La voacamine ou 12-methoxy-13- [ (3a)-17-méthoxy-17-oxovobasan-3- yl] ibogamine-18-carboxylate de méthyle, C43H52N405, dont la formule développée (I) est donnée ci-dessous. est un alcaloide bis-indolique dimère qu'on rencontre dans de nombreuses espèces du de plantes appartenant au genre Voacanga (voir par exemple US 2'823'204).

I Cet alcaloïde est connu pour son activité cytotoxique (J. Nat. Prod., 1994, 57,1517) et pour son activité anti-bactérienne tant contre les bactéries Gram + que contre les bactéries Gram- (Phytochemistry, 1984,23 1771).

L'objet de la présente invention est l'utilisation de la voacamine comme agent anti-paludéen, contre les souches de Plasmodium, notamment de Plasmodium faiciparum, y compris les souches résistantes

Le paludisme ou malaria est une maladie endémique grave qui affecte les populations des contrées tropicales et sub-tropicales et qui est véhiculée par un moustique. Le parasite est un hématozoaire du genre Plasmodium, par exemple Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae et surtout, le plus dangereux, le Plasmodium falciparum. Cette maladie est combattue par divers médicaments qui sont généralement des alcaloides quinolitiques, comme la chloroquine, ou des aminocrinodines. Malheureusement, les Plasmodium ont peu à peu acquis une résistance, en particulier à la chloroquine, et ce médicament est devenu sans effet dans de nombreuses régions du monde. On doit y substituer d'autres médicaments tels que les aminocrinodines, qui malheureusement sont toxiques.

Selon l'invention, les inventeurs ont mis en évidence l'efficacité de la voacamine contre les souches de Plasmodium, y compris celles qui sont devenues résistantes aux alcaloides quinolitiques et aux aminocrinodines, et ceci sans effet secondaire connu à ce jour. L'invention concerne donc, dans un premier aspect, la voacamine en tant qu'agent anti-paludéen.

Dans un autre aspect, I'invention concerne les agents anti-paludéens contenant de la voacamine, en particulier les extraits de plantes qui contiennent cet alcaloïde. L'invention se rapporte donc aux extraits basiques de plantes du Voacanga, mais aussi aux extraits basiques d'autres plantes contenant de la voacamine, en particulier aux extraits basiques des plantes du genre Peschiera (ou Tabernaemontana), en particulier Peschiera van heurckii, Pescheria campestris, Peschiera affinis, Peschiera laeta et plus particulièrement Peschiera Fuchsiaefolia.

Peschiera Fuchsiaefolia, une apocyancée de la sous famille des Tabernaemotanoideae, est une plante indigène de l'Amérique du Sud, en particulier du bassin amazonien. Appelée au Brésil"leitiero de vaca", c'est une mauvaise herbe infestante des pâturages, qui est traitée aux pesticides. On a rapporté récemment que des extraits de cette plante peuvent tre utilisés pour neutraliser le venin de cobra (J.

Venemous Anima Toxins 1997,3,22).

L'invention concerne donc également un extrait basique de Peschiera, en particulier de Pescheria Fuchsiaefolia et plus particulièrement encore un extrait

basique des graines, de l'écorce des tiges ou des racines de Peschiera Fuchsiaefolia, riche en alcaloides tertiaires.

On a d'ailleurs constaté, sans explication connue à ce jour, que l'extrait basique consistant en la fraction riche en alcaloides tertiaires des racines de !'écorce de Peschiera Fuchsiaefolia avait une activité supérieure à la voacamine seule, probablement par effet de synergie avec l'un ou l'autre des autres alcaloïdes présents dans cet extrait, à savoir la périvine, la 16-épi-affinise, I'affinisine, la voacamidine, la 16'-décarbomethoxyvoacamine, la Nb-déméthylvoacamine, la tabernamine, I'ervahanine A, la vobasine, la voachalotine, la heynéanine, la voacristine la conopharyngine, la coronaridine et la voacangine. de formules 11, II ou IV respectivement, données en page suivante.

La tabernamine, I'ervahanine A, la vobasine, la conopharygine, la heynéanine, la voacristaine et la coronaridine ont été pour la première fois isolés de cette plante.

Les autres alcaloïdes sont connus et leurs formules développées sont données dans The Merck Index, page 9944.

A I'aide de la voacamine ou de l'extrait basique de plantes contenant de la voacamine, il est possible de fabriquer des médicaments dans lesquels le ou les alcaloides présents, sous forme de base libre ou de sels physiologiquement acceptables, sont incorporés dans un support ou excipient pharmacologiquement acceptable.

Un autre aspect de l'invention encore est un procédé d'isolation à partir de Peschiera, en particulier de Pescheria Fuchsiaefolia, d'un extrait basique ayant des vertus anti-paludéennes, de mme qu'un procédé d'isolation de la voacamine à partir de ces mmes plantes.

L'extrait en question peut tre préparé par traitement par un acide dilué d'un broyât sec de Pescheria Fuchsiaefolia ou d'une partie de la plante seulement (écorce de racine, écorce de tige) pour en extraire les principes basique, suivi de I'alcalinisation de l'extrait aqueux ainsi obtenu à un pH de l'ordre de 9 et de 1'extraction de la fraction riche en alcaloides tertiaires avec un solvant organique, par exemple du

R R R R2 n N R R R Perivine H H COOCH3 CoHsMgO) C-epiaffinine CH3 CH20H H C20i3202 Vobastne CNCa CHg H COOCHa R1 Ici R, zu Rt R2 AfisineCH20H H CaoUziNzO Voacalotine COOCH3 CHH C21H23N2o3 R1 \ In R2 Rz H R1 3 R2 R3 Coronaridine HH CaHNzOa VoacangineOMe H H Oye H Conopharyngine OMe C23HN20a Heyneanine H H OH Voacriatine (Voacangerine)

dichlorométhane.

L'isolation de la voacamine à partir de cette fraction riche en alcaloides tertiaires est réalisée par distribution à contre-courant entre une phase aqueuse et une phase organique en faisant varier le pH de la phase aqueuse.

La voacamine, de mme que les extraits basiques la contenant, notamment les extraits de Pescheria Fuchsiaefolia, peuvent tre formulés sous forme de médicaments, selon les techniques de galénique classiques, par exemple sous forme d'injections, de sirops, de suppositoires, de tablettes ou comprimés, effervescents ou non, ou de gélules. On utilisera bien entendu des excipients et des supports pharmacologiquement acceptables, comme du sucre, du lactose, etc.

Dans ces formulations pharmaceutiques, la voacamine et les alcaloides qui éventuellement I'accompagne, pourront se trouver sous forme de bases libres ou de sels physiologiquement acceptables, comme les chlorhydrates, etc.

L'invention sera mieux comprise ne références aux exemples qui suivent, donnés à titre purement illustratif et non limitatif.

EXEMPLE 1 Le matériau de départ est de t'écorce de racine de Peschiera Fuchsiaefolia récoltée au Brésil, à Porto Alegre, qui a été identifiée localement, sur le plan botanique, par l'Industrie pharmaceutique Cibecol.

On traite 630 g du matériau végétal finement pulvérisé par extraction (3 fois successivement) avec de l'acide acétique aqueux à 2 %, on réunit les éluats qu'on alcalinise à pH 9 avec du carbonate de sodium, puis on extrait trois fois à nouveau la phase alcaline aqueuse avec du dichlorométhane.

Après réunion des phases organique et élimination du dichlorométhane, on obtient résidu (12,1 g) comprenant les alcaloides tertiaires, soit l'extrait basique désiré.

On mesure in vitro l'activité de cet extrait basique contre des souches Plasmodium falciparum, tant des souches résistances à la chloroquine (W2) que des souches sensibles à la chloroquine (D6). L'activité est évaluée en évaluant ICso

(inhibitor concentration). Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 situé après t'exempte 3.

EXEMPLE 2 On sépare les divers alcaloïdes tertiaires contenus dans 1'extrait basique de l'exemple 1 par distribution à contre-courant avec du dichlorométhane comme phase stationnaire et un tampon aqueux à pH décroissant par paliers (phase mobile).

Les alcaloïdes sont récupérés à partir de la phase aqueuse par extraction au dichlorométhane.

L'appareillage utilisé est un appareil de Craig type Post constitué de 200 tubes de verre (volumes de 10mi pour la phase inférieure et de 10ml pour la phase supérieure).

A pH 7 on obtient une première série alcaloïdes mineurs, puis à pH 5,2 sont éludées dans l'ordre la périvine (KrxKb=4. 10-9), la 16-épi-affinine (KrxKb=2, 5.10-) puis I'affinisine (KrxKb=7. 10-1°). A pH 4 sont élues la N-déméthylvoacamine (KrxKb=3- 5.10-11) et la vobasine (KrxKb=4. 10-11). A pH 3,2 sont éludées la voachalotine (KrxKb=2. 10-l') et la voacamine (KrxKb=1, 310-11). A pH 3,0 sont élues la heynéamine (KrxKb=5. 10-12) et la voacristine (KrxKb=3, 5.10-12). A pH 2,6 est éludée la conopharyngine (KrxKb=2 10-12) et enfin à pH 2,2, la coronaridine (KrxKb=8. 10 13) et la voacagine (KrxKb=6, 5.10-13). Par distribution à contre-courant dans un système bi- basique de dichlorométhane, méthanol et d'eau 7,5/2 sont obtenus des alcaloïdes quaternaires, soit la 12-méthoxy-Nb-méthylvoacalotine et la Nb-méthylaffinisine sous forme de chlorures.

Kr représente le coefficient de partition (répartition phase aqueuse/phase organique) et Kb est la constante de dissociation.

Chaque alcaloïde est purifié par un ou plusieurs nouveaux passages en recyclage dans une distribution à contre-courant, puis par cristallisation.

Les alcaloïdes ont été identifiés par 1H, 13C et spectrométrie de masse.

On procède pour la vocamine in vitro aux mesures de IC50 comme décrit à

!'exemple 1. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau récapitulatif 1 présenté plus loin. La cytotoxicité de la voacamine est la suivante : ED50 3,8 Fg/ml pour des lignées cellulaires de souris P 388 EDso 13,6 ug/ml pour les lignées cellulaires KB EXEMPLE 3 On procède comme dans l'exemple 1, mais en utilisant non pas t'écorce de racine, mais t'écorce de tige pour obtenir l'extrait basique comme décrit précédemment. Le rendement est de 1,9% Sur cet extrait, on procède in vitro aux mesures de IC50 comme décrit à l'exemple 1. Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau ci-dessus.

Tableau so Souches Souches D6 W2 ex.1 179 282 ex. 2 238 290 ex. 3 495 817 Les valeurs sont exprimées en ng/ml. Plus elles sont faibles, plus le produit est actif. On constate que la voacamine présente une remarquable activité anti- Plasmodium contre les deux types de souches (son activité étant comparable à celle de la chloroquine contre les souches sensibles D6). L'activité de 1'extrait basique d'écorce de tige de 1'exemple 3 est moindre, mais cet extrait reste néanmoins actif contre les souches de Plasmodium W2 résistantes à la chloroquine.

Le plus actif est 1'extrait basique des alcaloides tertiaires de t'exempte 1

obtenu à partir de t'écorce des racines.

EXEMPLE 4 On procède à des essais cliniques sur un groupe de 74 personnes au Mozambique, région endémique de souches de Plasmodium résistantes à la chloroquine. Ces personnes sont toutes atteintes du paludisme.

On injecte à chacune de ces personnes 4 ml de l'extrait basique de l'exemple 1 dans 100 mi de solution physiologique au niveau des 7ème, Sème ou 1 Sème vertèbre.

Après 3 heures, dans la plupart des cas, les signes cliniques du paludisme (fièvre, vomissements, diarrhées, mal aux articulations) ont disparus et après 4 h, les cultures de cellules correspondantes sont toutes négatives.

Dans 72 % des cas, les patients ont récupéré en 4 jours et 90 % des patients ont récupérés si le traitement est poursuivi pendant 3 jours consécutifs.

Quelques patients sont traités par voie orale (sirops) et par voie anale pour déceler d'éventuels effets secondaires indésirables. On en constate aucun. II s'agit ta d'une grande différence avec les effets secondaires toxiques constatée avec les médicaments usuels utilisés pour combattre le paludisme dans les régions du monde où les moustiques sont devenus résistants à la chloroquine.