Nach dem Stand der Technik, wie er von Wink et al.

(1997) in"The Analyst"122,43R-50R dargelegt wird, werden Sensoroberflächen aus Edelmetallen wie Gold, Silber, Platin, etc. häufig für elektrochemi- sche und direktoptische Sensoren verwendet. Durch Derivatisierung mit Nanoschichten werden dabei die unspezifischen Wechselwirkungen der Sensoroberflächen aus den genannten Metallen herabgesetzt und eine Matrix für die kovalente Immobilisierung von aktiven biologischen Komponenten geschaffen. Wesentlicher Bestandteil derartiger Nanoschichten sind in fast allen Fällen selbstorganisierte Monoschichten (SAM)

aus langkettigen Alkylmercaptanen, welche endständige aktivierbare Gruppen besitzen. Derartige Monoschich- ten werden auch in der EP 0 589 867 El offenbart. Da die selbstorganisierten Monoschichten den Nanorauhig- keiten der Metalloberfläche folgen, kommt es jedoch in der Regel zu punktuellen Inhomogenitäten, den sog. pinhole-defects Stelzle et al. (1993) J. Pyhs. Chem., 97,2974-2981, welche die selbstorganisierten Mono- schichten destabilisieren und außerdem Anlagerungs- stellen für unspezifische Proteinanlagerungen (NSB) bilden. Der Prozeß zur Herstellung, derartiger Be- schichtungen erfordert daher höchste Sauberkeit und liefert oft schwankende Qualitäten. Er ist daher nur schwer zu kontrollieren.

Eine weitere verbreitete Methode zur Immobilisierung von Enzymen, Zellen, etc. ist der Einschluß in quer- vernetzbare Hydrogele wie er von Fukui et al. in "Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology", Band 29, Seiten 1-33, Springer Verlag, 1984, be- schrieben wird. Um die Aktivität der biologisch ak- tiven Komponenten zu erhalten, muß dieser Vorgang so schonend wie möglich ablaufen. Herkömmlicherweise werden heutzutage verschiedene Verfahren wie Photo- crosslinking, radikalische Vernetzung, Polyanion/ Polykation-Gelbildung oder ionotrope Gelbildung zum Einschluß der biologisch aktiven Komponenten verwen- det. Diese Verfahren sind jedoch für empfindliche Enzyme und vor allem für Zellen noch immer zu rigide.

Das alternativ zur Verfügung stehende milde enzyma- tische Verfahren mittels Transglutaminase zur Immo- bilisierung von biologisch aktiven Komponenten ist jedoch sehr teuer.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Nanobeschichtung für Übergangsmetalloberflächen zur Verfügung zu stellen, deren Qualität weder durch die Topologie der Metalloberfläche noch durch Schwankun- gen der Produktionsprozeßparameter beeinflußt wird.

Als weitere Aufgabe soll ein Verfahren entwickelt werden, das eine extrem schonende Immobilisierung biologischer Komponenten ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch das Copolymer nach Anspruch 1 sowie die Verwendungen nach Anspruch 7,9 und 13 erfüllt. Vorteilhafte Weiterbildungen der erfin- dungsgemäßen Copolymere und der erfindungsgemäßen Verwendungen werden in den abhängigen Ansprüchen gegeben.

Die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Copolymere här- ten erst bei Kontakt mit Sauerstoff aus. Damit steht eine Substanz zur Verfügung, deren Verdickungswir- kung/Klebwirkung erst bei Luftkontakt einsetzt. Der- artige Stoffe sind bislang nicht bekannt. Sie eignen sich insbesondere für Schichten, die bei Biosensoren der Immobilisierung von biologisch aktiven Komponen- ten dienen sowie in allen technischen Bereichen, in denen eine sauerstoffhärtende Eigenschaft günstig ist, wie beispielsweise für Klebstoffe, für die Thixotropierung wässriger Dispersionen sowie für kos- metische Formulierungen, wie beispielsweise Haargele und dergleichen.

Das erfindungsgemäße Copolymer besitzt die allgemeine Formel (X-R) n (Y-R') m (R") p, wobei R, R'und R"sich

wiederholende Einheiten des Polymers sind mit n, m ganze Zahl und p ganze Zahl einschließlich 0 und wobei Y hydrophile und aktivierbare Gruppen und X eine Gruppe mit hoher Affinität zu Übergangsmetallen, insbesondere Edelmetallen, enthält. X enthält vor- teilhafterweise eine der folgenden Gruppen : Disulfid, Sulfid, Diselenid, Selenid, Thiol, Isonitril, Nitro, Selenol, dreiwertige Phosphorver- bindungen, Isothiocyanat, Xanthat, Thiocarbamat, Phosphin, Thiosäure oder Dithiosäure.

R, R'und R"stehen in der allgemeinen Formel für sich wiederholende Einheiten des Polymers, die vor- zugsweise hydrophil sind und R"steht für organische Reste der Gruppe X, die vorzugsweise hydrophil sind.

Mittels einer geeigneten Auswahl der Indizes n und m können die Copolymere dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden, wobei vorteilhafterweise n und/oder m > 3 sind. Eine geeignete Anpassung der Eigenschaf- ten des Copolymers an seinem Verwendungszweck kann auch über eine geeignete Wahl des Molekulargewichtes des Copolymers erfolgen.

Beaufschlagt man Übergangsmetalloberflächen mit wäs- srigen Lösungen der erfindungsgemäßen Polymere so bilden diese eine wenige Nanometer dünne homogene Monoschicht, die Oberflächenrauhigkeiten überdeckt und gegen unspezifische Proteinanlagerungen (NSB) stabilisiert. Auf dieser dünnen homogenen Monoschicht können anschließend nach Aktivierung der Gruppe Y Biomoleküle kovalent immobilisiert werden. Mit

anionischen Gruppen funktionalisierte Monoschichten sollten darüberhinaus eine gute Grundlage für unter- stützte Lipiddoppelschichten darstellen. Diese lassen sich durch calciuminduzierte Vesikelfusion auf hin- reichend glatte, negativ geladene Oberflächen auf- spreiten. Außer für sensorische Zwecke werden der- artige Schichten für Untersuchungen an biologischen Membransystemen verwendet. Für derartige Beschich- tungszwecke eignen sich insbesondere Copolymere mit einem Molekulargewicht von wenigen 10 kDa.

Ist X ein Thiol, so erhält man einen hervorragenden sauerstoffhärtenden Gelbildner. Bei längerem Stehen an der Luft führt dieses zur Oxidation der Thiole und zur Bildung von intermolekularen Disulfidbrücken.

Derartige sauerstoffhärtende Gelbildner eignen sich beispielsweise in Klebstoffen, zur Thixotropierung wässriger Dispersionen oder auch für kosmetische For- mulierungen wie Haargele, etc. Da keine weiteren Substanzen zugesetzt werden müssen und die Bedingun- gen extrem mild sind, eignen sich diese Gelbildner gut zum Einschluß empfindlicher biologischer Kom- ponenten in eine aus dem Gelbildner bestehende Gel- schicht auf dem Substrat eines Biosensors. Dies er- folgt beispielsweise indem das Copolymer und die ak- tive biologische Komponente gemischt und anschließend auf ein Substrat aufgetragen werden, woraufhin auf dem Substrat das Copolymer in Gegenwart des Luft- sauerstoffes aushärtet.

Im folgenden werden einige Beispiele der erfindungs- gemäßen Copolymere sowie ihrer Herstellung und ihrer Verwendung gegeben.

Beispiel 1 : Carboxymethyl (2-hydroxyethyl) sulfid In eine Lösung aus 50 mmol (6,95g) Bromessigsäure, 55 mmol (4,31g) Mercaptoethanol, 10 mg Natriumborhydrid und 1 g Dinatriumhydrogenphosphat in 10 ml Wasser wird unter Eiskühlung bis zur bleibenden alkalischen Reaktion 3 N wässrige KOH getropft. Bei pH 7 wird 1 h auf 60 °C nacherhitzt und anschließend mit Schwefel- säure auf pH 2 angesäuert. Nachdem das Wasser aus der Reaktionsmischung unter Vakuum abrotiert wurde, extrahiert man den farblosen Brei mit Aceton. Der Extrakt wird mit Natriumsulfat getrocknet und nach Entfernung des Trockenmittels eingeengt. Man erhält eine farblose Flüssigkeit (NMR resp. GC-MS rein).

Ausbeute : 6,41 g (94,1 % d. Th.) Beispiel 2 : Poly (ethylen-co-maleinsäure-co-maleinsäuremono (car- boxymethylethylsulfid) ester) 0,32 g (2,5 mmol Carbonsäureanhydrid) Poly (ethylen- alt-maleinsäureanhydrid) Mw = 10-15 kDa (Aldrich) werden in 10 ml Aceton gelöst, mit 3,5 mmol (0,476 g) Carboxymethyl (2-hydroxyethyl) sulfid sowie 20 yl konz. Schwefelsäure versetzt und eine Stunde reflu- xiert. Nach dem Abkühlen gibt man 20 ml Wasser dazu, dampft das Aceton unter Vakuum weitgehend ab und neutralisiert mit 3 N KOH. Die klare Lösung wird durch Dialyse entsalzt, mit 7 ml DMSO versetzt und unter Vakuum vom Wasser befreit, wobei letzte Wasser- reste mit abs. Ethanol azeotrop entfernt werden. Die erhaltene Lösung des Produkts in DMSO tropft man in

50 ml Diethylether, wäscht den Niederschlag dreimal mit demselben Lösungsmittel und trocknet schließlich im Vakuum. Ausbeute : 0,39 g weißes Pulver (59 % d. <BR> <BR> <BR> <P>Th.). Schwefelgehalt (Elementaranalyse) : 4,30 Gew. %.

Beispiel 3 : Poly (vinylalkohol-co-vinylthiol) 0,44 g Polyvinylalkohol MW 100 kDa, 86-89 % hydro- lysiert (Fluka, Buchs) (8,6-8,8 mmol-OH Gruppen) in 15 ml DMSO werden unter Eiskühlung und Rühren in eine Lösung aus 2,52 g (13 mmol) Toluolsulfonylchlo- rid und 1,81 ml (13 mmol) TEA in 10 ml DMSO getropft.

Die Temperatur wird unter Rühren langsam auf 30 °C gesteigert und eine Stunde beibehalten. Die leicht gelbliche Reaktionsmischung gibt man unter Eiskühlung in eine filtrierte Lösung aus 3,7 g (50 mmol) NaHS* H20 in 10 ml DMSO und erhitzt eine Stunde auf 50 °C.

Das Gemisch wird eingeengt, mit 30 ml Wasser auf- genommen und durch Dialyse gegen entgaste 0,01 % NaBH4 Lösung gereinigt. Das Dialysat bildet bei geringem Erwärmen an der Luft ein festes klares Gel aus, welches sich bei Erhitzen unter reduzierenden Bedingungen wieder verflüssigt. Fügt man vor dem oxidativen Aushärtungsvorgang biologisch aktive Kom- ponenten hinzu, so werden diese eingeschlossen.

Beispiel 4 : Beschichtung einer Goldoberfläche für sensorische Zwecke Ein einseitig mit Gold bedampfter Glaswafer wird 6 Stunden in einer Lösung von 0,1 % Poly (ethylen-co-

maleinsäure-co-maleinsäuremono (carboxymethyl-ethyl- sulfid) ester) (aus Beispiel 2) in Wasser geschwenkt.

Die Carboxygruppen der selbstorganisierten Mono- schicht aktiviert man eine Stunde mit einer 0,01 M N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid, 0,02 M N-Hydroxysuccinimid Lösung in 0,1 M 2-Morpholino- ethansulfonsäure Puffer pH 6,0. An diese aktivierten Schichten lassen sich auf bekannte Art und Weise Biomoleküle immobilisieren. Nach einem Blockschritt mit Ethanolamin ist die Oberfläche gegen unspezifi- schen Wechselwirkungen weitgehend stabilisiert und eignet sich beispielsweise zur Durchführung von direktoptischen Affinitätsuntersuchungen. Immobi- lisiert man auf dieser Oberfläche wasserlösliche Polymere, wie z. B. Dextrane, erhält man ebenfalls hervorragend stabilisierte zweidimensionale Hydrogele mit hoher Immobilisierungskapazität.