 生物具有广谱的抗肿瘤活性， 临床上主要用于治疗何杰金氏病、 绒毛膜上皮癌， 对急性白 血病、乳腺癌、卵巢癌、睾丸癌、头颈部癌、 口咽部癌、单核细胞白血病均有一定疗效（Wil son L. Ann NY Acad Sci US A , 1975, 253: 213-214 ) .近年来， Angelo Vacca等人研究发现， 非毒剂 量下长春碱可在细胞水平显著抑制血管的新生 （Angelo V, et al. Blood, 1999, 94: 4143-4155)； Giannoula Klement等人研究表明， 持续给予低剂量的长春碱可抑制肿瘤血管 的新生 （Giannoula K, et al. J /m Invest, 2000, 105: R15-24); James Moore等人证实长春新碱 能够抑制肿瘤新生血管的生长 （James M， et al. J Pe atr rg, 2001 , 36: 1273-1276); 另一方 面， Anna Kruczynskia等人研究发现， 长春氟宁可抑制肿瘤血管生成， 同时破坏已生成的 肿瘤血管， 对实验性恶性肿瘤转移也有显著的抑制作用 （Anna K， et al. Eur J Cancer, 2006, 42: 2821 -2832)。 然而， 长春碱类化合物在糖尿病视网膜病变以及类风 湿性关节炎等方面的 应用和研究尚未见报道。
与许多临床使用的化疗药物一样， 长春碱类药物在疾病治疗过程中也出现许多严 重的 副作用， 例如骨髓抑制、 肌痛、 恶性呕吐等不良反应 (Magnus P, et al. J Am Chem Soc, 1987,
109: 7929-7930 ) , 极大限制了其在临床上的应用。 降低该类药物毒副作用的有效途径之一 是对药物进行结构修饰， 使之成为前体药物， 利用病灶组织与正常组织之间分子生物学上 的差异， 选择性作用于病灶靶细胞的基因、 酶、 信号传导因子等， 从而达到靶向治疗的目 的。 近年来大量研究表明， 成纤维细胞激活蛋白酶 a ( Fibroblast- activation protein a, FAPa ) 特异性表达于伤愈组织和 90%以上的肿瘤组织激活的成纤维细胞与周细胞 表面 (Teresa RM, et al. Oncogene, 2004, 23: 5435-5446)， 同时亦表达于骨关节炎的软骨细胞表面 (Jennifer MM, et al. Arthritis Res Ther, 2006, 8: R23), 在玻璃体视网膜病变组织的肌成纤维细胞表面 也显著 地高表达 （Jennifer MM, et al. Acta Ophthalmol, 2011 , 89: 115-121)。 综上所述， 本发明将长 春碱类化合物经化学修饰形成 FAPot酶激活式前药， 以期达到靶向、 减毒和增效的目的。 发明内容
为了实现长春碱类药物的靶向性， 克服现有技术中该类药物具有严重毒副作用的 不足 和提高药物的疗效， 本发明提供了一类新的长春碱类衍生物 （包括肼解长春碱类化合物以 及长春碱类二肽衍生物） 及其生理上可接受的盐， 具体的发明技术方案如下：
本发明提供了一种长春碱类二肽衍生物或其生 理上可接受的盐， 其中所述的长春碱类 二肽衍生物选自如下所示的结构，分别命名为 BX-CCXJ、BX-CCJ、BX-CCRB和 BX-CCFN。
BX-CCXJ BX-CCJ
BX-CCRB BX-CCFN 其中， Z-GP-表示 酰脯氨酰基：
本发明还提供了上述长春碱类二肽衍生物的 制备方法， 其合成路线如下 :
NH 2 NH 2 Z-GP-OH
长春碱类化合物 ► R-NHNH 2 ► Z-GP-NHNH-R
通式 ( I) 产率： 60%_95% 产率： 70% - 95% 具体包括如下步骤：
51. 将长春碱类化合物或其盐溶于有机溶剂， 加入水合肼， 氮气保护下避光加热搅拌 反应 10〜60小时； 反应温度控制在 40°C〜120°C ; 反应结束后分离纯化得肼解长春碱类化 合物 （R- NHNH 2 )。
52. 将肼解长春碱类化合物 （R- NHNH 2 )、 苄氧羰基甘氨酰脯氨酸 （Z-GP-OH) 和缩 合试剂， 在 -10°C〜50°C下避光搅拌反应； 反应完毕后加水淬灭， 分离、 纯化得长春碱类二 肽衍生物 （Z-GP- NHNH-R)。
作为一种优选方案， S1中所述的水合肼为 40 wt%〜80 wt%的水合肼； 所述长春碱类 化合物与水合肼的摩尔投料比为 1 :5〜1200。 S1中所述的有机溶剂为甲醇。
作为一种优选方案， S2 中所述的缩合试剂选自氯甲酸乙酯、 1-乙基 -(3-二甲基氨基丙 基)碳酰二亚胺盐酸盐 （EDC'HC1)、 N，A -二异丙基碳二亚胺 （DIC)、 六氟磷酸苯并三唑 -1- 基 -氧基三吡咯垸基磷 （PyBOP) 和 1-氯 -N，AT,2-三甲基丙烯胺中的一种或几种的混合
作为一种优选方案， S2中所述肼解长春碱类化合物、苄氧羰基甘氨 脯氨酸 (Z-GP-OH) 和缩合试剂的投料摩尔比为 1 :1.05〜3.0:1.05〜3.0。 其中， 所述的长春碱类化合物选自长春新碱、 长春碱、 长春氟宁、 长春瑞滨或其盐; 所述的肼解长春碱类化合物选自如下所示的 JJ-CCXJ、 JJ-CCJ, JJ-CCRB和 JJ-CCFN。
JJ-CCRB JJ-CCFN 本发明另一目的， 还提供一种肼解长春碱类化合物或其生理上可 接受的盐， 其中所述 的肼解长春碱类化合物选自如上所示 JJ-CCXJ、 JJ-CCJ JJ-CCRB禾 P JJ-CCFN。
本发明还提供了一种由上述长春碱类二肽衍生 物形成的长春碱类二肽衍生物生理上 可接受的盐及其制备方法。
作为一种优选方案， 所述的长春碱类二肽衍生物生理上可接受的盐 选自表 1中的任意 一种： 表 1 长春碱类二肽衍生物的成盐形式
ΒΧ-CCJ·硫酸盐
BX-CCXJ.硫酸盐
ΒΧ-CCRB·酒石酸盐
ΒΧ-CCFN·酒石酸盐
本发明所述的长春碱类二肽衍生物或其生理 上可接受的盐， 在药用中可以游离态形式 存在。
上述所述的长春碱二肽衍生物或其生理上可接 受的盐的制备方法， 其特征在于， 将长 春碱类二肽衍生物， 溶于含 1.05〜3.0摩尔量酸 （HA) 的有机溶剂中， 于 -10T〜 40°C温度 下搅拌反应 3〜20小时， 分离固体化合物， 洗涤， 再将固体化合物重新溶于水中， 冷冻干 燥得成品。
作为一种优选方案， 所述的酸为盐酸、 硫酸、 醋酸、 酒石酸或柠檬酸， 所述的有机溶 剂为体积比为 1 :1的甲醇和二氯甲垸溶液。
本发明还提供了上述所述的肼解长春碱类化合 物、 长春碱类二肽衍生物或其生理上可 接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用， 优选地， 所述的肿瘤为胃癌、 肺癌、 鼻咽癌、 乳腺 癌、 肠癌、 肝癌、 白血病、 淋巴瘤、 前列腺癌、 宫颈癌、 黑色素瘤、 卵巢癌、 神经母细胞 瘤、 鼻咽癌、 肾母细胞瘤或多药耐药性肿瘤。
本发明还提供了上述所述的肼解长春碱类化合 物、 长春碱类二肽衍生物或其生理上可 接受的盐在制备预防或治疗糖尿病性视网膜病 变或类风湿关节炎药物中的应用。
本发明还提供了上述所述的肼解长春碱类化合 物、 长春碱类二肽衍生物或其生理上可 接受的盐在制备血管生成抑制剂或者血管阻断 剂的药物中的应用。
本发明还提供一种药物组合物， 其包含上述所述的长春碱类二肽衍生物或其生 理上可 接受的盐或者所述的肼解长春碱类化合物或其 生理上可接受的盐。
其中， 上述所述的生理上可接受的盐， 可以选自盐酸盐、 硫酸盐、 醋酸盐、 酒石酸盐 或柠檬酸盐。
上述所述应用， 优选地， 其中所述的长春碱类二肽衍生物作为 FAPa特异性水解底物。 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果：
( 1 ) 本发明所述的长春碱类二肽衍生物能显著降低 正常细胞的毒性和体内毒性， 在 体内外能被 FAPo;酶特异性水解切除二肽部分 （Z-GP) 释放出肼解长春碱类化合物。
(2 ) 所述长春碱类衍生物能显著抑制多种肿瘤细胞 株的体外增殖以及荷瘤裸鼠体内 肿瘤的生长。
( 3 ) 本发明所述的长春碱类衍生物还具有显著的抑 制新的血管生成及破坏已形成的 新生血管的作用。
( 4 ) 本发明所述的长春碱类衍生物对 HUVECs 细胞侵袭能力、 迁移能力以及 HUVECs管腔形成具有很好抑制作用； 对眼角膜微囊袋血管生成、 滑膜血管生成以及基质 胶栓塞模型血管生成等， 具有很好抑制作用。 同时对已形成的 HUVECs管腔、 眼角膜微囊 袋血管、 滑膜血管以及基质胶栓塞血管具有破坏作用。
(5) 体内外的药效试验均显示， 本发明所述的长春碱类衍生物可应用于恶性肿 瘤、 糖 尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病的 治疗或预防。 特别地， 本发明还发现， 所述 的长春碱类衍生物在应用于恶性肿瘤、 糖尿病性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病 上， 与长春碱类化合物相比， 具有更好的药效， 并且二者药效上差别显著。
(6) 本发明的合成方法具有反应条件温和、 实验步骤简单、 收率高、 产品纯度高、 经 济实用等特点。 特别是， 本发明所述的肼解长春碱类化合物可作为所述 的长春碱类二肽衍 生物的合成中间体， 而且其本身也具有良好的生理活性， 可以作为活性成分应用于制备相 关药物。
附图说明
图 1为重组人源 FAPo对长春碱类二肽衍生物酶解效率。
图 2为肿瘤组织 FAPcc对长春碱类二肽衍生物酶解效率。
图 3为长春碱类衍生物对 HUVECs细胞侵袭能力的抑制作用。
图 4为长春碱类衍生物对 HUVECs细胞迁移能力的抑制作用。
图 5为长春碱类衍生物对 HUVECs管腔形成的抑制作用。
图 6为长春碱类衍生物对已形成 HUVECs管腔的破坏作用。
图 7为长春碱类衍生物对鸡胚尿囊膜血管生长的 制作用。
图 8为长春碱类衍生物对已形成鸡胚尿囊膜血管 破坏作用
图 9为长春碱类衍生物对大鼠胸主动脉环微血管 成的抑制作用。
图 10为长春碱类衍生物对已形成大鼠胸主动脉环 血管的破坏作用。
图 11为长春碱类衍生物对基质胶栓塞模型血管生 的抑制作用。
图 12为长春碱类衍生物对已形成基质胶栓塞模型 管的破坏作用。
图 13 为长春碱类衍生物对大鼠眼角膜微囊袋血管生 成的抑制作用。
图 14为长春碱类衍生物对已形成大鼠眼角膜微囊 血管的破坏作用。
图 15为长春碱类衍生物对 CIA小鼠滑膜血管生成的抑制作用。
图 16为长春碱类衍生物对已形成 CIA小鼠滑膜血管的破坏作用。
其中， 在图 3— 16中， *表示 P<0.05, **表示 P<0.01。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一歩详细的描述 ， 但本发明的实施方式不限于此。 实施例 1 长春碱类衍生物的制备及分离纯化 1.1.1长春碱的肼解： 称取长春碱硫酸盐 182 mg ( 0.2 mmol ) 于 35 mL厚壁耐压管中， 加入 8 mL甲醇和 0.9 mL 80%水合肼（23 mmol ) ,超声 5 min，充氮气脱除溶液中所含空气， 然后塞紧塞子，用锡纸包住避光，放入 60°C油浴锅中搅拌反应 24 h，反应完毕后加水稀释， 以二氯甲烷（DCM )萃取多次， 合并有机相， 依次用水、饱和 NaC 溶液洗涤， 无水 Na 2 S0 4 干燥后减压蒸除溶剂。 所得混合物经 RP-HPLC (反相制备高效液相色谱） 分离纯化（流动 相为 MeOH： H 2 0： Et 3 N = 70： 30： 0.005， V/V/V) , 得 116 mg浅黄色粉末状固体化合物， 收 率 76· 1 %。 Ή NMR (300 MHz, CDC1 3 ) δ: 8.19(s, 1H), 8.03( s, 1H), 7.51 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.07~7.22(m, 3H), 6.54(s, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.74-5.88(m, 2H), 4.13(m, 2H)， 3.84-4.00 (m, 3H), 3.78(s, 3H), 3.60(s, 3H), 3.45-3.56 (m, 2H)， 3.34 (d， J = 6.0 Hz, 1H), 3.29(d, J = 6.0Hz, 1H), 3.12〜3.27(m, 3H), 2.81~2.93(m, 3H), 2.78(s, 3H), 2.61 (s, 1 H), 2.39-2.54 (m, 3H)， 2.26-2.38 (m ; 2H), 1.94〜2.08(m， 2H), 1.64~1.80(m, 4H), 1.43~1.58(m, 3H), 1.32~1.45(m, 4H), 0.81~0.96(m, 6H); 13 C NMR (75 MHz, CDC1 3 ) δ: 175.3, 173.4, 158.0, 152.5, 135.0, 131.4, 130.4, 129.3, 123.9, 123.7, 122.5, 122.3, 120.0, 118.9, 118.4, 116.7, 110.5, 93.4, 84.1 , 80.5, 73.7, 69.3, 66.4, 64.0, 55.8, 55.7, 53.3, 52.4, 50.4, 50.2, 49.7, 47.7, 45.1 , 42.2, 41.0, 40.8, 38.3, 34.5, 32.8, 29.7, 22.6, 8.6, 6.9； ESI-MS (m/z): 769.9[M+H]+。 以上数据证明产物为肼解长春碱 （JJ-CCJ ) ， 结构 如下所示：
JJ-CCJ
1.1.2 长春瑞滨的肼解： 称取长春瑞滨酒石酸盐 185.6 mg ( 0.2 mmol )于 35 mL厚壁耐 压管中， 往其中加入 8 mL甲醇和 9 mL 80%水合肼（0.23 mol)， 先超声 5 min， 再充氮气脱 气， 然后塞紧塞子， 用锡纸包住避光， 放入 52°C油浴锅中搅拌反应 60h， 反应完成后加水 稀释， 以 DCM萃取多次，有机相依次用水、饱和 NaCl溶液清洗， Na 2 S0 4 干燥后移除溶剂。 经 HPLC分离纯化 （MeOH: H 2 0: Et 3 N=70: 30: 0.005， V/V/V) , 得到 89.8 mg黄色粉末状固 体化合物， 收率为 61 %。 Ή NMR (300 MHz, CDC1 3 ) δ: 8.61 (s, 1H), 8.22(br s， 1H), 8.02 (d， j =6.0Hz, 1H), 7.16~7.25(m, 2H)， 6.27(s, 1H), 6.09 (s， 1 H)， 5.79-5.92 (m, 2H)， 5.71 (d, J = 9.0Hz, ½ ffi ϊίί °( + [H+W])9'S -(z/ui) SWISS (H8 ' 00· SO '(Η3 ' 81/· 9£Ί ΧΚΖ S9 l〜Stn '(HI ' ίβ' 'Ρ)
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Z6T000/M0ZN3/X3d ■6969Ϊ/ 0Ζ OAV 1.2.1 Z-GP-NHNH-长春碱 （BX-CCJ ) 的制备： 称取 36.7 mg ( 0.12 mmol ) N-苄氧羰基 甘氨酰脯氨酸溶于 5 mL乙腈中，用胶塞密封，置冰浴中搅拌 5 min; 取 0.031 mL( 0.2 mmol ) DIC加入反应体系中， 在冰浴下搅拌反应 20 min; 另称取 76.8 mg ( 0.1 mmol ) JJ-CCJ, 溶 于 l mL DCM中， 在冰浴下缓慢滴加到上述反应液中， 逐渐升至室温， 随后在室温下继续 搅拌反应 24h。 反应完毕后加水淬灭， 以 DCM萃取多次， 合并有机相， 依次用水、 饱和 NaCl溶液洗涤， 无水 Na 2 S0 4 干燥后减压蒸除溶剂。 所得混合物经 RP-HPLC分离纯化（淋 洗剂为 MeOH： Water： Et 3 N = 70： 30： 0.005， V/V/V， 得目标化合物 86.6 mg (浅黄色粉末 状固体）， 收率 82.2% Ή NMR (300 MHz, CDC1 3 ) δ: 8.04(br, 1H)， 7.53 (d, J = 9.0 Hz IH), 7.27-7.38 (m, 5H), 7.05~7.21(m, 3H), 6.54 (s, 1H)， 6.08 (s, IH), 5.61-5.84 (m, 2H), 5.00-5.20 (m， 2H), 4.63 (d, J = 6.0Hz, IH), 3.81-4.09 (m, 4H), 3.76 (s， 3H), 3.60 (s, 3H), 3.56 (s, 2H)， 3.25-3.49 (m, 4H), 3.08-3.24 (m, 3H), 3.04 (dd, J= 6.0, 15.0 Hz, 1H)， 2.86 (s, 2H), 2.81 (s, 3H), 2.60 (s， IH), 2.37-2.54 (m, 2H)， 2.24-2.37 (m， 2H), 1.90-2.10 (m, 4H), 1.58-1.79 (m， 2H), 1.40-1.53 (m, 2H), 1.14-1.39 (m, 8H), 0.81-1.00 (m, 8H); 13 C NMR (75 MHz, CDC1 3 ) δ: 175.1 , 171.2, 169.6, 168.8， 158.0, 156.5, 152.8, 136.5, 134.9, 131.4, 130.3, 129.3, 128.4, 128.0, 124.0, 123.5, 122.4, 122.3, 119.8, 118.9， 118.3, 116.4, 110.5, 93.5, 83.4, 80.8, 73.7, 69.4, 66.8, 66.2, 63.6, 58.8， 55.8, 55.7, 53.4, 53.2, 52.4, 50.3, 49.6， 47.3, 46.3, 45.3, 44.8， 43.4, 42.3, 40.8, 38.6, 34.5， 32,7, 29.6, 29.4, 28.2, 27.4， 24.8, 14.1 , 8.7, 8.6, 6.8; ESI- MS (m/z): 1057.9[M+H] + 。 以上数 据证明产物为 Z-GP-NHNH-长春碱 （BX-CCJ ) ， 结构如下所示：
BX-CCJ
1.2.2 Z-GP-NHNH-长春瑞滨（BX- CCRB )的制备：称取 33.7 mg ( 0.11 mmol ) Z-GP-OH 溶于 5 mL 乙腈中， 用胶塞密封， 置冰浴中搅拌 5 min, 取 0.031mL ( 0.2 mmol ) DIC加入 反应体系中，在冰浴下搅拌反应 20 min，得反应液 A;另称取 73.6 mg ( 0.1 mmol ) JJ-CCRB , 溶于 l mL DCM中， 在冰浴下缓慢滴加到反应液 A中， 逐渐升至室温， 随后在室温下搅拌 反应 24h， 反应完毕后加水淬灭， 以 DCM萃取多次， 有机相依次用水、 饱和 NaCl溶液清 洗，无水 Na 2 S0 4 干燥后蒸除溶剂。经 HPLC分离纯化（MeOH： ¾0： Et 3 N = 70： 30： 0.005 , V/V/V) , 得到 80.2 mg白色粉末状固体化合物， 收率为 77%。 1H NMR (300 MHz， CDC1 3 ) δ: 8.69 (s, IH), 8.43 (br, IH), 7.84 (s, 1H)， 7.14-7.40 (m, 9H), 6.41 (s, IH), 6.32 (s, IH), 6.08 (s, IH), 5.79 (s, 2H),5.60 (d, J = 9.0Hz, IH), 5.00-5.18 (m, 2H), 4.94 (d, J = 15.0 Hz 1H)， 4.61 (s, IH), 4.46 (d, J = 12.0Hz, IH), 3.88-4.11 (m, 4H), 3.81 (s， 3H), 3.69 (s, 3H), 3.48-3.65 (m， 4H), 3.36 (m, 4H), 2.98-3.27 (m, 8H), 2.87 (m, IH), 2.83 (s, 3H), 2.67 (m, 2H), 2.52 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 2.14-2.30 (m, IH), 1.83-2.14 (m, 6H), L66〜1.81 (m， 1H)， 1.50-1.66 (m, IH), 1.30 (t, J = 9.0 Hz, 3H)， 1.09 (t, J = 9.0Hz, 3H), 0.79 (m, 3H); l3 C NMR (75 MHz, CDC1 3 ) δ: 174.4， 171.1, 170.0, 168.5, 167.9, 157.9, 156.5, 153.0, 136.4, 134.6, 134.2, 131.7, 130.2, 128.2, 128.1, 127.7, 127.6, 124.3, 123.3， 123.1 , 122.6, 122.4, 120.6, 118.5, 117.3, 110.5, 105.6, 92.8, 82.8, 80.5, 73.8, 66.4, 64.5, 58.7, 55.6, 54.3, 52.9, 52.7, 52.1, 49.9, 48.9， 46.1, 46.0, 45.1 , 44.2, 43.2, 42.8, 42.2, 38.0, 34.4, 31.5, 28.6, 27.4, 27.1 , 24.4, 11.7, 8.3, 8.1； ESI- MS (m/z): 1025.6[M+H]+。 以上数据 证明产物为 Z- GP-NHNH-长春瑞滨 （BX-CCRB ) ， 结构如下所示：
BX-CCRB
1.2.3 Z-GP-NHNH-长春新碱（BX-CCXJ)的制备：称取 137.7 mg ( 0.45 mmol )Z-GP-OH 溶于 7.5 mL 乙腈， 用胶塞密封， 置冰浴中搅拌 5 min, 取 0.09 mL ( 0.6 mmol) DIC加入反 应体系中，在冰浴下搅拌反应 20 min，得反应液 A。 另称取 339.0 mg ( 0.45 mmol ) JJ-CCXJ， 溶于 4.5 mL DCM中， 在冰浴下缓慢滴加到反应液 A中， 逐渐升至室温， 随后在室温下搅 拌反应 24小时， 反应完毕后加水淬灭， 以 DCM萃取多次， 有机相依次用水、 饱和 NaCl 溶液清洗，无水 Na 2 S0 4 干燥后蒸除溶剂。经 HPLC分离纯化（MeOH： H 2 0： Et 3 N = 80： 20： 0.005， V/V/V) , 得到 286.1 mg浅黄色粉末状固体化合物， 收率为 61%， 该化合物命名为 B。
取 l .lmol乙酸酐，加入 0.5mol甲酸，充分搅拌均匀配成 11 :5的溶液备用。称取 208 mg (0.2mmol ) 化合物 B， 溶于 3mL DCM中， 加入适量乙酸酐甲酸溶液， 在室温下搅拌反应 2小时， 反应完毕蒸除溶剂， 经 HPLC分离纯化 （MeOH: H 2 0: Et 3 N=65: 35: 0.005 )， 得到 70.3mg浅黄色粉末状固体化合物，总收率为 32.9%。 1H NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 8.50 (m, (Hi ' s )89"£ '(Η£ 's)6乙 '£ \RZ 'm)£fl7~S8'£ XUZ ^)S P~ VP 'ui)9rg~io-S '(HI 'zH0'3l=T 'P)WS '(HI 'ΖΗ0·6 Ότ=Γ 'ΡΡ)6" '(ΗΪ 's) 0·9 '(HI 's)l£'9 '(Η£ ' 8ΓΛ '(HS 'ui)8£H '(HI 'ΖΗ0'9=Γ 'Ρ)ε '(HI 's) 89 ( GD W OOe) 麵 H L °% L ^W^' 'iHW棚
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Z6T000/M0ZN3/X3d ■6969Ϊ/ 0Ζ OAV 3.51~3.65(m, 2H)， 3.31〜3.50(m, 3H), 3.26(dd, J=3.0, 15Hz， IH), 3.07-3.19(m, IH), 2.90-3.07 (m, 3H)， 2.82(s, 3H), 2.78(s, IH), 2.64(dd, J=6.0, 15.0Hz, 1H)， 2.55(s, IH), 2.33~2.49(m, 2H), 1.65~1.73(m, 2H), 1.59〜1.68(m, 3H), 1.31~1.43(m, IH), 1.20-1.3 l(m, 5H)， 1.06~1.20(m, 2H)， 0.82~0.92(m, IH), 0.80(t, J=9.0Hz, IH); 13 C NMR (75 MHz, CDC1 3 ): δ 174.6, 173.3, 171.2, 170.0, 168.6, 157.8, 156,5， 155.7, 153.0, 136.4, 134.6, 133.5, 130.3, 128.5, 128.4, 127.9, 127.8, 124.3, 122.9, 122.5, 122.4, 120.1, 118.8, 118.3, 93.1, 83.1, 80.7, 73.8, 66.7, 65.3, 58.7, 55.6, 55.3, 53.1, 52.7, 50.2, 49.5, 49.4， 49.2， 46.4, 46.3, 45.8, 45.0, 44.5, 43.3, 42.3, 38.2, 33.6, 32.0, 29.6, 28.6, 28.1, 24.7, 22.5, 8.6, 8.3； ESI-MS (m/z): 1063.4 [M+H]+。 以上数据证明产物为 Z-GP- NHNH-长春氟宁 （BX-CCFN) ， 结构如下所示：
BX-CCFN
1.3.1 8 -0】'硫酸盐的制备：将 106.0 mg(0.1 mmol)BX-CCJ溶于 12 mL含 0.01 mol/L 硫酸（0.12 mmol)的 1:1甲醇 /二氯甲垸溶液中， 于 0°C下搅拌反应 3h, 室温下减压蒸除溶 剂， 所得固体化合物用冷乙醚洗涤三次， 离心除去乙醚， 合并固体化合物， 将固体化合物 重新溶于水中， 冷冻干燥得成品 111.4 mg, 收率为 96.2%。
1.3.2 ΒΧ-CCRB·酒石酸盐的制备： 将 102.5 mg (0.1 mmol) BX-CCRB溶于 15 mL含 0.01 mol/L酒石酸 （0.15 mmol) 的 1 :1甲醇 /二氯甲垸溶液中， 于 0°C下搅拌反应 3小时， 室温下减压蒸除溶剂， 所得固体化合物用冷乙醚洗涤三次， 离心除去乙醚， 合并固体化合 物， 将固体化合物重新溶于水中， 冷冻干燥得成品 115.1 mg， 收率为 98%。
实施例 2 长春碱类衍生物的体外细胞生长抑制活性实验
实验方法： 取对数生长期的细胞（A549 (人非小细胞肺癌细胞）、 LOVO (人结肠癌细 胞）、 CNE-2 (人鼻咽癌细胞）、 HepG2 (人肝癌细胞）、 Hela (人宫颈癌细胞）、 MCF-7 (人 乳腺癌细胞）、 MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞）、 NCI-N87 (人胃癌细胞）、、 PC-3 (人前列 腺癌细胞）、 DU145 (人前列腺癌细胞）、 K562 (人白血病细胞）、 A375 (人黑色素瘤细胞）、 SH-SY5H (人神经母细胞瘤细胞）、 人早幼粒白血病细胞 （HL-60)、 BEL-7402/5-Fu (人肝 癌氟尿嘧啶耐药株） 、 HepG2/ADM (人肝癌多柔比星耐药株） 、 MCF-7/ADR (人乳腺癌 阿霉素耐药株）） 分别加入 RPMI 1640培养液适量 (胎牛血清 10%, 青霉素 100 U/mL)， 调 整细胞浓度为 5 X 10 5 个 /mL， 接种于 96孔培养板， 每孔接种肿瘤细胞悬液 100 μί。 置于 5% C0 2 培养箱中， 37 °C培养 24 h后， 加入配制好的供试药物 （对照组不加药物）， 继续 培养 72 h后，每孑 L中力口入 5 mg/mL MTT [3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 溶液 30 μί， 37 °C温孵 4 h, 弃去上清液， 每孔加入 DMSO 100 溶解形成的甲 臜 （formazan), 应用酶标仪 （Thermo产品） 于 570 nm处测 OD值。
细胞生长抑制率按如下公式计算： 翻率 ( % ) - Ι^Ι )χι 。。％
以样品浓度为横轴， 以细胞生长抑制率为纵轴绘制曲线。 根据细胞生长抑制曲线， 计 算出半数有效抑制浓度 IC 5 o值。
实验结果： 从表 2-1和 2-2中可知， 本实验所检测的长春碱类化合物、 肼解长春碱类 化合物和长春碱类二肽衍生物具有广谱抗肿瘤 活性。 在 FAPcc酶阴性表达的肿瘤细胞株上， 长春碱类化合物的细胞生长抑制活性与相应的 肼解长春碱类化合物相近， 而长春碱类化合 物及相应的肼解长春碱类化合物的细胞生长抑 制活性均优于相应的长春碱类二肽衍生物； 另一方面， 在 FAPa酶阳性表达的 LOVO细胞， 肼解长春碱类化合物的细胞生长抑制活性 与相应的长春碱类二肽衍生物几乎一致， 说明长春碱类二肽衍生物可以被 FAPc酶切，产生 相应的肼解长春碱类化合物。
表 2-1. MTT法测定长春碱类衍生物对多种肿瘤细胞的生 长抑制作用
IC 50 (nM)
肿瘤细胞
长春碱 JJ-CCJ BX-CCJ 长春瑞滨 JJ-CCRB BX-CCRB
A549 2.31±0.13 6.43±2.42 62.1 1±3.87 14.54±1.07 73.06±2.36 1 14.81±5.23
LOVO 1.20±0.24 32.92±6.39 44.79±8.15 7.86±0.16 120.54±10.33 123.07±1 1.45
CNE-2 1.03±0.07 7.14±0.16 52.67±3.01 9.03±0.35 100.38±5.90 210.32±5.78
HepG2 3.07±0.12 12.44±0.72 46.84±1.17 8.34±0.53 89.31±0.71 167.22±4.37
Hela 4.34±0.36 14.50±1.81 56.77±3.08 1 1 .38±1.04 61.32±3.12 181.53±2.36
MCF-7 3.67±1.34 23.93±3.07 107.88±4.23 49.47±2.01 121.59±5.75 237.76±8.37
DA-MB-231 0.81±0.35 5.99±3.29 64.22±4.57 39.69±5.79 100.89±7.65 180.69±8.10
NCI-N87 2.23±0.43 17.37±2.20 103.49±8.87 35.78±6.57 89.02±3.34 244.07±9.33 PC-3 1.56±0.39 6.27±0.61 71.10±1.97 23.67士 4.31 65.89±3.05 269.76±2.03
DU-145 0.78±0.31 5.33±0.60 57.30±2.07 19.90±0.57 60.44±7.01 218.74±6.29
K562 0.72±0.20 3.67±0.79 1 1.69±3.04 12.25±0.54 49.74±3.39 108.77±4.66
A375 3.24±0.39 4.56±0.57 49.54±4.53 5.64±0.95 20.37±2.85 120.35±14.51
SH-SY5H 6.13±0.51 6.24±1.31 59.83±6.42 4·78±0·84 32.94±3.27 165.74±15.62
HL-60 5.21±0.84 8.65±1.28 85.49±9.57 8.68±1.35 46.82±5.41 208.41±18.43
BEL-7402/5-Fu 25.77±3.01 80.34±7.53 179.44±8.87 36.09±4.78 143.13±8.57 325.44±1 1.74
HepG2/ADM 10.07±1.12 43.90±3.77 146.43±5.47 24.40±3.82 182.06±4.38 437.09±14.43 表 2-2. MTT法测定长春碱类衍生物对多种肿瘤细胞的生 长抑制作用
IC50 ' ： nM )
肿瘤细胞 ·
长春氟宁 JJ-CCFN BX-CCFN 长春新滅 JJ-CCXJ BX-CCXJ
A549 137.1 1±4.10 206.34±6.79 334.59±7.31 1.32±0.03 4.34±0.42 47.71±2.64
LOVO 145.78±7.21 312.84±7.64 319.78±8.51 0.74±0.09 24.30±1.09 24.90±1.78
CNE-2 67.43±3.42 198.35±7.71 309.41±5.78 1.51±0.76 8.37±2.70 40.15±2.09
HepG2 32.07±2.17 103.21±6.37 299.10±7.64 0.97±0.12 12.27±1.96 33.43±2.01
Hela 56.66±4.47 132.02±6.67 430.2±10.1 1 2.33±0.77 23.56±2.97 55.34±1.90
MCF-7 77.03±2.74 303.89±9.44 605.71±1 1.47 2.74±0.36 26.88±4.38 73.21±3.66
MDA-MB-231 61.29±7.44 332.62±12.47 614.44±9.29 1.03±0.22 7.37±1 .18 57.32±3.36
NCI-N87 57.49±3.95 132.60±6.70 430.34±10.39 0.87±0.26 10.73±1.78 43.17±3.53
PC-3 31.14±5.34 98.34±3.19 317.45±31.27 2.93±0.37 27.07±2.18 88.91±6.84
DU-145 22.31±1.67 90.75±5.45 289.43±28.77 1.17±0.31 18.44±3.67 76.90±4.55
K562 19.27±2.48 55.87±7.59 229.31±6.60 1.07±0.33 12.08±1.67 44.90±3.28
A375 39.84±5.29 132.28±9.51 528.41±34.79 0.95±0.16 15.62±2.38 54.82±8.41
SH-SY5H 52.37±6.81 159.46±20.38 459.36±13.48 1.34±0.21 18.69±2.54 61.72±6.14
HL-60 41.75±6.85 197.54±19.52 725.67±98.21 1.81±0.17 32.47±3.51 72.85±4.59
BEL-7402/5-Fu 45.66±3.98 166.48±5.77 389.64±15.70 22.69±3.37 106.44±5.87 326.45±13.32
HepG2/ADM 67.14±4.39 276.89±9.67 603.71±17.88 7.78±2.01 44.90±3.67 134.88±5.54
MCF-7/ADR 154.39±3.95 713.46±25.57 907.93±20. 18 9.67±2.20 63.23±7.74 168.80±5.67 实施例 3长春碱类衍生物对正常细胞的体外毒性实验
实验方法： 按实施例 2方法检测长春碱类化合物、 肼解长春碱类化合物和长春碱类 肽衍生物对人正常肝癌细胞 L02以及人脐静脉内皮细胞 HUVEC的体外细胞毒性。
实验结果： 肼解长春碱类化合物及长春碱类二肽衍生物对 L02和 HUVEC的细胞毒性 远小于相应的长春碱类化合物 （见表 3 )。 说明经靶向修饰后化合物的细胞毒性明显降低 。
表 3. MTT法测定长春碱类衍生物对正常细胞的毒性作 用
IC 50 (n )
药物
HUVEC L02 长春碱 0.76±0.13 0.34±0.07
JJ-CCJ 36.07±1.00 20.10±0.97
BX-CCJ 128.88±1.34 96·27±1.11
长春瑞滨 1.13±0.56 0.97±0.08
JJ-CCRB 44.02±2.27 31.46±2.29
BX-CCRB 166.64±8.87 183.12±5.51
长春氟宁 1.53±0.33 0.79±0.30
JJ-CCFN 64.43±5.04 28.87士 2.76
BX-CCFN 269.90±7.70 301.31il4.30
长春新碱 0.42±0.09 0.2U0.05
JJ-CCXJ 48.64±2.13 22.59士 2.08
BX-CCXJ 175.70±5.51 100.70±9.02 实施例 4 重组人源 FAPoc特异性酶解长春碱类二肽衍生物的实验
实验方法： HPLC色谱条件如下： 高效液相色谱仪 Agilent 1200; 色谱柱 Cosmosil C 18 反相色谱柱（4.6x250 mm 2 ， 5 μπι); 流动相 [O min, 55%甲醇和 45%水（含 2mM甲酸铵）； 10 min, 65%甲醇和 35%水 （含 2mM甲酸铵） 15 min, 75%甲醇和 25%水 （含 2mM甲 酸钹）； 30 min， 85%甲醇和 15%水（含 2mM甲酸钹）； 40 min， 85%甲醇和 15%水（含、 、 2mM甲酸铵） ]; 流速 I mL/min; 检测波长： 254 nm; 进样量 2 L。 建立长春碱类二肽衍 生物检测标准曲线方法如下： 将长春碱类二肽衍生物溶解于酶解反应缓冲液 （50 mM Tris-HCL l .O M NaCl, pH7.4)中， 设计 5个浓度梯度， 分别为 6.25、 12.5、 25、 50、 100 μΜ。 以峰面积为纵坐标 （Υ), 化合物浓度 （μΜ) 为横坐标 （X) 绘制标准曲线。 本实验重复 3 次。 将终浓度为 50 μΜ的长春碱类二肽衍生物分别孵育于含 5 | g/mL重组人源 FAPo的酶 解反应缓冲液中， 37°C水浴进行反应。 分别在 0、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12及 24 h时吸取上清， HPLC法检测酶解产物， 计算酶解率。 其中 A: BX-CCJ; B: BX-CCRB; C: BX-CCFN; D: BX-CCXJ。
实验结果： 重组人源 FAPa呈时间依赖性水解长春碱类二肽衍生物 （见图 1 )。
实施例 5 肿瘤组织中 FAPa特异性酶解长春碱类二肽衍生物实验
实验方法： 裸鼠移植瘤接种后 21天， 用 C0 2 麻醉后脱臼处死， 剥离皮下肿瘤。用生理 盐水洗净并清除脂肪组织， 滤纸吸干表面水分。 秤取约 2 g肿瘤组织， 用剪刀剪成细小组 织块， 转移至玻璃匀浆器中， 加入 10 mL酶解缓冲液匀浆。 收集匀浆液， 过 200目筛网。 精确量取 lO mL匀浆液，分别加入 10 L浓度为 50 mM的长春碱类二肽衍生物储存液，使 化合物终浓度为 50 μΜ， 37°C水浴进行反应。 分别在 0、 2、 8、 12及 24 h时吸取 2 mL匀 浆液转至 15 mL离心管中，加入 5 mL萃取剂（乙腈 /二氯乙垸 =1 : 4)，涡旋混匀 1 min， 2500 rpm离心 5 min， 取下层有机相， 于氮气下吹干， 加入 200 /iL甲醇溶解残渣， 经 0.22 μηι滤 膜出去杂质， HPLC法检测酶解产物， 计算酶解率。 其中 A: BX-CCJ; B: BX-CCRB; C: BX-CCFN; D: BX-CCXJo
实验结果： 肿瘤组织 FAPa呈时间依赖性水解长春碱类二肽衍生物 （见图 2 )。 实施例 6 长春碱类二肽衍生物的急性毒性实验
实验方法： 取体重 18〜22 g的昆明种小鼠 （购自广东省动物中心）， 随机分组， 每组
10只，腹腔注射不同剂量的 VLB (长春碱）以及长春碱类二肽衍生物， 根据小鼠存活情况， 计算半数致死剂量 LD 50 。
半数致死量按如下公式计算：
^半.数^教死W ^- (
剂里 (mg/kg、) = 小鼠一半死亡时的剂
对应小鼠的体重
实验结果：结果表明， BX-CCJ 的 LD 5 o约为 10 mg/kg， BX-CCRB的 LD 5Q 约为 12 mg/kg， BX-CCFN的 LD 5 。约为 15 mg/kg, BX-CCXJ的 LD 5Q 约为 10 mg/kg; 而 VLB在 4 mg/kg的 给药剂量下， 已观察到一半小鼠的死亡。 实施例 7 长春碱类衍生物的体内抗肿瘤实验
实验方法： 将处于对数生长期的 MDA-MB-231细胞消化， 用 PBS (磷酸盐缓冲液） 清 洗 2遍， 调整细胞密度为 l xlO 7 个， 每只 BALB/nu/nu雌性裸鼠皮下接种 0.1 mL。 待瘤块 长至 70〜100 mm 3 时，裸鼠随机分为生理盐水组（对照组）、长 春碱类化合物（VLB、 CCRB、 CCFN、 CCXJ) 以及长春碱类衍生物 JJ-CCJ、 BX-CCJ. JJ-CCRB, BX-CCRB, JJ-CCFN、 BX-CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ组， 每组 6只， 每只裸鼠分别隔天腹腔注射 1 mg/kg的上 述药物， 共给药 8次， 隔天测量裸鼠体重及肿瘤大小。 实验结束后， 处死裸鼠， 剥离瘤块 及各脏器器官。 上述试验中肿瘤体积计算公式为： V=l/2 (ab 2 )， 其中 a、 b分别表示瘤块的 长径和短径。
HepG2、 LOVO、 K562 以及 HL-60细胞裸鼠移植瘤模型的建立以及实验方法 上述 方案一致。
实验结果： 在 1 mg/kg 的给药剂量下， 长春碱类化合物以及长春碱类衍生物对 MDA-MB-23K HepG2、 LOVO、 K562 以及 HL-60细胞的裸鼠移植瘤生长均有较强的抑 制作用且效果明显 （见表 4-表 8 )。 在 1 mg/kg 的给药剂量下， 长春碱类二肽衍生物的毒性 远低于相对应的长春碱类化合物及肼解长春碱 类化合物。 与生理盐水组比较， 长春碱类二 肽衍生物组的体重、 各脏器器官无明显差异， 而相对应的长春碱类化合物及肼解长春碱类 化合物组的体重明显下降， 且出现肝脏以及脾脏等脏器的损伤。
表 4.长春碱类衍生物对 MDA-MB-231裸鼠移植瘤的抑制作用
体重 ( g )
组别 剂量 - 瘤重 ( g) 抑瘤率 （％) 给药前 给药后
生理盐水组 一 20.3±2.3 25.5士3.6 2.61±0.73 一
VLB组 1 mg/kg 20·7±1.4 18.3±2.4* 1.22±0.35 53.26**
JJ-CCJ组 1 mg/kg 20·3±0.7 16.4士 1.7* 0.32±0.03 87.74**
BX-CCJ组 1 mg/kg 19.8±1·0 21.2±2.1 0.20±0.12 92.34**
JJ-CCRB组 1 mg/kg 21.0±2.7 16.7±1.4* 0.59±0.18 77.39* **
BX-CCRB组 1 mg/kg 19.1士 1.7 20.1±0.9 0.37±0.07 85.83**
JJ-CCFN组 1 mg/kg 19.7±2.1 16.3士 0.7* 0.65±0.13 75.10**
BX-CCFN组 1 mg/kg 20.2±0.7 20.6±1.6 0.31±0.11
JJ-CCXJ组 1 mg/kg 21.1±2·5 17.3±1.2* 0.63±0.15 75.86**
BX-CCXJ组 1 mg/kg 19.5±1.4 21.9±2.9 0.23±0.09 91.18** 相比于对照组， *P<0.05 , **P<0.01
表 5.长春碱类衍生物对 HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用
体重（g)
组别 剂量 - 瘤重 (g) 抑瘤率（％)
给药前 给药后
生理盐水组 一 21.8±1.0 27.3±1.9 2.55±0.68 一
VLB组 1 mg/kg 21.9±0.7 18.2±1.8* 1.46±0.27 42.75*
JJ-CCJ组 1 mg/kg 21.7±1.2 16.1±0.3** 0.57±0.7 77.65**
BX-CCJ组 1 mg/kg 22.0±1.7 22. 1.3 0.34±0.21 86.67**
JJ-CCRB组 1 mg/kg 21.9±1.6 17.0±0.8* 0.63±0.29 75.29**
BX-CCRB组 1 mg/kg 22.2±1.5 22.6±0.5 0.37±0.09 85.49**
JJ-CCF 组 1 mg/kg 22.3±1.7 16.5±0.4** 0.62士 0.19 75.69**
BX-CCFN组 1 mg kg 21.9±1.3 22.1±1.2 0.30士 0.17 88.24** JJ-CCXJ组 lmg/kg 22.0±2.1 17.8±0.9** 0.53±0.12 79.21** BX-CCXJ组 lmg/kg 22.2士 1.2 21.9士 2.1 0.29士 0.13 88.63**
相比于对照组， *P<0.05， **P<0.01
表 6.长春碱类衍生物对 LOVO裸鼠移植瘤的抑制作用
体重（g)
组别 剂量 一 瘤重 (g) 抑瘤率（％) 给药前 给药后
生理盐水组 ― 22.9±0.9 26.2±1.0 2.87±0.47 一
VLB组 lmg/kg 23.1±1.4 19.6±1.5* 1.59±0.51 44.60*
JJ-CCJ组 lmg/kg 22.8±1.7 17.3±1.2** 0.64±0.21 77.71**
BX-CCJ组 lmg/kg 23.8±1.9 24.4士 1.6 0.43±0.38 85.02**
JJ-CCRB组 lmg/kg 23.2±2.1 16.4±0.7** 0.87±0.16 69.69**
BX-CCRB组 lmg/kg 23.6±1.2 24.1±2.3 0.57士 0.23 80.14**
JJ-CCFN组 lmg/kg 22.7±1.5 18.9±2.1* 0.68士 0.13 76.31**
BX-CCFN组 lmg/kg 23.6±1.3 24.5±1.5 0.47±0.31 83.63**
JJ-CCXJ组 lmg/kg 22.9±2.3 17.5±1.3** 0.76±0.16 73.52**
BX-CCXJ组 lmg kg 23.8±1.0 24.2±1.7 0.59±0.33 79.45** 相比于对照组， *P<0.05 , **P<0.01
表 7. 长春碱类衍生物对 K562裸鼠移植瘤的抑制作用
体重 (g)
组别 剂量 瘤重 (g) 抑瘤率（％) 给药前 给药后
生理盐水组 一 21.8±1.1 25.5±1.7 1.68±0.32 一
VLB组 lmg/kg 21.9±0.7 17.4士 0.4* 0.86士 0.10 49.81*
JJ-CCJ组 lmg kg 22.1±1.9 16.5±0.8** 0.53±0.19 68.45**
BX-CCJ组 lmg/kg 22.3±1.0 23. 1.4 0.39士 0.27 76.79**
JJ-CCRB组 lmg/kg 21.8±1.4 18.2±0.5* 0.68±0.20 59.52**
BX-CCRB组 lmg/kg 22.1±0.5 23.4±1.2 0.46±0.29 72.62**
JJ-CCFN组 lmg/kg 21.5士2.1 17.4±0.9* 0.71±0.21 57.74**
BX-CCFN组 lmg/kg 22.9±1·3 23.0±0.8 0.57±0.13 66.08**
JJ-CCXJ组 lmg/kg 22.4±1.7 17.1±0.3** 0.67±0.22 60.12**
BX-CCXJ组 lmg kg 21.2±0.9 22.5±1.1 0.42±0.14 75.00** 相比于对照组， *P<0.05 , **P<0.01
表 8.长春碱类衍生物对 HL-60裸鼠移植瘤的抑制作用
体重 (g)
组别 剂量 - 瘤重 (g) 抑瘤率（％) 给药前 给药后
生理盐水组 一 19.9±1.8 22.7士 1.6 2.08±0.38 一
VLB组 lmg/kg 19.4±1.0 16.2±0.7* 0.98±0.25 52.89**
JJ-CCJ组 lmg/kg 20.1±1.7 16.1±0.4* 0.64±0.17 69.23**
BX-CCJ组 lmg/kg 18.8土 1.1 20.1±1.0 0.41±0.19 81.29**
JJ-CCRB组 lmg/kg 19.5±1.3 17.1±0.3* 0.72±0.21 65.38**
BX-CCRB组 lmg/kg 19.0士 1.2 19.2±1.3 0.53±0.28 74.52** JJ-CCFN组 lmg/kg 19.2士1.9 17.3±0.1* 0.83士 0.13 60.10**
BX- CCFN组 lmg/kg 18.7±1.4 18.6±1.4 0.61±0.35 70.68**
JJ-CCXJ组 lmg kg 19.7±1.5 16.3±0.6* 0.84±0.13 59.62**
BX-CCXJ组 lmg/kg 19.3±1.1 19.7土 0.9 0.58士 0.17 72.12**
相比于对照组， *P<0.05 , **P<0.01
实施例 8 长春碱类衍生物对人血管内皮细胞 HUVECs侵袭能力的抑制作用
实验方法： 将处于对数生长期的 HUVECs细胞消化， 离心， 计数， 以 5 x l 0 6 /mL分别接种 于铺有 Matrigd基质胶 （BD公司） 的 Transwdl 小室， 每孔 0.1 mL， 置于 5% C0 2 、 37
°C 细胞培养箱孵育 24小时后， 设立空白对照组及给药组， 给药组分别加入长春碱类化合 物以及长春碱类衍生物，药物终浓度均为 lOO pmol/L, 培养 24小时后，吸去培养液，用 PBS 清洗一次， 4%(W7i 多聚甲醛固定 15 分钟， 用吉姆萨染料着色 30分钟， PBS清洗一次， 显微镜观察并计算细胞数目。 结果如图 3。
实验结果表明， 长春碱类化合物、 肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均 具有 抑制 HUVECs细胞的侵袭作用。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类化合 物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制 HUVECs细胞的侵袭作用。
实施例 9 长春碱类衍生物对人血管内皮细胞 HUVECs迁移能力的抑制作用
实验方法：取对数生长期的 HUVECs细胞， PBS清洗离心，重悬细胞于无血清培养基中。 将 2x l0 6 个 /mL 的细胞接种于 Transwdl 小室， 每孔 100 μί， 设立空白对照组及给药组， 给 药组分别加入长春碱类化合物长春碱 （CCf)、 长春瑞滨（CCRB)、 长春氟宁（CCFN)和长 春新碱 （CCXJ) 以及长春碱类衍生物肼解长春碱 （JJ-CCJ)、 长春碱二肽 （BX- CCJ)、 胼 解长春瑞滨 （JJ-CCRB)、 长春瑞滨二肽 （BX-CCRB )、 肼解长春氟宁 （JJ-CCFN)、 长春氟 宁二肽 （BX- CCFN)、 肼解长春新碱 （JJ-CCXJ) 和长春新碱二肽 （BX-CCXJ), 药物终浓 度均为 100 pmol/L, 下室加入 700 L含 10% 新生牛血清的 1640 培养液。置 37°C、含 5% C0 2 的细胞培养箱中， 培养 24 h后， 弃去培养液， 用 4%多聚甲醛于 4°C固定 30 min， 清水缓慢清 洗两遍。 用吉姆萨染料着色 30 min后， 用棉棒将膜上的细胞擦去， 水慢清洗， 在显微镜下 观察并计算细胞数目。 结果如图 4。
实验结果： 与长春碱类化合物相比， 实施例 1所制得的长春碱类衍生物更显著地抑制 HUVECs细胞的迁移能力。 实验结果表明， 长春碱类化合物、 肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具有抑制 HUVECs细胞的迁移能力。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所 述的肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生 物更显著地抑制 HUVECs细胞的迁移能力。 实施例 10 长春碱类衍生物对人血管内皮细胞 HUVECs管腔形成的抑制作用
实验方法： 将 Matrigel 基质胶铺于预冷的 48孔板中， 每孔加 100 L， 放置于 37°C细胞培 养箱中 20 min。 待基质胶凝固后， 加入 l x l O 5 个 HUVECs细胞 /孔， 细胞培养液预先加入长 春碱类化合物以长春碱类衍生物 JJ-CCJ、 BX-CCJ、 JJ-CCRB , BX-CCRB , JJ-CCFN、 BX-CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ (终浓度为 100 pmol/L ) 和血管内皮生长因子 （VEGF ) (终浓度为 lOO ng/mL ) , 不加药物及 VEGF的孔作为空白对照组。 继续培养 8 h后， 在倒 置显微镜下观察管腔形成的情况并拍照。 结果如图 5。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具有 抑制 VEGF诱导的 HUVECs管腔形成。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱 类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制 VEGF诱导的 HUVECs管腔形成。
实施例 11 长春碱类衍生物对已形成 HUVECs管腔的破坏作用
实验方法： 参照文献（Zhi-Ting Deng，et al. ocAemica/ P/^mmco/ogy 2011, 82: 1832-42. )并 加以优化， 将 Matrigel 基质胶铺于预冷的 48孔板中， 每孔加 100 L, 放置于 37°C细胞培 养箱中 20 min。待基质胶凝固后，加入 l x 10 5 个 HUVECs细胞 /孔， 培养 4h后，待 HUVECs 管腔形成后， 细胞培养液换成加入长春碱类化合物以及长春 碱类衍生物 JJ-CCJ、 BX-CCJ、 JJ-CCRB, BX-CCRB. JJ-CCFN、 BX-CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ (终浓度为 100 pmol/L) 和血管内皮生长因子 （VEGF ) (终浓度为 100 ng/mL) 的培养液， 不加药物及 VEGF的孔 作为空白对照组。 继续培养 8 h后， 在倒置显微镜下观察管腔形成的情况并拍照。 结果如 图 6。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均可破 坏 VEGF诱导已形成 HUVECs管腔。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类 化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏 VEGF诱导已形成的 HUVECs管腔。
实施例 12长春碱类衍生物对鸡胚尿囊膜血管生长的抑 作用
实验方法： 参照文献 ( Cho SG, et al. Cancer Res. 2009, 69(17): 7062-7070 ) 方法， 将 60只 5 日龄种蛋随机分为 PBS组， 长春碱类化合物组以及长春碱类衍生物 JJ-CCJ组， BX-CCJ 组， JJ-CCRB组， BX-CCRB组， JJ-CCFN组， BX-CCFN组， JJ-CCXJ组以及 BX-CCXJ 组， 每组 10只。 种蛋经消毒后， 放入 37°C恒温培养箱， 气室朝上。 孵育 8天后， 用剪刀 和镊子在气室部位开窗(1. 5 (：111>< 1. 5 01^， 剥离卵壳膜， 暴露出尿囊膜。 将含药滤纸放在尿 囊膜血管较少部位。 用封口膜封好气室口， 置于孵育箱中继续孵育 1天后除去封口膜， 注 入甲醇和丙酮的混合液 室温固定 15 min。待血管凝固后， 以滤纸为中心把膜剪下， 放入盛有少量水的平皿上展开， 平铺于滤纸上， 而后将滤纸连同膜从水中取出， 采用眼科 显微镜观察实验部位边缘 5 mm范围内的血管， 计数并拍照。 结果如图 7。 实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具有 抑制鸡胚尿囊膜的血管生成。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类化合物 和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制鸡胚尿囊 膜的血管生成。
实施例 13 长春碱类衍生物对己形成鸡胚尿囊膜血管的破 坏作用
实验方法： 将 60只 5日龄种蛋随机分为长春碱类化合物组以及长 碱类衍生物 JJ-CCJ组， BX-CCJ组， JJ-CCRB组， BX-CCRB组， JJ-CCFN组， BX-CCFN组， JJ- CCXJ组以及 BX-CCXJ组， 每组 10只。 种蛋经消毒后， 放入 37Ό恒温培养箱， 气室朝上。 孵育 8天后， 用剪刀和镊子在气室部位开窗(1. 5 C m>< 1. 5 C m)， 剥离卵壳膜， 暴露出尿囊膜。 将含 VEGF ( 100 nmol) 的滤纸放在尿囊膜血管较少部位。 用封口膜封好气室口， 置于孵育箱中继续 孵育 1天后除去封口膜， 在滤纸上分别滴加长春碱类化合物以及长春碱 类衍生物 JJ-CCJ, BX-CCJ, JJ-CCRB, BX-CCRB, JJ-CCFN, BX-CCFN, JJ-CCXJ以及 BX-CCXJ各 1 nmol, 用封口膜再次封好气室口， 重新置于孵育箱中继续孵育 1天后除去封口膜， 注入甲醇和丙 酮的混合液 (1 :1, 室温固定 15 min。 待血管凝固后， 以滤纸为中心把膜剪下， 放入盛有 少量水的平皿上展开， 平铺于滤纸上， 而后将滤纸连同膜从水中取出， 采用眼科显微镜观 察实验部位边缘 5 mm范围内的血管， 计数并拍照。 结果如图 8。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均可破 坏 VEGF诱导的新生鸡胚尿囊膜血管。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱 类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏 VEGF诱导的新生鸡胚尿囊膜的血管。
实施例 14 长春碱类衍生物对大鼠动脉环微血管生成的抑 制作用
实验方法： 参照文献 ( Srinivas Reddy Boreddy, et al. PLoS One. 2011, 6(10): e25799 ) 方法， 将 100 /xL预冷溶解好的 Matrigd基质胶加到预冷的 48孔板中， 置于 37'C细胞培养箱中孵 育 30 min，使基质胶完全凝固。在此期间， SD大鼠经 C0 2 安乐死后，用 75%酒精浸泡 3 min, 在无菌操作台中将大鼠胸腔剖开， 分离胸主动脉。 分离出来的胸主动脉用 PBS清洗至无血 迹，转移至 DMEM/F12完全培养液后用剪刀和镊子剔除主动脉 围的结缔组织和脂肪组织， 然后用眼科剪将胸主动脉剪成约 1 mm长的小段， 并接种于 Matrigel上。 在血管环上再铺 上 ΙΟΟ μί预冷的 Martigel, 再置于 37°C细胞培养箱中孵育 30 min后， 设立空白对照组和给 药组， 给药组在孔里加入含有 2 nmol/L长春碱类化合物以及长春碱类衍生物 JJ- CCJ、 BX-CCJ JJ-CCRB, BX-CCRB, JJ-CCFN、 BX-CCFN, JJ-CCXJ和 BX-CCXJ的 DMEM/F12 完全培养液 （含 100 ng/mL VEGF)。 隔天换液一次， 换液四次后在倒置显微镜下拍照， 对 新生芽管进行统计。 结果如图 9。 实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具有 抑制大鼠动脉环微血管的生成。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类化合 物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制大鼠动 脉环微血管的生成。
实施例 15 长春碱类衍生物对已形成大鼠胸主动脉环微血 管的破坏作用
实验方法： 参照文献 （Deng ZT, et al. Biochemical Pharmacology 2011 , 82: 1832-42 ) 并加以 优化， 将 100 / L预冷溶解好的 Matrigel基质胶加到预冷的 48孔板中， 置于 37°C细胞培养 箱中孵育 30 min, 使基质胶完全凝固。 在此期间， SD大鼠经 C0 2 安乐死后， 用 75%酒精 浸泡 3 min, 在无菌操作台中将大鼠胸腔剖开， 分离胸主动脉。 分离出来的胸主动脉用 PBS 清洗至无血迹，转移至 DMEM/F12完全培养液后用剪刀和镊子剔除主动脉 围的结缔组织 和脂肪组织， 然后用眼科剪将胸主动脉剪成约 1 mm长的小段， 并接种于 Matrigel上。 在 血管环上再铺上 100 μ∑预冷的 Martigd, 再置于 37°C细胞培养箱中孵育 30 min后， 加入 DMEM/F12完全培养液 （含 100 ng/mL VEGF)。 隔天换液一次， 待微血管形成后， 在孔里 加入含有 2 nmol/L长春碱类化合物以及长春碱类衍生物 JJ-CCJ、 BX-CCJ、 JJ-CCRB BX-CCRB、 JJ-CCFN、 BX-CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ的 DMEM/F12完全培养液， 24h 后在倒置显微镜下拍照， 对芽管进行统计。 结果如图 10。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具可 破坏已形成的大鼠动脉环微血管。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类化 合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已形 成的大鼠动脉环微血管。
实施例 16长春碱类衍生物对基质胶栓塞模型血管生成 抑制作用
实验方法：参照文献（Nasim Akhtar, et al. Angiogenesis. 2002, 5 : 75-80 )方法，取 500 预冷的 Matrigel, 加入 500 ng VEGF和 150单位的肝素钠， 分别与长春碱类化合物以及长 春碱类衍生物 JJ-CCJ、 BX-CCJ、 JJ-CCRB、 BX-CCRB JJ-CCFN、 BX-CCFN、 JJ-CCXJ 和 BX-CCXJ按 1 : 1(Ρ7ί 比例混合，使药物终浓度为 100 pmol/L,接种于 6周龄 BALB/C nu/nu 裸鼠背侧皮下。 设立 PBS组为空白对照组， 每组 6只。 常规饲养 14天后， 裸鼠经 C0 2 安 乐死， 小心剥离 Matrigel栓塞， 马上用 4%多聚甲醛固定， 24 h后， 进行石蜡切片及 H&E 染色， 切片在倒置显微镜下观察血管形成情况并拍照 ， 进行新生血管数目统计。结果图 11。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具有 抑制基质胶栓塞模型血管的生成。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类化 合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制基质 胶栓塞模型血管的生成。
实施例 17 长春碱类衍生物对己形成基质胶栓塞模型血管 的破坏作用 实验方法： 参照文献 （Nasim Akhtar, et al. Angiogenesis. 2002, 5: 75-80) 方法并加以改 进， 取 500 μΐ预冷的 Matrigel, 加入 500 ng VEGF和 150单位的肝素钠， 接种于 6周龄 BALB/C nu/nu裸鼠背侧皮下， 一周后， 隔天尾静脉注射长春碱类化合物以及长春碱类 衍生 物 JJ- CCJ、 BX-CCJ、 JJ-CCRB, BX-CCRB, JJ-CCFN、 BX- CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ, 药物浓度均为 1 mg/kg， 设立生理盐水空白对照组， 每组 6只。 给药 7次后， 裸鼠经 C0 2 安 乐死， 小心剥离 Matrigel栓塞， 马上用 4%多聚甲醛固定， 24 h后， 进行石蜡切片及 H&E 染色， 切片在倒置显微镜下观察血管形成情况并拍照 ， 进行新生血管数目统计。结果图 12。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均可破 坏已形成的基质胶栓塞模型血管。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类化 合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已形 成的基质胶栓塞模型血管。
实施例 18 长春碱类衍生物对大鼠眼角膜微囊袋血管生成 的抑制作用
实验方法： 参照文献方法 (Yi ZF，et al. /«t J OmceK 2009， 124: 843-852) 方法， 构建大鼠眼角 膜微囊袋模型。 采用硫糖铝及 Poly-HEMA制作含 VEGF200 ng/粒的缓释微粒， SD大鼠用 2% (的戊巴比妥纳麻醉后， 将 VEGF缓释微粒注射进眼角膜微囊袋， 术后用盐酸氯霉素涂 眼。 术后次日， 将大鼠随机分组， 分成 PBS组， 长春碱类化合物组， JJ-CCJ组， BX-CCJ 组， JJ-CCRB组， BX-CCRB组， JJ-CCFN组， BX-CCFN组， JJ- CCXJ组以及 BX-CCXJ 组， 每组 10只， 给药剂量均为 1 mg/kg。 隔天尾静脉给药 1次， 给药 7次后， 在体视显微 镜下观察血管的生长情况， 并记录新生血管的长度 （VL) 和钟点数 （CN)， 如以下公式计 算血管面积： Area (mm 2 ) = 0.2 ττχ VL (mm) xCN (mm)。 结果如图 13。
实验结果表明， 长春碱类化合物、 肼解长春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物均 具有 抑制大鼠眼角膜微囊袋血管的生成。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类 化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑制大 鼠眼角膜微囊袋血管的生成。
实施例 19长春碱类衍生物对已形成大鼠眼角膜微囊袋 管的破坏作用
实验方法： 参照文献方法 (Yi ZF, et al. Int J Cancer. 2009, 124(4): 843-852) 方法并加以改进， 构建大鼠眼角膜微囊袋模型。采用硫糖铝及 Poly-HEMA制作含 VEGF200 ng/粒的缓释微粒， SD大鼠用 2% (的戊巴比妥纳麻醉后， 将 VEGF缓释微粒注射进眼角膜微囊袋， 术后用盐酸 氯霉素涂眼。 术后次円， 将大鼠随机分组， 分成 PBS组， 长春碱类化合物组， JJ- CCJ组， BX-CCJ组， JJ-CCRB组， BX-CCRB组， JJ-CCFN组， BX-CCFN组， JJ-CCXJ组以及 BX- CCXJ组， 每组 10只， 先饲养一周， 待血管生成后， 隔天尾静脉给药 1次， 给药剂量 均为 l mg/kg。 给药 7次后， 在体视显微镜下观察血管的生长情况， 并记录新生血管的长度 (VL)和钟点数（CN)，如以下公式计算血管面积 Area (mm 2 ) = 0.2χττχ VL (mm) xCN (mm)。 结果如图 14。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均可破 坏已形成的大鼠眼角膜微囊袋血管。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春碱类 化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地破坏已 形成的大鼠眼角膜微囊袋血管。
实施例 20 长春碱类衍生物对 CIA小鼠滑膜血管生成的抑制作用 实验方法： 参照文献方法（Campbell IK, et al. Eur J Immunol, 2000, 30: 1568-1575 )构建 C57 小鼠 CIA (胶原诱导性关节炎） 模型， 以每只 100 L的剂量在尾根部皮内多点激发注射含 lOO g ll型胶原的乳液。 对照组以生理盐水注射， 方法同模型组。 小鼠造模后随机分组， 每 组 10只。造模后次日，隔天经尾静脉分别注射 PBS、长春碱类化合物以及 JJ-CCJ、BX-CCJ、
JJ-CCRB. BX-CCRB, JJ-CCFN、 BX-CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ,给药剂量均为 1.0 mg/kg„ 连续给药 7次后结束实验， 小鼠经 C0 2 麻醉后处死， 剥取后腿右侧膝关节， 分离滑膜组织。
4%多聚甲醛溶液固定 24h后，按常规免疫组化方法 (Yajuan Song, et al. Angiogenesis. 2012, 15:
421~432)检测滑膜组织血管生成， 以 CD31为标记，微血管评判标准参考文献（Tatsuta M， et al. Int J Cancer, 1999， 80: 396-399)：染成棕黄色单个内皮细胞或内皮细胞 均作为一个血管 计数， 凡管腔大于 8个红细胞大小、 带有较厚肌层的血管区域的血管均不计数； 计数方法： 先用低倍镜 （xlO) 选取 3个血管密度高的区域， 再转到高倍镜 （x40 ) 下计数每个区域微 血管密度 （MVD ) 值。 结果如图 15。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均具有 抑制 CIA模型小鼠滑膜组织的血管生成。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长春 碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地抑 制 CIA模型小鼠滑膜组织的血管生成。
实施例 21 长春碱类衍生物对己形成 CIA小鼠滑膜血管的破坏作用
实验方法： 参照文献方法 （Campbell IK，et al. Ei^ J /m/mwo/. 2000， 30: 1568-1575 ) 并加以 改进构建 C57小鼠 CIA模型， 以每只 100 L的剂量在尾根部皮内多点激发注射含 100 μ& II型胶原的乳液。 对照组以生理盐水注射， 方法同模型组。 小鼠造模后随机分组， 每组 10 只。 造模后先饲养 7天， 然后隔天经尾静脉分别注射 PBS,、 长春碱类化合物以及 JJ-CCJ、 BX-CCJ、 U-CCRB, BX-CCRB, JJ-CCFN. BX-CCFN、 JJ-CCXJ和 BX-CCXJ, 给药剂量 均为 1.0 mg/kg。连续给药 7次后结束实验，小鼠经 C0 2 麻醉后处死，剥取后腿右侧膝关节， 分离滑膜组织。 4%多聚甲醛溶液固定 24h 后， 按常规免疫组化方法 (Yajuan Song, et al. ^7g 0 g e « 2012, 15: 421-432)检测滑膜组织血管生成， 以 CD31为标记， 微血管评判标准 参考文献（Tatsuta M, et al. Int. J. Cancer. 1999, 80: 396-399)： 染成棕黄色单个内皮细胞或内 皮细胞簇均作为一个血管计数， 凡管腔大于 8 个红细胞大小、 带有较厚肌层的血管区域的 血管均不计数； 计数方法： 先用低倍镜 （x lO) 选取 3个血管密度高的区域， 再转到高倍镜 (x40 ) 下计数每个区域微血管密度 （MVD ) 值。 结果如图 16。
实验结果表明， 长春碱类化合物、肼解长春碱类化合物和长春 碱类二肽衍生物均可破 坏已形成的 CIA模型小鼠滑膜组织的血管。 而且， 与长春碱类化合物相比， 所述的肼解长 春碱类化合物和长春碱类二肽衍生物更显著地 破坏已形成的 CIA 模型小鼠滑膜组织的血 管。
上述实验结果证实了本发明所述长春碱类衍生 物在体内外可应用于恶性肿瘤、糖尿病 性视网膜病变以及类风湿关节炎等疾病的治疗 和预防， 特别是所述的肼解长春碱类化合物 和长春碱类二肽衍生物具有更好地预防或治疗 恶性肿瘤、 糖尿病性视网膜病变以及类风湿 关节炎等疾病的效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的限 制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。
Next Patent: MAGNETIC HEAD FOR DETECTING MAGNETIC FIELD ON SURFACE OF MAGNETIC PATTERN BASED ON MAGNETO-RESISTANC...