本発明はWNVのVLP高分泌生産のためのシグナ� ��ペプチドを提供する。該シグナルペプチド� ��、
 (a)配列番号1に示されるアミノ酸配列;
 (b)上記(a)のアミノ酸配列の部分アミノ酸配� ��であって、少なくともアミノ酸番号11~25で� �されるアミノ酸配列を含む配列;あるいは
 (c)上記(a)または(b)のアミノ酸配列と同一も� ��くは実質的に同一のアミノ酸配列からなる� ��

 ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」� ��は、上記(a)または(b)のアミノ酸配列におい� ��、1~数(2、3、4もしくは5)個のアミノ酸が置� �、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸� �列であって、WNVのネイティブなシグナル配� �と比較して、有意に高いWNVのVLPの分泌能力� �有するアミノ酸配列を意味する。

 「実質的に同一のアミノ酸配列」がアミ� ��酸の置換を含む場合、もとのアミノ酸と物� ��化学的性質において類似したアミノ酸であ� ��ことが望ましい。例えば、芳香族アミノ酸( Phe、Trp、Tyr)、脂肪族アミノ酸(Ala、Leu、Ile、V al)、極性アミノ酸(Gln、Asn)、塩基性アミノ酸( Lys、Arg、His)、酸性アミノ酸(Glu、Asp)、水酸基 を有するアミノ酸(Ser、Thr)、側鎖の小さいア� ��ノ酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)などの同じグル� �プに分類されるアミノ酸同士の置換が挙げ� �れる。このような類似アミノ酸による置換� �蛋白質の表現型に変化をもたらさない(即ち� ��保存的アミノ酸置換である)ことが予測され る。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術 分野で周知であり、種々の文献に記載されて いる(例えば、Bowieら,Science, 247:1306-1310 (1990)� ��参照)。アミノ酸(配列)が置換、欠失または� ��入されている場合、その置換、欠失または� ��入の位置は、もとのシグナルペプチドにお� ��るWNVのVLP分泌能力が実質的に保持される限� ��、特に限定されない。「実質的に保持され� ��」とは、少なくともWNVのネイティブなシグ� ��ル配列と比較して、有意に高い分泌能力を� ��持していることを意味する。

 配列番号1に示されるアミノ酸配列は、ウ エストナイルウイルスNY99-flamingo382-99株(Lanciot ti, R.S.ら, Science, 286: 2333-2337, 1999)(GenBank Ac cession No. AF196835)のポリプロテイン前駆体(Gen Bank Accession No. AAF20092.2)の99位~123位(即ち、pr M蛋白質のN末の直前のアミノ酸から上流25ア� �ノ酸残基まで)のアミノ酸配列に相当する。W NVにはこれまで多くのバリアントが報告され� ��おり、今後も新たな変異ウイルス株が続々� ��見出されるだろう。したがって、そのよう� ��他の変異WNV株における、NY99-flamingo382-99株の 上記特定配列に対応するアミノ酸配列もまた 、本発明のシグナルペプチドにおける「実質 的に同一のアミノ酸配列」に包含される。NY9 9-flamingo382-99株以外の変異WNV株としては、例� �ば、Ebel, G.D.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 71(4):� �493-500, 2004の「Table I」に記載のもの等が挙� ��られ、該表中に示される各Accession No.の配� �を入手して、対応する領域を決定すること� �より、容易に上記「実質的に同一のアミノ� �配列」を取得することができる。

 本発明のシグナルペプチドのアミノ酸配列� ��は、最短で15アミノ酸、最長で25アミノ酸で あることが望ましい。また、20アミノ酸以外� ��長さであることが好ましい。より好ましく� ��、該シグナルペプチドのアミノ酸配列長は� ��15~19または21~25アミノ酸であり、さらに好ま しくは15~18アミノ酸である。
 したがって、「実質的に同一のアミノ酸配� ��」がアミノ酸の欠失、付加もしくは挿入を� ��む場合、その数は、改変後に上記の好まし� ��全長を与える範囲内であることが望ましい� ��尚、アミノ酸を付加もしくは挿入する場合� ��付加もしくは挿入後の全長が上記の好まし� ��範囲となる限り、付加もしくは挿入される� ��ミノ酸の種類に特に制限はない。

 本発明のシグナルペプチドは、そのアミノ� ��配列情報に基づいて、公知のペプチド合成� ��、例えば、固相合成法や液相合成法によっ� ��製造することもできるが、WNVのVLPを宿主細� ��から効率よく分泌させるという該ペプチド� ��用途に鑑みれば、該ペプチドは、それをコ� ��ドする塩基配列からなる核酸を、目的のVLP� ��構成するprM蛋白質およびE蛋白質をコードす る核酸に機能的に連結した、ポリプロテイン 前駆体をコードする核酸を含む発現ベクター を導入した形質転換体を培養して、該前駆体 を生成せしめることにより、該前駆体のN末� �部分として提供される。
 したがって、本発明はまた、上記本発明の� ��グナルペプチドをコードする塩基配列から� ��質的になる、単離された核酸を提供する。� ��こで「から実質的になる」とは、該核酸がW NVのprM蛋白質およびE蛋白質をコードする核酸 に機能的に連結、さらに適当な発現ベクター 中に挿入されて、適当な宿主細胞に導入され た際に、生成するポリプロテイン前駆体のprM 蛋白質およびE蛋白質以外のN末端部分に、本� ��明のシグナルペプチドのアミノ酸配列以外� ��アミノ酸(但し、開始メチオニン残基を除く )が含まれないことを意味する。したがって� �本発明のシグナルペプチドをコードする塩� �配列以外に、該核酸に含まれ得る配列とし� �は、例えば、開始ATGコドンや、該核酸を発� �ベクターのプロモーター配列の下流、ある� �はWNVのprM蛋白質をコードする核酸の上流に� �結することを容易ならしめるための制限酵� �認識配列などが挙げられる。
 該核酸は、DNAであってもRNAであってもよく� ��あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好 ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二 本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二 本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA :RNAのハイブリッドでもよい。

 上記本発明のシグナルペプチドをコード� ��る塩基配列としては、翻訳された結果、上� ��本発明のシグナルペプチドのいずれかのア� ��ノ酸配列を生じるものであれば特に制限は� ��いが、目的とするシグナルペプチドがいず� ��かの入手可能なWNV株のポリプロテイン前駆� ��配列の一部と完全同一の場合には、該ウイ� ��ス株のゲノムRNAから調製されるcDNAを鋳型と して、該アミノ酸配列をコードする塩基配列 部分を、PCR法などにより取得することができ る。かかる方法は、シグナルペプチドだけで なく、WNVのprM蛋白質およびE蛋白質をコード� �る塩基配列を一括して取得できる点で有利� �ある。プライマー配列の選択によって、ア� �ノ酸配列長の異なるシグナルペプチドをコ� �ドする核酸を容易に調製することができる� �

 一方、宿主細胞での発現効率を考慮すれ� ��、用いる宿主細胞で使用頻度の高いコドン� ��選択することが一般的には好ましい。種々� ��生物種におけるコドン使用頻度のデータは� ��例えば(財)かずさDNA研究所のホームページ� �公開されている遺伝暗号使用頻度データベ� �ス(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)から入手� �ることができる。宿主細胞のコドン使用頻� �に合わせた塩基配列の変換は、シグナルペ� �チドをコードする核酸の全配列をDNA/RNA自動� ��成機を用いて化学合成するか、あるいは合� ��した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖� ��、PCR法を利用して接続することにより実施� ��ることができる。

 本発明はまた、上記本発明のシグナルペプ� ��ド、WNV由来のprM蛋白質およびE蛋白質をコー ドする塩基配列からなる核酸を含む、WNVのVLP 発現ベクターを提供する。
 ここで「WNVのprM蛋白質をコードする塩基配� ��」とは、配列番号3に示されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含む蛋白質をコードする塩基配列を意味し 、「WNVのE蛋白質をコードする塩基配列」と� �、配列番号5に示されるアミノ酸配列と同一� ��しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む� ��白質をコードする塩基配列を意味する。

 「配列番号3(または配列番号5)に示される アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 」としては、配列番号3(または配列番号5)に� �されるアミノ酸配列と約80%以上、好ましく� �約90%以上、さらに好ましくは約95%以上、特� �好ましくは約97%以上の相同性を有するアミ� �酸配列などが挙げられる。ここで「相同性� �とは、当該技術分野において公知の数学的� �ルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列をア� ��インさせた場合の、最適なアラインメント( 好ましくは、該アルゴリズムは最適なアライ ンメントのために配列の一方もしくは両方へ のギャップの導入を考慮し得るものである)� �おける、オーバーラップする全アミノ酸残� �に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸� �基の割合(%)を意味する。「類似アミノ酸」� �は物理化学的性質において類似したアミノ� �を意味し、例えば、本発明のシグナルペプ� �ドについて前記したと同様の分類において� �もとのアミノ酸と同じグループに分類され� �アミノ酸が挙げられる。

 本明細書におけるアミノ酸配列の相同性� ��、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National  Center for Biotechnology Information Basic Local Align ment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10; ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタ� ��ング=OFF)にて計算することができる。アミ� �酸配列の相同性を決定するための他のアル� �リズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl . Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)に記載のア� ��ゴリズム[該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLAST プログラム(version 2.0)に組み込まれている(Alt schulら, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))]� �Needlemanら, J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)に記 載のアルゴリズム[該アルゴリズムはGCGソフ� �ウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み� �まれている]、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-1 7 (1988)に記載のアルゴリズム[該アルゴリズ� �はCGC配列アラインメントソフトウェアパッ� �ージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)� ��組み込まれている]、Pearsonら, Proc. Natl. Aca d. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴ� ��ズム[該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッ ケージ中のFASTAプログラムに組み込まれてい� ��]等が挙げられ、それらも同様に好ましく用 いられ得る。

 より好ましくは、配列番号3(または配列� �号5)に示されるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列とは、配列番号3(または配列� ��号5)で表されるアミノ酸配列と約80%以上、� �ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%� �上、特に好ましくは約97%以上の同一性を有� �るアミノ酸配列である。

 「配列番号3(または配列番号5)に示されるア ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を 含む蛋白質」とは、前記の配列番号3(または� ��列番号5)に示されるアミノ酸配列と実質的� �同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号3( または配列番号5)で表されるアミノ酸配列を� ��む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋� ��質を意味する。
 「実質的に同質の活性」とは、prM蛋白質に� ��いては、M蛋白質として成熟した際にE蛋白� �のコンフォーメーション変化を引き起こす� �性などが挙げられ、E蛋白質については、感� ��宿主細胞への吸着および赤血球凝集活性な� ��が挙げられる。「実質的に同質」とは、そ� ��らの活性が定性的に同じであることを意味� ��る。したがって、上記の各活性は同等(例え ば、約0.5~約2倍)であることが好ましいが、こ れらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量 的要素は異なっていてもよい。

 また、本発明で用いられるprM蛋白質(E蛋白� �)には、例えば、(1)配列番号3(または配列番� �5)に示されるアミノ酸配列のうち1または2個� ��上(好ましくは1~30個程度、より好ましくは1~ 10個程度、いっそう好ましくは1~数(2、3、4も� ��くは5)個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配� ��、(2) 配列番号3(または配列番号5)に示され� ��アミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは1 ~30個程度、より好ましくは1~10個程度、いっ� �う好ましくは1~数(2、3、4もしくは5)個)のア� �ノ酸が付加したアミノ酸配列、(3) 配列番号 3(または配列番号5)に示されるアミノ酸配列� �1または2個以上(好ましくは1~30個程度、より� ��ましくは1~10個程度、いっそう好ましくは1~� ��(2、3、4もしくは5)個)のアミノ酸が挿入され たアミノ酸配列、(4) 配列番号3(または配列� �号5)に示されるアミノ酸配列のうち1または2� ��以上(好ましくは1~30個程度、より好ましく� �1~10個程度、いっそう好ましくは1~数(2、3、4� ��しくは5)個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置� ��されたアミノ酸配列、または(5)それらを組� ��合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質な� ��も含まれる。
 上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失ま� ��は置換されている場合、その挿入、欠失ま� ��は置換の位置は、蛋白質の活性が保持され� ��限り特に限定されない。

 WNVのprM蛋白質(またはE蛋白質)をコードす� ��DNAは、WNVのウイルスストックより調製したR NAを鋳型として用い、Reverse Transcriptase-Polymera se Chain Reaction(以下、「RT-PCR法」と略称する) によって直接増幅することができる。prM蛋白 質とE蛋白質はWNVゲノム中に連続してコード� �れており、両者のコード領域をカバーする� �基配列を増幅し得るプライマーを設計する� �とにより、prM蛋白質およびE蛋白質をコード� ��るDNAを一括調製することができる。さらに� ��該WNVゲノム中の配列を本発明のシグナルペ� ��チドをコードする塩基配列として利用する� ��合、該シグナルペプチドコード領域はprM蛋� ��質のコード領域の直前に位置するので、三� ��を一括調製することも可能である。

 prM蛋白質(またはE蛋白質)をコードするDNAと� ��ては、例えば、配列番号2(または配列番号4) に示される塩基配列を含有するDNA、または配 列番号2(または配列番号4)に示される塩基配� �の相補鎖配列とストリンジェントな条件下� �ハイブリダイズする塩基配列を含有し、前� �したprM蛋白質(またはE蛋白質)と実質的に同� �の活性を有する蛋白質をコードするDNAなど� �挙げられる。
 配列番号2(または配列番号4)に示される塩基 配列とストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号 2(または配列番号4)に示される塩基配列と約70 %以上、好ましくは約80%以上、さらに好まし� �は約90%以上、特に好ましくは約95%以上の相� �性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用� �られる。
 本明細書における塩基配列の相同性は、相� ��性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center f or Biotechnology Information Basic Local Alignment Sea rch Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャッ プを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;� ��スマッチスコア=-3)にて計算することができ る。塩基配列の相同性を決定するための他の アルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配 列の相同性計算アルゴリズムが同様に好まし く例示される。

 ハイブリダイゼーションは、自体公知の方� ��あるいはそれに準じる方法、例えば、モレ� ��ュラー・クローニング(Molecular Cloning)第2版( J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press,  1989)に記載の方法などに従って行なうことが� ��きる。また、市販のライブラリーを使用す� ��場合、ハイブリダイゼーションは、添付の� ��用説明書に記載の方法に従って行なうこと� ��できる。ハイブリダイゼーションは、好ま� ��くは、ストリンジェントな条件に従って行� ��うことができる。
 ストリンジェントな条件としては、例えば� ��6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)中45℃でのハ� ��ブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC/0.1% S DS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられ� �。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液� �塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度� �プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッ� �の数、ハイブリダイゼーション反応の時間� �洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更� �ることにより、所望のストリンジェンシー� �容易に調節することができる。

 prM蛋白質およびE蛋白質をコードするDNAは 、上記のようにWNVゲノムより取得することが できるが、化学的にDNA鎖を合成するか、もし くは合成した一部オーバーラップするオリゴ DNA短鎖を、PCR法を利用して接続することによ り、prM蛋白質およびE蛋白質の全長をコード� �るDNAを構築することも可能である。化学合� �もしくはPCR法との組み合わせで全長DNAを構� �することの利点は、上述の通り、該遺伝子� �導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝� �全長にわたり設計できる点にある。

 上記のようにしてクローン化されたDNAは� ��目的によりそのまま、または所望により制� ��酵素で消化するか、リンカーを付加した後� ��、使用することができる。シグナルペプチ� ��をコードするDNA、prM蛋白質をコードするDNA� ��E蛋白質をコードするDNAを、別個にクローン 化した場合には、適当な制限酵素、リンカー 、リガーゼ等を用いて、それらを上記の順序 で連結する。

 次いで、得られた「シグナルペプチド-prM 蛋白質-E蛋白質」ポリプロテイン前駆体をコ� ��ドするDNAは、必要に応じて、その5’末端側 に翻訳開始コドンとしてのATGを、また3’末� �側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまた� �TAGをそれぞれ導入し、制限酵素およびDNAリ� �ーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプ� �モーターの下流に連結される。翻訳開始コ� �ンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダ� �ターを用いて付加することができる。ある� �は、予めPCRを利用してシグナルペプチドを� �ードする塩基配列の5’側、およびE蛋白質を コードする塩基配列の3’側に、それぞれ導� �しておいてもよい。

 発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラ� ��ミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);枯草菌由来の プラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194);酵母由来プラ� ��ミド(例、pSH19,pSH15);昆虫細胞発現プラスミ� �(例:pFast-Bac);動物細胞発現プラスミド(例:pCAGG S 、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);λフ� ��ージなどのバクテリオファージ;バキュロウ イルスなどの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV� �AcNPV);レトロウイルス、ワクシニアウイルス� ��アデノウイルスなどの動物ウイルスベクタ� ��などが用いられる。
 プロモーターとしては、遺伝子の発現に用� ��る宿主に対応して適切なプロモーターであ� ��ばいかなるものでもよい。
 例えば、宿主が動物細胞である場合、CAGプ� ��モーター、β-アクチンプロモーター、SRαプ ロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモー� �ー、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター 、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMu LV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(� ��純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロ モーターなどが用いられる。なかでも、CAGプ ロモーターが好ましい。
 宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモ ーター、SPO2プロモーター、penPプロモーター� ��どが好ましい。
 宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、 PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモ ーターなどが好ましい。
 宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリン� ��ロモーター、P10プロモーターなどが好まし� ��。

 発現ベクターとしては、上記の他に、所望� ��よりエンハンサー、スプライシングシグナ� ��、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40� �製起点(以下、SV40 oriと略称する場合がある) などを含有しているものを用いることができ る。選択マーカーとしては、例えば、ジヒド ロ葉酸還元酵素遺伝子(以下、dhfrと略称する� ��合がある、メソトレキセート(MTX)耐性)、ア� ��ピシリン耐性遺伝子(以下、amp ^r と略称する場合がある)、ネオマイシン耐性� �伝子(以下、neo ^r と略称する場合がある、G418耐性)等が挙げら� ��る。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハム スター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカ� �として使用する場合、チミジンを含まない� �地によって目的遺伝子を選択することもで� �る。

 本発明のシグナルペプチド、prM蛋白質およ� ��E蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸 を含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得 られる形質転換体を培養することによって、 WNVのVLPを製造することができる。
 宿主としては、例えば、バチルス属菌、酵� ��、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、動物などの� ��泌発現に適したものが用いられる。
 バチルス属菌としては、例えば、バチルス� ��サブチルス(Bacillus subtilis)MI114,バチルス・� �ブチルス207-21などが用いられる。
 酵母としては、例えば、サッカロマイセス� ��セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R ^- ,NA87-11A,DKD-5D,20B-12、シゾサッカロマイセス・� ��ンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036、ピ� ��ア・パストリス(Pichia pastoris)KM71などが用い られる。

 昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNP Vの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera  frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由� ��のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five ^TM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acr ea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがB mNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化� �胞(Bombyx mori N 細胞;BmN細胞)などが用いられ る。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC  CRL1711)、Sf21細胞などが用いられる。
 昆虫としては、例えば、カイコの幼虫など� ��用いられる。

 動物細胞としては、例えば、COS-7、Vero、CHO� ��CHO(dhfr ^- )、CHO-K1、L、AtT-20、GH3、FL、HEK293、NIH3T3、Balb3 T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、P388などの細胞� ��用いられる。好ましくは、HEK293またはCHO-K1� ��どが用いられるが、それらに限定されない� ��
 動物としては、トランスジェニック系の確� ��した哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウ サギ、ヒツジ、ブタ、ウシ)もしくはニワト� �などが挙げられる。

 形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方� ��に従って実施することができる。
 バチルス属菌は、例えば、Molecular & Gene ral Genetics,168巻,111 (1979)などに記載の方法に� ��って形質転換することができる。
 酵母は、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182 -187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929 (1 978)などに記載の方法に従って形質転換する� �とができる。
 昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technolog y, 6巻,47-55 (1988)などに記載の方法に従って� �質転換することができる。
 動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細� ��工学実験プロトコール,263-267 (1995)(秀潤社� �行)、Virology,52巻,456 (1973)に記載の方法に従� �て形質転換することができる。
 動物は、例えば、トランスジェニック動物� ��開発(シーエムシー出版), (2001) に記載の方 法に従って形質転換することができる。

 形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、� ��知の方法に従って実施することができる。
 例えば、宿主がバチルス属菌である形質転� ��体を培養する場合、培養に使用される培地� ��しては液体培地が好ましい。また、培地は� ��形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源� ��無機物などを含有することが好ましい。こ� ��で、炭素源としては、例えば、グルコース� ��デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが; 窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類 、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプ トン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイ ショ抽出液などの無機または有機物質が;無� �物としては、例えば、塩化カルシウム、リ� �酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムな� �がそれぞれ挙げられる。また、培地には、� �母エキス、ビタミン類、生長促進因子など� �添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約 5~約8である。形質転換体の培養は、通常約30~ 約40℃で、約6~約24時間行なわれる。必要によ り、通気や撹拌を行ってもよい。
 宿主が酵母である形質転換体を培養する場� ��の培地としては、例えば、バークホールダ� ��(Burkholder)最小培地や0.5%カザミノ酸を含有す るSD培地などが挙げられる。培地のpHは、好� �しくは約5~約8である。培養は、通常約20~約35 ℃で、約24~約72時間行なわれる。必要に応じ� ��、通気や撹拌を行ってもよい。
 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換� ��を培養する場合の培地としては、例えばGrac e's Insect Mediumに非働化した10%ウシ血清等の� �加物を適宜加えたものなどが用いられる。� �地のpHは、好ましくは約6.2~約6.4である。培� �は、通常約27℃で、約3~約5日間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
 宿主が動物細胞である形質転換体を培養す� ��場合の培地としては、例えば、約5~約20%の� �児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM),ダルベ� �コ改変イーグル培地(DMEM),RPMI 1640培地,199培� �などが用いられる。培地のpHは、好ましくは 約6~約8である。培養は、通常約30~約40℃で、� ��15~約60時間行なわれる。必要に応じて通気� �撹拌を行ってもよい。
 宿主が動物である場合、遺伝子導入した受� ��卵から、常法に従ってトランスジェニック� ��物を得、通常の飼育条件下で飼育、哺乳動� ��の乳やニワトリの卵を採取すればよい。
 以上のようにして、形質転換体の培地もし� ��は細胞外にWNVのVLPを分泌生産せしめること� ��できる。

 また、本発明においては、上記の如く胎� ��ウシ血清を含む培地で形質転換体を培養し� ��もよいが、胎児ウシ血清に混入して細胞汚� ��の原因となるウシウイルス性下痢症ウイル� ��(BVDV)等のリスク因子の排除、WNVのVLP精製工� ��の簡略化を目的とするウシ由来タンパク質� ��の不純物の排除、及び経済性の観点から、� ��質転換体を無血清に馴化させて培養する方� ��も好ましく用いられる。また、後述する実� ��例にも記載されるように、無血清培地に馴� ��させることにより、付着性細胞から浮遊細� ��化することも、形質転換体の維持・継代お� ��び大量培養が容易となるという点で好まし� ��。

 培地中(細胞外)に分泌されたVLPの精製に� �いては、自体公知の方法に従って行うこと� �できる。例えば、回収した培地(細胞外液)を フィルター処理して低分子量蛋白質を除去し た後、ショ糖密度勾配遠心分離することによ ってVLPを調製することができる。

 本発明のWNVのワクチンは、WNVのVLPを有効成� ��として免疫を奏する量含有する。具体的に� ��、WNVのワクチンは、例えば以下のようにし� ��製造することができるが、これに限定され� ��い。
 抗原として精製した本発明のVLPを、等張の� ��類溶液、緩衝液、組織培養液などの溶媒、� ��えばPBS(phosphate buffer saline)に浮遊し、ワク� ��ン原液を調製する。必要であれば、ワクチ� ��抗原を常用の固定化剤で固定することによ� ��、その立体構造を固定化することもできる� ��固定化剤としては、例えば、ホルマリン、� ��ェノール、グルタルジアルデヒド、β‐プ� �ピオラクトン等があげられる。固定化剤は� �ワクチン原液を調製する前に抗原に添加す� �か、またはワクチン原液に添加することが� �きる。

 次に、ワクチン原液を希釈して、ワクチ� ��溶液を調製する。ワクチン原液は、例えば� ��PBSを用いて、ワクチン中の抗原量が、抗体� ��生を誘導して免疫を奏するのに必要な量、� ��えば蛋白質含量で1~20μg/ml、好ましくは10μg/ mlとなるように希釈する。ワクチン溶液を調� ��する際に、ワクチンの耐熱性を増強する安� ��化剤や、免疫原性を高める補助剤としての� ��ジュバントを添加混合してもよい。安定化� ��としては、糖類やアミノ酸類が挙げられ、� ��ジュバントとしては、鉱物油、植物油、ミ� ��ウバン、アルミニウム化合物、ベントナイ� ��、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サ� ��モシン、インターロイキン等が挙げられる� ��

 ワクチン溶液を適当な容量の容器、例え� ��約0.5~20ml容のバイアルに分注し、密栓・密� �した後に、ワクチンとして使用に供する。� �かるワクチンは、液状のみならず、分注後� �凍結乾燥を行うことにより、乾燥製剤とし� �使用に供することもできる。

 本発明のワクチンは、通常のワクチンと� ��様に被接種者に接種すればよい。例えば、1 ドーズ約0.2~0.5mlのワクチンを、約1~4週間隔で 1~3回皮下接種すればよい。尚、乾燥製剤は接 種前に滅菌蒸留水などで溶解してもとの体積 に戻して使用する。

 上記した本発明のシグナルペプチド、WNVのp rM蛋白質およびE蛋白質をコードする塩基配列 からなる核酸を含む発現ベクター(非ウイル� �ベクターおよびウイルスベクター)は、それ� ��体をヒトに投与することにより、該ヒト体� ��で効率よくWNVのVLPを分泌させ得るので、い� ��ゆるDNAワクチンとして用いることができる� ��
 これらの非ウイルスベクターおよびウイル� ��ベクターの好ましい調製法、投与法などは� ��業者に公知であり、例えば、別冊実験医学� ��遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996;別冊� �験医学、遺伝子導入&発現解析実験法、羊 土社、1997;日本遺伝子治療学会編遺伝子治療� ��発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス� ��1999などが参考とされる。DNAワクチンに適し た非ウイルスベクターとしては、例えばpcDNA3 .1、pZeoSV、pBK-CMV(Invitrogen社、Stratagene社)やpCAGG S(Gene 108,193-200(1991))などが挙げられるが、そ� ��らに限定されない。ウイルスベクターとし� ��は、組換えアデノウイルス、レトロウイル� ��等のウイルスベクターが代表的なものであ� ��。具体的には、例えば、無毒化したレトロ� ��イルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイ� ��ス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイル� ��、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シ� ��ビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免 疫不全症ウイルス(HIV)等のDNAウイルスまたはR NAウイルスを挙げることができる。

 本発明のDNAワクチンをヒトへ導入する方� ��としては、DNAワクチンを直接体内に導入す� ��in vivo法やヒトからある種の細胞を取り出� �て体外でDNAワクチンを該細胞に導入しその� �胞を体内に戻すex vivo法などがある(日本遺� �子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンド� �ック、エヌ・ティー・エス、1999)。in vivo法� ��しては、例えば本発明のDNAワクチンを適当� ��溶剤(PBS等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等 )に溶解した後、必要に応じてフィルター等� �濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填し� �注射剤を調製して、ヒトへ注射することに� �り投与される。注射剤には必要に応じて慣� �の担体等を加えてもよい。また、脂質二重� �で作られたリポソーム中にDNAワクチンを封� �し、さらにこのリポソームと不活化したセ� �ダイウイルス(Hemagglutinating virus of Japan : H VJ)とを融合させたHVJ-リポソームとして投与� �ることもできる(実験医学別冊、遺伝子治療� ��基礎技術、羊土社、1996;遺伝子導入&発現 解析実験法、羊土社、1994)。本発明のDNAワク� ��ンは、筋肉、皮膚、鼻腔内等に投与するこ� ��ができる。ex vivo法としては、リポフェク� �ョン法、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デ� �ストラン法、微小ガラス管などを用いて細� �内へDNAワクチンを直接注入する方法などが� �げられる。

 本発明のDNAワクチンの投与量は、投与す� ��対象、投与方法、投与形態等によって異な� ��が、通常成人1人当たり遺伝子として約500μg から約50mgの範囲、好ましくは約500μgから約1m gの範囲である。

 以下に実施例を示して、本発明をより詳� ��に説明するが、これらは本発明の範囲を限� ��するものではない。