本发明涉及一种新型肽类免疫剂全蛋蛋白肽的 制备方法与应用。

背景技术

通常肽类免疫剂都属于多肽激素类， 主要是药物， 如胸腺肽、 胸腺五 肽、 免疫球蛋白、 丙种球蛋白、 人血清白蛋白、 干扰素、 肿瘤细胞坏死因 子、 白细胞介素 I 、 白细胞介素 II 、 白细胞介素 III 等。 这些肽类免疫剂 都是从动物的腺体、 组织或血液中分离提取的。 这些多肽药物大都是针 剂， 只能对一定的病人使用， 使用过程中， 容易产生排异、 过敏和副作用 反应， 须谨慎， 必须在医生严格监督下使用。

发明公开

本发明的目的是提供一种肽类免疫剂全蛋蛋白 肽及其制备方法。

本发明所提供的全蛋蛋白肽是按照下述方法制 备得到的： 采用复合植 物蛋白酶对全蛋蛋白粉进行酶催化降解， 得到所述全蛋蛋白肽。

其中， 所述复合植物蛋白酶可由木瓜蛋白酶、 无花果蛋白酶和菠萝蛋 白酶组成， 其酶活力比为（100〜120万） U : (30〜40万） U : (560〜700万） U。

所述全蛋蛋白粉可由下述至少一种禽鸟蛋为原 料制备得到的： 鸡蛋、 鸭蛋、 鹅蛋、 鹌鹑蛋、 麻雀蛋、 鸽蛋、 斑鸠蛋和鸵鸟蛋。

所述酶催化降解的反应体系中， 全蛋蛋白粉与水的质量份数比为 1 : 8-10， 酶解每克全蛋蛋白粉所需各种酶的量为：木瓜 蛋白酶 5〜6万 U，无花 果蛋白酶 1. 5〜2万 U，菠萝蛋白酶 28〜35万 U。 所述酶催化降解的温度为 48〜50°C，时间为 3〜4小时， pH值为 7. 5〜8. 5。

在酶催化降解反应结束后， 还需对酶解液进行灭菌和酶灭活处理， 然 后再对所述酶解液进行冷却、 冷冻处理， 即得到最终的全蛋蛋白肽。 所述 冷冻的温度为 4〜8°C， 时间为 48小时； 所述灭菌和酶灭活的条件为： 温 度 100°C， 时间 10分钟。

本发明中， 酶活力单位 U是指在特定条件下 （25°C， pH7. 0) ， 每 1分 钟转化 1微摩尔的底物所需的酶量或转化 1微摩尔的有关基团所需的酶 本发明所得到的全蛋蛋白肽含有多肽， 寡肽， 20种氨基酸 (其中有 8 种是人体必需而又不能合成的氨基酸）， 多种维生素（VA、 VC、 VE、 Bl、 B2、 B6、 B12)， 钙及多种人体极易吸收的有机天然的各种微量 元素（CPPS， 蛋白锌、 硒、 镁、 铜、 铁、 锰等， 这些微量元素与蛋白质天然螯合）。 所述 多肽和寡肽的相对分子质量均在 lOOODa以下， 由 2-6个氨基酸组成。 所述 全蛋蛋白肽可以以浓缩液、 冻干粉、 喷雾干燥干粉、 水剂或固体剂的形式 存在。

本发明的另一个目的是提供所述全蛋蛋白肽的 应用。

本发明所提供的全蛋蛋白肽的应用是其在制备 增强免疫力的产品中的 应用。

本发明的再一个目的是提供一种用于增强免疫 力的产品。

本发明所提供的用于增强免疫力的产品， 其活性成分包括本发明所提 供的全蛋蛋白肽。 所述产品可为药品或保健品。

当然， 还可根据需要在所述产品中加入其它能增强免 疫力的物质，如大 枣多糖和枸杞多糖。 所述增强免疫力产品中， 全蛋蛋白肽、 大枣多糖和枸 杞多糖的质量比可为 （900-1200 ) ： ( 8-30 ) ： ( 3-15 ) 。

以全蛋蛋白肽为活性成分制备的增强免疫力的 药物或保健品， 需要的 时候， 在上述药物或保健品中还可以加入一种或多种 药学上可接受的载 体。 所述载体包括药学领域常规的稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿 润剂、 崩解剂、 吸收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑剂等。

所述增强免疫力的药物可以制成口服液、 片剂、 颗粒剂、 胶囊、 膏 剂、 膜剂等多种形式。 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常 规方 法制备， 所得到的药物均无苦味。

以全蛋蛋白粉为原料进行酶解是本发明的一个 显著特点。 上述蛋类的蛋 白质评分均接近 100分， 其蛋白质与人体蛋白质接近， 容易被人体吸收和利 用。 而选择全蛋是科学的选择， 若仅选择蛋清蛋白质， 蛋黄中的蛋白质和很 多营养素会丢失； 若仅选择蛋黄， 蛋清中的蛋白质也同样丢失， 选择全蛋也 就是选择了一个完整的营养体系， 不仅营养全面， 而且各营养物质彼此可发 挥协同增效作用。

本发明采用复合植物蛋白酶， 即木瓜蛋白酶、 无花果蛋白酶和菠萝蛋 白酶， 三酶科学配方形成复合酶制剂， 对全蛋蛋白粉进行催化降解， 获得 全蛋蛋白肽。 该全蛋蛋白肽可替代多肽激素类免疫剂， 起到多肽激素类免 疫剂的免疫调节作用。 多肽激素类免疫剂是药物， 只能对病人使用， 而本 发明的产品可以制成口服的多肽营养免疫剂， 不仅能对病人起到治疗的效 果， 而且能对无病的人起到增强免疫力、 防病健体的作用。 该产品是一种 口服制剂， 比针剂携带方便、 使用安全， 使用时不会产生排异、 过敏或其 他副作用反应， 不需在医生的监督下使用。 可用于免疫功能低下、 免疫功 能障碍、 免疫功能下降、 免疫器官受损等引起的诸多疾病和亚健康状态 ， 还可用于蛋白质营养缺乏者， 因蛋白质营养缺乏引起的诸多病症及亚健康 状态的人群， 可用于预防感冒， 可用于运动后、 产后、 病后、 术后人群， 促进 "负氮平衡" ， 对产后恢复、 病后恢复、 伤口愈合、 保肝护肝、 醒 酒、 恢复食欲、 促进睡眠、 恢复肾脏功能、 剌激巨噬细胞的吞噬能力、 抑 制肿瘤细胞的生长、 升高白血球等有较好的作用。

附图说明

图 1为本发明制备全蛋蛋白肽的生产工艺流程图� �

实施发明的最佳方式

下述实施例中所述实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所述试 剂和材料， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 实施例 1、 制备增强免疫力的全蛋蛋白肽口服液

将全蛋蛋白粉 （冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉） 放到发酵罐内， 加相 当于全蛋蛋白粉质量 10 倍的水， 逐步将温度升至 5CTC时， 将按酶解每克全 蛋蛋白粉所需各种酶的量为：木瓜蛋白酶 5万 U，无花果蛋白酶 2万 U，菠萝蛋 白酶 35万 U配伍成的复合蛋白酶加入发酵罐中酶解。 温度始终保持在 50 V， 酶解 4小时后， 进行灭菌和酶灭活处理，然后冷却至 60°C进行装桶， 再 冷却至常温时放入冷藏室， 冷冻沉降 2天后过滤， 即获得全蛋蛋白肽浓缩 液。 然后进行配制， 配制的功效成分构成为： 每 100ml口服液中含全蛋蛋白 肽 1000mg ± 10%，配制后灌装并于 10CTC灭菌 10分钟， 即得到增强免疫力的口 服液。 实施例 2、 制备含大枣多糖和枸杞多糖的增强免疫力的全 蛋蛋白肽口服 液

将全蛋蛋白粉 （冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉） 放到发酵罐内， 加相 当于全蛋蛋白粉质量 8倍的水， 逐步将温度加温至 48°C时， 按照酶解每克全 蛋蛋白粉需木瓜蛋白酶 6万 U， 无花果蛋白酶 1. 5万 U，菠萝蛋白酶 28万 U， 将 上述三种酶配伍成复合蛋白酶加入发酵罐中进 行酶解， 温度始终保持在 48 V， 酶解 3.5小时后， 进行灭菌和酶灭活处理， 然后冷却至 60°C进行装桶， 再冷却至常温时放入冷藏室， 冷冻沉降 2天后过滤， 即获得全蛋蛋白肽浓缩 液。 然后进行配制， 配制的功效成分构成为： 每 100ml口服液中含全蛋蛋白 肽 1000mg ± 10%， 大枣多糖 10mg， 枸杞多糖 5mg， 配制后灌装并于 10CTC灭 菌 10分钟， 即得到增强免疫力的口服液。 实施例 3、 制备含大枣多糖和枸杞多糖的增强免疫力的全 蛋蛋白肽口服 液

将全蛋蛋白粉 （冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉） 放到发酵罐内， 加相 当于全蛋蛋白粉质量 8倍的水， 逐步将温度加温至 5CTC时， 按照酶解每克全 蛋蛋白粉需木瓜蛋白酶 6万 U， 无花果蛋白酶 2万 U，菠萝蛋白 32万 U， 将上述 三种酶配伍成复合蛋白酶加入发酵罐中进行酶 解， ， 温度始终保持在 50 V， 酶解 3小时后， 进行冷却装桶， 再冷却 12 °C时放入冷藏室， 冷冻沉淀 2 天后过滤， 即获得全蛋蛋白肽浓缩液。 然后进行配制， 配制的功效成分构 成为： 每 100ml口服液中含全蛋蛋白肽 1000mg ± 10%， 大枣多糖 15mg， 枸杞 多糖 10mg， 配制后灌装并于 10CTC灭菌 10分钟， 即得到增强免疫力的口服 液。 实施例 4、 增强免疫力的口服液初步稳定性试验

试验样品： 实施例 1制备的口服液

考察指标：

1、 性状： 按常规方法对样品的形状 （含颜色） 及气味进行检査。

2、 含量测定：

对样品中的主要成分， 即以有机氮 （％) 表示肽及氨基酸含量， 测定方 法参照 GB5009。

3、 卫生学及理化指标检査： 按照食品卫生国标 GB4789、 GB5009要求 对产品中的细菌总数、 大肠菌群、 致病菌、 霉菌及酵母和砷、 铅、 汞含量 进行检测。

4、 加速试验：

将三批不同日期生产的样品 （批号分别为 090718、 090720、 090724， 均为玻璃瓶装） 置于相对湿度为 75%的干燥器内 （干燥器底部放置氯化钠饱 和溶液） ， 然后将干燥器放入 37°C恒温箱中， 连续加热三个月， 定期抽样 (0、 1、 2、 3月） ， 测定相关指标 （结果见表 1-3) 。 在三个月的加速试验 中各项指标均未发生明显变化， 由此可推算出： 本品的室温留样期大于 2 年。

表 1、 批号 090718样品的稳定性结果

0月 1月 2月 3月 项目^ ^^^ί果

性状 淡黄色液体 同左 同左 同左 质量指标 ρΗ 值 5.28 5.27 5.29 5.27

肽及氨基酸 （以有 0.218 0.216 0.216 0.213

机氮表示％)

砷 （mg/kg) <0.1 未测 未测 <0.1 铅 （mg/kg) <0.3 未测 未测 <0.3

¾ (mg/kg) 未检出 未测 未测 未检出 卫生学检测 细菌总数（CFU/ml) <10 <10 <10 <10

大肠菌群 MNP (100ml) <3 <3 <3 <3

霉菌（CFU/ml) 未检出 同左 同左 同左 酵母菌（CFU/ml) 未检出 同左 同左 同左

致病菌 未检出 同左 同左 同左 表 2、 批号 090720样品的稳定性结果

0月 1月 2月 3月 项目^ ^^^ί果 性状 淡黄色液体 同左 同左 同左 质量指标 ρΗ 值 5.29 5.26 5.26 5.27 肽及氨基酸 （以有 0.219 0.216 0.213 0.218 机氮表示％)

砷 （mg/kg) <0.1 未测 未测 <0.1 铅 （mg/kg) <0.3 未测 未测 <0.3

¾ (mg/kg) 未检出 未测 未测 未检出 卫生学检测 细菌总数（CFU/ml) <10 <10 <10 <10 大肠菌群 MNP (100ml) <3 <3 <3 <3 霉菌 （CFU/ml) 未检出 同左 同左 同左 酵母菌 （CFU/ml) 未检出 同左 同左 同左 致病菌 未检出 同左 同左 同左 表 3、 批号 090724样品的稳定性结果

0月 1月 2月 3月 项目^ ^^^ί果

性状 淡黄色液体 同左 同左 同左 质量指标 pH 值 5.27 5.27 5.28 5.27 肽及氨基酸 （以有 0.216 0.214 0.213 0.212 机氮表示％)

砷 （mg/kg) <0.1 未测 未测 <0.1 铅 （mg/kg) <0.3 未测 未测 <0.3

¾ (mg/kg) 未检出 未测 未测 未检出 卫生学检测 细菌总数（CFU/ml) <10 <10 <10 <10 大肠菌群 MNP (100ml) <3 <3 <3 <3 霉菌 （CFU/ml) 未检出 同左 同左 同左 酵母菌 （CFU/ml) 未检出 同左 同左 同左 致病菌 未检出 同左 同左 同左 结论： 本品对热比较稳定， 在常温下可保存两年。 实施例 5、 增强免疫力的口服液的安全性评价试验

1) 急性毒性试验

动物： 昆明种小鼠 18-20g， 雌雄各半， 共 20只； 动物由湖北省医学实 验动物中心提供。

受试药物： 实施例 1制备的增强免疫力的口服液。

给药方式： 受试动物按 0.3ml/10g.b.w灌胃。 灌胃前禁食 12h， 观察一 周。

结果： 小鼠灌胃后无中毒症状， 一周内无死亡， LD50>30ml/kg。 按急 性毒性分级， 该受试品属无毒类物质。

2) 微核试验

动物： 昆明种小鼠， 25-27g。

试验方法： 两次灌胃给予受试药物， 第二次灌胃 6h后， 处死动物， 取 胸骨髓用小牛血清稀释涂片， Gimsa染色， 每只动物显微镜下观察 1000个嗜 多染红细胞。 记录微核细胞形成的数目， 以千分率表示。 结果见表 4。 其 中， CP组为环磷酰胺阳性对照组。

表 4

剂量 动物数 观察细胞数 出现微核细 微核形成率 受试物

(ml/mg) (只） (个） 胞数 （个） (%) 阴性对照组 0 10 10X 1000 21 2.1

2 10 10X 1000 29 2.9

4 10 10X 1000 27 2.7 试验组 6 10 10X 1000 21 2.1

8 10 10X 1000 26 2.6

10 10 10X 1000 24 2.4

CP组

60 8 8X 1000 325 40.6 (mg/kg)

结论： 各实验组与阴性对照组结果比较， 无显著性差异； 表明该受试 产品骨髓微核试验结果为阴性。

3) 小鼠精子畸形试验：

动物： 昆明种小鼠 23-25g。 试验方法： 连续灌胃 5天后， 再继续饲喂 30天。 处死动物， 取两侧副睾 制片。 每只动物计数 1000个结构完整的精子， 计算精子畸形发生率。 结果 见表 5。 其中， CP组为环磷酰胺阳性对照组。

表 5

剂量 动物数 观察细胞数 出现微核细 微核形成率 受试物

(ml/mg) (只） (个） 胞数 （个） ( %) 阴性对照组 0 5 5 X 1000 89 1. 78

5 5 5 X 1000 91 1. 82 试验组 10 5 5 X 1000 99 1. 98

15 5 5 X 1000 97 1. 94

CP组

30 5 5 X 1000 359 7. 18 (mg/kg)

结论： 各实验组与阴性对照组结果比较， 无显著性差异； 表明该受试 产品精子畸形试验结果为阴性。

4 ) Ames试验

采用经鉴定符合生物学要求的鼠伤寒沙门氏菌 组氨酸缺陷型 TA97、 TA98、 TA100、 TA102四株菌株进行试验： 采用多氯联苯 （PCB ) 诱导的大 鼠肝匀浆作为体外活化系统 （+S ₉ ) 。 受试产品分为三个剂量组， 样品稀释 成不同浓度， 灭菌每皿加入 0. 5ml， 使浓度分别为 1 : 10、 1： 100、 1： 1000。 采用掺入法记录两次重复的平行样品结果。 结果见表 6。

表 6

阳性 0.0003 > > 396 25 164 > > 283 对照 5000 3000 3000 3000

注： -S ₉ 阳性对照组为 3-硝基 9-芴酮 （2.4.7-TNFone) ， +S ₉ 阳性对照组为 2-氨基芴 (2-AF) 由上表可知， 各实验组回变菌落数均未超过自发回变数的两 倍； 且无 剂量反应关系， 试验结果为阴性。 实施例 6、 全蛋蛋白肽的免疫调节作用检测

1、 试验动物： 昆明种小鼠 18-22g， 雌雄各半。 （湖北省医学实验动 物中心提供）

2、 分组： 剂量分组为： 对照组， 灌胃蒸馏水； "实施 1 制备的口服 液" 的浓度为 1% (即 lOOOmg/lOOml ) ， 低、 中、 高剂量组分别以 lOOmg/kg. b. w、 300mg/kg. b. w、 900mg/kg. b. w的口月艮液灌胃； 低、 中、 高剂量组剂量分别相当于人推荐摄入量的 6、 18、 54 倍。 灌胃一个 月， 然后进行各项实验。

3、 实验方法与结果：

3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验

方法： MTT法 （ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验） 对各组加 ConA 孔与不加 ConA孔吸光度差值的均值进行单因素方差分析� �

结果： 见表 7。

从表 7 可见， 组间差距显著， "口服液"低剂量组显著性增强 ConA诱 导的脾淋巴细胞增殖能力。 表 7 "口服液"对小鼠细胞免疫功能的影响

ConA诱导脾淋巴细胞增值 DNFB诱导 DTH 组别

N=10 (OD差值， M+SD) N=9 (左右耳重差量， mg) 对照组 0.229±0.075 16.14± 12.02

低剂量组 0.344±0.055* 26.89±6.64*

中剂量组 0.241±0.013 18.21±6.96

高剂量组 0.24. ±0.097 18.89±7.26

与对照组比较 * P<0.05 注： 取 0.2ml测定 0D ₅₇ 。值

3.2二硝基氟苯 （DNFB) 诱导迟发型变态反应 （DTH)

方法： 耳肿胀法。 用 DNFB 致敏小鼠后， 第五天再用 DNFB 攻击右耳， 24h 后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径 8mm 的耳片， 称重， 以左 右耳的重量之差来表示 DTH的程度。

结果： 见表 7。

从表 7可见： "口服液"低剂量组可显著提高小鼠对 DNFB诱发的 DTH 反应。

3. 3 血清溶血素的测定

方法： 血凝法。 根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数，对 各组抗体 积数的均值进行单因素方差分析.

结果： 见表 8。

从表 8 可见， 组间差距显著， "口服液"低、 高剂量组可显著性增加血 清溶血素含量。 表 8 "口服液"对小鼠体液免疫功能的影响

组别 N 血清溶血素 (抗体积数) 对照组 10 66.7 ± 11.6

低剂量组 10 90.4 ± 8.40*

中剂量组 10 73.5 ± 17.7

10 80.9 ± 5.09*

3. 4 腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

方法： 半体内法。 制备 20%的鸡红细胞悬液； 每只鼠腹腔注射 ImL该悬 液， 30min后处死动物， 开腹， 经腹腔注入生理盐水 2mL， 平均分滴于 2片 载玻片上， 37 °C温育 30min; 育毕用生理盐水漂洗， 晾干， 以 1 : 1 的丙酮 甲醇溶液固定， 4% Giemsa-磷酸缓冲液染色 3min， 再用蒸馏水漂洗晾干。 油镜下计数 100个巨噬细胞， 按下式计算吞噬率和吞噬指数：

吞噬率 （ _{% ) =} 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数議

计数的巨噬细胞数

^ ^ψ-被吞噬的鸡红细胞总数

'、 — ~计数的巨噬细胞数

结果： 见表 9。 从表 9可见， "口服液"低、 高剂量组吞噬率明显高于 对照组； 低剂量组吞噬指数明显高于对照组。 表 9 "口服液"对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 组别 N 吞噬百分率 (%) 吞噬指数 对照组 10 77.2±2.15 1.037±0.053 低剂量组 10 81.5±2.76** 1.237±0.145 中剂量组 10 79.3±3.95 1.097±0.130 高剂量组 10 80.2±3.52 1.106±0.095 与对照组比较 * P<0.05 与对照组比较 * * P<0.01 3.5 小鼠碳廓清试验

方法： 依程序规定的方法。 根据注入墨汁 2min、 lOmin 后血中碳浓度 (测吸光值） ， 计算出各组小鼠的吞噬指数。

结果： 见表 10。 从表 10 可见， "口服液"低剂量组可显著增强小鼠 碳廓清吞噬指数。 表 10 "口服液"对小鼠碳廓清功能的影响

组别 N 吞噬指数

对照组 5 6.609 ±0.755

低剂量组 10 7.196 ±0.489* 中剂量组 10 5.966±0.670

高剂量组 10 6.152±0.854

与对照组比较 * P〈0.05 免疫调节作用实验结果表明： "全蛋蛋白肽的口服液" 1) 可增强 ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖能力； 2) 增强二硝基氟苯诱导的小鼠迟 发型变态反应； 3) 提高小鼠血清溶血素含量； 4) 增强小鼠腹腔巨噬细胞 吞噬鸡红细胞功能和碳廓清能力。 依据 《保健食品功能学评价程序和检验 方法》 第 3.1 项规定的免疫调节作用的评价方法， 可认为本发明所制备的 全蛋蛋白肽具有免疫调节作用。

工业应用

本发明以全蛋蛋白粉为底物， 采用复合植物蛋白酶： 即木瓜蛋白酶、 无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶， 三酶科学配方形成复合酶制剂， 对全蛋蛋白 粉进行催化、 降解， 得到全蛋蛋白肽。 该产品具有较高的生物活性， 是一 种新型的免疫调节剂和免疫增强剂。 本发明的全蛋蛋白肽可用于开发免疫 药剂、 保健食品、 功能食品、 抗衰老和婴幼儿食品及重病患者的营养补充 剂。 本发明通过冷冻干燥制成冻干粉，进而可制成 胶囊或片剂，可深度开发 肿瘤辅助治疗药物 （增强免疫功能， 增强放化疗患者抗辐射能力、 升高 红、 白血球） 、 抗炎药物及肝炎治疗药物、 非典型肺炎的防治药物，也可作 为其他药物原料或作为食品添加剂。 无论哪类药物、 保健品、 功能食品的 开发都将产生巨大的经济和社会效益， 其前景非常广阔。